danielle patrÍcia cerqueira macÊdo · aos familiares que me acompanharam e ajudaram a perseverar...

ETIOLOGIA DA CANDIDÍASE ESOFÁGICA E AVALIAÇÃO DO EFEITO

ANTIFÚNGICO DO EXTRATO DE PRÓPOLIS IN VITRO E IN VIVO

DANIELLE PATRÍCIA CERQUEIRA MACÊDO

RECIFE

2011

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS

ETIOLOGIA DA CANDIDÍASE ESOFÁGICA E AVALIAÇÃO DO EFEITO

ANTIFÚNGICO DO EXTRATO DE PRÓPOLIS IN VITRO E IN VIVO

Danielle Patrícia Cerqueira Macêdo

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos do Departamento de Micologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Biologia de Fungos. Área de Concentração: Micologia Aplicada

Orientador: Rejane Pereira Neves

Co-orientadores: Neiva Tinti de Oliveira

José Vitor Moreira Lima Filho

RECIFE

2011

Macêdo, Danielle Patrícia Cerqueira Etiologia da candidíase esofágica e avaliação do efeito antifúngico do extrato de própolis in vitro e in vivo/ Danielle Patrícia Cerqueira Macêdo. – Recife: O Autor, 2011. 117 folhas : il., fig., tab.

Orientador: Rejane Pereira Neves Co-orientadores: Neiva Tinti de Oliveira José Vítor Moreira Lima Filho Tese (doutorado) – Universidade Federal de

Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Micologia aplicada, 2011. Inclui bibliografia

1. Candidíase 2. Própolis 3. Micologia I. Título.

579.5 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2011-166

DEDICO

Ao verdadeiro Mestre e Pai, ao amado Filho e ao Espírito Santo de amor.

Aos meus pais Alfredo e Liliane e ao meu irmão Paulo,

pelo amor dedicado.

OFEREÇO

Ao meu amado esposo Alexandre, meu verdadeiro companheiro

e à minha linda filha Clara,

fontes de inspiração e perseverança na caminhada.

Amo vocês!

"Nada te perturbe Nada te espante

Tudo passa, Só Deus não muda.

A paciência Tudo alcança

Quem a Deus tem, Nada lhe falta

Só Deus basta." (Santa Teresa d'Ávila)

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Pernambuco, por toda minha formação profissional

repleta de incríveis momentos de aprendizagem e realizações.

Ao Departamento de Micologia pela acolhida desde minha graduação até hoje,

sempre me encantando através do maravilhoso mundo dos fungos e de seus dedicados

profissionais.

Ao Programa de Pós-graduação em Biologia de Fungos por todo apoio científico,

financeiro e pela confiança nos projetos por mim propostos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

confiança e apoio financeiro durante estes quatro anos de muito trabalho.

Ao meu esposo Alexandre e à minha filha Clara, pela paciência e companheirismo,

estando lado a lado nos desafios enfrentados e nas muitas provas do amor de Deus para

comigo.

Aos meus pais Alfredo e Liliane e ao meu irmão Paulo, pela constante preocupação

e cuidado nos momentos de luta.

À minha querida orientadora e amiga Rejane Neves, pelo amor à sua profissão e

aos seus alunos, capaz de inspirar toda minha formação profissional e pessoal, dando-me

coragem e incentivo para a concretização desta obra.

Aos professores Oliane Magalhães, Cristina Souza Motta, Armando Marsden,

Neiva Tinti, Maria Auxiliadora Cavalcanti, Leonor Costa Maia, Elaine Malosso, Uided

Cavalcanti e Lusinete Aciole de Queiroz (in memorian) pelos ensinamentos e

contribuições valiosas.

Ao amigos do Laboratório de Micologia Médica pela amizade e fidelidade por

todos estes anos, em especial Aline Mary, Vanessa Karina, Reginaldo Gonçalves, André

Ferraz, Patrícia Cariolano, Fabíola Marques, Elvislene, Nadja Lopes, Ana Maria Rabelo,

Carol, Ildnay, Nadyr, Suanni Lemos, Caroline Sanuzi, Heloísa, Helton, entre tantos outros

queridos.

Aos meus colegas e amigos do Departamento de Micologia: Suzane Chang,

Micheline, Patrícia, Marielle, Paula, Vilma, Indra, Catarina, Filipe, Bruno Tomio, André

Santiago, Philipe, Tatiana, Rodrigo, Juliana e tantos outros, por toda alegria e ajuda.

Aos profissionais do Setor de Endoscopia Digestiva do Hospital Universitário

Oswaldo Cruz, na pessoa da Drª Ana Botler Wilhein, por toda atenção e contribuição a esta

pesquisa.

Ao meu co-orientador, Prof. José Vitor Lima-Filho (UFRPE), por todos os

ensinamentos, atenção e valiosas contribuições.

À Roberta Ventura, Ayrles Brandão e Taciana Ralph pela valiosa amizade e ajuda

incansável (LAMIN-UFRPE).

Ao Dr. David Bousfield, por seus ensinamentos e colaboração na revisão criteriosa

de nossos artigos publicados.

Ao senhor Edivaldo Pacheco, pelas amostras de própolis fornecidas e por sua

disponibilidade em colaborar com a pesquisa.

Às queridas religiosas da Instrução Cristã pelo apoio e orações durante todos os

momentos.

Aos colegas do Departamento de Medicina Tropical da Universidade Federal de

Pernambuco, pela compreensão e torcida.

Aos familiares que me acompanharam e ajudaram a perseverar nos momentos de

cansaço: Fátima Militão, Maria Jaqueline Militão, Ana Carolina e sobrinhos, Flávia

Regina, Diógenes, Débora Ferreira, Saulo e Juliana Medeiros, Filipe, Daniela Dubeux, e

aos meus irmãos queridos que me fazem acreditar em um Sonho.

RESUMO GERAL

Candidíase esofágica (CE) é uma infecção oportunista comum em hospedeiros imunossuprimidos. Devido à identificação inadequada e imprecisa, o surgimento de espécies não-C. albicans como patógenos potenciais tem sido subestimado. Assim, os objetivos deste trabalho foram isolar espécies de Candida da cavidade oral e mucosa esofágica de pacientes diagnosticados para esofagite, comparar as amostras isoladas por marcadores moleculares e avaliar in vitro e in vivo o efeito antifúngico do extrato de própolis vermelha. Um total de 1.482 pacientes com sintomas gastrointestinais foi examinado. Destes, 42 apresentaram lesões sugestivas para CE durante a endoscopia. Amostras da cavidade oral e do esôfago foram obtidas e cultivadas em Sabouraud dextrose ágar. A identificação foi realizada por métodos clássicos e moleculares. As espécies isoladas da mucosa oral e esofágica foram C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii, C. kefyr e Trichosporon inkin. O polimorfismo inter e intraespecífico dos isolados de Candida foi avaliado pela técnica de PCR com primer derivado de regiões dos espaços intergênicos (T3B), e primers microssatélites (GTG)5 e (GACA)4. O primer (GACA)4 revelou variabilidade inter e intraespecífica e nenhuma similaridade foi observada entre os isolados orais e esofágicos, demonstrando a independência na patogênese entre a candidíase oral e CE. Testes in vitro conduzidos pelo M27-A3 (CLSI) apresentaram concentrações inibitórias mínimas entre 32-512 µg ml-1 para própolis vermelha (Rp) e 0,125-16 µg ml-1 para fluconazol (Flz), respectivamente. Para realização dos testes in vivo, camundongos foram imunossuprimidos com doses diárias de dexametasona (0,5 mg/animal) por via intraperitoneal durante 14 dias, com intervalos de três dias. A infecção foi realizada, após o período de imunossupressão, com 1x108 células viáveis de C. albicans URM6285 por swab via intra-esofágica seguida pela administração intragástrica de 0,2 mL desta suspensão. Sete dias após a infecção, os camundongos foram divididos em 6 grupos (n = 5) e tratados diariamente por via oral com Flz e Rp em diferentes concentrações. O tratamento exclusivo com Rp 150 mg/kg/dia e doses combinadas com Flz:Rd em diferentes concentrações eliminou a levedura da língua e mucosa do esôfago. Este estudo destaca a possível utilização do extrato de própolis vermelha isoladamente ou em combinação com medicamentos antifúngicos comerciais para o tratamento da CE.

Palavras-chave: Candidíase esofágica, diagnóstico micológico, susceptibilidade

antifúngica, modelo experimental, própolis vermelha.

ABSTRACT

Candida esophagitis (CE) is a common opportunistic infection in immunocompromised hosts. Due to inadequate and inaccurate identification, the emergence of non-Candida albicans species as potential pathogens has been underestimated. The objectives of this study were isolate Candida species from oral and esophageal mucosa from patients diagnosed with esophagitis, compare the isolated strains using molecular markers, determine the main risk factors for disease and evaluate the in vitro and in vivo antifungal effect of red propolis extract. A total of 1482 patients with gastrointestinal symptoms were examined. Of these patients, 42 had lesions suggestive of CE during endoscopy. Samples of the oral cavity and esophagus were obtained and cultured on Sabouraud dextrose agar. The identification was performed by classical and molecular methods. The isolated species from the oral and esophageal mucosa were C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii, C. kefyr and Trichosporon inkin. The inter and intraspecific polymorphism of Candida isolates was evaluated by PCR method with a primer derived from intergenic space regions (T3B), and microsatellite primers (GTG)5 and (GACA)4. Primer (GACA)4 revealed inter and intraspecific variability and no similarity was found between esophageal and oral isolates, demonstrating the independence in the pathogenesis of oral candidiasis and CE. In vitro tests conducted by the M27-A3 (CLSI) had minimal inhibitory concentrations between 32-512 mg ml-1 for red propolis (Rp) and 0.125-16 mg ml-1 for fluconazole (Flz), respectively. To perform the in vivo tests, 30 mice were immunosuppressed with intraperitoneal daily doses of dexamethasone (0.5 mg/animal) for 14 days with intervals of three days. The infection was performed after the period of immunosuppression with 1x108 viable cells of C. albicans URM6285 via esophageal swab followed by intragastric administration of 0.2 mL of this suspension. Seven days after infection, the mice were divided into six groups (n = 5) treated daily with oral fluconazole (Flz) and red propolis extract (Rp) at different concentrations. The exclusive treatment with Rp 150 mg/kg/day and the combined doses with Flz:Rp at different concentrations eliminated the yeast from the tongue and esophagus. This study highlights the potential use of red propolis extract alone or in combinations with antifungal commercial drugs for the treatment of CE.

Key-words: Esophageal candidiasis, mycological diagnosis, antifungal susceptibility,

experimental model, red propolis.

LISTA DE PUBLICAÇÕES

Macêdo, D.P.C., Silva, V.K.A., Farias, A.M.A., Melo, L.R.B., Wilheim, A.B., Neves, R.P.

2008. Candida glabrata esophagitis: new case reports and management. Brazilian Journal

of Microbiology, 39: 279-281. (Artigo publicado)

Macêdo, D.P.C., Oliveira, N.T., Farias, A.M.A., Silva, V.K., Wilheim, A.B., Couto, F.M.,

Neves, R.P. 2010. Esophagitis caused by Candida guilliermondii in diabetes mellitus: first

reported case. Medical Mycology, 48(6): 862-865. (Artigo publicado)

Macêdo, D.P.C., Oliveira, N.T., Silva, V.K., Farias, A.M.A., Lima-Neto, R.G., Wilheim,

A.B., Oliveira, P.C., Pedi, N., Andrade, S.L., Neves, R.P. 2011. Trichosporon inkin

esophagitis: an uncommon disease in a patient with pulmonary cancer. Mycopathologia,

171(4), 279-283. (Artigo publicado)

Macêdo, D.P.C., Oliveira, N.T., Farias, A.M.A., Chang, S.C., Wilheim, A.B., Neves, R.P.

DNA fingerprinting of Candida species from oral and esophageal mucosa: risk factors and

molecular relation with esophagitis pathogenesis. Fungal Genetics and Biology, Maio de

2011. (Artigo submetido e em análise)

Macêdo, D.P.C., Lima-Neto, R.G., Oliveira, P.C., Silva, V.K., Farias, A.M.A., Leal,

A.F.G., Pacheco, E., Neves, R.P. In vitro antifungal activity of Brazilian red propolis: a

therapeutic option against esophageal candidiasis. Letters in Applied Microbiology. (Artigo

a ser submetido)

Macêdo, D.P.C., Lima-Filho, J.V.M., Leal, A.F.G., Andrade, S.L., Ventura, R.F., Silva,

A.F.B., Ralph, M.T., Pacheco, E., Pontes-Filho, N.T., Neves, R.P. In vivo activity of red

propolis and fluconazole against Candida esophagitis: therapeutic effects of simple and

combined administration. Clinical Microbiology and Infection. (Artigo a ser submetido)

LISTA DE FIGURAS

Capítulo 3 Pág.

Figura 1. Aparência endoscópica da esofagite por Candida glabrata grau II de Wilcox (A), apresentando placas brancas e exsudato característicos de esofagite por Candida e exame direto da lesão, clarificado com solução de hidróxido de potássio a 20% exibindo numerosos blastoconídeos (B)................

50

Capítulo 4 Fig. 1 Aspecto endoscópico de esofagite por Candida guilliermondii grau II de

Wilcox (A), exibindo placas brancas e exame microscópico do agente apresentando numerosos blastoconídeos e pseucomicélio (B).............................

57

Capítulo 5 Fig 1. Aparência endoscópica de esofagite grau I de Wilcox (a) e numerosos

artroconídios (indicados) ao exame direto (b). Aspectos macroscópico (c) e microscópico (d) de Trichosporon inkin em ágar fubá (X 400)...........................

66

Capítulo 6 Figura 1. Perfil de amplificação dos isolados de Candida albicans e C. glabrata

(22A-B, 32A-B) obtidos a partir da cavidade oral e esôfago com iniciador (GACA)4. Linha M: marcador de 100pb. (A: isolados orais; B: isolados esofágicos) ...........................................................................................................

76

Figura 2. Perfil de amplificação dos isolados de Candida albicans e C. glabrata (22A-B, 32A-B) obtidos a partir da cavidade oral e esôfago com iniciador (GTG)5. Linha M: marcador de 100pb. (A: isolados orais; B: isolados esofágicos) ...........................................................................................................

77

Figura 3. Perfil de amplificação dos isolados de Candida albicans e C. glabrata (22A-B, 32A-B) obtidos a partir da cavidade oral e esôfago com iniciador T3B. Linha M: marcador de 100pb. (A: isolados orais; B: isolados esofágicos).

78

Capítulo 8 Figura 1. Modelo experimental de candidíase esofágica em camundongos

imunossuprimidos com dexametasona, apresentando ao exame direto do tecido da mucosa do esôfago (A) e língua (C) numerosos blastoconídeos, pseudomicélio e micélio verdadeiro típicos de Candida e numerosas células de leveduras viáveis infectando toda a mucosa do esôfago (B) e da língua (D) ao exame histopatológico corado com hematoxilina-eosina (400X)..................

95

Figura 2. Modelo experimental de candidíase esofágica em camundongos tratados oralmente com extrato de própolis vermelha, apresentando redução qualitativa e quantitativa das estruturas de Candida albicans ao exame direto da mucosa do esôfago (A) e língua (C) e células de leveduras fragmentadas com sinais de normalização da camada serosa da mucosa do esôfago (B) e língua (D) ao exame histopatológico corado com hematoxilina-eosina (400X).

96

Figura 3. Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de Candida albicans viáveis na língua e esôfago de camundongos suíços com candidíase esofágica. A concentração do inóculo foi de 1 x 108 UFC/mL. Após diluições seriadas dos órgãos infectados foi realizado plaqueamento em ágar Sabourand Dextrose, sendo a quantificação realizada após 48 horas a 37ºC........................

97

LISTA DE TABELAS

Capítulo 4 Pág.

Tabela 1. Perfil fisiológico distinguindo C. guilliermondii de C. famata e C. fermentati ...................................................................................................................

58

Capítulo 6

Tabela 1. Espécies de Candida isoladas da mucosa oral e esofágica e fatores de risco associados com a candidíase ...........................................................................

75

Capítulo 7 Tabela 1. Determinação da concentração inibitória mínima de fluconazol e própolis vermelha frente a espécies de Candida associadas com candidíase esofágica ....................................................................................................................

86

SUMÁRIO

Pág.

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 14

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .......................................................................................... 16

2.1. HISTOLOGIA E FISIOLOGIA DA MUCOSA ORAL E ESOFÁGICA........................... 16

2.1.1 Mucosa Oral................................................................................................................... 16

2.1.2 Mucosa Esofágica ......................................................................................................... 17

2.2. COLONIZAÇÃO POR ESPÉCIES DE Candida: RISCO PARA INFECÇÃO.................. 17

2.3. CANDIDÍASE ESOFÁGICA .............................................................................................. 19

2.3.1 Fatores predisponentes para candidíase esofágica......................................................... 22

2.3.2 Sinais, sintomas e casos clínicos da candidíase esofágica............................................. 25

2.4. DIAGNÓSTICO DA CANDIDÍASE ESOFÁGICA ........................................................... 30

2.5. ESOFAGITE EXPERIMENTAL ........................................................................................ 32

2.6. TERAPIA ANTIFÚNGICA NA CANDIDÍASE ESOFÁGICA ......................................... 33

2.7. NOVOS COMPOSTOS COM POTENCIAL ANTIFÚNGICO: FITOTERAPIA

ALTERNATIVA .................................................................................................................

38

2.7.1 Própolis.......................................................................................................................... 38

3. ESOFAGITE POR CANDIDA GLABRATA: NOVOS CASOS RELATADOS E

CONDUTA TERAPÊUTICA .............................................................................................

45

4. ESOFAGITE CAUSADA POR CANDIDA GUILLIERMONDII NO DIABETES

MELLITUS: PRIMEIRO CASO RELATADO .................................................................

51

5. ESOFAGITE POR TRICHOSPORON INKIN: UMA DOENÇA RARA EM PACIENTE

COM CANCER DE PULMÃO .............................................................................................

59

6. IDENTIFICAÇÃO DO DNA DE ESPÉCIES DE CANDIDA DA MUCOSA ORAL E

ESOFÁGICA: FATORES DE RISCO E SUA RELAÇÃO MOLECULAR COM A

PATOGÊNESE DA ESOFAGITE .....................................................................................

67

7. ATIVIDADE FUNGICIDA IN VITRO DA PRÓPOLIS VERMELHA BRASILEIRA:

UMA OPÇÃO TERAPÊUTICA CONTRA A CANDIDÍASE ESOFÁGICA......................

79

8. ATIVIDADE IN VIVO DA PRÓPOLIS VERMELHA E FLUCONAZOL CONTRA

ESOFAGITE POR CANDIDA: EFEITOS TERAPÊUTICOS DA ADMINISTRAÇÃO

SIMPLES E COMBINADA ..................................................................................................

87

9. CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................................................................. 98

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................ 99

Macêdo, Danielle. Etiologia da candidíase esofágica e avaliação do efeito antifúngico...

1. INTRODUÇÃO

Candidíase esofágica é uma infecção fúngica oportunista, inicialmente subaguda,

comum em imunocomprometidos e rara em imunocompetentes, e se caracteriza por

apresentar placas pseudomembranosas esbranquiçadas aderidas à parede do esôfago.

Detectada através de endoscopia digestiva alta, apresenta como agentes várias espécies de

Candida, organismos comensais do trato gastrointestinal que colonizam o esôfago em

aproximadamente 20% dos adultos saudáveis (Lott et al., 2005). C. albicans é a espécie

mais freqüente, embora C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei e outras possam estar

envolvidas (Olmos et al., 2005).

Alterações no estado de hidratação, pH, concentração de nutrientes, microbiota

local da membrana mucosa, defeitos específicos no sistema imune do hospedeiro, em

especial na imunidade mediada por células, bem como o uso de esteróides, antibióticos de

largo espectro, inibidores de ácidos gástricos e imunossupressores favorecem o

estabelecimento desta micose (Karmeli et al., 1995, Barbaro et al., 1996, Weerasuriya;

Snape, 2006, Macêdo et al., 2010).

No curso desta doença podem ocorrer complicações com episódios de

sangramentos, perfurações no trato digestivo, desnutrição ou até disseminação, a qual pode

acometer aproximadamente 15% dos pacientes com leucemia e 11% dos transplantados

renais. Em imunocompetentes a candidíase esofágica está relacionada ao uso de inibidores

da bomba de prótons e antagonista do receptor de histamina, gerando hipocloridria e

alteração da microbiota da cavidade oral, aumentando assim o risco de infecção (Gupta et

al., 1994, Karmeli et al., 1995, Gaissert et al., 1999, Underwood et al., 2003).

As variadas espécies de Candida representam uma grave ameaça aos pacientes

imunocomprometidos e a disseminação da candidíase esofágica para regiões mais

profundas pode ser fatal. Este fato fundamenta a urgência do diagnóstico e o início

tratamento (Traeder et al., 2008). A conduta laboratorial adequada através de exame direto

e cultura auxiliam no diagnóstico clínico e tratamento, entretanto esses métodos estão

sendo complementados por métodos moleculares como estratégia de diagnóstico rápido

uma vez que características fenotípicas comuns entre algumas espécies de leveduras

dificultam a taxonomia desses organismos (Reis, 1998, Mannarelli; Kurtzman, 1998,

Sullivan et al., 1999, Alves et al., 2000).

Macêdo, Danielle. Etiologia da candidíase esofágica e avaliação do efeito antifúngico... 15

Muitas técnicas de biologia molecular (DNA fingerprinting) têm sido usadas para

definir populações fúngicas. A amplificação de microssatélites com um alto nível de

polimorfismo permite uma discriminação precisa entre indivíduos proximamente

relacionados com a utilização de iniciadores homólogos, que amplificarão as regiões

localizadas entre os microssatélites (Inter Seqüências Simples Repetidas-ISSR) que

também apresentam polimorfismo permitindo diferenciação intra-específica (Gupta et al.,

1994, Barros Lopes et al., 1996, Becerra; Paredes, 2000, Dalzoto et al., 2003).

O conhecimento da variabilidade genética entre os isolados de Candida, além das

pesquisas com novos agentes antifúngicos, tem contribuído para o controle das infecções

fúngicas, uma vez que as drogas atualmente utilizadas apresentam limitações devido aos

efeitos citotóxicos e desenvolvimento de resistência (Lacaz et al., 2002, Resende et al.,

2004, Vasquez, 2010).

A resistência ao fluconazol, droga de escolha para tratamento de candidíase

esofágica, é um problema emergente (Vazquez, 2010). As opções terapêuticas são

limitadas nos pacientes resistentes aos azoles, particularmente quando há resistência

cruzada a outros triazoles e intolerância aos seus componentes (Walsh et al., 2000).

Novos compostos antifúngicos têm sido propostos como alternativas para

minimizar as ações hepatotóxica e nefrotóxica causadas pelas drogas convencionais, a

partir de pesquisas com substâncias popularmente conhecidas por suas propriedades

terapêuticas (Queiroz et al., 2008).

Apesar de ainda se apresentar em fase de estudos preliminares, a própolis vermelha

foi citada por exibir propriedades antifúngicas, antibacteriana, anti-inflamatória,

antioxidante e antineoplásica comprovadas. Constitui-se em uma substância resinosa

produzida por abelhas (Apis mellifera) a partir de Dalbergia ecastophyllum (L) Taub.,

vegetação bastante encontrada no litoral da região Nordeste do Brasil e em países como

Cuba. Este produto de origem natural apresenta-se rico em flavonóides, aldeídos, cetonas,

ácidos aromáticos, graxos, ésteres, terpenos, esteróides, aminoácidos, polissacarídeos,

hidrocarbonetos, álcoois, hidroxibenzeno e vários outros compostos ainda em tipificação

(Basnet et al., 1997, Kanazawa et al., 2003, Trusheva et al., 2006, Aslan et al., 2007,

Daugsch et al., 2007, Franchi-Júnior et al., 2007).

Diante do exposto, esta pesquisa teve como objetivos isolar diferentes espécies de

Candida da cavidade oral e da mucosa esofágica de pacientes diagnosticados para

esofagite, comparar as amostras isoladas por meio de marcadores moleculares e avaliar in

vitro e in vivo o efeito antifúngico do extrato de própolis vermelha.


2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 HISTOLOGIA E FISIOLOGIA DA MUCOSA ORAL E ESOFÁGICA

As mucosas da cavidade oral, do esôfago, do estômago e do intestino delgado

compõem o trato gastrointestinal superior, o qual abriga uma grande variedade de micro-

organismos como vírus, protozoários, bactérias e fungos que, em determinadas condições,

podem causar infecções (Repentigny et al., 2004, Lamps, 2008).

2.1.1 Mucosa Oral

A mucosa oral apresenta características histológicas semelhantes às mucosas

vaginal e esofágica incluindo epitélio escamoso estratificado superficial e lâmina própria

abaixo de tecido colagenoso denso, separado pela membrana basal (Ross et al., 1995,

Eroschenko, 2000, Squier; Kremer, 2001).

O revestimento das mucosas encontradas na região geniana, assoalho da boca,

região inferior da língua e palato mole, representa 60% da superfície da cavidade oral. O

epitélio escamoso estratificado nestas áreas apresenta a camada basal, uma camada

espinhosa e superficialmente uma camada granular geralmente não queratinizada e,

portanto, semelhante à do epitélio esofágico (Squier; Kremer, 2001, Repentigny et al.,

2004).

O epitélio oral varia, portanto, no grau de queratinização e cornificação encontrados

na gengiva, palato duro e superfície dorsal da língua, onde ocorrem forças de atrito criadas

por morder, mastigar e pela circulação de alimentos (Schroeder, 1991). A descamação

contínua dos queratinócitos e a presença de nódulos de tecido linfóide componentes da

superfície oral desempenham papel crucial na manutenção de uma mucosa oral saudável e

no controle da colonização e infecção por espécies de Candida (Samaranayake;

Samaranayake, 2001, Repentigny et al., 2004).

A depleção de células Langerhans e sua reduzida expressão de moléculas do

complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II e interleucina 12

provavelmente alteram o desenvolvimento de linfócitos T CD4, imprescindíveis na

resposta imunológica adaptativa mediada por células na cavidade oral e mucosa do esôfago

(Repentigny et al., 2004).


2.1.2 Mucosa Esofágica

O esôfago é considerado um órgão que conecta a faringe (localizado em oposição à

sexta vértebra cervical) à cárdia (à esquerda da décima primeira vértebra torácica). Fixa-se

acima da cartilagem cricóide e abaixo do diafragma, sendo ocluído na região superior pelo

esfíncter faringo-esofageano e na terminal, pelo esfíncter esofágico inferior. O

revestimento muscular é composto por uma camada externa, formada por fibras

longitudinais, e uma camada interna de musculatura circular, com a presença do plexo de

Auerbach entre as duas, sendo estriadas na porção superior do esôfago (Sheehan, 2008).

Sheehan (2008) afirma que no início da deglutição o alimento se desloca

voluntariamente da boca para a faringe, desenvolvendo uma onda peristáltica primária,

causando relaxamento do esfíncter esofágico superior e permitindo que o alimento penetre

no esôfago. A estimulação direta do esôfago promove peristalse secundária, a qual conduz

o conteúdo para o estômago, usualmente auxiliado pela gravidade. A falha de contração

faríngea e/ou relaxamento do esfíncter cricoesofageano é responsável pela maioria dos

casos de disfagia alta; entretanto, a disfagia baixa é causada mais freqüentemente por

obstrução.

Baseado em Iglesias e Gómez (2006), disfagia é citada como a dificuldade na

passagem dos alimentos desde a boca, onde se forma o bolo alimentar, até o estômago. É

uma sensação subjetiva que aparece durante ou imediatamente após a deglutição e variadas

causas podem provocar este sintoma. Estes autores concordam que a disfagia que começa

apenas para alimentos sólidos é indício de obstrução mecânica.

Aproximadamente 20% dos adultos saudáveis apresentam colonização do trato

gastrointestinal por micro-organismos comensais, incluindo cavidade oral e esôfago

(Simon et al., 1997, Baehr; Mcdonald, 1998). Contudo, há controvérsias acerca dos riscos

destes comensais tornarem-se patógenos e promoverem lesão esofágica.

2.2 COLONIZAÇÃO POR ESPÉCIES DE Candida: RISCO PARA INFECÇÃO

Baseado em estudos epidemiológicos, humanos estão expostos repetidamente às

leveduras do gênero Candida. Uma característica comum entre indivíduos colonizados é

que a espécie mais freqüente ainda é C. albicans com variações intra-específicas e outras

espécies de Candida com tropismo específico para o trato gastrointestinal, contudo, a

história natural da colonização permanece pouco compreendida (Boerlin et al., 1996).


A significância da colonização esofágica por fungos é controversa, com escassez de

dados sobre este assunto (Andersen et al., 1992; Underwood et al., 2003). De acordo com

Péter e colaboradores (2000) colonização é definida como a não observância de placas

esofágicas sugestivas para micose com a presença de estruturas fúngicas ao exame direto

e/ou cultura positiva.

Na população dinamarquesa a prevalência de colonização do esôfago por Candida

foi estimada em 23% segundo Andersen et al. (1992). No mesmo estudo, desconsiderando

o número de colônias isoladas, os fungos foram encontrados em 60% dos pacientes com

aparência macroscópica normal da mucosa esofágica.

Hidratação alterada, pH, concentração de nutrientes e microbiota da membrana

mucosa, bem como alterações específicas do sistema imune especialmente a imunidade

mediada por células, permitem a colonização e invasão da mucosa pelas leveduras do

gênero Candida (Brodey, 1993; Richardson; Flörl, 2008).

Segundo Underwood et al. (2003), a colonização é inibida pela defesa exercida pela

salivação, clearance do conteúdo do lúmen esofágico, presença de barreira mucosa intacta

e manutenção da microbiota bacteriana e fúngica normais. Os antibióticos podem predispor

os pacientes imunocompetentes à infecção fúngica através da colonização e crescimento

exacerbado das espécies da microbiota (Thapa; Kumar, 1989, Wilcox; Karowe, 1994).

As leveduras sobrevivem como comensais em sítios anatômicos, de acordo com o

ambiente em que se encontram e a pressão ambiental exercida sobre estas. Em superfícies

mucosas, a limitação dos nutrientes e a competição entre as bactérias e fungos pertencentes

à microbiota normal, exercem uma pressão seletiva, o que resulta na eliminação dos micro-

organismos menos adaptados (Calderone; Fonzi, 2001).

Segundo Alexander et al. (1990), qualquer variável que provoque o desequilíbrio

da microbiota ou lesão da mucosa gastrointestinal pode ser um agente facilitador de

translocação de espécies de Candida até os capilares mesentéricos. Sendo assim, fatores

que aumentem a colonização intestinal por estes micro-organismos (uso de antibióticos,

oclusão intestinal) ou determinem atrofia ou lesão de mucosa intestinal (jejum prolongado,

nutrição parenteral total, hipotensão, quimioterapia) pode potencializar o fenômeno de

translocação no tubo gastrointestinal.

Um número significativo de autores acredita que infecções por Candida resultam

de colonização endógena da microbiota (Reagan et al., 1990, Grauhan et al., 1994, Voss et

al., 1994). Contudo, de acordo com Wey et al. (1989), a colonização não exerce influência

no prognóstico, sendo considerada um fator independente para subseqüente micose.


Péter et al. (2000) sugerem associação direta entre colonização e esofagite por

fungos e que estudos moleculares podem contribuir para verificação de similaridade entre

os isolados, uma vez que a presença de fungos na orofaringe é um fator preditivo para

colonização esofágica ou esofagite.

2.3 CANDIDÍASE ESOFÁGICA

Em 1956, Andrén e Theander foram os primeiros a descrever candidíase

(anteriormente denominada monilíase) esofágica através de técnicas de raios X. Desde

então, um grande número de relatos têm sido descritos, abordando características clínicas e

epidemiológicas desta doença ( Eras et al., 1972, Laufer, 1982, Kliemann et al., 2008).

Esta micose é considerada uma infecção fúngica oportunista, inicialmente

subaguda, comum em imunocomprometidos e rara em imunocompetentes, e se caracteriza

por apresentar placas pseudomembranosas esbranquiçadas aderidas à parede do esôfago

(Lott et al., 2005, Macêdo et al., 2008).

Wingard et al. (1993) e Ortuño et al. (1997) relataram que o aumento na taxa de

colonização relaciona-se com a severidade da doença de base com a permanência no

ambiente hospitalar e o uso de antibióticos de largo espectro, os quais eliminam

determinadas bactérias que competem com a microbiota fúngica.

Reagan et al. (1990) e Voss et al. (1994) afirmam que a colonização por cepas

idênticas de Candida frequentemente desenvolvem infecções disseminadas. Segundo estes

autores, os fungos podem invadir algum nível da parede do esôfago e a invasão dos vasos

sanguíneos da mucosa e submucosa pode ocasionar candidíase invasiva.

A candidíase esofágica é observada na obstrução funcional ou mecânica do esôfago

com estase o que favorece o crescimento excessivo do fungo (Wilcox; Karowe, 1994, Yee;

Wall, 1994). Para atingir a corrente sangüínea as leveduras do gênero Candida necessitam

translocar as barreiras físicas, tais como as camadas de células epiteliais, seja através de

penetração ativa e/ou da endocitose induzida (Zakikhany et al., 2007).

Segundo os resultados obtidos por Filler e Kullberg (2002), uma vez no sangue a

levedura pode disseminar-se pelo organismo causando infecções sistêmicas em diversos

órgãos.

Diversos autores concordam que o trato gastrointestinal é considerado a maior porta

de entrada para candidíase disseminada, uma vez que leveduras deste gênero

freqüentemente superinfectam úlceras presentes na mucosa por outras causas clínicas. Por


esta razão, a candidíase sistêmica embora seja uma complicação incomum é passível de

ocorrer a partir da colonização do trato gastrointestinal e encontra-se associada a altas

taxas de mortalidade principalmente em pacientes cirúrgicos (Washington et al., 1991,

Prescott et al., 1992, Lamps et al., 2000).

A translocação da levedura através de sítios do trato gastrointestinal pode culminar

em candidemia. Acredita-se que a maioria dos casos seja adquirida por via endógena,

devido à rica colonização por Candida, o que ocorre em até 70% da população normal.

Métodos de genotipagem apresentam a similaridade entre cepas colonizantes e infectantes,

comprovando a provável origem endógena da maioria das infecções por tais patógenos

(Cole et al., 1996, Nucci; Anaisse, 2001).

Em 1963, eram conhecidas apenas cinco espécies como agentes de doenças em

humanos, incluindo C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. stellatoidea e C.

guilliermondii. Atualmente, são conhecidas cerca de dezessete espécies de Candida

agentes de micoses superficiais ou invasivas em seres humanos (Dignani et al., 2003).

As principais espécies de interesse clínico são: C. albicans, C. parapsilosis, C.

tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilliermondii e C. lusitaniae. Entretanto, número

progressivo de casos de doenças superficiais e invasivas, em diferentes sítios anatômicos,

relacionadas e espécies emergentes de Candida tem sido descrito com o isolamento de C.

dubliniensis, C. kefyr, C. rugosa, C. famata, C. utilis, C. lipolytica, C. norvegensis, C.

inconspicua entre outras (Coleman et al., 1998, Richardson; Flörl, 2008).

Em contraste com o que ocorre na América do Norte e Europa, C. parapsilosis e C.

tropicalis são as espécies responsáveis pela grande maioria das infecções por espécies não-

C. albicans no Brasil (Colombo et al., 1999, Antunes et al., 2004, Pasqualotto et al., 2005).

C. glabrata tem sido considerada um fungo sapróbio, relativamente não patogênico

que compõe a microbiota normal de indivíduos saudáveis, raramente causando infecções

graves em humanos. Todavia, devido ao aumento no uso de terapia imunossupressiva

associada à terapia antimicótica de amplo espectro, a freqüência de infecções de mucosa e

sistêmica causadas por esta espécie tem aumentado significativamente (Hitchcock et al.,

1993, Wingard et al., 1993, Knoke et al., 1997). De fato, dependendo do sítio de infecção,

C. glabrata é considerada a segunda ou terceira causa mais comum de candidíase seguindo

C. albicans.

Infecções invasivas por C. guilliermondii ainda são infreqüentes; contudo, esta

espécie vem sendo reconhecida por diferentes autores como agente emergente. A maioria

dos casos descritos relaciona-se a pacientes com câncer (Colombo; Guimarães, 2003).


C. krusei exibe a capacidade de disseminar-se endogenamente a partir do trato

gastrointestinal, particularmente em pacientes com hematopatias malignas. Diversos

trabalhos relatam o aumento no número de pacientes granulocitopênicos com colonização

e infecção por esta espécie (Hautala et al., 2007, Richardson; Flörl, 2008).

O agente etiológico predominante da candidíase esofágica é C. albicans, um fungo

comensal da microbiota normal humana, capaz de causar um grande número de infecções

que variam desde superficiais mucosas a disseminadas (Sutclife et al., 1999, Traeder et al.,

2008). Todavia, de acordo com Kliemann et al. (2008), outras espécies tais como C.

tropicalis e C. krusei estão envolvidas.

Historicamente, C. albicans equivalia de 70 a 80% dos isolados obtidos de

pacientes infectados. C. glabrata e C. tropicalis equivaliam a aproximadamente 5 a 8% dos

isolados, enquanto outras espécies de Candida não-albicans raramente ocorriam. Contudo,

pesquisas revelam uma mudança micológica de C. albicans para as espécies não-albicans

tais como C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei, algumas destas altamente

resistentes aos antifúngicos convencionais (Wingard et al., 1993).

Nos últimos anos, vem aumentando o número de infecções esofágicas causadas por

espécies de Candida não-albicans e outras espécies de leveduras como Cryptococcus

neoformans. Ademais, fungos filamentosos como Aspergillus e Histoplasma capsulatum

também podem ser causa rara de infecções neste órgão (Lamps et al., 2000, Kliemann et

al., 2008).

De acordo com Hube e Naglik (2001), a primeira etapa para o sucesso da

colonização, com subseqüente infecção da superfície mucosa por C. albicans, é a adesão.

C. albicans não somente induz sua própria endocitose como também penetra ativamente

através dos tecidos. Enzimas hidrolíticas secretadas podem auxiliar a levedura durante o

processo de invasão através da destruição de componentes da superfície celular hospedeira

e fatores imunes ou através da extração de nutrientes para o próprio fungo.

Sanglard et al. (1997) e Felk et al. (2002) relatam que a invasão de C. albicans na

célula hospedeira é um processo multifatorial o qual precisa ser regulado apropriadamente.

A percepção de condições como o pH extracelular torna-se crucial, além da formação de

hifas pelos isolados, reduzida sob condições alcalinas.

Baseado nos achados de Gow (2002), outro fator de virulência importante de C.

albicans é a habilidade de mudança entre as formas de crescimento ovóide e hifal,

características do dimorfismo.


Dignani et al. (2003) afirmam que C. albicans possui elevado potencial, cujos

principais fatores de patogenicidade e virulência são a capacidade de aderência a diferentes

mucosas e epitélios, o dimorfismo com produção de estruturas filamentosas que auxiliam

na invasão tissular, a termotolerância significativa e a produção de enzimas como proteases

e fosfolipases.

Hube (2004) propõe que células de leveduras são mais susceptíveis a realizar

infecção quando as formas hifais participam da invasão tecidual. Adicionalmente, a

habilidade de reconhecer e se adaptar às mudanças ambientais, como meios alcalinos ou

ácidos, são propriedades importantes de C. albicans. Este autor relata que, durante os

diferentes estágios da infecção por esta espécie no tecido hospedeiro, sob condições

favoráveis, a levedura expressa fatores de virulência específicos, adaptando-se como

parasita.

Apesar do modo de reprodução clonal de C. albicans há diferenças claras entre

isolados clínicos e nem todos isolados desta mesma espécie apresentam propriedades

biológicas semelhantes. Tipificação de seqüência multilocus foi usada para demonstrar que

pacientes adultos com fungemia são usualmente infectados com seus próprios isolados

endógenos e comensais de Candida. Ainda permanece em debate se variações genéticas

intra-específicas podem estar associadas com diferentes capacidades de virulência (Tavanti

et al., 2005, Odds et al., 2006).

Thewes et al. (2008) concluíram que diferenças fenotípicas observadas entre

isolados de C. albicans ocorrem devido a mudanças nos níveis de expressão de certos

genes e/ou devido às diferenças na função das proteínas codificadas (causadas por

modificações mínimas de seqüência). Estas diferenças exibem impacto na formação das

hifas, captação de ferro, resposta a estresses, metabolismo de fosfato e virulência desta

espécie. Estes mesmos autores verificaram que isolados desta levedura exibiram

características genéticas comuns com base em análises de rDNA, embora não se saiba

porque aparentes diferenças entre os isolados de uma mesma espécie influenciem na

capacidade de causar infecção.

2.3.1 Fatores predisponentes para candidíase esofágica

Baseado no trabalho de Simon et al. (1997), o uso prolongado de corticosteróides

inalantes pode promover o aparecimento de candidíase esofágica, usualmente precedida

por colonização ou lesão em cavidade oral causada por espécies de Candida. Os estudos de


Bailey et al. (1998) comprovam que pacientes tratados com esteróides apresentam risco

elevado de candidíase esofágica secundária à infecções pelo herpes simplex e

citomegalovírus.

Os principais fatores predisponentes para candidíase esofágica são

imunossupressão, doença esofágica prévia e outras condições que aumentem o crescimento

de Candida no trato digestivo. Diversas doenças endócrinas, incluindo diabetes mellitus,

hipotireoidismo, hipoparatireoidismo e hipoadrenocorticismo (Phaosawasdi et al., 1986),

bem como câncer, terapia com corticosteróides ou drogas citotóxicas e, mais recentemente

a infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), são causas conhecidas de

imunossupressão e, desta forma, fatores de risco para esta micose (Gornig et al., 1997).

Interessantemente, desde o início da década de 80, a maioria dos estudos desta micose

envolvia pacientes HIV-positivos (López-Dupla et al., 1992, Chaisson et al., 1998).

Na era da terapia antiretroviral altamente ativa (HAART) ocorreu uma diminuição

das doenças oportunistas relacionadas à imunodeficiência (especialmente desordens

associadas com contagens de linfócitos T CD4+ abaixo de 50-100 células/µL), se

comparado com os anos que precederam a introdução de combinações antiretrovirais

potentes em 1996. Todavia, experiências recentes provaram que as infecções oportunistas

ainda são as maiores causas de morbidade e mortalidade na era HAART. Como

conseqüência a candidíase esofágica permaneceu como uma das doenças oportunistas mais

freqüentes em pacientes com AIDS, mesmo após uma década da introdução dos

antiretrovirais (Manfredi et al., 2001, Manfredi et al., 2007).

A má nutrição, alcoolismo, idade avançada e terapia com corticosteróides, tanto

sistêmicos como inalados, são fatores que facilitam o desenvolvimento desta patologia

segundo diversos pesquisadores (Baehr; Mcdonald, 1994, Wilcox; Karowe, 1994, Simon et

al., 1997, Weerasuriya; Snape, 2006). Corticosteróides administrados sistematicamente

predispõem à infecção, suprimindo tanto as funções dos linfócitos quanto dos granulócitos.

Além deste efeito, estas drogas inaladas podem depositar-se no esôfago após a deglutição e

facilitar colonização e subseqüente infecção por Candida (Baehr; Mcdonald, 1994, Simon

et al., 1997).

Wingard (1995) e Marr et al. (2000) relatam que C. tropicalis possui considerável

potencial biológico como agente oportunista quando o hospedeiro encontra-se

neutropênico, quando há supressão da microbiota bacteriana pelo uso de antimicrobianos e

danos na mucosa gastrointestinal.


Inibidores de bomba de ácidos têm sido amplamente utilizados e alguns relatos

referem o uso de omeprazol com o desenvolvimento de candidíase esofágica (Larner;

Lendrum, 1992, Mosiman, 1993, Sood et al., 1995). Adicionalmente às propriedades dos

inibidores das bombas de prótons, o omeprazol tem apresentado efeito inibidor dos efeitos

citotóxicos dos linfócitos in vivo e da secreção salivar, facilitando o crescimento de

Candida na cavidade oral e subseqüente disseminação através do trato digestivo (Teare et

al., 1993, Scaringi et al., 1996).

Culturas quantitativas foram desenvolvidas por Karmeli et al. (1995) em amostras

de suco gástrico obtidas de 12 pacientes ambulatoriais com esofagite antes e um mês

depois de terapia com omeprazol. Aumento no número de pacientes com cultura positiva

foi observado. Segundo estes autores, o espectro de micro-organismos isolados do suco

gástrico foi idêntico ao da microbiota normal da cavidade oral, especialmente quanto às

bactérias e espécies de Candida, sendo reflexo da deglutição da microbiota oral capaz de

sobreviver em ambiente com pH ácido.

Martínez et al. (2000) investigaram o emprego de omeprazol em seis pacientes com

candidíase esofágica e relacionaram o desenvolvimento desta micose ao uso desta droga.

Além disso, os autores descreveram dados similares quando na presença de co-fatores tais

como neoplasias, antibiótico ou corticoidoterapia.

Segundo Jimenez-Alonso et al. (2003) e Ebert (2006), o esvaziamento insuficiente

do esôfago, terapia imunossupressora e supressão ácida predispõem à esofagite por

Candida.

Gupta et al. (1994) e Koh et al. (2008) afirmam que nos pacientes com câncer e

transplantados de medula óssea, as drogas anti-câncer administradas causam como efeito

indesejado a supressão do sistema imunológico humano. Esta condição permite que a

levedura se dissemine e cause infecções em sítios corpóreos variados, até mesmo

fungemia.

A candidíase esofágica em pacientes mais jovens sugere a associação entre esta

micose e o uso de esteróides inalatórios, antibióticos e terapia supressora da produção de

ácidos bem como diabetes mellitus, câncer e HIV (Chocarro; Martinez, 2000, Kanda et al.,

2003, Yakoob et al., 2003, Boktour et al., 2004, Khosravi et al., 2008).


2.3.2 Sinais, sintomas e casos clínicos da candidíase esofágica

Sinais e sintomas de infecções fúngicas do trato gastrointestinal são geralmente

similares, independente das espécies envolvidas e incluem diarréia, vômitos, melena,

sangramento, dor abdominal e febre (Sheehan, 2008). Contudo, segundo Lamps (2008),

infecções fúngicas esofágicas usualmente apresentam sintomas característicos e podem

ocorrer devido à presença de doenças de base, seus tratamentos ou ambos.

Chen e colaboradores (2007) afirmam que pacientes com esofagite infecciosa aguda

usualmente apresentam no decorrer da doença odinofagia, disfagia e, algumas vezes,

complicações severas tais como sangramento, perfuração ou disseminação dos agentes

etiológicos.

Na candidíase esofágica, complicações severas como sangramento do trato

digestivo, perfuração e disseminação sistêmica são observadas como consta nos achados de

Gaissert et al. (1999). Candidíase sistêmica tem sido relatada em 15% dos pacientes com

leucemia e 11% dos transplantados renais (Gupta et al., 1994) e, de acordo com Cole et al.

(1996), devido aos riscos de disseminação, o estudo desta micose tem se tornado relevante.

Holt (1968) descreveu 13 casos de pacientes com neutropenia, 10 do sexo feminino

e três do masculino, que apresentaram esofagite por Candida. Em sete casos foram

diagnosticados como agente etiológico C. albicans e em um, C. krusei. Nos demais, os

agentes não foram identificados ao nível de espécie pelo autor. C. albicans era a única

espécie considerada agente etiológico desta doença, sendo o isolamento de C. krusei ponto

de partida para estudos mais detalhados acerca das possíveis espécies de Candida

emergentes.

Entre 3.501 indivíduos avaliados por Naito et al. (1988), 49 apresentaram sinais

para candidíase esofágica, incluindo 17 com câncer, 14 com desordens imunológicas,

quatro com diabetes mellitus, sete com outras doenças de base e sete aparentemente

saudáveis. Invasão sistêmica por fungo foi observada na maioria dos pacientes com câncer

envolvendo o sistema hematopoiético e tratados com corticóides, antibióticos ou agentes

anticâncer. Embora as complicações associadas com candidíase esofágica sejam raras, os

autores enfatizaram que pacientes com imunidade afetada deveriam ser cuidadosamente

examinados para esta micose, a fim de prevenir o desenvolvimento de formas invasivas.

Thapa e Kumar (1989) consideram candidíase esofágica uma doença incomum em

crianças, relacionando-a a alterações na defesa imunológica celular primária ou secundária,


como linfomas, leucemias e estados de imunossupressão. Todavia, os autores relataram

esta micose em duas crianças com sintomas de disfagia e dor retroesternal.

Vermeersch e colaboradores (1989) isolaram fungo no esôfago de 37% dos

pacientes selecionados para realizar endoscopia do trato gastrointestinal superior. Porém,

baseados em número de colônia acima de 100 e/ou presença de pseudohifa, apenas 11%

foram considerados com micose. Por outro lado, Kusne et al. (1994) reportaram a presença

de fungo no esôfago de 75% dos pacientes com doença hepática avançada, avaliados para

transplante; todavia, o método utilizado não fez referência aos casos com esofagite.

Young et al. (1993) avaliaram endoscopicamente sete pacientes diagnosticados para

esofagite fúngica por um período de 12 anos em hospital universitário de Taiwan,

República da China. O agente etiológico mais isolado foi C. albicans, seguido por C.

krusei, Trichosporon beigelii e Rhodotorula rubra, apesar de exibirem aspectos

endoscópicos semelhantes das lesões. A porção mais baixa do esôfago foi a mais

freqüentemente envolvida. Apenas um paciente apresentou lesão de cavidade oral. A

maioria dos pacientes não apresentou sintomas típicos de esofagite tais como disfagia ou

odinofagia.

Sutclife et al. (1999) descreveram um caso de bola fúngica no esôfago em mulher

iraniana de 54 anos que foi diagnosticada para leucemia promielocítica, iniciando sintomas

de disfagia durante o quarto ciclo de quimioterapia. Durante estado de neutropenia severa,

foi realizado tratamento empírico para esofagite por fungo ou viral com anfotericina B e

aciclovir. C. glabrata sensível ao fluconazol foi isolada do tecido biopsiado, iniciando-se

tratamento com derivado azólico.

Péter e colaboradores (2000) avaliaram 100 pacientes com doença hepática por

consumo de álcool, sendo 22 pacientes com sintomas dispépticos considerados como grupo

controle. 41,9% dos pacientes com a doença hepática e 13,6% do grupo controle

apresentaram fungo no esôfago. Segundo estes autores, significativamente mais pacientes

com doença hepática apresentaram esofagite por fungo e a taxa de colonização do esôfago

também foi mais elevada.

Underwood et al. (2003) revisaram 42 casos de pacientes com candidíase esofágica

diagnosticados por endoscopia para caracterizar a micose e suas condições predisponentes.

Apenas dois pacientes apresentaram associação com malignidade. Outros possíveis fatores

predisponentes foram terapia ácido-supressiva (14 pacientes), cirurgia gástrica prévia

(cinco), dano da barreira mucosa (quatro), uso de esteróides inalatórios (quatro), uso de

esteróide oral (três), desordens relacionadas à motilidade esofageal (três), doenças


reumatológicas (três), uso prévio de antibióticos (dois), diabetes mellitus (dois), ocorrendo

em alguns casos associação de mais de um fator.

Bonavina et al. (2003) estudaram a prevalência de colonização por Candida em 131

pacientes com doença esofágica que foram submetidos a processos cirúrgicos e em 40

voluntários saudáveis através de swab da cavidade oral e faríngea. Colonização por

Candida foi mais freqüente em pacientes com doença esofágica do que nos indivíduos

controle, sendo a prevalência mais alta em indivíduos com carcinoma do que naqueles com

doenças benignas.

Seis homens e quatro mulheres imunocompetentes com idade entre 48 e 82 anos,

foram diagnosticados para candidíase esofágica através de endoscopia por Cortés et al.

(2004). Seis pacientes apresentaram baixa contagem de linfócito T CD4 e sete tiveram

baixa contagem de linfócitos CD8. Todos os pacientes foram tratados com fluconazol oral

em doses de 150mg/dia por 14 dias, com completa resolução das lesões. Os autores

concluíram que pacientes com esta micose têm frequente alteração da imunidade celular

necessitando de diagnóstico precoce e tratamento adequado.

Baseado em Mocroft et al. (1997) e Vazquez (2003), esofagite por Candida ocorre

em 10-15% dos pacientes com AIDS e apresenta sintomas como disfagia, odinofagia e dor

retroesternal. Tipicamente diagnosticados em altas contagens de linfócitos T CD4 (Crowe

et al., 1991), esta doença estava associada com longevidade (Luo et al., 1995, Mocroft et

al., 1997), se comparada a outras doenças que definem AIDS.

Mocroft et al. (2005) descreveram as mudanças no uso de medicação antimicótica,

a incidência de candidíase esofágica e fatores de risco associados com esta doença antes e

depois do início da HAART. De um total de 9.873 pacientes que não apresentavam

esofagite por Candida no início das investigações, 537 (15,8%) subseqüentemente

desenvolveram esta micose após uso de anti-retrovirais. Pacientes mais velhos e aqueles

com baixa contagem de linfócitos T CD4 apresentaram a mais alta incidência de esofagite

por Candida na era pós-HAART.

Segundo Raufman (2005), na última década ocorreu redução significativa no

número de casos de candidíase esofágica em pacientes infectados pelo HIV, sendo

justificada pelos benefícios imunológicos obtidos a partir das terapias anti-retrovirais.

Esofagite por Candida é considerada um forte indício de prognóstico desfavorável

em pacientes idosos dos quais aproximadamente 50% morreram dentro de seis meses do

diagnóstico, enquanto 90% do controle sobreviveram por mais de um ano (Weerasuriya;

Snape, 2006).


Pasqualotto et al. (2006), no período de Outubro de 1997 a Outubro 2003, isolaram

C. guilliermondii das amostras clínicas obtidas por biópsia esofágica de oito pacientes,

especialmente com AIDS.

Iglesias e Gómez (2006) relataram um caso de uma mulher de 72 anos com disfagia

mecânica causada por Candida, etiologia considerada pouco freqüente em

imunocompetentes. Segundo estes autores, diversos fatores predisponentes se relacionam

com o aparecimento desta micose, devendo-se considerar a possibilidade mesmo na

ausência de uma doença de base. A paciente fez uso de antibiótico por oito dias, dois

meses antes da consulta e diagnóstico da esofagite, sendo considerado pelos autores o fator

de risco. A endoscopia digestiva alta auxiliou no diagnóstico, confirmando-se a etiologia

ao exame micológico.

Weerasuriya e Snape (2006) investigaram a ocorrência de candidíase esofágica em

população mais velha que 65 anos, comparando com pacientes controles de idade e sexo

compatíveis. Patologias associadas ao trato gastrointestinal superior, como candidíase, e os

riscos associados foram avaliados. Características clínicas clássicas associadas com doença

esofágica foram relativamente incomuns: disfagia em 14% dos casos, candidíase

orofaríngea em 2% e dispepsia em 2%, enquanto anemia e perda de peso foram as

principais indicações para endoscopia. Câncer, doença pulmonar obstrutiva crônica e o uso

de antibióticos estavam associados com esta micose, enquanto nenhuma associação foi

observada com diabetes mellitus.

Chen et al. (2007) descreveram um caso de esofagite combinada causada pelo vírus

herpes simplex e Candida em uma paciente urêmica de 57 anos, a qual realizava contínua

diálise peritoneal há três anos. A paciente veio a óbito após sépsis progressiva e falência

respiratória.

Cinco casos de candidíase esofágica foram descritos em pacientes com lúpus

eritematoso sistêmico em hospital suíço entre 1990 e 2004. O uso prolongado de

corticoidoterapia foi destacado pelos autores como principal fator de risco para esta micose

(Khalifaa et al., 2007).

Para os pacientes imunocomprometidos, os patógenos mais frequentemente

isolados são espécies de Candida, citomegalovírus e o vírus herpes simplex, embora

etiologias mais raras não possam ser excluídas (Mastroianni et al., 1999, Chen et al.,

2007).

Vidal et al. (2007) avaliaram biópsias esofagianas de 227 pacientes com AIDS,

identificaram os agentes e verificaram a associação entre os achados endoscópicos e


histológicos. Espécies de Candida foram os agentes mais encontrados, seguidas de

citomegalovírus, herpes e micobactérias. A presença de placas sugeriu o diagnóstico de

candidíase esofágica. Os autores reconhecem a alta prevalência e a importância de estudos

acerca desta micose neste grupo de pacientes.

Segundo Manfredi et al. (2007), baixa contagem absoluta de CD4+ nem sempre

pode ser considerada fator de risco independente em pacientes acometidos de candidíase

esofágica. Os autores reportaram esofagite por C. albicans em paciente com AIDS com

contagem de linfócitos CD4+ de 1.025 céls/μL, o qual apresentou dois episódios

recorrentes. Foram considerados como co-fatores a aderência insuficiente ao tratamento

com conseqüente replicação viral e imunossupressão celular.

Traeder et al. (2008) analisaram 15.000 pacientes internados com AIDS, entre 1985

e 2007, constatando aumento na incidência de espécies não-albicans como agentes de

candidíase esofágica e diminuição no número de casos de infecções oportunistas como

pneumonia por Pneumocystis carinii (atualmente denominado Pneumocystis jiroveci),

toxoplasmose cerebral, dentre outras, desde a introdução dos anti-retrovirais. Todavia, a

incidência de candidíase esofágica permaneceu tão elevada quanto nos anos antes da era

HAART. Segundo os autores, esta observação pode refletir o desenvolvimento de

resistência ao fluconazol através da seleção de espécies não-albicans como conseqüência

de terapia profilática em pacientes HIV+ ao longo dos anos.

De acordo com Kliemann et al. (2008), estudo realizado em centro médico

brasileiro no período de 18 meses identificaram 158 casos positivos para candidíase

esofágica de um total de 21.248 endoscopias do trato digestivo alto. A maioria das

infecções foi causada por C. albicans (96,2%), seguido por C. tropicalis (2,5%), C.

lusitaniae (0,6%) e C. glabrata (0,6%), acometendo com discreta predominância o sexo

feminino (51,3%) entre 21 e 88 anos de idade. Os autores concluíram que infecção por

espécies não-albicans não está relacionada à presença de nenhum fator predisponente

específico, ressaltando a importância de pesquisas neste sentido.

De acordo com o trabalho de Lamps (2008), infecções do esôfago ocorrem em

indivíduos aparentemente imunocompetentes; contudo, a maioria dos casos relaciona-se

fortemente ao grau de imunodeficiência ou doença de base.


2.4 DIAGNÓSTICO DA CANDIDÍASE ESOFÁGICA

A endoscopia digestiva alta é o procedimento diagnóstico de eleição para

candidíase esofágica na atualidade; porém, a confirmação da esofagite deve ocorrer com o

histopatológico da mucosa ou exame citológico da raspagem esofágica (Wilcox; Schwartz,

1996, Vidal et al., 2007).

Os locais indicados para a realização de biópsias ou escovados para citologia,

histologia e culturas dependem dos achados endoscópicos (Wilcox; Karowe, 1994),

podendo ser observadas placas esbranquiçadas aderidas à mucosa esofágica, às quais

recobrem uma mucosa ulcerada. A resposta inflamatória associada varia desde mínima

reação tecidual (em pacientes imunocomprometidos) a infiltrados neutrofílicos

prominentes, formação de abscesso, erosão/ulceração e necrose; contudo, granulomas são

ocasionalmente vistos (Chandler; Watts, 1987, Attwood; Lamb, 2008).

A classificação endoscópica é utilizada para avaliar o grau de infecção por Candida

em: Grau 1 - caracterizado pela visualização de placas esparsas, comprometendo menos

que 50% da mucosa esofágica, sem ulceração; Grau 2 - placas esparsas, comprometendo

mais que 50% da mucosa esofagiana, sem ulceração; Grau 3 - placas confluentes, que

cobrem circunferencialmente pelo menos 50% da mucosa, com ulceração; e Grau 4 -

placas circunferenciais, presença de ulceração, estenose e estreitamento do lúmen, não

reversíveis à insuflação (Wilcox; Schwartz, 1996, Attwood; Lamb, 2008).

O diagnóstico desta micose é realizado através da demonstração de estruturas e

culturas fúngicas. Alguns autores afirmam que a análise da invasão tecidual pelo fungo é

menos sensível nos métodos que empregam fixação com formalina devido à provável

remoção das estruturas fúngicas superficialmente localizadas (Vermeersch et al., 1989,

Lamps, 2008).

Os fungos podem ser detectados através de exames histopatológicos; todavia, para

classificar o agente segundo a espécie a cultura é considerada o padrão ouro, além dos

testes fisiológicos de identificação taxonômica para leveduras. Outros métodos

diagnósticos podem ser considerados aliados à cultura como testes sorológicos,

antigênicos, imunohistoquímicos e moleculares (Lamps, 2008). A taxonomia clássica das

leveduras baseia-se fundamentalmente no uso de características morfológicas e fisiológicas

(Barnnet et al., 2000; De Hoog et al., 2000). No entanto, para detecção dos padrões de

similaridade intra-específica, estas características não são suficientes. Em contraste,


métodos moleculares são universalmente aplicados e fornecem segurança (Dendis et al.,

2003).

A tipagem do DNA de isolados de Candida obtidos de amostras clínicas de

pacientes com AIDS e candidíase oral e esofágica indica uma distribuição idêntica na

freqüência daqueles isolados presentes em indivíduos saudáveis. Isto sugere que candidíase

associada a AIDS não é causada por isolados virulentos particulares, mas provavelmente

resulta de falhas no mecanismo de defesa do hospedeiro (Boerlin et al., 1996).

Mannarelli e Kurtzman (1998), utilizando um sistema de primers espécie-

específicos, identificaram 14 espécies patogênicas de Candida e estabeleceram relação

evolutiva entre os isolados, comprovando ser esta técnica bastante rápida e de fácil

interpretação.

Walsh et al. (1988) destacaram a utilidade do espécime obtido por biópsia da

mucosa endoscopicamente diagnosticada. Em 1989, Vermeersch e colaboradores relataram

a importância da cultura da amostra clínica para o diagnóstico da espécie de fungo

envolvida na infecção; contudo alertaram para a possibilidade de resultados falso positivos,

através do isolamento de sapróbios.

Baehr e McDonald (1994) alertaram que o aparecimento de sinais esofágicos e

sintomas não ocorrem necessariamente devido a processos infecciosos e, possíveis

diagnósticos alternativos como danos induzidos por alta secreção de ácidos pépticos, ação

medicamentosa ou anormalidades estruturais/ funcionais do esôfago, não devem ser

excluídos nos pacientes imunodeficientes.

Um total de 933 pacientes com odinofagia e disfagia foi incluído em estudo

realizado por Badarinarayanan et al. (2000) na Índia. Endoscopia do trato gastrointestinal

superior foi realizada em todos os pacientes e amostras de tecidos obtidas por biópsia

foram retiradas dos locais das lesões. Após triagem, 56 pacientes foram positivos para

fungos como agentes etiológicos. A cultura foi considerada o método mais confiável. C.

albicans (87,5%) foi o patógeno predominante seguido por C. tropicalis (8,9%). Esta

investigação sugeriu a possibilidade de candidíase esofágica em pacientes mesmo na

ausência de fatores predisponentes, tais como infecção pelo HIV ou condições que

comprometam o sistema imune, sendo atribuídos os casos positivos à precariedade de

higiene pessoal e razões sócio-econômicas.

Paillaud et al. (2004) descreveram características clínicas classicamente associadas

com doença esofágica como odinofagia, disfagia, desconforto epigástrico e candidíase


esofágica. Estes achados sugerem que esta doença em pacientes idosos pode estar

relacionada à má nutrição por dieta pobre em proteínas.

Pesquisa realizada por Vidal et al. (2007) acerca das associações significativas

entre o diagnóstico histopatológico e os aspectos endoscópicos da esofagite, constataram

formação de placas por Candida em 89% dos pacientes.

De um total de 107 pacientes com leucemia investigados, Gorschlüter et al. (2008)

diagnosticaram clinicamente através de endoscopia alta 12 casos de esofagite

exclusivamente por Candida (11,3%) e quatro casos de esofagite por Candida associada

com doença de refluxo (3,8%). Interessantemente, este diagnóstico não foi confirmado

pelos autores em nenhum dos oito pacientes nos quais a indicação para a endoscopia foi

dor retroesternal ou suspeita para candidíase esofágica. Vale ressaltar que a incidência

desta micose nos pacientes investigados foi mais comum naqueles que receberam

antifúngico profilático (predominantemente itraconazol).

Woittiez et al. (2008) relataram caso de um homem caucasiano de 48 anos, com

sintoma de disfagia, dor, regurgitação após ingestão de alimentos sólidos e perda de peso.

Ao exame endoscópico, a mucosa estava revestida por placas esbranquiçadas, sugestivas

para candidíase esofágica. Uma vez que a hipótese diagnóstica era câncer, múltiplas

biópsias foram realizadas. Contudo, exame histopatológico revelou epitélio escamoso com

infiltração neutrofílica e presença de Candida sem sinais de malignidade.

2.5 ESOFAGITE EXPERIMENTAL

Hoshika e colaboradores testaram e comprovaram em 1996 a hipótese de que os

mecanismos de aderência em C. albicans com inserção subepitelial ocorrem devido ao

simples contato com a mucosa esofágica de animais imunocompetentes. Candidíase

esofágica foi observada em 14 dos 15 ratos que receberam suspensões da levedura por 13

dias.

Walsh et al. (2000) selecionaram, após teste de susceptibilidade in vitro, isolados

de C. albicans resistentes e sensíveis ao fluconazol para testes experimentais de candidíase

orofaríngea e esofágica. Após o tratamento com a referida droga, verificaram redução

significativa no número de unidades formadoras de colônias (UFC) obtidas de amostras

dos animais desafiados com isolados sensíveis ao fluconazol, quando comparados ao grupo

com isolados resistentes, os quais, neste último caso, resultaram em insucesso terapêutico.


Em estudo com modelo animal imunocompetente, Arendrup et al. (2002) avaliaram

oito espécies de Candida quanto ao grau de patogenicidade, sendo C. albicans e C.

tropicalis consideradas as mais patogênicas, seguidas por C. glabrata, C. lusitaniae, C.

kefyr, C. parapsilosis, C. krusei e C. guilliermondii. Esta classificação hierárquica foi

baseada na mortalidade, número de rins infectados, contagem de UFC no tecido,

capacidade de envolvimento ocular e achados histopatológicos nos rins. Há algum tempo

sabe-se que diferentes cepas de C. albicans podem exibir níveis diferentes de virulência e

que a invasão dos isolados em modelo experimental de candidíase oral pode apresentar-se

variável (Bartie et al., 2004).

Ishibashi et al. (2007a), desenvolveram método experimental para candidíase

esofágica com sintomas locais característicos. Os camundongos foram imunossuprimidos

com o corticosteróide prednisolona. Sob sedação, foram infectados com concentração de 4

x 107 células viáveis de C. albicans através de seringa intra-esofágica. A partir do terceiro

dia de infecção, os autores observaram lesões características para a micose, sendo tratados

com solução oral de itraconazol. Estes autores reforçaram o sucesso terapêutico em

substituição de solução intra-gástrica deste antifúngico, a partir de trabalho posteriormente

desenvolvido (Ishibashi et al., 2007b).

Koh et al. (2008) imunossuprimiram os animais com drogas anti-câncer e

colonizaram o trato gastrointestinal de camundongos com C. albicans, concluindo que a

baixa contagem de neutrófilos, os danos no trato gastrointestinal, bem como a habilidade

da célula mudar da forma leveduriforme para a filamentosa, são necessários para causar

infecção sistêmica por C. albicans.

2.6 TERAPIA ANTIFÚNGICA NA CANDIDÍASE ESOFÁGICA

A terapia antifúngica na candidíase esofágica é comumente instituída através do

uso de antimicóticos sistêmicos incluindo polienos e principalmente, azólicos. A meta da

terapia é o alívio dos sintomas e prevenção de recidiva, uma vez que é rara a erradicação

da infecção (Barchiesi et al., 2003, Vazquez, 2003, Traeder et al., 2008).

O aumento em 30% desde 2000 na disponibilidade de agentes para o tratamento de

infecções fúngicas tem atingido apenas 15 fármacos atualmente aprovados para uso clínico

(Gogtay et al., 2008, Thompson et al., 2009).

Diferenças no espectro de atividade antifúngica, biodisponibilidade, formulação,

interações medicamentosas e efeitos colaterais são fatores que elegem a terapia ideal a ser


instituída sendo, portanto, indispensável o conhecimento detalhado das classes de drogas

(Traeder et al., 2008, Thompson et al., 2009).

De acordo com Graybill (1992), o primeiro agente antifúngico absorvido por via

oral foi o cetoconazol, mas seu emprego rotineiro para infecções por Candida tornou-se

restrito, em virtude de sua pequena absorção, numerosas interações medicamentosas e

efeitos colaterais como hepatotoxicidade, alteração da síntese de testosterona e de

esteróides. Igualmente, tratamentos tópicos a base de clotrimazol e nistatina para

candidíase esofágica mostraram-se pouco eficazes como relatado por Darouiche (1998).

Demuria et al. (1993), afirmam que triazóis exercem alterações na membrana

celular fúngica através da inibição do citocromo P450 e da enzima 14-α-demetilase,

impedindo a conversão de lanosterol para ergosterol. Este mecanismo resulta no acúmulo

de substâncias tóxicas e conseqüente inibição do crescimento celular e replicação,

resultando na ação fungistática ou fungicida in vitro espécie-dependente. Dentre os

triazóis, fluconazol é comumente utilizado na terapia de candidíase esofágica devido à sua

biodisponibilidade, penetração tecidual, tolerabilidade e reduzidos efeitos colaterais.

Ainda, este fármaco possui absorção oral inalterada mesmo em pacientes que recebem

terapia ácido-supressiva como os inibidores da bomba de prótons/H2-bloqueadores.

A introdução de agentes antifúngicos triazólicos orais como o fluconazol em 1990 e

o itraconazol em 1992, marcou um importante avanço no tratamento das infecções por

Candida, relacionado à eficácia e segurança. O fluconazol pode ser absorvido em qualquer

pH gástrico, com efeitos mínimos sob a síntese de esteróides (Redding et al., 1994,

Kauffman, 1996).

Existem opiniões que reforçam a escolha do fluconazol no tratamento da candidíase

esofágica. Barbaro et al. (1996) avaliaram a eficácia do fluconazol e itraconazol após

tratamentos por longos períodos em 2.213 humanos HIV-positivos com primeiro episódio

de candidíase esofágica. Os autores observaram cura endoscópica e clínica em 96% dos

doentes tratados com fluconazol e em 65,6% dos tratados com itraconazol, apresentando

clara diferença de sucesso terapêutico. Entretanto, algumas espécies de Candida

apresentam alta resistência intrínseca (C. krusei) ou resistência intermediária (C. glabrata)

ao fluconazol in vitro (Wingard et al., 1991, Redding et al., 1994).

Wilcox et al. em 1996 avaliaram por um período de 53 meses, através de um estudo

prospectivo com 134 pacientes HIV-positivos que apresentavam sinais e sintomas de

esofagite, a segurança e o custo benefício da introdução de fluconazol na profilaxia antes

do procedimento endoscópico. Destes, 68 pacientes receberam fluconazol profilático e em


uma semana, 56 (82%) apresentaram completa remissão dos sintomas. Dos 66 pacientes

submetidos à endoscopia, candidíase esofágica foi o achado mais comum em 42 pacientes

(64%), seguida de esofagite ulcerativa associada em 10 (15%). Segundo os autores, o

tratamento empírico foi mais vantajoso com relação ao custo benefício para pacientes HIV-

positivos com sintomas esofágicos sugestivos.

Segundo Lange et al. (1997), itraconazol é outra opção terapêutica na esofagite, que

apesar de bem tolerado apresenta reações adversas, como a toxicidade, observadas em até

39% dos pacientes, exigindo assim a interrupção do tratamento. Em concordância,

Jaruratanasirikul e Kleepkaew (1997) confirmam o emprego positivo deste fármaco;

entretanto, ressaltam a necessidade durante o tratamento associado ao uso de antiácidos

(antagonistas de receptores de H2), da ingestão de alimentos e bebidas ácidas para uma

absorção máxima da droga.

Com base nos relatos de Samaranayake (1997), o uso excessivo de drogas

triazólicas, como o fluconazol (droga de escolha para candidíase esofágica) em pacientes

infectados pelo HIV contribui para o surgimento de espécies não-C. albicans como C.

krusei, que tem se destacado gradualmente como o patógeno mais comum em hospedeiros

imunossuprimidos. A autora enfatiza a importância da identificação do agente até o nível

de espécie, antes da instituição da terapia antifúngica.

Durante os primeiros anos da epidemia pelo HIV, poucos antifúngicos estavam

disponíveis (anfotericina B, nistatina, cetoconazol, fluconazol e itraconazol). Espécies de

Candida resistentes a estas drogas se espalharam rapidamente, tornando o insucesso

terapêutico um grande problema no final da década de 1980 até meados de 1990. A

introdução de suspensões de itraconazol em outubro de 1997 representou um avanço e, o

contínuo aprimoramento da terapia anti-retroviral, minimizou o problema das infecções

fúngicas por algum tempo (Smith et al., 1999, Koks et al., 2002).

De acordo com Bossche (1997) e Thakur et al. (2008) a falha terapêutica por

azólicos pode ser originada devido aos baixos níveis intracelulares da droga, gerando ação

insuficiente ou expressão acentuada das bombas de efluxo dos fármacos. Por outro lado,

Thakur et al. (2008) comprovaram que alterações genéticas na codificação de enzimas

responsáveis pela síntese de ergosterol causam diminuição da ação dos agentes

antifúngicos, especialmente de derivados triazólicos.

Silva et al. (2002) verificaram o aumento na freqüência de leveduras com

suscetibilidade diminuída ou resistentes aos antifúngicos e classificaram a resistência em

clínica e in vitro. Segundo os autores, a primeira pode ser conseqüência do baixo nível do


fármaco no sangue e diversos tecidos, devido à interação entre os fármacos ou à

imunodepressão do paciente. A resistência in vitro caracteriza-se quando cepas suscetíveis

se transformam em resistentes devido ao prévio contato com o antifúngico.

A análise de isolados de C. albicans, provenientes de pacientes com infecções

recorrentes, tem mostrado que a resistência ao fluconazol ocorre nas mesmas cepas que

anteriormente eram suscetíveis. Isso confirma os dados de estudos anteriores de que as

cepas são modificadas ao longo da exposição do paciente à droga (Morschhäuser, 2002).

Nucci e Colombo (2002) descreveram pacientes inicialmente infectados com

amostras suscetíveis de C. albicans que desenvolveram infecção pelo mesmo genótipo do

fungo, porém com concentração inibitória mínima (CIM) mais elevada após o uso do

fluconazol.

Böhme et al. (2003) consideram o fluconazol como droga de escolha para o

tratamento da candidíase esofágica pela sua segurança e tolerabilidade e por apresentar

uma rápida resposta clínica às infecções fúngicas. Todavia, profilaxia primária de rotina

não é recomendada desde 2003, como citado por Vazquez, devido à diminuição na eficácia

da medicação antifúngica e ao potencial para desenvolver resistência.

A resistência ao fluconazol por C. albicans é citada por Zardo e Mezzari (2004),

apresentando 93% de resistência cruzada ao itraconazol, podendo atingir até 45% dos

indivíduos que receberam tratamento prévio.

Pappas et al. (2004) enfatizam que fluconazol continua a ser a droga de escolha no

tratamento da candidíase orofaríngea e que pacientes que apresentem recidivas devem

permanecer em terapia profilática com este antifúngico até reconstituição total ou parcial

do sistema imunológico.

Goldman et al. (2005) avaliaram que o desenvolvimento de resistência ao

fluconazol, definido como a perda da resposta clínica a 200 mg de fluconazol por um

período de 14 a 21 dias, ocorreu em 4,1% dos pacientes que fizeram uso contínuo e em

4,3% daqueles que fizeram uso esporádico desta droga. Brion et al. (2007) destacaram a

importância do teste de sensibilidade a drogas antifúngicas in vitro para detectar espécies

resistentes e dose-dependentes.

A partir da década de 90, a ampla utilização do fluconazol na profilaxia e

tratamento de infecções fúngicas em pacientes imunocomprometidos tem resultado no

aumento da incidência de infecções por outras espécies de Candida diferentes de C.

albicans (Richardson; Flörl, 2008). Para Baddley et al. (2008), fluconazol é ativo contra


espécies de Candida, com exceção de C. krusei e alguns isolados de C. glabrata,

suscetíveis a doses mais elevadas.

Seguido à era HAART, o número de casos de esofagite por Candida atingiu os

níveis mais baixos em 1999. Porém, o número de casos voltou a aumentar nos anos

seguintes, excedendo atualmente àqueles da década de 1990. Como possível explicação

para este fenômeno, cita-se o uso de fluconazol profilático ou de manutenção.

Simultaneamente, a exposição prolongada a esta droga por uma população inteira pode

conduzir à emergência de diversas espécies de Candida (Traeder et al., 2008).

Traeder et al. (2008) relataram um caso de esofagite por Candida severa em

infectado pelo HIV, com 40 anos, com aderência incompleta à terapia antiretroviral e

contagem de células T CD4 variando entre zero e 150 células/mL. Após tratamento com

fluconazol, itraconazol, caspofungina, anidulafungina, posaconazole e anfotericina B

lipossomal apresentou insucessos terapêuticos com episódios recorrentes de candidíase

esofágica.

De 296 isolados de leveduras da cavidade oral de 292 pacientes infectados pelo

HIV com candidíase orofaríngea, atendidos no Muhimbili National Hospital da Tanzânia,

não foi observada diferença significante na distribuição das espécies entre os pacientes

com candidíase orofaríngea primária ou recorrente. Todavia, os isolados obtidos de

pacientes previamente tratados foram significantemente menos susceptíveis aos compostos

azoles fluconazol, itraconazol, miconazol, clotrimazol, anfotericina B e nistatina. C.

albicans foi a espécie mais frequente (84,5%) seguida por C. glabrata (6,8%) e C. krusei

(3,4%). Para os autores, candidíase orofaríngea recorrente e terapia antifúngica prévia

estão correlacionadas significativamente com susceptibilidade reduzida aos azólicos

(Hamza et al., 2008).

De acordo com Richardson e Flörl (2008), o reconhecimento das mudanças

epidemiológicas nas infecções por Candida é de grande valor para o cuidado com o

paciente e condições como severidade da imunossupressão, exposição prévia a drogas

antifúngicas e o conhecimento da espécie envolvida devem ser levadas em consideração

para escolha do tratamento.

Tratamento prolongado gera efeitos tóxicos ao organismo, visto que os antifúngicos

também agem sobre outras células eucarióticas como as somáticas, sendo indispensável o

desenvolvimento de estratégias terapêuticas com fitoterápicos (Bendazzoli, 2000, Giordani

et al., 2001, García et al., 2003, Fernández-Torres et al., 2006, Traeder et al., 2008).


2.7 NOVOS COMPOSTOS COM POTENCIAL ANTIFÚNGICO: FITOTERAPIA

ALTERNATIVA

As pesquisas utilizando produtos naturais visam obter novos princípios ativos que

possam se tornar fármacos ou modelos para síntese de novas drogas, além de possibilitar a

avaliação dos efeitos farmacológicos, toxidade potencial, bem como analisar a relação

entre os efeitos metabólicos, imunológicos e hormonais (Bendazolli, 2000, De Moura et

al., 2001).

Segundo Antunes et al. (2004), Barros et al. (2007) e Queiroz et al. (2008), os

últimos anos têm sido caracterizados pela retomada aos estudos com produtos naturais,

demonstrando que a busca por substâncias fitoterápicas alternativas permanece, como

ocorre nos estudos dos variados tipos de própolis.

2.7.1 Própolis

Atenção especial tem se voltado para derivados naturais, com base no

conhecimento da produção de compostos antifúngicos, visando o desenvolvimento de

novas alternativas terapêuticas e agregando valor econômico auto-sustentável, podendo ser

alcançado com a exploração da própolis (Castro; Higashi, 1995, Park et al., 1996,

Burdock, 1998, Park et al., 1998, Gurgel et al., 2005).

A própolis é um complexo resinoso produzido por abelhas, com aparência que varia

a depender de diversos fatores naturais como a espécie das abelhas, a flora local ou até

mesmo a variabilidade genética da abelha rainha. O material de origem vegetal é coletado

por abelhas Apis mellifera a partir de botões florais ou outras partes de árvores sendo o

produto final utilizado por estes insetos como uma importante arma de defesa contra

micro-organismos patogênicos (Park et al., 1998). O nome deriva do grego, pro “a favor,

em defesa de” e polis “cidade” (Salatino et al., 2005). A própolis bruta apresenta em sua

composição básica cerca de 50% de resinas vegetais, 30% de cera de abelhas, 10% de

óleos essenciais, 5% de pólen e 5% de detritos de madeira e terra (Monti et al., 1983,

Cirasino et al., 1987).

O espectro de vôo de uma abelha A. mellifera abrange um raio de cerca de 4-5 km

em torno da colméia, de onde abelhas campeiras coletam pólen e néctar para alimentação,

bem como resina para a própolis. Não são conhecidos os fatores que direcionam a

preferência das abelhas coletoras de resina por uma determinada fonte vegetal, mas se sabe


que estas são seletivas nesta coleta (Salatino et al., 2005; Teixeira et al., 2005).

Possivelmente, esta escolha esteja relacionada com a atividade antimicrobiana da resina,

uma vez que as abelhas utilizam própolis como um anti-séptico (Sahinler; Kaftanoglu,

2005).

A amplitude das atividades farmacológicas da própolis é maior em regiões tropicais

do planeta e menor nas regiões temperadas, refletindo a diversidade fitogeográfica

(Bankova, 2005a). De acordo com Silici e Kutluca (2005b), variações na composição

química da própolis também foram observadas entre amostras de própolis coletadas em

uma mesma região, por diferentes raças de A. mellifera, a partir da grande diversidade de

plantas envolvidas e das reservas de néctar e pólen. Como conseqüência, além da

composição química diferenciada, ocorre também uma variação nas atividades

farmacológicas.

Tradicionalmente, a própolis é usada na medicina popular por sua ação

antibacteriana; todavia outras propriedades como antiviral, antifúngica, anti-inflamatória e

imunoestimulante também têm sido descritas (Park et al.,1998, Marcucci et al., 2001,

Kartal et al., 2003, Beyer; Melzig, 2005).

A composição da própolis varia sazonalmente em uma mesma localidade, sendo

determinada principalmente pelas características fitogeográficas existentes ao redor da

colméia de onde o material vegetal para produção da própolis é coletado (Sforcin et al.,

2000, Kumazawa et al., 2004).

De acordo com Park et al. (2002), esta resina tem sido usada na medicina

tradicional desde a antigüidade. Segundo os autores, vários fatores interferem na

composição química da própolis brasileira como o clima, espécie da abelha e flora local, os

quais refletem, de maneira decisiva, nas propriedades biológicas do produto e classificação

em 12 grupos.

A própolis de coloração vermelha tem sido reportada por ser típica de Cuba cuja

planta de origem é a Clusia nemorosa (G. Mey) e da Venezuela a partir da C. scrobiculata

(Benoist) (Cuesta-Rubio et al., 2002, Trusheva et al., 2004). No Brasil, a própolis verde ou

do alecrim do campo é a mais explorada, originadas da Baccharis dracunculifolia (Slatino

et al., 2005, Teixeira et al., 2005). Contudo, melhores resultados terapêuticos têm sido

atingidos com a própolis vermelha, cuja principal fonte botânica no Brasil é a Dalbergia

ecastophyllum (L. Taub.), conhecida como rabo-de-bugio, localizadas nos estados da

região nordeste do país, tais como Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe e Bahia

(Daugsch et al., 2007).


A composição química da própolis depende fortemente da estação do ano (Sforcin

et al., 2001) e de sua origem botânica (Bankova et al., 2000). Própolis da região tropical

contém flavonóides, di e triterpenos, lignina e outras substâncias fenólicas, ácido prenil-p-

cumárico, acetofenonas, açúcares, açúcares-álcoois, ceras, vitaminas e minerais. Também

vários compostos voláteis como monoterpenos e sesquiterpenos são encontrados (Bankova

et al., 1994). Contudo, a própolis originária de zona temperada é geralmente composta de

50% de resinas e bálsamos, 30% de cera, 10% de essência e óleos aromáticos, 5% de

pólen, e 5% de outras substâncias, como ácidos alifáticos, ésteres, ácidos aromáticos,

ácidos graxos, carboidratos, aldeídos, aminoácidos, cetonas, chalconas, diidrochalconas,

terpenóides, vitaminas (B1, B2, B6, C e E) e minerais (alumínio, antimônio, cálcio, césio,

cobre, ferro, lítio, manganês, mercúrio, níquel, prata, vanádio e zinco) (Marcucci, 1995,

Park et al., 1996, Burdock, 1998, Bankova et al., 2000, Almeida; Menezes, 2002, Sahinler;

Kaftanoglu, 2005).

Daugsch e colaboradores (2008) estudaram a origem botânica e a composição

química de seis amostras de própolis vermelha oriundas de cinco estados do nordeste do

Brasil. A produção desta própolis estava localizada em regiões de mangue ao longo do

litoral ou margens de rios. As abelhas foram observadas coletando exsudatos na Dalbergia

ecastophyllum (L) Taub. (Leguminosae). Segundo estes autores a própolis vermelha

brasileira contêm teor elevado de isoflavonóides.

Os isoflavonóides são de distribuição bastante restrita no reino Plantae e ocorre

quase que exclusivamente na família Leguminosae (Piccinelli et al., 2005). Donnelly et al.

(1973) foram os primeiros a constatar a presença destes compostos em D. ecastophyllum.

Segundo Nunes et al. (2009), após análise dos constituintes da própolis vermelha

brasileira, os metabólitos secundários majoritários foram os derivados fenólicos

(flavonóides, antraquinonas) e terpenos (monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos e

esteróides), além da presença de açúcares. Flavonóides como quercetina, kaempferol,

luteolina e apigenina não foram detectados, mesmo sendo reportados na literatura como

presentes em outras própolis (Pietta et al., 2002, Salatino et al., 2005).

Atribui-se a ação antifúngica (fungistática e fungicida) aos ácidos fenólicos,

terpenos e flavonóides, sendo a atividade fungicida relacionada a este último composto.

Estas substâncias são encontradas principalmente na própolis vermelha brasileira (Park et

al., 2002, Daugsch et al., 2007, Marcucci et al., 2007, Silva et al., 2007).

Os flavonóides são compostos fenólicos que compreendem um amplo grupo de

substâncias naturais não sintetizadas pelos animais, e a presença e concentração destes


compostos são utilizadas como índice de qualificação de amostras de própolis (Havsteen,

2002, Beecher, 2003, Lu et al., 2004, Manach et al., 2004).

A ingestão de flavonóides interfere em diversos processos fisiológicos, auxiliando

na absorção e na ação de vitaminas, atuando nos processos de cicatrização como

antioxidantes, além de apresentarem atividade antimicrobiana e moduladora do sistema

imune (Williams et al., 2004).

A composição química da própolis é um dado extremamente importante, pois suas

distintas atividades farmacológicas podem também decorrer do sinergismo entre seus

diversos compostos químicos (Krol et al., 1993). Apesar dos flavonóides serem os

componentes da própolis mais extensivamente estudados, não são os únicos responsáveis

pelas suas propriedades farmacológicas (Awale et al., 2005).

Nas amostras brasileiras, segundo Beyer e Melzig (2005) e Fernandes et al. (2007),

outras classes de compostos bioativos são descritas, tais como ácidos fenólicos e

terpenóides específicos e, devido a esta grande variedade de componentes químicos, a

padronização química é extremamente difícil.

De acordo com Reynaud et al. (2005), isoflavonóides são os componentes

antimicrobianos mais importantes da própolis vermelha, especialmente com atividade

frente a Candida albicans. Os achados dos autores são reforçados pela presença de

pterocarpanos, compostos conhecidos pela ação antifúngica de defesa das próprias plantas.

Como decrito por Bankova (2005b) e Trusheva et al. (2006), a maioria dos

constituintes da própolis vermelha brasileira tem atividade antimicrobiana e antioxidante,

independentemente da planta de origem.

Embora existam relatos atribuindo à própolis as mais variadas aplicações em

medicina popular e veterinária (Gacs et al., 1993, Heinze et al., 1998, Barros et al., 2007),

os estudos vêm corroborando que esta resina possui um grande potencial terapêutico em

relação às atividades anti-inflamatória, antimicrobiana, antineoplásica e antioxidante.

A capacidade da própolis em inibir o crescimento de micro-organismos é a

atividade farmacológica mais conhecida. A despeito de suas distintas composições,

amostras de própolis da Europa são muito similares em relação à atividade antimicrobiana

quando comparadas com amostras de própolis provenientes do Brasil (Popova et al., 2004,

Barros et al., 2007).

Ensaios de antibiose realizados por Antunes et al. (1996) com a própolis verde

frente a 10 cepas de bactérias gram-positivas e 20 de gram-negativas, comprovaram que a

atividade antibacteriana desta própolis é mais efetiva sobre as gram-positivas.


Atividade antiprotista foi observada por Castro e Higashi (1995), em camundongos

infectados com Trypanosoma cruzi. Além disso, a ação antibacteriana em culturas de

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e S. enteritides foi

demonstrada em várias pesquisas (Bankova et al., 1995, Serra; Escola, 1995, Mazzuco et

al., 1996, Park et al., 1998).

A inibição de crescimento de Helicobacter pylori foi observada por Ohsugi et al.

(1997), Hashimoto et al. (1998), Banskota et al. (2000) e Boyanova et al. (2005) e, em

concordância com estes trabalhos, a inibição de úlceras gástricas através da ingestão de

própolis, possivelmente está relacionada com a atividade anti-helicobacter, tendo em vista

que esta bactéria é reconhecidamente associada a úlceras.

Ensaios in vitro avaliando o efeito da própolis sobre a proliferação de vírus da gripe

de aves (Barros et al., 2007) resultaram na inibição destes vírus. Harish et al. (1997) e Park

et al. (2000) também descreveram atividade inibitória da própolis sobre a replicação do

vírus HIV-1 em culturas celulares de linfócitos T CD4.

A ação de vários tipos de própolis, exceto a vermelha, foi avaliada quanto à

capacidade de inibir o crescimento de isolados clínicos de Candida. Através dos resultados

a propriedade antifúngica foi constatada em todos os tipos de própolis testados,

destacando-se a ação da própolis verde (Sosa et al., 1997, Hegazi et al., 2000, Sforcin et

al., 2001, Chee, 2002, Cushnie; Lamb, 2005, Uzel et al., 2005).

Ota et al. (2001) avaliaram a atividade antifúngica da própolis verde em 80 isolados

do gênero Candida, como C. albicans, C. tropicalis, C. krusei e C. guilliermondii. As mais

sensíveis foram C. albicans seguida de C. tropicalis, C. krusei e C. guilliermondii. Os

pacientes avaliados que utilizavam próteses dentárias e foram submetidos ao uso de extrato

hidroalcoólico desta própolis apresentaram diminuição de colonização e doença por estas

leveduras.

Sawaya et al. (2002) compararam diversos métodos microbiológicos a fim de

determinar qual o mais sensível para testar a atividade do extrato de própolis produzido por

Apis mellifera, independente de sua origem botânica, contra espécies de Candida. Os

autores concluíram que o método de diluição em placas apresentou os resultados mais

expressivos devido à presença de composto ativo diferente, valorizando os métodos de

padronização a partir de análises cromatográficas.

Martins e colaboradores (2002) testaram a susceptibilidade de isolados de C.

albicans, obtidos de pacientes HIV positivos com candidíase oral, ao extrato alcoólico de

própolis verde e compararam à ação inibitória de antifúngicos comerciais como nistatina,


clotrimazol, econazol e fluconazol. Resultados significativos foram observados entre a

ação do extrato de própolis quando comparados ao fluconazol e nistatina. Este fato sugere

que o extrato de própolis pode ser um tratamento alternativo em casos de candidíase em

pacientes HIV positivos. Os autores ressaltaram a necessidade de estudos in vivo.

Leveduras isoladas de amostras clínicas de pacientes com micoses superficiais

foram testadas por Silici et al. (2005a) contra amostras de própolis coletadas de diferentes

regiões da Turquia por raças de abelhas diversas. Os resultados obtidos apresentaram que

C. albicans, C. glabrata, espécies de Trichosporon e Rhodotorula foram susceptíveis a

baixas concentrações de própolis, demonstrando alta susceptibilidade. A própolis coletada

por Apis mellifera caucasica apresentou ação antifúngica mais significativa.

Santos e colaboradores (2005) avaliaram a eficácia do extrato alcoólico de própolis

verde brasileira contra candidíase oral em 12 pacientes que faziam uso de prótese dentária,

comprovando sua ação antifúngica. Estes mesmos autores em 2008 testaram uma

formulação em gel a base de própolis verde em pacientes com estomatite dentária. Dos 30

pacientes com estomatite, 15 receberam higiene diária com miconazol gel e 15 receberam

tratamento com própolis gel. Em ambos os tratamentos houve completa remissão do edema

e eritema, apresentando eficácia comparável.

Baseado nos experimentos in vivo realizados com camundongos por Hu et al.

(2005), tanto o extrato aquoso como o alcoólico de uma própolis chinesa, cuja origem

botânica era o Populus sp., exibiram significante efeito anti-inflamatório. Os mecanismos

para este efeito provavelmente envolvem a diminuição nos níveis de prostaglandinas e

óxido nítrico e a inibição da ativação e diferenciação de macrófagos mononucleares.

Oliveira et al. (2006) constataram o efeito fungistático da própolis da região de

Maringá na concentração de 5x102 mg/mL sobre espécies de Candida, Trichosporon e

Geotrichum isoladas de escamas ungueais de casos de onicomicoses, seguindo o protocolo

de referência M27-A do CLSI (2005). O efeito fungicida foi obtido na concentração de

20x102mg/mL com perfis de susceptibilidade diferentes entre as espécies das leveduras.

De acordo com os testes de susceptibilidade realizados por Fernandes et al. (2007),

um isolado padrão de Cryptococcus neoformans foi inibido por extrato alcoólico de

própolis verde em concentrações de 0,2 mg/mL e 1,6 mg/mL, consideradas fungicidas.

Aslan e colaboradores (2007) realizaram estudo para investigar os efeitos da

própolis de origem turca na colite experimental. Após indução de colite distal, os animais

foram tratados com própolis via lavagem intragástrica (600mg/kg). A maioria dos animais


tratados apenas com a própolis apresentou histologia normal com redução da reação

inflamatória.

Siqueira et al. (2009), ao testar a atividade antifúngica in vitro de própolis verde e

vermelha contra diferentes espécies de Trichophyton, referiram que o extrato alcoólico da

própolis vermelha apresentou-se mais eficiente que o da própolis verde. O potencial

antifúngico do extrato alcoólico da própolis vermelha foi apresentado como alternativa

para o tratamento das dermatofitoses causadas por espécies de Trichophyton.

Dalben-Dota e colaboradores (2010) avaliaram a atividade antifúngica in vitro de

extrato de própolis comercial frente à C. albicans e não-albicans isoladas de secreção

vaginal, em comparação à nistatina. Todas as leveduras foram inibidas por baixas

concentrações de própolis, inclusive um isolado resistente a nistatina, representando uma

nova alternativa terapêutica nos casos de candidíase vulvovaginal.

Ledón et al. (2002) avaliaram o potencial alergênico de extrato de própolis

vermelha de Cuba e os animais testados não apresentaram irritação dermatológica no teste

de toxicidade dérmica e ocular, porém o teste de alergia de contato mostrou resposta

moderada (presença de eritema, porém não apresentaram edemas ou outras reações

alérgicas). Em humanos as reações alérgicas causadas pela própolis de Cuba foram muito

baixas (De Campos et al., 1998).

De acordo com Santos e Cruz (2001), quando associados a agentes

quimioterápicos, os antioxidantes presentes na própolis minimizam a toxicidade causada

pelas drogas quando interagindo com radicais livres.

Dessa maneira, a expansão da indústria de própolis vermelha só será possível, de

forma segura, com a padronização da matéria-prima e dos produtos acabados, levando-se

em conta a diversidade da vegetação regional, a atividade de coleta das diferentes

variedades de abelhas e com o estabelecimento da eficácia e segurança dos produtos

obtidos. A proposta atual de alguns grupos de pesquisa é fracionar a própolis vermelha

para isolar os marcadores e assim, através de cálculos matemáticos, tipificá-la. A

descoberta de outros compostos com atividades biológicas variadas incluirá a própolis

vermelha na tipificação, viabilizando a proposta de novos medicamentos com risco

reduzido ao paciente, através de um rígido controle de qualidade e pesquisa aplicada

(Lustosa et al., 2008).


3. ESOFAGITE POR CANDIDA GLABRATA: NOVOS CASOS RELATADOS E

CONDUTA TERAPÊUTICA 1

1 Artigo publicado: Macêdo, D.P.C., Silva, V.K.A., Farias, A.M.A., Melo, L.R.B., Wilheim, A.B., Neves, R.P. 2008. Candida glabrata esophagitis: new case reports and management. Brazilian Journal of Microbiology, 39: 279-281.


RESUMO

Esofagite por Candida (CE) é uma infecção oportunista comum em hospedeiros

imunossuprimidos. C. glabrata é raramente citada como agente de CE e tem sido

subestimada devido à falta de identificação adequada. No presente estudo, dois casos de

esofagite por C. glabrata em pacientes com AIDS e doença de Chagas são relatados. O

diagnóstico de espécies de Candida deve ser considerado como requisito para a escolha da

terapia antifúngica ideal contra esta micose.

Palavras-chave: Candida glabrata, esofagite, AIDS, doença de Chagas.


Esofagite por Candida (CE) é uma infecção oportunista comum nos pacientes

imunossuprimidos. Acredita-se que esta micose também ocorra em pacientes debilitados

que receberam antibióticos de amplo espectro, corticóides e imunossupressores (Laine;

Boncini, 1994, Wilcox; Karowe, 1994, Weerasuriya; Snape, 2006).

Espécies de Candida são organismos comensais do trato gastrointestinal. Elas

colonizam o esôfago em aproximadamente 20% dos adultos saudáveis. C. albicans é o

micro-organismo considerado o mais comum e virulento nos casos de CE. Outras espécies,

incluindo C. tropicalis, C. krusei e C. stellatoidea, também já foram isoladas (Simon et al.,

1997). C. glabrata atualmente ocupa o segundo ou terceiro lugar como agente causador de

infecções superficiais (oral, esofágica, vaginal, urinária) ou sistêmicas, as quais são muitas

vezes de origem nosocomial (Neves et al., 2002). Esta espécie é raramente citada como

agente de CE e tem sido subestimada devido à falta de identificação adequada (Fidel et al.,

1999, Martinez et al., 2002, Tran et al., 2003).

Vários distúrbios endócrinos e condições clínicas tem sido associadas com CE

como a obstrução funcional ou mecânica do esôfago acompanhada de estase e crescimento

excessivo da levedura (Wilcox; Karowe, 1994, Yee; Wall, 1994). Este trabalho relata dois

casos de esofagite causada por C. glabrata em pacientes imunossuprimidos, diagnosticados

no Hospital Oswaldo Cruz, em Recife, Pernambuco, Brasil. O primeiro caso foi um

paciente do sexo masculino com 46 anos de idade, infectados pelo HIV, que apresentou

disfagia e regurgitação acompanhada de perda de peso. Ele não estava fazendo uso de

medicamentos anti-retrovirais e exibia graves déficits imunológicos. O segundo caso foi

uma mulher com 82 anos, portadora da doença de Chagas, que se apresentou com disfagia

tanto a sólidos como a líquidos, durante os últimos dois anos. A regurgitação ocasional

com aspiração e odinofagia intermitente foram os sintomas associados. Houve também

queixa de febre, dor torácica e perda significativa de peso no ano anterior ao exame

endoscópico. Ambos os pacientes não obtiveram resposta terapêutica eficaz através de

tratamento profilático com fluconazol e foram examinados quanto ao agente causador da

infecção.

CE foi diagnosticada quando placas características de colônias Candida foram

identificadas a endoscopia (esôfago-gastro-duodenoscopia) (Fig. 1A). Os pacientes foram

submetidos a endoscopia do trato digestivo e amostras de fragmentos da mucosa esofágica

foram coletadas com instrumento especial em condição estéril, e em seguida processadas

no Laboratório de Micologia Médica (Departamento de Micologia, Universidade Federal

de Pernambuco) para a confirmação micológica do agente etiológico.


As amostras foram clarificadas com hidróxido de potássio (KOH) a 20% para

ajudar a dissolver os resíduos, facilitando a observação através da microscopia direta de

elementos fúngicos. Para a cultura, os espécimes foram inoculados em meio Ágar

Sabouraud Dextrose (SDA) (Difco) acrescido de cloranfenicol (50mg/L) contido em placas

de Petri e incubados a 28ºC por 72 horas sendo a identificação realizada com base em suas

características morfofisiológicas e exames bioquímicos, como auxanograma, zimograma e

produção de ácido e urease, de acordo com Barnett et al. (2000) e De Hoog et

al. (2000). A identificação foi confirmada pelo método automatizado do VITEK 120

(bioMérieux).

O exame direto das amostras apresentou blastoconídeos hialinos, isolados e de

dimensões menores que a maioria da estruturas de leveduras (1 a 4 mm) (Figura 1B). À

cultura produziram colônias de coloração creme e textura lisa, características relativamente

indistinguíveis de outras espécies de Candida, com exceção do tamanho celular reduzido.

De fato, C. glabrata é a única espécie de Candida que não forma pseudomicélio em

temperaturas acima de 37ºC (Fidel et al., 1999). Glicose, trealose e sulfato de amônio

foram assimilados como fontes de carbono e nitrogênio, e a fermentação destes açúcares

foi observada, apesar de não ter ocorrido produção de ácido e urease.

As reações bioquímicas de C. glabrata também são bastante distintas. Em contraste

com C. albicans, a qual fermenta e/ou assimila uma série de açúcares, C. glabrata

fermenta e assimila apenas glicose e trealose. De fato, entre as espécies de levedura mais

comumente isoladas em um laboratório de micologia clínica, C. glabrata é a única que

utiliza a trealose, mas não sacarose (Kreger-Van Rij, 1984).

Esofagite por C. glabrata grau II de Wilcox (Wilcox; Karowe, 1994) foi

diagnosticada em ambos os casos pela presença de achados endoscópicos característicos,

tais como placas esbranquiçadas e exsudato (Fig. 1A), e pela confirmação micológica das

espécies envolvidas.

Até recentemente, C. glabrata foi considerada um fungo comensal relativamente

não patogênico presente na mucosa humana. No entanto, com o aumento do uso dos

agentes imunossupressores, o número de infecções de mucosa e sistêmicas causadas por

este fungo tem aumentado significativamente, especialmente na população infectada pelo

HIV. Um importante desafio nestas infecções é a sua resistência inata à terapia

antimicótica com azólicos, a qual é bastante eficaz no tratamento de infecções causadas por

outras espécies de Candida (Laine; Boncini, 1994, Wilcox, et al., 1996).


As formas digestivas da doença de Chagas são as dilatações que ocorrem ao longo

do trato digestivo prejudicando o trânsito normal ou até mesmo impedindo-o

completamente. Embora o desenvolvimento da candidíase no esôfago obstruído seja

incomum, algumas revisões de literatura e relatos de casos raros sugerem tal associação.

Este relato reforça o fato de que a estase de longa duração no esôfago pode levar a

infecções oportunistas secundárias como a esofagite (Crema et al., 2002). Segundo

Praveen et al. (2007), em aproximadamente 25% dos casos de doenças de base que

conduzam à estase, como por exemplo o megaesôfago, ocorre aumento de colonização

fúngica.

Baseado em Westwater et al. (2007), cepas de C. glabrata colonizam o trato

digestivo e penetram no estrato queratinizado do tecido gástrico diferindo, contudo, de C.

albicans. Segundo estes autores esta levedura é considerada incapaz de infectar o tecido

oroesofágico. Este comportamento pode explicar a capacidade de C. glabrata em persistir

nos tecidos infectados e sobreviver como um comensal do aparelho digestivo.

Em resumo, ambos os casos de CE por C. glabrata desenvolveram resistência ao

fluconazol. Assim, esta espécie emergente pode estar sendo subestimada devido à falta de

uma correta identificação podendo ser isolada mais facilmente devido, em parte, ao

impacto da terapia com fluconazol sobre a ecologia das espécies de leveduras orais

(Martinez et al., 2002, Yakoob et al., 2003). A associação do megaesôfago com a esofagite

por Candida é rara e um diagnóstico precoce é indispensável para o tratamento adequado

de ambas as enfermidades e para prevenção do risco de metaplasia. Endoscopia com

amostragem para avaliação microbiológica foi, no entanto, a maneira conclusiva para

estabelecer o diagnóstico (Wilcox et al., 1996, Crema et al., 2002).

Estes resultados sugerem que esofagite por C. glabrata pode estar relacionada à

pacientes imunossuprimidos, especialmente com doenças crônicas, previamente tratados

com antibióticos, corticosteróides ou omeprazol (Martinez et al., 2000). O diagnóstico das

espécies de Candida deve ser considerado um importante procedimento para a escolha de

antifúngicos ideais ao tratamento desta micose.


Figura 1. Aparência endoscópica da esofagite por Candida glabrata grau II de Wilcox (A),

apresentando placas brancas e exsudato característicos de esofagite por Candida e exame

direto da lesão, clarificado com solução de hidróxido de potássio a 20% exibindo

numerosos blastoconídeos (B).


4. ESOFAGITE CAUSADA POR CANDIDA GUILLIERMONDII NO DIABETES

MELLITUS: PRIMEIRO CASO RELATADO 2

2 Artigo publicado: Macêdo, D.P.C., Oliveira, N.T., Farias, A.M.A., Silva, V.K., Wilheim, A.B., Couto, F.M., Neves, R.P. 2010. Esophagitis caused by Candida guilliermondii in diabetes mellitus: first reported case. Medical Mycology, 48(6): 862-865.


Resumo

Pacientes diabéticos estão mais vulneráveis a adquirir infecções do esôfago como aquelas

causadas por membros do gênero Candida. Neste trabalho foi descrito um caso de

isolamento de C. guilliermondii a partir da mucosa do esôfago de um paciente com

diabetes mellitus não controlada. Devido à identificação inadequada e imprecisa, o

surgimento de espécies não-C. albicans como patógenos potenciais tem sido subestimado.

Este deve ser um motivo de preocupação, uma vez que C. guilliermondii é um

componente da microbiota humana. A identidade do isolado foi confirmada por suas

características morfofisiológicas e pela amplificação de rDNA utilizando oligonucleotídeos

espécie-específicos. Tratamento com fluconazol não produziu melhora dos sintomas do

esôfago sendo confirmada a resistência do agente etiológico através de testes in vitro. Este

é considerado o primeiro caso documentado de esofagite por C. guilliermondii em um

paciente com diabetes mellitus.

Palavras-chave: Esofagite, Candida guilliermondii, espécies emergentes, diabetes

mellitus.


Introdução

O trato gastrintestinal superior, incluindo o esôfago, estômago e intestino delgado,

abriga uma ampla variedade de agentes patogênicos em potencial (Lamps, 2008). Embora

ainda considerada por alguns autores uma doença incomum, esofagite por Candida (CE)

está sendo reconhecida devido ao aumento de freqüência em hospedeiros

imunossuprimidos, principalmente como resultado do uso de endoscopia digestiva alta

(Frokjaer et al., 2007). CE tem sido associada com condições que causam depressão

imunológica e vários distúrbios endócrinos, incluindo diabetes mellitus, hipotireoidismo,

hipoparatireoidismo e hipoadrenocorticismo (Phaosawasdi et al., 1986, Yee; Wall, 1994,

Lamps, 2008).

Curiosamente, pesquisas com pacientes diabéticos relacionadas à patologias

esofágicas se concentram especialmente em disfunções da motilidade, de acordo com

Kapoor et al. (2009), desconsiderando-se que pacientes diabéticos estão em maior risco

para uma série de outras doenças do esôfago. O aumento da incidência de refluxo

gastroesofágico, bem como infecções por Candida são exemplos de dois fatores

agravantes. Além disso, uma série de mudanças estruturais ocorrem no esôfago de

pacientes diabéticos (Frokjaer et al., 2007).

Tem sido observado um aumento na proporção de infecções do esôfago causadas

por espécies não-C. albicans. O surgimento de casos por espécies não-C. albicans é uma

grande preocupação uma vez que alguns desses micro-organismos, particularmente C.

glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C. tropicalis, podem ser altamente

resistentes às drogas antifúngicas comerciais (Antunes et al., 2004, Pasqualotto et al.,

2006a, Pasqualotto et al., 2006b, Macêdo et al., 2008). Por esta razão, uma identificação

rápida e confiável das leveduras ao nível de espécie é extremamente importante.

C. guilliermondii é um componente da microbiota normal humana não sendo

comumente citada como agente da CE, provavelmente devido à identificação inadequada

deste micro-organismo. Devido à sua baixa freqüência, as infecções causadas por esta

espécie são relativamente menos estudadas em comparação com aquelas causadas por

outras espécies de Candida (Pasqualotto et al., 2006a).


Relato de caso

A paciente era uma mulher de 56 anos, diabética, que apresentou disfagia

acompanhada de perda de peso. A endoscopia foi realizada, após período de jejum de 12

horas, com um endoscópio EXERA 1600 (Olympus Corp, Lake Success, NY) que tinha

sido desinfectado com uma solução de glutaraldeído a 2,6%. Após a observação direta de

placas esbranquiçadas e exsudatos na mucosa do esôfago (Fig. 1A), foram coletados

fragmentos das lesões com pinça Medglobe® sob condições assépticas. As amostras foram

posteriormente imersas em água destilada esterilizada contendo cloranfenicol (50 mg/L) e

processadas para diagnóstico micológico no Laboratório de Micologia Médica

(Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco).

Uma parte dessa amostra clínica foi tratada com hidróxido de potássio (KOH) a

20% para facilitar a observação da morfologia dos elementos fúngicos através da

microscopia direta. Além disso, a outra parte das amostras foi inoculada em meio Ágar

Sabouraud Dextrose (SDA, Difco) com cloranfenicol (50 mg/L) contido em placas de Petri

e incubados a 30°C e 37°C por 15 dias. A identificação da levedura isolada foi conduzida

de acordo com Barnett et al. (2000) e De Hoog et al. (2000) baseado nas características

morfofisiológicas, nos resultados dos testes bioquímicos (método clássico), VITEK 120-

bioMérieux (método automatizado) e dados da biologia molecular (PCR com primer

espécie-específico) (Mannarelli; Kurtzman, 1998). O teste de susceptibilidade ao

fluconazol foi realizado utilizando o método de microdiluição em caldo descrito pelo

Clinical Laboratory Standards Institute (2008).

Exame microscópico direto com KOH revelou células de leveduras hialinas

isoladas e em brotamento, esféricas a elipsoidais. Colônia cremosa de coloração branca a

creme e formação de pseudomicélio a partir de um conjunto de células em brotação (Figura

1B) foram observadas na cultura e sua microscopia. As características morfofisiológicas e

o VITEK 120, identificaram C. guilliermondii.

A reação de PCR, utilizando oligonucleotídeos espécie-específicos a partir do

rDNA genômico (forward GCCTTGCCTTCGTGGCGGGGTGA e reverse

GGGATCATTATGCCAGCATCCTTGAT) gerou um fragmento de aproximadamente

175bp.

Embora poucos métodos diferenciem C. guilliermondii de C. famata e C. fermentati

(Vaughan-Martini et al., 2005), estas espécies podem ser distinguidas com base em seus

perfis fisiológicos como indicado na Tabela 1.


Esofagite por C. guilliermondii grau II de Wilcox (Wilcox e Karowe, 1994) foi

diagnosticada e nenhuma outra espécie de Candida foi isolada em cultura. O paciente foi

tratado com fluconazol oral em doses de 150 mg/dia durante 14 dias sem melhora dos

sintomas esofágicos. A resistência do isolado a este antifúngico foi confirmada através do

teste de susceptibilidade in vitro, com concentração inibitória mínima (MIC) de 64 µg/mL.

A tentativa para uso de outras opções terapêuticas não foi possível porque a paciente não

retornou ao serviço de saúde.

Discussão

Infecções orais causadas por C. guilliermondii tem sido descritas em pacientes

diabéticos (Dorko et al., 2005), e naqueles com estomatite pelo uso de próteses dentárias

(Dorko et al., 2001). Em um relato, um paciente imunocompetente apresentou abcesso

dento-alveolar em que C. guilliermondii foi considerado um co-patógeno, juntamente com

duas bactérias orais (McManners; Samaranayake, 1990). Colonização oral também foi

descrita em indivíduos saudáveis (Rasool et al., 2005), pacientes com câncer (Tekeli et al.,

2002), bem como aqueles tratados com corticosteróides inalatórios (Komiyama et al.,

2004).

Esofagite por C. guilliermondii não é considerada comum (Tacconelli et al., 2002,

Melo et al., 2004) como verificada durante estudo brasileiro multicêntrico o qual avaliou

130 pacientes com AIDS e CE (Sant’ana et al., 2002). Neste contexto, diversos casos já

foram relatados por Takasawa et al. (2007) e outros pesquisadores em que diabetes era o

único fator predisponente para o desenvolvimento de CE (Underwood et al., 2003, Goto et

al., 2007, Lamps, 2008), embora nenhum desses casos tenha sido causado por C.

guilliermondii.

O presente relato destaca C. guilliermondii como um agente etiológico emergente e

recém-descrito de CE associado com diabetes mellitus não controlada. O paciente não

respondeu à terapia com fluconazol, provavelmente porque a levedura foi resistente a este

antifúngico. Isolados desta espécie são freqüentemente referidos por apresentarem

concentrações inibitórias mínimas maiores aos antifúngicos, incluindo o fluconazol. Esta

pode ter sido a causa da falha terapêutica com nossa paciente, e em outras situações pode

estar relacionado ao desenvolvimento de neoplasias ou até mesmo óbito (Arendrup et al.,

2002, Pappas et al., 2004, Domingues-Ferreira et al., 2009).


Segundo alguns autores, o método padrão para cultura e diferenciação das espécies

de Candida são demorados e podem não estabelecer distinção entre as espécies não-C.

albicans e, por estas razões o diagnóstico por técnicas moleculares pode ser

particularmente útil em laboratórios clínicos (Mannarelli; Kurtzman, 1998, Vaughan-

Martini et al., 2005, Rocha et al., 2008). No entanto, procedimentos taxonômicos

convencionais de fermentação e assimilação foram capazes de distinguir positivamente C.

guilliermondii, C. famata e C. fermentati.

O surgimento de espécies de Candida como agentes de esofagite ressalta a

importância do diagnóstico laboratorial micológico e estudos epidemiológicos para o

controle desta micose, especialmente nos pacientes imunossuprimidos.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. David Bousfield pela revisão deste artigo e à Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.

Declaração de interesse: Nenhum.


Fig. 1 Aspecto endoscópico de esofagite por Candida guilliermondii grau II de Wilcox

(A), exibindo placas brancas e exame microscópico do agente apresentando numerosos

blastoconídeos ( ) e pseucomicélio ( ) (B).


Tabela 1. Perfil fisiológico distinguindo C. guilliermondii de C. famata e C. fermentati.

Reações fisiológicas Fontes Espécies de leveduras

Candida guilliermondii C. fermentati C. famata F G F G F G

D-Galactose + + + + - +

L-Sorbose 0 + 0 + 0 -

Maltose + + + + - -

Sacarose + + + + - +

Celobiose + + - + - -

α, α -Trealose + + + + - +

Melibiose + + - + - -

Melicitose - + - + - -

Rafinose + + + + - +

Inulina + + + + - -

D-Xilose - + - + - +

L-Arabinose 0 + 0 + 0 -

D-Ribose 0 + 0 + 0 -

L-Rhamnose 0 + 0 - 0 -

Me α –D-glicosídeo + + - + - -

D-Glucosamina 0 + 0 + 0 -

Nitrito 0 + 0 - 0 +

Biotina & Tiamina 0 + 0 - 0 + F- Teste de fermentação; G- Perfil de crescimento; 0- Não realizado.


5. ESOFAGITE POR TRICHOSPORON INKIN: UMA DOENÇA RARA EM

PACIENTE COM CANCER DE PULMÃO3

3 Artigo publicado: Macêdo, D.P.C., Oliveira, N.T., Silva, V.K., Farias, A.M.A., Lima-Neto, R.G., Wilheim, A.B., Oliveira, P.C., Pedi, N., Andrade, S.L., Neves, R.P. 2011. Trichosporon inkin esophagitis: an uncommon disease in a patient with pulmonary cancer. Mycopathologia, 171(4), 279-283.


Resumo

Espécies de Trichosporon são conhecidas como patógenos oportunistas. Aqui, nós

apresentamos um caso de esofagite por T. inkin em mulher com 54 anos, com câncer de

pulmão e neutropenia grave nos quais o perfil de sensibilidade do isolado contra azóis e

polienos foi verificado. O paciente foi diagnosticado com esofagite grau de I Wilcox,

apresentando placas esbranquiçadas esparsas e exsudatos nos dois terços superiores do

esôfago. Terapia antifúngica com fluconazol oral (150 mg/dia durante 14 dias) foi ineficaz.

In vitro, o isolado apresentou sensibilidade a este medicamento e à anfotericina B. Uma

vez que T. inkin tem exibido importância crescente como agente de infecções invasivas em

pacientes imunossuprimidos, ressalta-se que o diagnóstico de esofagite por esta espécie

deve ser seguido por uma avaliação da sensibilidade antifúngica do isolado envolvido.

Palavras-chave: Trichosporon inkin, esofagite, imunocomprometidos, diagnóstico, perfil

antifúngico


Introdução

Esofagite é uma condição inflamatória, envolvendo irritação ou inchaço do esôfago,

que pode ser causada por uma grande variedade de micro-organismos, incluindo vírus,

bactérias, fungos e outros parasitas (Lamps, 2008).

Os casos de esofagite fúngica são freqüentemente relatados em pacientes que

sofrem de doença neoplásica, que estão fazendo uso de antibioticoterapia prolongada, ou

que tenham diabetes mellitus, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), dentre

outras condições (Underwood et al., 2003, Manfredi et al., 2007, Traeder et al., 2008,

Macêdo et al., 2010).

Infecções fúngicas esofágicas geralmente se apresentam com odinofagia, disfagia e

muitas vezes são parte de um processo disseminado da doença. Quando causada por

espécies de leveduras, a infecção se apresenta como placas brancas que, dependendo do

grau do dano, pode ser removida revelando uma mucosa ulcerada abaixo (Wilcox; Karowe,

1994, Lamps, 2008).

Embora as espécies de Candida sejam consideradas os micro-organismos

causadores de esofagite mais comuns, outras leveduras também podem ocorrer, tais como

as representantes do gêneros Trichosporon, um fungo basidiomiceto isolado do solo,

vegetais, mamíferos, aves e também considerado como um membro da microbiota normal

da boca, unhas e pele. Estes micro-organismos têm sido citados como agentes de infecções

superficiais e profundas em humanos (Lacroix; Chauvin, 2005, Koyanagi et al., 2006,

Carvalho et al., 2008).

Esofagite por Trichosporon é considerada rara, tendo sido relatada infecções neste

sítio corpóreo somente por T. asahii (Lo Passo et al., 2001) e T. cutaneum (anteriormente

considerada T. beigelii) (Gueho et al., 1994). O objetivo deste trabalho é descrever um

caso incomum de esofagite por T. inkin.

Relato de Caso

A paciente era uma mulher de 54 anos de idade, hipertensa, diabética que se

apresentou com queixas de tosse, dispnéia e estado geral precário por aproximadamente 2

meses. Ela foi diagnosticada através de exame histopatológico com carcinoma pulmonar

diferenciado, ulcerando e invadindo a mucosa brônquica, no lobo médio direito. A paciente

foi tratada com ciclos de quimioterapia resultando em sintomas posteriores como disfagia


acompanhada de perda de peso. A avaliação do trato gastrointestinal superior foi feita

utilizando um endoscópio (EXERA 1600 Olympus Corp, Lake Success, NY), previamente

desinfectado com solução de glutaraldeído a 2,6%. Anestesia tópica da faringe (xilocaína

2% spray) foi utilizada para evitar refluxo no ato do exame.

Fragmentos de tecido foram coletados das lesões com pinça (Medglobe®), em

condições estéreis e as amostras foram analisadas, bem como a solução desinfetante de

glutaraldeído. As amostras foram então colocadas em água destilada esterilizada contendo

cloranfenicol (50 mg/L) e enviadas para o Laboratório de Micologia Médica da

Universidade Federal de Pernambuco/Brasil para diagnóstico microbiológico, identificação

definitiva e teste de susceptibilidade.

Materiais e Métodos

Isolamento do agente etiológico

Para exame micológico, os espécimes clínicos foram clarificados com solução de

hidróxido de potássio (KOH) a 20% e observados ao microscópio. Para a solução de

glutaraldeído, microscopia direta foi realizada sem clarificante. Simultaneamente, as

amostras clínicas e a solução desinfetante foram inoculadas/semeadas em meio Sabouraud

Dextrose Ágar (Difco) com cloranfenicol (50 mg/L) e incubadas a 30 e 37ºC por 10 dias.

Caracterização fenotípica e molecular do fungo

Culturas puras foram identificadas com base em suas características morfo-

fisiológicas, fermentação de carbohidratos e auxanograma, crescimento em fontes de

nitrogênio, crescimento em temperaturas variadas e na capacidade de hidrolisar uréia

(Barnett et al., 2000, De Hoog et al., 2000), VITEK 120-bioMérieux (método

automatizado) e nas características da biologia molecular das regiões ITS do DNA

ribossomal as quais foram amplificadas com os primers ITS-1 (5’-TCCGTA GGTGAA

CCTGCG-3’) e ITS-4 (5’- CCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (Diaz e Fell, 2004).

Os testes de suscetibilidade foram avaliados para fluconazol (Pfizer Incorporated,

Nova York, NY) com intervalos de concentração de 0,125-64µg/mL e anfotericina B

(Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO) de 0,03-16 µg/mL. Os testes foram

realizados utilizando método de microdiluição em caldo de acordo com o documento M27-

A3 (CLSI, 2008). As cepas controle de C. krusei (ATCC 6528) e C. parapsilosis (ATCC

22019) também foram incluídas. A concentração inibitória mínima (MIC) para fluconazol


foi considerada a menor concentração da droga causando uma redução de

aproximadamente 50% no crescimento, e para a anfotericina B foi considerada a menor

concentração de droga testada capaz de evitar qualquer crescimento visível (CLSI, 2008).

Resultados

O paciente foi diagnosticado como tendo esofagite grau I de Wilcox, apresentando

placas esbranquiçadas espassas e exsudato nos 2/3 superiores da mucosa do esôfago sem

disseminação aparente da infecção ao longo do trato gastrointestinal (Fig. 1a). A

preparação do tecido do esôfago com KOH apresentou células com brotamentos e hifas

com artroconídios desarticulados (Fig. 1b). A cultura das amostras de tecido exibiram

colônias de coloração branca a creme e relevo cerebriforme após 48 h de incubação (Fig.

1c) apresentando, na análise microscópica do agente, cadeias de artroconídios cilíndricos

(Fig. 1d).

A assimilação de fontes de carbono pela cepa diferenciou-a de outras espécies

fenotipicamente semelhantes como T. asahii e T. mucoides. No entanto, o isolado não foi

capaz de realizar fermentação. A PCR utilizando os iniciadores ITS1 e ITS4 gerou

fragmentos de aproximadamente 530 pb. Os resultados bioquímicos, identificação pelo

sistema VITEK 120-bioMérieux (99% de especificidade) e biologia molecular

confirmaram T. inkin como agente etiológico.

O paciente foi tratado com fluconazol oral em doses de 150 mg/dia por 14 dias e

não revelou melhora dos sintomas esofágicos. A resistência a esta droga não foi

confirmada após o teste de susceptibilidade, uma vez que o MIC foi 8 µg/mL para

fluconazol. Por outro lado, T. inkin foi sensível à anfotericina B na concentração de 0,125

µg/mL. As amostras de glutaraldeído analisadas não apresentaram crescimento de

quaisquer micro-organismos.

Discussão

Este caso demonstra a capacidade de T. inkin em invadir a mucosa e causar

esofagite infecciosa grau I de Wilcox. Wilcox e Karowe (1994) destacaram o valor

diagnóstico da endoscopia e da identificação do agente etiológico a partir de biópsia.

Infecções por Trichosporon são incomuns na esofagite (Gueho et al., 1994, Lo

Passo et al., 2001), e não há nenhuma citação de dano à mucosa esofágica causada pelo T.


inkin. Por outro lado, esta espécie tem sido isolada como agente de piedra branca

(Madariaga et al., 2003), pneumonia (Wynne et al., 2004), abscesso pulmonar (Piwoz et

al., 2000), infecção por cateter contaminado (Moretti-Branchini et al., 2001), endocardite

(Chaumentin et al., 1996, Ramos et al., 2004), peritonite (Lopes et al., 1997, Crowther et

al., 2003, Madariaga et al., 2003), nódulos cutâneos (Song et al., 2007, David et al., 2008),

e durante diagnóstico post mortem (Koyanagi et al., 2006). De acordo com o exame

endoscópico, esofagite por Trichosporon não pode ser clinicamente diferenciada daquela

causada por espécies de Candida.

Fatores de risco para trichosporonosis incluem imunossupressão, rompimento da

integridade da mucosa, uso de cateter venoso central e outras condições, tais como

malignidade hematológica, AIDS, transplantados, pacientes queimados, prematuros de

baixo peso e pacientes neutropênicos com câncer que recebem tratamentos citotóxicos

(Girmenia et al., 2005, Lacroix; Chauvin, 2005). No entanto, até o momento não há

qualquer citação de T. inkin causando esofagite em pacientes com câncer de pulmão.

O dano esofágico é uma condição localizada, embora possa resultar de uma causa

secundária. Segundo Ramos et al. (2004) e Song et al. (2007), a via de infecção por

Trichosporon provavelmente começa com a colonização da superfície da mucosa e quebra

de sua integridade, risco mais comum durante os ciclos de quimioterapia. No caso descrito,

o procedimento de desinfecção utilizado à endoscopia foi considerado totalmente seguro.

Considerando-se que as amostras de glutaraldeído estavam isentas de contaminantes, a

esofagite por T. inkin deve ter sido causada após infecção por outra via.

As opções terapêuticas para essa micose incluem fluconazol, ravuconazol,

posaconazol, voriconazol e anfotericina B (Chaumentin et al., 1996, Matsue et al., 2006,

Bayramoglu et al., 2008). Embora voriconazol possa ser considerada uma opção em

infecções por Trichosporon, a introdução deste medicamento no esquema terapêutico foi

difícil, devido à indisponibilidade deste antifúngico no hospital, e por esta razão, o perfil

de susceptibilidade in vitro para voriconazol não foi realizado. O uso de triazóis para casos

de tricosporonose tem sido considerado por alguns autores como satisfatório (Asada et al.,

1996); contudo, o caso descrito mostrou-se insensível ao fluconazol (150 mg/dia por 14

dias). A anfotericina B não representou a opção terapêutica naquele momento devido à

condição geral de saúde do paciente. Ademais, o tratamento ideal para tricosporonose é

atualmente incerto e a taxa de mortalidade ainda é bastante elevada (80-90%) nos casos de

infecção dissemidada (Koyanagi et al., 2006).


A maioria das cepas de T. inkin são suscetíveis in vitro a polienos e azólicos. No

entanto, os resultados dos testes de susceptibilidade não garantem a mesma resposta in vivo

a estes compostos, e os fatores predisponentes do hospedeiro podem ter maior impacto

sobre a infecção do que os resultados de susceptibilidade como citado por Ramos et al.

(2004) e verificado por este caso. O paciente não retornou ao hospital após falha do

tratamento para um maior acompanhamento.


Fig 1. Aparência endoscópica de esofagite grau I de Wilcox (a) e numerosos artroconídios

(indicados) ao exame direto (b). Aspectos macroscópico (c) e microscópico (d) de

Trichosporon inkin em ágar fubá (X 400).


6. IDENTIFICAÇÃO DO DNA DE ESPÉCIES DE CANDIDA DA MUCOSA

ORAL E ESOFÁGICA: FATORES DE RISCO E SUA RELAÇÃO

MOLECULAR COM A PATOGÊNESE DA ESOFAGITE4

4 Artigo submetido: Macêdo, D.P.C., Oliveira, N.T., Farias, A.M.A., Chang, S.C., Wilheim, A.B., Neves, R.P. DNA fingerprinting of Candida species from oral and esophageal mucosa: risk factors and molecular relation with esophagitis pathogenesis. Fungal Genetics and Biology, Maio de 2011.


Resumo

Candida é um dos micro-organismos que mais frequentemente causam infecções em

pacientes imunossuprimidos. Os objetivos deste estudo foram avaliar a candidíase oral

(CO) e esofágica (CE), os fatores de risco associados a estas micoses e determinar a

correlação molecular entre leveduras colonizadoras e patogênicas. Um total de 1.482

pacientes com sintomas gastrointestinais foi examinado. Destes pacientes, 41 apresentaram

lesões sugestivas de CE durante a endoscopia. Amostras da mucosa oral e do esôfago

foram obtidas e cultivadas em Sabouraud dextrose ágar. A identificação foi realizada por

métodos clássicos, automatizado e molecular. As espécies mais isoladas da mucosa oral e

esofágica foram C. albicans e C. glabrata. O polimorfismo inter e intraespecífico dos

isolados de Candida foi avaliado por meio da amplificação do DNA genômico pelo

método de PCR que utilizou um primer derivado de regiões dos espaços intergênicos

(T3B), e primers microssatélites (GTG)5 e (GACA)4. O primer (GACA)4 revelou

variabilidade inter e intraespecífica e nenhuma similaridade foi observada entre os isolados

orais e esofágicos, demonstrando a independência da patogênese entre CO e CE.

Palavras-chave: colonização oral, candidíase oral, candidíase esofágica, caracterização

molecular, fatores de risco


1. Introdução

Os seres humanos estão constantemente expostos a vários gêneros de fungos

através de diversas vias, permitindo a colonização do trato gastrointestinal. Dependendo da

interação entre os mecanismos de defesa do hospedeiro na mucosa, fatores de virulência

dos fungos e outros fatores de risco, a colonização pode ser transitória ou persistente

podendo causar doença localizada (Vazquez, 2010).

Entre os numerosos fungos patogênicos, o gênero Candida é o dominante

responsável por micoses em seres humanos. A espécie de levedura com maior prevalência

entre os isolados humanos é C. albicans, sendo esta considerada o principal patógeno

oportunista (Vazquez e Sobel, 2003), embora outras espécies, incluindo C. tropicalis, C.

glabrata, C. dubliniensis, C. parapsilosis, C. krusei e C. guilliermondii também tenham

sido isoladas (Tintelnot et al., 2000, Calderone, 2002, Macêdo et al., 2010).

A alta prevalência de colonização oral por Candida pode ser citada como um fator

predisponente para o desenvolvimento posterior da candidíase, incluindo a forma esofágica

(Katiraee et al., 2010). Conforme relatado, a candidíase de mucosa surge em indivíduos

colonizados por Candida que estão predispostos por doenças de base, medicamentos ou

pela redução da resistência local a um crescimento excessivo da sua própria microbiota

(Vazquez; Sobel, 2003, Vazquez, 2010).

O isolamento de espécies de Candida da mucosa oral saudável não exclui a

possibilidade do paciente desenvolver lesões esofágicas por estes mesmos micro-

organismos. Por esta razão, os objetivos deste estudo foram avaliar a candidíase oral (CO)

e esofágica (CE), os fatores de risco associados e comparar geneticamente os isolados de

Candida utilizando primer derivado de espaços intergênicos (T3B), e primer de regiões

microssatélites (Inter Sequência Simples Repetida - ISSR).

2. Material e Métodos

2.1 Diagnóstico micológico e avaliação dos fatores de risco

Amostras de secreções orais foram coletadas com swab de algodão esterilizado a

partir das lesões ou da mucosa saudável de pacientes com sintomas sugestivos para

esofagite. Em seguida, a endoscopia foi realizada por médico gastroenterologista com

auxílio de endoscópio EXERA 1.600 (Olympus Corp, Lake Success, NY) após jejum do

paciente durante a noite anterior. Os fibroscópios foram desinfetados com uma solução de


glutaraldeído a 2,6%. Após a observação direta de placas esbranquiçadas e exsudato na

mucosa esofágica, foram coletados fragmentos das lesões com pinça Medglobe ® em

condições estéreis. Os fragmentos foram então imersos em água destilada esterilizada

contendo cloranfenicol (50mg/L) e processados no Laboratório de Micologia Médica

(Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco) para diagnóstico

micológico.

O exame direto de amostras de secreção oral foi realizado a fresco. Os fragmentos

de tecidos obtidos por biópsia foram clarificados com solução de hidróxido de potássio

(KOH) a 20% e analisados microscopicamente. Para a cultura, o meio utilizado foi

Sabouraud Dextrose Agar (SDA) (Difco) com cloranfenicol (50mg/L) contido em placas

de Petri, incubadas a 30°C e 37°C por até 15 dias. A identificação foi realizada de acordo

com Barnett et al. (2000) e De Hoog et al. (2000) com base nas características

morfofisiológicas da cultura, tais como auxanograma, zimograma, produção de ácido e

urease (método clássico), VITEK 120-bioMérieux (método automatizado) e pela biologia

molecular (Thanos et al, 1996, Mannarelli; Kurtzman, 1998).

Fatores de risco associados com o desenvolvimento das lesões orais e esofágicas

foram avaliados através dos dados contidos nos registros hospitalares, relacionando a

clínica com o uso de medicamentos e doenças prévias.

2.2 Relação molecular entre os isolados de Candida orais e esofágicos

A análise molecular foi desenvolvida apenas com os isolados de mesma espécie

obtidos da mucosa oral e esofágica do mesmo paciente.

2.2.1 Extração de DNA

Após a identificação das espécies pelo método clássico e automatizado, o DNA foi

extraído segundo o método de Gardes e Bruns (1993) no qual poucas colônias de leveduras

foram retiradas de uma placa com meio SDA e ressuspensas em 300 mL de tampão de

extração (composto por 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,4 M NaCl, 20 mM de EDTA,

brometo de cetiltrimetilamônio a 2% e b-mercaptoetanol a 2%). As células foram

enfraquecidas por três rodadas de congelamento e descongelamento, e esmagadas com um

micropistilo. Um volume de clorofórmio foi adicionado, e a mistura foi centrifugada a

13.000 g por 15 min. A fase superior foi removida, e o DNA foi precipitado com 600mL

de isopropanol frio. Após centrifugação por 10 min, o sedimento foi lavado com etanol a


70% e seco a 37ºC. O DNA isolado foi dissolvido em tampão TE e armazenado a 4ºC. A

concentração de DNA foi estimada por corrida em gel de agarose.

2.2.2 PCR fingerprinting

O DNA genômico dos 34 isolados de Candida (17 da cavidade bucal e 17 do

esôfago, ambos da mesma espécie) foram analisados e comparados.

Foram utilizados oligonucleotídeos como primers como as seqüências de repetição

simples (GTG)5 (Ali et al., 1986), (GACA)4 (Barros Lopes et al., 1996) e T3B (5'-AGG

TCG CGA CGG GTT ATC C) (McClelland et al., 1992), este último derivado dos espaços

intergênicos do tRNA (Thanos et al., 1996).

As reações de amplificação foram realizadas em volumes de 50 mL contendo de 1 a

25 ng do DNA molde, tampão de reação (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM KCl, 1,5 mM

MgCl2, 3 mM de acetato de magnésio), 200 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP

(Fermentas®) e 1,5 U de Taq DNA polimerase (Fermentas®). O primer T3B foi

adicionado a uma concentração final de 25 pmol/50 µL de mistura do teste. (GTG)5 e

(GACA)4 foram utilizados a 5 pmol/50 µL.

As amostras foram cobertas com óleo mineral esterilizado (Sigma) e amplificadas

em um termociclador como se segue: desnaturação inicial por 5 min a 95ºC; desnaturação

por 15 segundos a 95ºC, anelamento por 30 segundos a 50ºC para os primers (GTG)5 e

(GACA)4, 52ºC para o primer T3B e extensão de 1,20 min a 72ºC. Esta foi seguida por um

ciclo de extensão final de 6 min a 72ºC. Os tubos com as reações foram mantidos a 4ºC

antes da análise. 32 ciclos de amplificação foram utilizados para todos os primers. As

amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 1,2% em tampão TBE (pH

8,0) a 100V por 150 minutos e seus pesos moleculares foram determinados através de

marcador de 100pb (Invitrogen) e corados com brometo de etídio para fotografia. As

sequências de DNA foram analisadas quanto ao tamanho e comparadas.

3. Resultados

Os 1.482 pacientes examinados apresentavam sintomas gastrointestinais como

disfagia, náuseas e/ou vômitos, azia, odinofagia e dor abdominal. Destes, 41 apresentaram

lesões sugestivas de CE durante a endoscopia, tendo como fatores de risco o uso de

antibioticoterapia por período prolongado (17), infecção pelo HIV (13), diabetes mellitus

(2), doença hepática crônica (2), e o uso de corticosteróide (2). Casos isolados de


neoplasias, anemia crônica, lupus eritematoso sistêmico, doença de Chagas e cardiopatia

também foram verificados (Tabela 1).

Os exames diretos das amostras dos casos de CO e CE exibiram numerosas células

hialinas, esféricas a elipsoidais, com brotação e/ou pseudomicélio e micélio verdadeiro.

Culturas de coloração creme a branco e a presença de pseudomicélio à microscopia foram

observadas em alguns isolados.

A assimilação e fermentação de fontes carbono, a assimilação de fonte de

nitrogênio, bem como a não produção de ácido e urease identificaram os isolados como

Candida spp. Estes resultados foram semelhantes aos obtidos através do método

automatizado (VITEK 120) (Tabela 1).

Quanto às espécies de Candida isoladas da cavidade oral, C. albicans (74%) foi a

mais freqüente, seguida por C. glabrata (13,1%), C. parapsilosis (4,3%), C. tropicalis

(4,3%) e C. kefyr (4,3%). Apenas um paciente apresentou CO com presença de lesões em

placas esbranquiçadas aderidas à mucosa oral, causada por C. glabrata. Das lesões

esofágicas observadas à endoscopia pela presença de placas pseudomembranosas

esbranquiçadas aderidas à mucosa do órgão em diferents graus de acometimento, C.

albicans representou 83% dos agentes etiológicos, seguido por C. glabrata (7,4%) e por

outras espécies emergentes como C. parapsilosis (2,4%), C. tropicalis (2,4%), C. krusei

(2,4%) e C. guilliermondii (2,4%).

Os isolados que ocorreram no mesmo paciente, identificados como da mesma

espécie de Candida totalizaram 17 pares, sendo comparados por técnica padrão de

fingerprinting de DNA. As reações utilizando os primers (GTG)5 e T3B exibiram produtos

de amplificação semelhantes e reprodutíveis. No entanto, variações intraespecíficas

puderam ser melhor visualizadas com o primer (GACA)4, entre os pares 11 e 20 de C.

glabrata (Fig. 1). De forma semelhante, para os pares de C. albicans este mesmo marcador

foi mais sensível em destacar as variações intraespecíficas (Fig. 1). (GTG)5 e T3B não

distinguiram claramente essas cepas (Fig. 2 e 3).

4. Discussão

Do total de pacientes com sintomas sugestivos, 41 casos de CE foram confirmados.

A associação entre CE e CO foi verificada um apenas um paciente, nos demais casos

provavelmente ocorreu colonização oral por leveduras uma vez que havia um número

insignificante de estruturas fúngicas ao exame direto. De acordo com Vázquez e Sobel


(2003) e Vazquez (2010), espécies de Candida são freqüentemente isoladas da cavidade

oral, havendo aumento nas taxas de colonização devido à gravidade da doença e à

permanência hospitalar, conduzindo à doença fúngica neste sítio corpóreo.

O principal agente etiológico da CE foi C. albicans, responsável por 83% dos

casos. Até o momento, C. albicans continua sendo citado como o agente mais freqüente da

esofagite fúngica. Vários fatores contribuem para o estabelecimento da candidíase como o

uso prolongado de antibióticos de largo espectro e a Síndrome da Imunodeficiência

Adquirida (AIDS), como constatado com os pacientes avaliados nesta pesquisa. Estes

dados são importantes uma vez que esta doença ocorre em mais de 10% dos pacientes com

AIDS, debilitando ainda mais o estado geral destes indivíduos através da diminuição na

ingestão de alimentos com perda de peso associada (Vazquez, 2010).

Em um estudo recente com indivíduos infectados pelo HIV com candidíase

orofaríngea Katiraee et al. (2010) verificaram que C. albicans correspondeu a 50,2% dos

agentes e C. glabrata a 22%, enquanto as outras espécies não-C. albicans foram raramente

isoladas. Segundo estes autores, não houve diferença significativa no grau de colonização

oral e o desenvolvimento da candidíase orofaríngea entre pacientes que receberam

HAART e aqueles que não fizeram uso destas medicações, corroborando com os dados

apresentados nesta casuística.

Os casos de recidiva na CE representam causa de preocupação constante, uma vez

que o estabelecimento desta micose está diretamente relacionado com o grau de

imunossupressão dos indivíduos e às espécies de Candida envolvidas (Traeder et al.,

2008). Assim, o surgimento de diferentes espécies de Candida como agentes de esofagite

ressalta a importância do diagnóstico laboratorial micológico e de estudos epidemiológicos

para o controle desta micose. Neste trabalho, C. glabrata foi a segunda espécie mais

freqüente, considerada por alguns autores como emergente (Macêdo et al., 2008).

Com base nos resultados dos testes moleculares, a baixa capacidade de

discriminação dos iniciadores (GTG)5 e T3B foi constatada. Thanos et al. (1996)

verificaram distinção entre as espécies de Candida ao utilizarem o primer T3B em sua

pesquisa, correspondendo aos dados aqui apresentados, os quais revelaram apenas

semelhanças interespecíficas entre todos os isolados de C. albicans e C. glabrata. No

entanto, apesar dos padrões homogêneos obtidos pelos marcadores, (GACA)4 foi capaz de

demonstrar as diferenças entre os isolados, melhor distinguindo intraespecificamente as

cepas de Candida.


Neste estudo, os resultados obtidos com o uso do primer ISSR (GACA)4 indicam

que cepas de Candida isoladas da cavidade oral e das lesões da CE não são as mesmas,

embora ao isolamento mesmo paciente tenham sido identificadas como da mesma espécie.

Distâncias genéticas podem ser sugeridas através da técnica de DNA fingerprinting,

pois esta técnica seleciona seqüências aleatórias de polimorfismos distribuídos por todo o

genoma (Welsh; McClelland, 1990, Boerlin et al., 1996). A proximidade genética é

deduzida a partir do número de fragmentos amplificados que duas linhagens ou espécies

têm em comum, como ocorreu com os isolados de Candida testados. As diferenças

observadas nesta pesquisa entre os isolados de uma mesma espécie e de espécies distintas

pode justificar a variação do grau de dano tecidual e resistência antifúngica comprovada

durante os tratamentos.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES). Os autores gostariam de agradecer ao Departamento de Micologia da

Universidade Federal de Pernambuco pelas instalações e toda assistência.

Conflito de interesse

Os autores não relatam nenhum conflito de interesse neste trabalho.


Tabela 1. Espécies de Candida isoladas da mucosa oral e esofágica e fatores de risco

associados com a candidíase.

Número do paciente

Espécie de Candida presente na cavidade

oral

Espécie de Candida agente de esofagite

Fatores de risco

1 NG C. albicans uso de antibiótico 2 NG C. albicans uso de antibiótico

5* C. glabrata C. albicans diabetes mellitus 15 C. albicans C. albicans cardiopatia 16 NG C. albicans uso de antibiótico 17 NG C. parapsilosis uso de antibiótico 18 NG C. albicans AIDS 19 NG C. albicans AIDS 20 C. albicans C. albicans uso de antibiótico 21 C. albicans C. albicans AIDS 22 C. glabrata C. glabrata Doença de Chagas 23 C. albicans C. albicans AIDS 24 C. albicans C. albicans uso de antibiótico 25 C. albicans C. albicans AIDS 26 NG C. albicans uso de antibiótico 27 C. albicans C. albicans doença hepatica crônica 29 C. albicans C. albicans Anemia crônica 30 C. albicans C. tropicalis uso de antibiótico 31 C. albicans C. albicans AIDS 32 C. glabrata C. glabrata AIDS 33 C. albicans C. albicans AIDS 34 NG C. krusei AIDS 35 NG C. glabrata AIDS 36 C. albicans C. albicans AIDS 37 NG C. albicans Cancer no timo 38 C. albicans C. albicans uso de antibiótico 39 C. albicans C. guilliermondii diabetes mellitus 40 NG C. albicans uso de antibiótico 41 NG C. albicans uso de antibiótico 42 C. kefyr C. albicans AIDS 43 C. albicans C. albicans uso de antibiótico 44 C. tropicalis C. albicans uso de antibiótico 45 C. parapsilosis C. albicans uso de antibiótico 46 C. albicans C. albicans AIDS 47 C. albicans C. albicans uso de antibiótico 48 NG C. albicans uso de corticosteróides 49 NG C. albicans doença hepatica crônica 50 NG C. albicans uso de antibiótico 51 NG C. albicans lupus eritematoso

sistêmico 52 NG C. albicans uso de corticosteróides 53 NG C. albicans uso de antibiótico

*Caso de candidíase oral; NG: sem crescimento; AIDS: Síndrome da Imunodeficiência Adquirida


Figura 1. Perfil de amplificação dos isolados de Candida albicans e C. glabrata (22A-B,

32A-B) obtidos a partir da cavidade oral e esôfago com iniciador (GACA)4. Linha M:

marcador de 100pb. (A: isolados orais; B: isolados esofágicos)



32A-B) obtidos a partir da cavidade oral e esôfago com iniciador (GTG)5. Linha M:

marcador de 100pb. (A: isolados orais; B: isolados esofágicos)



32A-B) obtidos a partir da cavidade oral e esôfago com iniciador T3B. Linha M: marcador

de 100pb. (A: isolados orais; B: isolados esofágicos)


7. ATIVIDADE FUNGICIDA IN VITRO DA PRÓPOLIS VERMELHA

BRASILEIRA: UMA OPÇÃO TERAPÊUTICA CONTRA A CANDIDÍASE

ESOFÁGICA5

5 Artigo a ser submetido: Macêdo, D.P.C., Lima-Neto, R.G., Oliveira, P.C., Silva, V.K., Farias, A.M.A., Leal, A.F.G., Pacheco, E., Neves, R.P. In vitro antifungal activity of Brazilian red propolis: a therapeutic option against esophageal candidiasis. Letters in Applied Microbiology.


Resumo

Objetivos: A atividade in vitro das amostras de própolis vermelha (Pv) coletadas nas

margens de estuários da região Nordeste do Brasil foi avaliada contra isolados de Candida

spp. obtidos de pacientes com candidíase esofágica (CE).

Métodos e Resultados: A atividade antifúngica de Pv foi testada contra espécies de

Candida isoladas de pacientes com CE, utilizando o fluconazol (Flz) como controle. A

concentração inibitória mínima foi determinada seguindo o método de microdiluição

indicado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute. A concentração fungicida

mínima foi determinada pela ausência de crescimento em ágar Sabouraud dextrose. Os

dados obtidos mostraram que a atividade antifúngica de Pv variou de 32 a 512 µg/mL.

Conclusões: Este trabalho enfatiza a importância do potencial antifúngico de Pv frente a

espécies de Candida, como um tratamento alternativo contra CE, apesar de experimentos

in vivo serem essenciais para seu uso terapêutico no futuro.

Significado e impacto do estudo: Este estudo foi pioneiro quanto à avaliação das

propriedades antifúngicas da Pv frente a isolados de Candida agentes de CE. A atividade

antifúngica destes compostos naturais sugere um potencial aplicável para CE isoladamente

ou em combinação com Flz.

Palavras-chave: atividade antifúngica, própolis vermelha, Candida spp, susceptibilidade

antifúngica


Introdução

Candidíase esofágica (CE) tem ocorrido predominantemente em indivíduos

imunossuprimidos, como resultado de fatores predisponentes devido a vários distúrbios

endócrinos, neoplasias, uso de corticosteróides, antibioticoterapia prolongada, síndrome da

imunodeficiência adquirida (AIDS) e outras condições. Candida albicans ainda é o

principal agente causador desta micose, seguida por outras espécies emergentes como C.

parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, C. guilliermondii e C. krusei (Underwood et al.,

2003, Manfredi et al., 2007, Traeder et al., 2008, Cascio et al., 2010, Macêdo et al., 2010).

Atualmente, o fluconazol é considerado droga de escolha para o tratamento da CE

uma vez que pode ser absorvido em qualquer condição de pH gástrico, com efeitos

mínimos sobre a síntese de esteróides, além de ser considerado geralmente seguro e bem

tolerado (Darouiche, 1998, Rex et al., 2000, Vázquez, 2003, Wilheim et al., 2009). No

entanto, algumas cepas de Candida são resistentes a este azol (Redding et al., 1994,

Vazquez et al., 2010). Altas taxas de recorrência e persistência de fungos provocam uma

crescente preocupação entre os médicos sobre o aumento no número de casos de

candidíase refratários aos tratamentos padrões (Cowen; Steinbach, 2008).

Durante o desenvolvimento de estratégias terapêuticas alternativas para o

tratamento de CE, produtos naturais com propriedades antifúngicas têm sido bastante

explorados. Após estudos bioquímicos sobre a composição e atividade antimicrobiana da

própolis, vários novos tipos têm sido explorados e testados contra fungos patogênicos

(Kujumgiev et al., 1999, Gurgel et al., 2005, Santos et al., 2005).

Uma nova própolis vermelha do nordeste do Brasil produzida por abelhas Apis

mellifera a partir da coleta de exsudato resinoso de coloração vermelha de Dalbergia

ecastophyllum (L) Taub. tem sido citado pelas suas propriedades terapêuticas; contudo

informações científicas sobre a sua atividade antifúngica ainda é escassa (Trusheva et al.,

2006).

O objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades antifúngicas in vitro do extrato

de própolis vermelha frente a 41 isolados de Candida obtidos de pacientes diagnosticados

com CE.

Materiais e métodos

Isolados fúngicos

Quarenta e uma amostras de Candida spp. obtidas de pacientes com CE, atendidos

no setor de endoscopia digestiva do Hospital Universitário Oswaldo Cruz, foram


analisadas neste estudo. Dos pacientes com lesões fortemente sugestivas para a micose

foram coletados fragmentos de tecidos, colhidos por biópsia. As amostras clínicas foram

processadas no Laboratório de Micologia Médica da Universidade Federal de Pernambuco

(UFPE) para diagnóstico micológico, usando o método padrão (exame direto e isolamento

em cultura), automatizado (VITEK 120) e métodos moleculares complementares.

O exame direto foi realizado com solução de 20% de hidróxido de potássio (KOH).

As culturas foram preparadas em meio Sabouraud dextrose ágar (SDA) (Difco) acrescido

de cloranfenicol (50 mg/L) e incubadas a 30 e 35ºC, em uma atmosfera aeróbica durante

10 dias. Culturas puras foram transferidas para a superfície do meio SDA enriquecido com

extrato de levedura para identificação taxonômica (Barnett et al., 2000, De Hoog et al.,

2000). C. albicans (34), C. glabrata (3), C. parapsilosis (1), C. guilliermondii (1), C.

tropicalis (1) e C. krusei (1) foram os agentes etiológicos isolados dos casos de CE. C.

parapsilosis (ATCC 22019) e C. krusei (ATCC 6528) foram as cepas padrão utilizadas.

Atividade antifúngica

A metodologia utilizada seguiu as condições estabelecidas pelo documento em

M27-A3 (CLSI, 2008). O meio de cultura utilizado durante os experimentos foi RPMI

1640 (Sigma-Aldrich, EUA) com L-glutamina e sem bicarbonato de sódio, pH 7,0 ± 0,1,

com ácido morfolino-propanossulfônico (MOPS; 0,165 mol-1, Sigma-Aldrich). O meio foi

esterilizado por filtração, em membranas de 0,22 µm, (Millipore, Darmstadt, Alemanha).

A droga comercial utilizada para comparação foi fluconazol (Flz, Pfizer, New

York, EUA), preparada em água destilada. Foram utilizadas dez concentrações diferentes,

variando de 0,125-64 µg ml-1 para Flz. Própolis vermelha (Pv) (Apiário Apimel, João

Pessoa - Paraíba, Brasil) foi diluída em DMSO com concentrações testadas variando de 2-

1,024 µg ml-1.

Os isolados de Candida foram cultivados em meio SDA e incubados a 35ºC. As

suspensões destas leveduras foram preparadas e a densidade foi ajustada de acordo com a

escala padrão 0,5 de MacFarland, para a transmissão de 90% usando um

espectrofotômetro. O volume do inóculo foi ajustado para 5 ml de solução salina

esterilizada, sendo posteriormente diluído em RPMI 1640 para uma concentração de 2-

5x103 células ml-1.

Para os testes de susceptibilidade, microplacas com 96 poços de fundo chato (TPP;

Trasadingen, Suíça) foram utilizadas e os procedimentos seguiram o Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI, 2008). O inóculo foi adicionado aos poços com as

drogas testadas, e as placas foram incubadas a 25ºC por três dias antes da leitura dos


resultados para determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do Flz e Pv. A

inibição do crescimento foi demonstrada pela observação visual.

O CIMs para Flz foram as concentrações capazes de inibir o crescimento das

leveduras ≥ 80% (CLSI, 2008). Para Pv, a CIM foi determinada pela inibição em 100%

quando comparada ao crescimento dos poços controles.

Para determinar a concentração fungicida mínima (CFM) de Flz e Pv, o conteúdo

dos poços que apresentaram de 80 a 100% de inibição do crescimento por Flz e 100% de

inibição pela Pv foi transferido para placas de Petri contendo SDA. As placas foram então

incubadas a 35ºC, por três dias, para determinar a viabilidade fúngica. A CFM foi

confirmada pela ausência de crescimento fúngico. Cada experimento foi realizado em

duplicata. As CIM e CFM para cada agente antifúngico foram determinadas.

Resultados

O método do CLSI utilizado nos testes de susceptibilidade a Flz e Pv apresentou

valores de CIM que variaram inter e intraespecificamente. Entre as 41 cepas, incluindo C.

albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis, os

valores de CIM variaram entre 0,125-32 µg ml-1 para fluconazol e 32-512 µg ml-1 para Pv.

Todos os isolados testados frente a Pv apresentaram valores correspondentes tanto para

atividade fungistática quanto fungicida; contudo estes mesmos microrganismos

apresentaram apenas atividade fungistática frente ao Flz.

Os menores valores de CIM foram 0,125 µg ml-1 de Flz frente C. albicans e 32 µg

ml-1 de Pv frente C. albicans e espécies não- C. albicans. Sete cepas de Candida foram

dose-dependente ao Flz, porém sensíveis a Pv (Tabela 1).

Entre as amostras analisadas, uma amostra de C. glabrata apresentou o mesmo

valor da CIM (32 µg ml-1) para Flz e Pv.

Discussão

Alguns autores descreveram a atividade antifúngica de diferentes tipos de própolis

contra espécies de Candida variadas (Sawaya et al., 2002, Oliveira et al., 2006),

Cryptococcus neoformans (Fernandes et al., 2007), Trichophyton rubrum, T.

mentagrophytes (Koc et al., 2005, Siqueira et al., 2008) e Paracoccidioides brasiliensis

(Murad et al., 2002). No entanto, não há dados que relacionem a atividade antifúngica da

própolis vermelha contra espécies de Candida.


Bastante atenção tem sido focada na própolis de Populus sp. (Salicaceae) e

Baccharis dracunculifolia (Asteraceae); contudo, informações científicas sobre os demais

tipos de própolis ainda é escassa. A própolis verde brasileira é realmente a mais estudada

quanto ao perfil de suscetibilidade contra espécies de Candida (Daugsch et al., 2008).

A própolis vermelha é um novo tipo de própolis produzida em regiões próximas aos

manguezais, a partir da coleta pelas abelhas Apis mellifera de resina de vegetação arbustiva

com um alto teor de flavonóides, substâncias que desempenham seu potencial

antimicrobiano (Trusheva et al., 2006, Daugsch et al., 2008), explicando a sua propriedade

fungicida mesmo contra cepas resistentes ou dose dependentes ao fluconazol, considerado

droga padrão para a CE. Espécies emergentes de Candida agentes de CE representam um

problema, uma vez que casos de resistência por espécies não-C. albicans estão se tornando

cada vez mais frequentes, especialmente em indivíduos tratados profilaticamente com Flz

ou mesmo com outros derivados azólicos (Cowen; Steinbach, 2008, Wilheim et al., 2009).

Outros pesquisadores demonstraram CIM e CFM em concentrações mais elevadas

utilizando a própolis verde tendo verificado efeito fungistático de 3,8 mg ml-1 frente C.

albicans e 2,1 mg ml-1 frente C. tropicalis. A CFM observada variou de concentrações de

1,6 mg ml-1 a 9 mg ml-1 (Ota et al., 2001, Fernandes et al., 2007). Em contraste,

concentrações mais baixas utilizando a Pv foram suficientes para inibir ou matar as cepas

de Candida spp. testadas neste trabalho.

Martins et al. (2002) avaliaram a suscetibilidade de 12 cepas de C. albicans,

provenientes de pacientes HIV-positivos com candidíase oral, testando um extrato de

própolis alcoólico a 20% (EPA) comercial. Além disto, os autores compararam à ação

inibitória dos antifúngicos comerciais como nistatina (Nis), clotrimazol (Cl), econazole

(Ec) e fluconazol (Flz). EPE inibiu todas as cepas de C. albicans testadas sendo observadas

diferenças significativas entre a ação da própolis e dos demais fármacos, sugerindo EPE

como forma alternativa de tratamento para candidíase oral em pacientes HIV-positivos.

Opções terapêuticas utilizando alguns tipos de própolis no tratamento de candidíase

oral e vulvovaginal já foram propostas (Santos et al., 2005, Santos et al., 2008, Dalben-

Dota et al,. 2010). Entretanto, ainda não foram descritos ensaios in vitro ou in vivo

utilizando Pv como alternativa terapêutica na candidíase esofágica. Nunes et al. (2009)

afirmam que a comercialização da Pv como medicamento necessita da tipificação dos

compostos desta própolis, uma vez que diferentes origens botânicas, espécies de

abelhas/raças e as variações sazonais tornam essa resina bioquimicamente complexa.


Pesquisas que busquem formas de tratamento antimicótico mais baratas e eficazes e

que evitem o desenvolvimento da resistência in vitro e clínica são urgentes, uma vez que

CE é considerada uma das mais frequentes e recidivantes micoses oportunistas do mundo

(Vazquez, 2010). Assim, a própolis vermelha brasileira sugere ser uma excelente opção

diante dos dados obtidos, exigindo a continuidade das análises para obtenção de

parâmetros de eficácia in vivo.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior (CAPES). Os autores gostariam de agradecer ao Departamento de Micologia da

Universidade Federal de Pernambuco pelas instalações e toda assistência.

Conflito de interesse

Nenhum.


Tabela 1. Determinação da concentração inibitória mínima de fluconazol e própolis

vermelha frente a espécies de Candida associadas com candidíase esofágica.

Número do isolado

Espécie do isolado Fluconazol (MIC/ µg ml-1)

Própolis vermelha (MIC/ µg ml-1)

1 Candida albicans 4 128 2 C. albicans 0.5 256 5 C. albicans 32 256

15 C. albicans 1 256 16 C. albicans 0.125 32 17 C. parapsilosis 0.5 32 18 C. albicans 0.25 128 19 C. albicans 0.125 128 20 C. albicans 0.125 64 21 C. albicans 0.125 128 22 C. glabrata 4 256 23 C. albicans 0.125 256 24 C. albicans 32 256 25 C. albicans 0.25 256 26 C. albicans 0.5 128 27 C. albicans 0.125 256 29 C. albicans 0.125 256 30 C. tropicalis 16 256 31 C. albicans 0.125 64 32 C. glabrata 32 32 33 C. albicans 32 256 34 C. krusei 4 32 35 C. glabrata 2 32 36 C. albicans 0.125 256 37 C. albicans 0.5 64 38 C. albicans 0.25 256 39 C. guilliermondii 4 64 40 C. albicans 2 256 41 C. albicans 0.5 64 42 C. albicans 4 256 43 C. albicans 32 256 44 C. albicans 0.125 128 45 C. albicans 0.125 256 46 C. albicans 1 256 47 C. albicans 0.5 256 48 C. albicans 4 256 49 C. albicans 0.25 128 50 C. albicans 32 512 51 C. albicans 1 128 52 C. albicans 0.125 256 53 C. albicans 0.125 256

ATCC 22019 C. parapsilosis 0.25 64 ATCC 6528 C. krusei 0.25 64

CIM: concentração inibitória mínima


8. ATIVIDADE IN VIVO DA PRÓPOLIS VERMELHA E FLUCONAZOL

CONTRA ESOFAGITE POR CANDIDA: EFEITOS TERAPÊUTICOS DA

ADMINISTRAÇÃO SIMPLES E COMBINADA6

6 Artigo a ser submetido: Macêdo, D.P.C., Lima-Filho, J.V.M., Leal, A.F.G., Andrade, S.L., Ventura, R.F., Silva, A.F.B., Ralph, M.T., Pacheco, E., Pontes-Filho, N.T., Neves, R.P. In vivo activity of red propolis and fluconazole against Candida esophagitis: therapeutic effects of simple and combined administration. Clinical Microbiology and Infection.


RESUMO

A atividade antifúngica in vivo do extrato de própolis vermelha em um modelo

experimental de candidíase esofágica foi investigada. Os camundongos foram

imunossuprimidos com doses diárias de dexametasona (0,5 mg/animal) por via

intraperitoneal durante 14 dias, com intervalos de três dias. A infecção foi realizada após o

período de imunossupressão com 1x108 células viáveis de Candida albicans URM6285

por swab via intra-esofágica seguida pela administração intragástrica de 0,2 mL desta

suspensão. Cloridrato de tetraciclina a 0,08% foi adicionado à água oferecida ad libitum

uma semana antes da infecção. Sete dias após a infecção, os camundongos foram divididos

em 6 grupos (N = 5) e tratados diariamente por via oral com fluconazol (Flz) e extrato de

própolis vermelha (Rp) em diferentes doses (1 -Flz 15 mg/kg, 2 -Flz 10 mg/kg:Rp 25

mg/kg, 3 -Flz 5 mg/kg:Rp 50 mg/kg; 4 -Flz 1 mg/kg:Rp 100 mg/kg; 5 -Rp 150mg/kg; 6 -

DMSO 25% :Tween 10% em PBS) por sete dias. O tratamento com Rp 150 mg/kg/dia

eliminou a levedura das mucosas da língua e do esôfago, quando comparado ao grupo não

tratado. Este resultado foi semelhante aos obtidos com Flz:Rd em diferentes concentrações

sendo confirmado através de exame histopatológico, que mostrou uma redução do processo

infeccioso com aparência normal da mucosa oral e esofágica. Este estudo destaca a

possível utilização do Rp isoladamente ou em combinação com medicamentos antifúngicos

comerciais para o tratamento de candidíase esofágica.

Palavras-chave: Própolis vermelha, fluconazol, Candida, candidíase oral, candidíase

esofágica experimental.


Introdução

Leveduras do gênero Candida são os principais fungos que causam uma variedade

de formas clínicas superficiais recorrentes, especialmente na mucosa oral e esofágica. O

crescimento maciço e contínuo de C. albicans no lúmen do esôfago provoca a colonização

do trato digestivo, mas também aumenta o risco de candidíase sistêmica, principalmente

em pacientes imunossuprimidos. Além disso, casos de candidíase de alta letalidade entre

pacientes graves exige a introdução de novas opções terapêuticas (Macêdo et al., 2010).

Atualmente fluconazol é considerado o tratamento de escolha para candidíase

esofágica e a administração oral de antifúngicos azólicos pode ser eficaz, mas casos de

resistência e efeitos adversos são comuns (Traeder et al., 2008).

Como alternativa ao tratamento convencional da candidíase esofágica, produtos

naturais e substâncias derivadas com propriedades antifúngicas têm sido propostas (Barros

et al., 2007). Assim, alguns tipos de própolis têm sido amplamente relatados, uma vez que

apresentam muitas propriedades farmacológicas, tais como antibacteriana, antiviral, anti-

inflamatória, anestésica, citostática e antifúngica (Marcucci, 1995, Kujumgiev et al., 1999,

Pereira et al., 2002, Cicala et al., 2003). A própolis verde tem sido amplamente

comercializada e utilizada para o tratamento de várias doenças (Santos et al., 2005, Amaral

et al., 2006, Galvão et al., 2007); no entanto, outras opções ainda estão em estudos

preliminares como a própolis vermelha, uma substância resinosa produzida por abelhas

(Apis mellifera) a partir de Dalbergia ecastophyllum (L) Taub. (Daugsch et al., 2008).

O objetivo desta pesquisa foi avaliar o efeito simples e combinado do extrato de

própolis vermelha e fluconazol em um modelo animal de candidíase esofágica.

MATERIAL E MÉTODOS

Candida albicans URM6285 e atividade antifúngica in vitro

Os testes in vitro foram realizados por método padrão (CLSI, 2008) com um total

de 41 cepas de Candida agentes de esofagite para posterior seleção de um isolado. Para

realizar a avaliação in vivo, C. albicans URM6285 foi selecionada e estocada na Coleção

de Culturas Micoteca URM (Universidade Federal de Pernambuco-UFPE, Recife, Brasil).

O isolado foi obtido de um paciente com AIDS que apresentou lesões esofágicas grau 3 de

Wilcox e a seleção foi baseada na sua virulência e perfil de suscetibilidade aos antifúngicos

através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração


fungicida mínima (CFM) contra o extrato de própolis vermelha (Rp) (2 a 1024 µg/mL) e

fluconazol (Flz) (4 a 64 µg/mL). A leitura da CIM foi estimada como a menor

concentração que causou a inibição visível do crescimento após um período de incubação

de 72 horas a 37ºC.

Animais

Camundongos suiços adultos fêmeas, com seis semanas de idade, pesando

aproximadamente 30g foram utilizados neste estudo. Um número mínimo de animais (n =

5 por grupo) foi utilizado em todos os experimentos, a fim de respeitar as regras atuais para

uso de animais em experimentação, totalizando 30. Estes foram mantidos em um local com

iluminação controlada (ciclos claro-escuro de 12 horas), bem como temperatura (25ºC) e

umidade (60-70%), com oferta de água e dieta comercial esterilizada (Purina, Paulínia, SP,

Brasil) ad libitum. Os animais foram tratados de acordo com os procedimentos

estabelecidos, seguindo o "Guia para o cuidado e uso de animais de laboratório" do

Conselho Nacional de Pesquisa, após aprovação do Comitê de Ética Animal (Centro de

Ciências Biológicas da UFPE) protocolo n º 23076.006668/2009-29.

Desenho experimental

Os procedimentos experimentais dos modelos de candidíase oral e esofágica foram

desenvolvidos com camundongos imunossuprimidos (IS=30 animais), induzidos pelo

tratamento subcutâneo com uma dose de 100 mg/kg de dexametasona por 14 dias antes da

infecção do esôfago com três dias de intervalo. Cloridrato de tetraciclina na dose de 0,08%

foi adicionado à água de beber oferecida aos animais, tendo início este tratamento uma

semana antes da infecção.

O isolado de C. albicans URM6285 foi cultivado em Sabouraud Dextrose Agar

(SDA/Difco) a 37ºC e seriadamente diluído em tampão fosfato (PBS) para atingir uma

suspensão contendo 108 UFC/mL.

Duas horas antes da infecção por Candida, os animais foram mantidos em jejum e

após este período foi realizada inoculação com swab uretral saturado com 1x108

células/mL de C. albicans em PBS (Clancy et al., 2009) e com uma agulha de cabeça

redonda (39 mm de comprimento, Fuchigami, Ltd, Kyoto) acoplada em seringa contendo

0,2 ml da suspensão, sendo posicionada logo abaixo da faringe do animal, após o primeiro

procedimento. O grupo controle foi inoculado com 0,2 ml de PBS, de acordo com os

mesmos procedimentos experimentais. Os camundongos foram acompanhados


diariamente, durante 30 dias, para observação dos sinais clínicos e estresse (Ishibashi et al.,

2007).

Avaliação dos sinais clínicos

Os animais que foram submetidos ao teste de longa duração (30 dias) foram

avaliados quanto aos sinais clínicos, tais como prostração e perda de peso a partir do

inóculo inicial com C. albicans.

Tratamento da esofagite por Candida com extrato de própolis vermelha e fluconazol

Sete dias após a infecção, os animais foram tratados por via oral (0,4 mL),

diariamente, com doses simples e combinadas de extrato de própolis vermelha e

fluconazol em seis grupos experimentais: grupo 1- Flz 15 mg/Kg; grupo 2- Flz 10

mg/Kg:Rp 25mg/Kg; grupo 3- Flz 5 mg/Kg:Rp 50 mg/Kg; grupo 4- Flz 1 mg/Kg:Rp 100

mg/Kg; grupo 5- Rp 150 mg/Kg e grupo 6- DMSO 25%:Tween 10% in PBS.

Fluconazol foi utilizado em combinação com o extrato de própolis vermelha para

comparar os efeitos do tratamento com redução das dosagens do azol.

Contagem de células de C. albicans

Uma alíquota de sangue foi coletada por punção cardíaca, após a eutanásia com

halotano, para contagem total e diferencial de leucócitos. A língua e o esôfago foram

pesados e macerados em PBS (1:10 ou 1:100, p/v). Todas as amostras foram submetidas a

diluições seriadas e alíquotas de 0,1 mL foram semeadas em placas contendo SDA

acrescido de cloranfenicol (50 mg/mL) e incubadas a 37°C por 24-72 h. Os dados foram

apresentados como unidades formadoras de colônia (UFC)/g de órgão ou por mL de

sangue.

Exame direto e histopatológico

Amostras dos tecidos da língua e do esôfago dos camundongos sacrificados um dia

após o final do tratamento (8º dia) foram clarificadas com KOH 20% para exame direto e

fixadas em formol a 10%, processadas em rotina histológica e emblocadas para serem

embebidas em parafina para análise histopatológica. As secções histológicas (5 µm) foram

coradas com hematoxilina-eosina e examinadas por um único patologista, que desconhecia

as condições experimentais de todos os grupos.


Análise estatística

A significância estatística quanto à contagem de leucócitos e das UFCs foi avaliada

pela análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste-t Student. O nível de significância

foi determinado em p <0,05.

RESULTADOS

Suscetibilidade in vitro de C. albicans URM6285

O CIM obtido foi 128μg/mL para o extrato de própolis vermelha e 8μg/mL para

fluconazol contra C. albicans URM6285 através do método descrito pelo CLSI (2008).

Esofagite experimental por Candida

A imunossupressão por dexametasona aplicada aos camundongos suíços foi

confirmada pela contagem total (920-940/mm3) e diferencial de neutrófilos (23,5-29,2%).

C. albicans URM6285 produziu uma infecção local nos animais com o isolamento de 104-

105 UFC/g na língua e no esôfago, sete dias pós-infecção. Os animais apresentaram perda

de peso, fadiga e diminuição na ingestão de água e alimentos. O efeito da infecção por C.

albicans foi verificado através de exame direto que apresentou numerosas células de

leveduras agrupadas e isoladas também presentes no histopatológico, numerosas células

em brotamento, além de pseudomicélio e micélio verdadeiro (Figura 1).

Tratamento da candidíase oral e esofágica

Sete dias após o tratamento, o exame microscópico direto exibiu uma redução

qualitativa e quantitativa do número de células aderidas à mucosa infectada no grupo 3, 4 e

5 (Figura 2). Os resultados pós-tratamento com dose simples e combinada de extrato de

própolis vermelha e fluconazol mostraram uma diminuição na população de C. albicans na

língua e no esôfago baseada na contagem de UFC. Além disso, o fungo foi eliminado da

língua e do esôfago e a carga fúngica foi reduzida nos grupos 2, 3, 4 e 5 tratados, 14 dias

pós-infecção, apresentando diferença significativa do resultado no Grupo 6 (Figura 3). A

diferença estatística entre os grupos 1 e 6 não foi significativa, indicando que a eficácia

terapêutica de Flz 15 mg/kg foi equivalente ao grupo controle.

O exame histopatológico apresentou numerosas células de leveduras no grupo não

tratado e ausência de resposta inflamatória com redução da população de células viáveis de

Candida nos tecidos, especialmente nos grupos tratados com própolis vermelha (Figura 2).


A contagem diferencial de leucócitos exibiu diferença significativa quanto ao

número de linfócitos e neutrófilos, quando comparada à contagem realizada nos mesmos

animais ao final da imunossupressão e antes da infecção. O número de monócitos

apresentou diferença quando comparado ao resultado da contagem realizada com os

animais ainda saudáveis e sem imunossupressão.

DISCUSSÃO

O tratamento simples e combinado com extrato de própolis vermelha resultou em

uma recuperação clínica considerável durante os experimentos. Após a análise dos

diferentes tratamentos entre os grupos foi verificada eficácia significativa nos Grupos 2, 3,

4 e 5 tratados com extrato de própolis vermelha. Além disso, o uso de fluconazol mostrou

melhores resultados quando combinado com o extrato de própolis vermelha demonstrando

a influência de produtos naturais no tratamento da candidíase. Este efeito protetor foi

confirmado através dos exames micológico e histopatológico (Figura 2 e 3).

A identificação dos componentes e modelos in vitro com a própolis vermelha

brasileira confirmou a atividade bactericida, anti-radical livre, anti-câncer, anti-

inflamatória e antifúngica (Basnet et al., 1997, Kanazawa et al., 2003, Trusheva et al.,

2006, Aslan et al., 2007, Franchi-Júnior et al., 2007). Os resultados obtidos nesta pesquisa

demonstraram mais uma vez que a própolis vermelha apresenta efeitos mais positivos do

que o esperado. As opções apresentadas para o tratamento experimental foram

desenvolvidas, principalmente, devido à falta de estudos que investiguem as propriedades

antifúngicas desta nova própolis contra a candidíase esofágica.

A maioria dos camundongos tratados com própolis vermelha + fluconazol exibiu

aspecto histológico com sinais de recuperação das mucosas enquanto que os animais

tratados com fluconazol apresentaram sinais de destruição da levedura, porém com uma

discreta infiltração de células inflamatórias, especialmente na mucosa do esôfago. Os

resultados obtidos sugerem que o extrato de própolis vermelha foi eficiente, tanto na forma

de administração simples quanto associada com o fluconazol, uma vez que não foi

observada diferença significativa entre os animais tratados com fluconazol e o grupo

controle. Ademais, o extrato de própolis vermelha teve efeito protetor direto contra as

células de C. albicans.


AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior) e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico)

pelo financiamento da pesquisa e ao Biotério do CPqAM (Centro de Pesquisas Aggeu

Magalhães) pelo fornecimento dos animais utilizados neste estudo.

TRANSPARÊNCIA DE DECLARAÇÕES

Nada a declarar.


Figura 1. Modelo experimental de candidíase esofágica em camundongos imunossuprimidos com dexametasona, apresentando ao exame direto do tecido da mucosa do esôfago (A) e língua (C) numerosos blastoconídeos, pseudomicélio e micélio verdadeiro típicos de Candida e numerosas células de leveduras viáveis ( ) infectando toda a mucosa do esôfago (B) e da língua (D) ao exame histopatológico corado com hematoxilina-eosina (400X).

A B

C D


Figura 2. Modelo experimental de candidíase esofágica em camundongos tratados oralmente com extrato de própolis vermelha, apresentando redução qualitativa e quantitativa das estruturas de Candida albicans ao exame direto da mucosa do esôfago (A) e língua (C) e células de leveduras fragmentadas ( ) com sinais de normalização da camada serosa da mucosa do esôfago ( ) (B) e língua (D) ao exame histopatológico corado com hematoxilina-eosina (400X).

A B

C D


Figura 3. Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de Candida albicans viáveis na língua e esôfago de camundongos suíços fêmeas com candidíase esofágica. A concentração do inóculo foi de 1 x 108 UFC/mL. Após diluições seriadas dos órgãos infectados foi realizado plaqueamento em ágar Sabourand Dextrose, sendo a quantificação realizada após 48 horas a 37ºC. * Diferença estatística entre os grupos experimentais e o grupo controle com p < 0,05.

G1: Fluconazol 15mg/kg G 2: Fluconazol 10 mg/kg + Própolis Vermelha 25 mg/kg G3: Fluconazol 5 mg/kg + Própolis Vermelha 50 mg/kg G4: Fluconazol 1 mg/kg + Própolis Vermelha 100 mg/kg G 5: Própolis Vermelha 150 mg/kg G 6: DMSO 25%:Tween 10% in PBS

** ** *


9. CONSIDERAÇÕES GERAIS

Com base nos resultados obtidos pode-se concluir que:

Colonização e levedurose oral por espécies de Candida associam-se a casos de

candidíase esofágica e ocorre em imunocompetentes e imunossuprimidos.

Pacientes com candidíase esofágica apresentam como fatores de risco o uso

prolongado de antibióticos de largo espectro e corticóides, infecção por HIV, diabetes

mellitus, neoplasias, cardiopatia, anemia crônica, doença de Chagas, doença hepática

crônica e lúpus eritematoso sistêmico.

Candida albicans predomina como agente etiológico de candidíase esofágica seguida

por C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei e C. guilliermondii.

O primer (GACA)4 revela diferenças intraespecíficas entre isolados orais e esofágicos

de C. albicans e C. glabrata.

Espécies de Candida que colonizam a mucosa oral não causam esofagite, sendo

geneticamente distintas.

Isolados de Candida resistentes a fluconazol são sensíveis à ação fungicida do extrato

de própolis vermelha.

Tratamentos de candidíase esofágica experimental por administração oral com doses

simples e combinadas de extrato de própolis vermelha são estatisticamente

significantes quanto à ação terapêutica quando comparados ao grupo controle e ao

grupo tratado exclusivamente com fluconazol.

Não há diferença estatística entre os animais com candidíase esofágica tratados com

fluconazol e o diluente (PBS+Tween+DMSO).

Modelo experimental é indispensável para avaliação da eficácia terapêutica de novos

compostos naturais com ação antifúngica para posterior uso humano.


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danielle patrÍcia cerqueira macÊdo · aos familiares que me acompanharam e ajudaram a perseverar...

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