ĐẠi hỌc thái nguyên trƯỜng ĐẠi hỌc y dƯỢc · pdf file3.12 Định...
TRANSCRIPT
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC
THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN 7 VÀ
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ
Mã số: ĐH2014-TN05-01
Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Huy Hoàng
THÁI NGUYÊN - 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC
THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN 7 VÀ
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ
Mã số: ĐH2014-TN05-01
Xác nhận của tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài (ký họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)
THÁI NGUYÊN - 2017
i
DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI
I. Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu
STT Họ và tên Đơn vị công tác
1 ThS. Nguyễn Huy Hoàng Đại học Y Dược - ĐHTN
2 PGS. TS. Lê Văn Sơn Viện Công nghệ Sinh học
3 TS. Phạm Bích Ngọc Viện Công nghệ Sinh học
4 TS. Nguyễn Thu Hiền Đại học Y Dược - ĐHTN
5 TS. Nguyễn Thị Thu Ngà Đại học Sư phạm - ĐHTN
II. Đơn vị phối hợp chính
STT Tên đơn vị Họ tên người đại diện
1 Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam PGS. TS. Chu Hoàng Hà
ii
MỤC LỤC
DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI .................... I
MỤC LỤC ....................................................................................................... II
DANH MỤC NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................... III
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................ IV
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................... VII
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... III
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. Interleukine 7 ........................................................................................ 3
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong
y học..................................................................................................................7
1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới ............................. 7
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước ............................... 9
1.3. Nghiên cứu biểu hiện interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá....10
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 15
2.1. Vật liệu.................................................................................................15
2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................ 15
2.1.2. Các chủng vi khuẩn ....................................................................... 15
2.1.3. Các gene và vector ........................................................................ 15
2.1.4. Hóa chất và thiết bị máy móc ....................................................... 15
2.1.5. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 16
2.1.6 . Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................17
2.2.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu
hiện ở thực vật ......................................................................................... 18
2.2.2. Thiết kế mồi .................................................................................. 19
2.2.3. Thiết kế vector chuyển gene mang gene interleukin 7 tái tổ hợp . 19
2.2.5. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử ... 24
2.2.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp interleukin 7 ..................................... 26
2.2.7. Đánh giá hoạt tính protein interleukin 7 tái tổ hợp ....................... 28
2.2.8. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ....................................... 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 30
3.1. Thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật30
3.2. Thiết kế vector chuyển gene interlukin 7 tái tổ hợp vào cây thuốc lá 32
3.2.1. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP ............. 32
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gene pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-
100xELP ................................................................................................. 34
3.3. Biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng
phương pháp Agro-infiltration......................................................................36
3.4. Đánh giá biểu hiện tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp..........................39
3.5. Phân tích định lượng và tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp................39
3.6. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp ..................44
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................. 46
4.1. Biểu hiện tạm thời protein interleukin 7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá...46
4.2. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC 47
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ............................................................... 50
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ....... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 68
iii
DANH MỤC NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký tự Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt
35S Promoter CaMV 35S
A. tumefaciens Agrobacteria tumefaciens
bp Base pairs Cặp bazơ
BSA bovine serum albumin Dung dịch protein chuẩn
cDNA Complementary DNA Complementary DNA
DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic
E.Coli Escherichia coli
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic
ELISA Enzym-linked
immunosorbent assay
Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên
trong mẫu xét nghiệm
ELP elastin-like peptide
hIL-7 human interleukin 7 interleukin 7 của người
HRP Horseradish Peroxidase Horseradish Peroxidase
IFN Interferon
IL Interleukin
IMAC Immobilized Metal ion Affinity
Chromatography Sắc kí ion cố định kim loại
kb Kilo base
kDa Kilo danton
mITC membrane-based Inverse
Transition Cycling Đảo ngược theo màng
OD Optical Density Mật độ quang
PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp
RNase Ribonuclease Enzyme ribonuclease
rpm Revolutions per minute Vòng/phút
scFv Single-chain variable fragment
SDS Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis
TCR T-cell receptor Thụ thể kháng nguyên tế bào T
WT Wild type Chủng hoang dại
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
1.1 Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật 11
2.1 Trình tự mồi sử dụng trong đề tài 16
2.2 Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn 20
2.3 Thành phần phản ứng lai 20
2.4 Thành phần gel SDS-PAGE 25
3.1 Hiệu suất thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp
mITC 43
3.2 Kết quả hoạt hóa dòng tế bào 2E8 bằng interleukin 7 45
v
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Tên hình Trang
1.1 Cấu trúc protein Interleukin 7 người 3
1.2 Thụ thể interleukin 7 4
2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 17
3.1 Trình tự gene interleukin 7 trước và sau khi thay đổi mã di truyền 31
3.2 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 32
3.3 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene
pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 33
3.4 Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene
pCB301/IL7/100xELP 35
3.5 Kết quả kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
bằng enzyme NcoI 36
3.6 Kết quả colony PCR bằng cặp mồi đặc hiệu
IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R 37
3.7 Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI 38
3.8 Quá trình biến nạp pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào
cây thuốc lá 39
3.9 Kiểm tra biểu hiện protein IL-7 tái tổ hợp trong lá thuốc lá bằng
Western blot 40
3.10 Kết quả tinh sạch và định lượng protein IL-7 bằng phương pháp IMAC 41
3.11 Kết quả tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC 43
3.12 Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp lai miễn dịch 44
3.13 Hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp 46
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Đơn vị: Trường Đại học Y Dược
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thông tin chung:
Tên đề tài: Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh
giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá
Mã số: ĐH2014-TN05-01
Chủ nhiệm: ThS. Nguyễn Huy Hoàng
Cơ quan chủ trì: Đại học Y Dược Thái Nguyên
Thời gian thực hiện: 2014 - 2017
2. Mục tiêu:
Thiết kế được vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin 7 tái
tổ hợp.
Tạo được cây thuốc lá biểu hiện protein interleukin 7
3. Kết quả nghiên cứu:
Thiết kế được 2 cấu trúc vector chuyển gene và biểu hiện protein tái tổ
hợp ở thực vật.
Biểu hiện thành công protein ở thực vật bằng phương pháp Agro-
infiltration.
Đã đánh giá được hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp.
4. Sản phẩm:
4.1. Sản phẩm khoa học:
03 bài báo đăng các tạp chí khoa học, 01 trình tự gen đăng kí trên Ngân
hàng gen.
- Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích
Ngọc, Lê Văn Sơn (2014), “Interleukin 7 và vai trò trong hệ thống miễn dịch ở
người”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, Tập 118 số
04, tr. 153-156.
- Nguyễn Huy Hoàng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn
(2015), “Thiết kế vector mang cấu trúc gen Interleukin 7 phục vụ chuyển gen
trong hệ thống thực vật”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái
Nguyên, Tập 134 số 04, tr. 25-28.
- Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn
(2017), “Biểu hiện tạm thời protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá
(Nicotiana benthamiana domin) bằng phương pháp Agro-Infiltration”, Tạp chí
Sinh học, Tập 39 số 02, tr. 232-238.
- Hoang,N.H, Ha,C.H., Ngoc,P.B. and Son,L.V. (2017), IL7 human gene
is optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank:
MF170526.1
4.2. Sản phẩm đào tạo
4.3. Sản phẩm ứng dụng
01 quy trình thiết kế vector tái tổ hợp mang gene mã hóa protein
interleukin 7 và sản phẩm vector tái tổ hợp.
01 quy trình biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium.
01 quy trình biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật bằng phương pháp
Agro-infiltration.
5. Hiệu quả:
Khoa học công nghệ: Đề tài hoàn thành sẽ góp phần hoàn thiện các
phương pháp sản xuất protein interleukin 7 tái tổ hợp phục vụ trong y học
Thông tin: Cung cấp những thông tin về giá trị của các loại cytokin nói
chung và interleukin, trong đó có interleukin 7 nói riêng trong hệ thống miễn
dịch của con người
Nâng cao năng lực nghiên cứu của những người tham gia, đặc biệt với
chủ nhiệm đề tài.
Bổ sung 01 tài liệu tham khảo phục vụ cho việc nghiên cứu, giảng dạy
và học tập của học viên, sinh viên chuyên ngành Di truyền học.
6. Khả năng áp dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu:
Đề tài đã cung cấp quy trình biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp ở
cây thuốc lá chuyển gene trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục
đích nuôi cấy thu sinh khối tế bào.
Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein interleukin 7 tái
tổ hợp thu được sau khi tinh sạch, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn.
Ngày 14 tháng 7 năm 2017
Cơ quan chủ trì (ký, họ và tên, đóng dấu)
Chủ nhiệm đề tài (ký, họ và tên)
INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information:
Project title: Research on expressing the recombinant interleukin 7
protein in plant culture systems
Code number: ĐH2014-TN05-01
Coordinator: Nguyen Huy Hoang, MA
Implementing institution: TNU-University of Medicine and Pharmacy
Duration: from 2014 to 2017
2. Objective(s):
- Design the recombinant interleukin 7 encoded gene transferred the
plant culture systems culture systems.
- Generates tobacco expressing protein interleukin 7.
3. Research results:
- Design of two transgenic vector constructs and recombinant protein
expression in plants.
- Successfully expression of protein in plants by Agroinfiltration.
- The recombinant IL-7 protein was evaluated bioactivity
4. Products:
4.1. Scientific product:
03 articles published scientific journals, 01 sequence has been registered
on the genebank
- Nguyen Huy Hoang, Nguyen Thu Giang, Chu Hoang Ha, Phạm Bich
Ngoc, Le Van Son (2014), “Interleukin 7 and role in the immune system of
humans”, TNU-Journal of scrience and technology, 118 (04), pp. 153-156.
- Nguyen Huy Hoang, Chu Hoang Ha, Pham Bich Ngoc, Le Van Son
(2015), “Vector construction contained structure interleukin-7 in plant”, TNU-
Journal of scrience and technology, 134 (04), pp. 25-28.
- Nguyen Huy Hoang, Pham Bich Ngoc, Le Van Son, Chu Hoang Ha (2017),
“Transient expression of a taste-modifying protein, interleukin-7, in nicotiana
benthamiana using agro-infiltration”, Journal of biology, 39 (02), pp. 232-238.
- Hoang,N.H, Ha,C.H., Ngoc,P.B. and Son,L.V. (2017), IL7 human gene
is optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank:
MF170526.1
4.2. Training product
4.3. Application product:
01 recombinant vector design process carrying genes encoding
interleukin 7 protein and recombinant vector product.
01 recombinant vector transformation process into Agrobacterium.
01 process of recombinant protein expression in plants by method
Agroinfiltration.
5. Effects:
Science and Technology: The completed project will contribute to the
improvement of the methods of recombinant interleukin 7 production in
medicine.
Information: Provides information on the value of cytokines and
interleukins, including interleukin 7 in particular in human immune systems.
Improve the research capacity of the participants, especially the leader.
Additional 01 reference material for the research, teaching and learning
of students, specialized students in Genetics.
6. Transfer alternatives of reserach results andapplic ability:
The subject has provided a process for expression of interleukin 7 recombinant protein in transgenic tobacco plants in a laboratory scale for cell culture purposes.
Initial evaluation of the bioactivity of the recombinant interleukin 7 protein obtained after purification, is the premise for further research.
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống được nâng cao thì vấn đề chăm sóc
sức khỏe ngày càng được quan tâm, coi trọng. Tuy nhiên, hiện nay con người
đang phải đối mặt với rất nhiều bệnh nguy hiểm như HIV, AIDS, tiểu đường,
SARS, ebola v.v…. Trong khi đó, việc điều trị chủ yếu là sử dụng thuốc theo
từng giai đoạn diễn biến của bệnh nên tính hiệu quả không cao và chỉ mang
tính cầm cự.
Interleukine là một nhóm các cytokine được tìm thấy đầu tiên trong các
tế bào bạch cầu. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu
vào các Interleukine. Trong đó, nhóm Interleukine 7 (IL-7) là một cytokine có
vai trò chính trong sự tăng trưởng của các dòng tế bào B và T [3]. Đây là những
dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng
là những tế bào đích tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ
thể con người.
Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng
rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp... Trước
đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết
từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi
nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm
bệnh nguy hiểm cho con người. Do đó, việc tổng hợp protein tái tổ hợp được
đặt ra một cách cấp thiết.
Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực
công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như
trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Mặc dù một số protein có thể tổng
hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính
2
tối ưu và thực tiễn cao. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng
rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin,
hormone tăng trưởng v.v…. mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong
khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn.
Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm
nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như
chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết
ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch
dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con
người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do
các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người.
Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng
liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản
xuất các cytokine nói chung và interleukine 7 nói riêng một cách tối ưu. Căn
cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng
tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Thiết kế vector chuyển gene
interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Thiết kế được vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin 7.
Tạo được cây thuốc lá biểu hiện protein interleukin 7
3. Nội dung nghiên cứu
Tối ưu mã di truyền gene interleukin 7 biểu hiện ở thực vật.
Thiết kế gen mã hóa interleukine 7 tái tổ hợp vào vector chuyển gen phù
hợp với hệ thống nuôi cấy thực vật.
Chuyển cấu trúc gen vào cây thuốc lá
Phân tích, đánh giá chất lượng interleukine 7 tái tổ hợp thu được.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Interleukine 7
IL-7 gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4
kDa và được ổn định bằng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu
nối disulfide nội phân tử [102]. Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb, gồm
có 6 exon và 5 intron nằm trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13. Cấu trúc
phân tử của hIL-7 được giữ vững ngay cả khi nồng độ pH có sự biến động mạnh
(2,1 - 8,0) [18]. Tuy nhiên, hIL-7 sẽ mất hoạt tính sinh học khi bổ sung 2-
mercaptoethanol, điều này cho thấy tầm quan trọng của các liên kết disulfide
có trong cấu trúc phân tử hIL-7 [7].
Hình 1.1. Cấu trúc protein hIL-7
(Nguồn: Wikipedia, 2017) [98].
hIL-7 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1988 bởi công ty Immunex
[58] và cDNA được nhân bản đầu tiên vào năm 1989 [59]. hIL-7 có vai trò quan
trọng trong hệ bạch huyết do có khả năng thúc đẩy sản sinh các tế bào bạch cầu
lympho ở chuột bị nhiễm bệnh [54], [55].
hIL-7 chủ yếu được sản xuất bởi tuyến ức [58], [99]. Ngoài ra, các tế bào
khác như các tế bào tủy [26], nội mạc ruột [97] và tế bào sừng trên da [31] cũng
có thể sản xuất IL-7. Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hIL-7 còn được
4
sản xuất bởi các tế bào nguyên bào sợi lưới (FRC) trong vùng tế bào T của hạch
bạch huyết [47].
hIL-7 có hai thụ thể (IL-7 receptor) là IL-7Rα và thụ thể γc. Trong đó,
thụ thể IL-7Ra (CD127) cũng là thụ thể của các lymphopoietin mô đệm tuyến
ức (TSLP) [107] và chuỗi g (CD132) là thụ thể của IL-2, IL-9, IL-15 và IL-21
[15], điều này cho thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa các cytokine trong hệ miễn
dịch người [22]. Trong khi thụ thể gc thường thấy ở các tế bào tạo máu thì IL-
7Ra lại thấy ở trên bề mặt các tế bào bạch huyết. Gen mã hóa cho protein thụ
thể hIL-7 nằm ở vị trí 5p13 trên nhiễm sắc thể số 5, gần với vị trí của thụ thể
hormone tăng trưởng prolactin và một gen ức chế ung thư tế bào bạch cầu có
đặc điểm tín hiệu tương tự như thụ thể IL-7 [31].
Trọng lượng phân tử của protein thụ thể IL-7 là 80 kDa. Chuỗi γc là
thành phần chức năng và có vai trò góp phần làm tăng liên kết giữa hIL-7 và
IL-7 receptor. Protein IL-7Rα tồn tại ở hai dạng: dạng liên kết với màng và
dạng hòa tan. Các đồng vị màng (p64) cũng được liên kết với IL-2Rγc [31].
Hình 1.2. Thụ thể interleukin 7
(Nguồn: Wikipedia, 2017) [98]
5
Janus kinase-3 (Jak3) gắn chọn lọc với các chuỗi gc [89] trong khi Jak1
gắn với IL-7Ra [76]. Sự đột biến ở chuỗi gc [13], [20], [64] hoặc Jak3 [9], [62],
[70] gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải trầm trọng ở người, đặc
trưng bởi sự thiếu hụt lympho T và NK [63]. Khi hIL-7 gắn với IL-7Ra mang
theo chuỗi gc liên kết với Jak1 và Jak3, điều này làm hoạt hoá kinase và
phosphoryl hoá các vị trí Y449 quan trọng trên IL-7Ra [33]. Sau đó, các thụ
thể trở thành điểm bám cho protein Stat5 qua sự tương tác SH2-
phosphothyrosine để thực hiện các chức năng. Các tiểu đơn vị p85a của
PI3Kinase liên kết trực tiếp với Y449 phosphoryl hoá thông qua vùng SH2. Các
PI3K được đưa qua màng tế bào và hoạt hoá các gen PDK1 và Akt [85]. Akt
sau đó sẽ phosphoryl hoá gen điều tiết chuyển hoá tế bào, sự tiến triển của chu
kì tế bào như GSK3b, P27. hIL-7 điều khiển quá trình này bằng việc phosphoryl
hoá GSK3b, làm ngăn cản quá trình phosphoryl hoá các phân tử tín hiệu của tế
bào b-catein, cản trở sự suy thoái và kết hợp với các yếu tố phiên mã khác như
TCF/LEF-1, giúp một số gen được biểu hiện [57].
hIL-7 có tính đặc hiệu cao với IL-7 receptor. Sweeney và cộng sự đã
chứng minh yếu tố DAB389 gây độc tế bào chỉ hoạt động với tế bào có IL-7
receptor, điều này rất có ý nghĩa trong vấn đề trị liệu nhằm chống lại các khối
u ác tính mang IL-7 receptor. Sự biểu hiện của IL-7 receptor cũng có thể được
coi là mục tiêu điều trị trong các khối u ác tính [90].
Tuy nhiên, hIL-7 cũng được chứng minh có khả năng tạo ra các tín hiệu
khác khi truyền thông tin trong các tế bào không có sự xuất hiện của IL-7R bởi
khả năng đặc hiệu với các thụ thể bề mặt khác như Flt-3 và c-kit [26].
Hoạt tính sinh học của hIL-7
hIL-7 có chức năng chủ yếu là hỗ trợ cho sự tăng trưởng và chống lại các
yếu tố phá hủy các tế bào lympho B và lympho T, thúc đẩy sự tăng trưởng của
tế bào lympho B gốc [104] và kích thích tế bào lympho B và lympho T phát
6
triển [7], [18]. hIL-7 giúp tăng cường sự phát triển của tế bào thực bào tự nhiên
và thúc đẩy sự tăng trưởng và khác biệt của các dòng tế bào lympho T [71],
[75], [86], đồng thời tăng cường hệ thống, kích thích sự hoạt động của bạch cầu
đơn nhân máu ngoại vi [7]. hIL-7 có thể tăng tốc độ sản sinh bạch huyết trong
trạng thái giảm bạch cầu lympho như ở những bệnh nhân AIDS [26], [64] hoặc
sau khi hóa trị liều cao hoặc xạ trị [57, [57].
Morrissey (1991) đã chỉ ra rằng tế bào lympho T đáp ứng với phorbal
myristate acetate trong thụ thể của hIL-7 thay vì trải qua quá trình apoptosis.
Apoptosis hay quá trình chết của tế bào theo một chu trình là một quá trình
phức tạp của các hoạt động thông qua trung gian hoặc mất yếu tố tăng trưởng
cytokine cần thiết hoặc do sự tham gia của một thụ thể chết với TNF. Ví dụ khi
loại bỏ p53 ở gen ức chế khối u trong Rag-1-/- ở chuột, quá trình apoptosis bị
chặn lại, tế bào lympho T ban đầu sẽ sống sót lâu hơn mà không có một chức
năng TCR cụ thể [54]. Do đó, nhiều khả năng đây là một chức năng quan trọng
của hIL-7 để ngăn chặn tế bào gốc từ tuyến ức trải qua quá trình apoptosis.
Cytokine sử dụng chuỗi γc trong các thụ thể của chúng, chẳng hạn như IL-2,
IL-4, IL-9 và IL-15 để có thể tồn tại trong điều kiện nhất định. hIL-7 có thể
duy trì khả năng tồn tại của tế bào bằng cách ngăn cản yếu tố “gây chết” hoặc
kích hoạt yếu tố “thúc đẩy sự sống” [55].
Mặt khác, hIL-7 có thể hoạt hóa các tế bào T chống lại quá trình
apoptosis bằng cách nâng cao mức độ hoạt động của các protein chống
apoptosis như Bcl-2 và Bcl-XL [7], [22]. Ngoài ra, hIL-7 ngăn chặn tế bào chết
bằng cách ức chế một số protein pro-apoptosis như Bid, Bad hoặc Bax [57,
[37], [67] và có thể hoạt động như một đồng yếu tố với gen V, D, J tái tổ hợp
để thực hiện các phản ứng của các chuỗi TCR trong sự hiện diện của hIL-7 tái
tổ hợp [97]. Đặc biệt, hIL-7 cũng đóng góp vào quá trình cân bằng nội môi của
tế bào T CD8+ ở các tế bào lymphopenic và có thể thay thế cho sự thiếu hụt của
IL-15 [83]; làm tăng khả năng sinh kháng thể chống ung thư [72].
7
Hiện nay, hIL-7 được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong điều trị bệnh như
bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính [35], [80], bệnh cúm A [4], một số bệnh
tự miễn [14]; được sử dụng là yếu tố chỉ thị một số bệnh như viêm đường mật
cấp tính [88], ung thư đại trực tràng (CRC) [44], bệnh viêm gan B [105] v.v…
đã thu được nhiều kết quả khả quan.
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÁC LOẠI
CYTOKINE TÁI TỔ HỢP TRONG Y HỌC
1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới
Cytokine đầu tiên được phát hiện là interferon vào năm 1957, là một
cytokine có hoạt tính chống virus. Trong những thập niên vừa qua, các nghiên
cứu và hiểu biết về vai trò sinh lý cũng như sinh lý bệnh của cytokine đã đạt
được những thành tựu đáng kể. Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh
học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm.
Ngoài ra, các phân tử này cũng đóng vai trò quan trọng trong các bệnh lý như:
bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư, các bệnh lý viêm mạn tính (viêm đại
tràng mạn, bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp, bệnh vảy nến...), viêm gan
siêu vi, nhiễm HIV v.v... Các cytokine cũng được sử dụng là các tác nhân trị
liệu (yếu tố tạo khóm tế bào hạt được sử dụng trong huyết học) hay là các đích
điều trị (như TNF trong bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp v.v...).
Vì vậy hiện nay, việc nghiên cứu và sử dụng các loại cytokine tái tổ hợp
đang mở ra một hướng điều trị tích cực mới trong y học. Hàng loạt các cytokine
khác nhau đã được nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm trong điều trị lâm sàng
như: hIL-2, hIL-7, IFN-a, G-CSF, GM-CSF, hIL-11 và EPO [45], [50]. Ngoài
ra, còn có một số loại cytokine khác đã được sử dụng nhưng còn hạn chế do
chưa kiểm soát được khả năng thải loại cũng như các hiệu ứng phụ khác như
TNF-a, hIL-12 v.v…
Các loại cytokine có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu
và không đặc hiệu, do đó các hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào tác dụng
8
điều trị của cytokine như là một tác nhân dược lý hoặc đích tác động theo bốn
hướng chính:
Dùng các chất đối vận với các cytokine được xem là có vai trò gây bệnh.
Sử dụng các kháng thể kháng cytokine như kháng thể kháng TNF a trong điều
trị nhiễm trùng huyết hoặc ức chế hIL-6 trong viêm đa khớp dạng thấp v.v…
Dùng các cytokine để kích thích các hoạt động sinh lý của cơ thể:
erythropoietin trong điều trị thiếu máu, các yếu tố kích thích tạo khóm trong
điều trị giảm bạch cầu v.v…
Sử dụng cytokine trong liệu pháp điều hoà miễn dịch, tự miễn dịch. hIL-
6, hIL-7 được xác định như một yếu tố biệt hóa tế bào B, đóng một vai trò quan
trọng trong sự phát triển của các tế bào B huyết tương sản xuất kháng thể. hIL-
6 kích hoạt tế bào B qua hoạt tính của chúng trên các nguyên bào huyết tương
và gần đây đã cho thấy gián tiếp kích hoạt tế bào B sản xuất kháng thể bằng
cách hoạt hóa các tế bào T CD4 có đặc tính hỗ trợ tế bào B thông qua sự sản
xuất IL-21 v.v…
Dùng cytokine trong điều trị nhiễm virus, bệnh ung thư: điều trị viêm
gan bằng interferon, hIL-12 [27], [38], điều trị ung thư bằng hIL-2 v.v…
Một số thành tựu trong nghiên cứu và ứng dụng cytokine trong điều trị
bệnh như: hIL- 11 và hIL-3 được sử dụng để điều trị bệnh thrombocytopenia
do chúng có khả năng kích thích sự tạo thành tiểu cầu [82]. hIL-2 được sử dụng
để điều trị một số bệnh ung thư như ung thư biểu mô, ung thư mạch bạch huyết,
đặc biệt là ung thư thận và da; hIL-7 được ứng dụng giúp hồi phục mạch bạch
huyết sau khi phẫu thuật, sử dụng trong các bệnh suy giảm hệ miễn dịch như
HIV/AIDS do có khả năng bảo vệ và thúc đẩy sản sinh các tế bào bạch cầu
lympho T CD4+ và T CD8+. hIL-12 được sử dụng để làm tá chất cho sản xuất
vaccine [6], [8].
Interferon là một nhóm trong số các nhóm chính của cytokine cũng có
nhiều nghiên cứu và ứng dụng trong y học. Từ năm 1991, FDA đã đồng ý cho
9
sử dụng một số loại IFN để chữa một số bệnh do virus như HBV, HCV. Những
sản phẩm này gồm có interferon 2b (Intron A), interferon 2b (Roferon,
infergen) và peginterferon (PEG-IFN). Đặc biệt, IFN có thể được đưa vào cơ
thể bằng đường miệng với một liều lượng thấp hơn nhưng cho hiệu quả cao
hơn đường tiêm [11].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước
Trong bối cảnh hiện nay, Bộ Y tế rất khuyến khích việc nghiên cứu tự
sản xuất thuốc trong nước với giá thành rẻ và chất lượng tốt để chữa bệnh.
Cùng với những ưu điểm của các loại cytokine nói chung cũng như IL nói
riêng, ở Việt Nam đã và đang có một số công trình nghiên cứu, chuyển giao
công nghệ về việc sản xuất và ứng dụng các loại cytokine trong điều trị bệnh
cho con người.
Trong đó, nổi bật nhất là công trình nghiên cứu và sản xuất interleukin-
2 ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư năm 2010 do PGS. TS. Trương Nam
Hải, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam thực hiện đã thu được protein hIL-2 tái tổ hợp có độ tinh sạch 95% và có
hoạt tính tốt, đang được triển khai sản xuất ở quy mô công nghiệp [1]. Điều này
mở ra triển vọng rất lớn đối với bệnh nhân ung thư, khi theo đánh giá của tổ
chức y tế thế giới WHO thì Việt Nam hiện đứng trong 50 nước top 2 của bản
đồ ung thư thế giới khi mỗi ngày có khoảng 315 người chết vì ung thư [100].
Ngoài ra, trung tâm Công nghệ sinh học TP. HCM đang tiến hành các
nghiên cứu về cytokine hIL-33, thuộc họ cytokine tiền viêm hIL-1 (IL-1β, IL-
1α, IL-1Ra, hIL-18, hIL-33) được phát hiện vào năm 2005. Cytokine hIL-33
giữ vai trò kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng của
cơ thể chống lại tác nhân xâm nhiễm. Ức chế hoạt động của hIL-33 có thể là
liệu pháp tiềm năng cho việc điều trị các bệnh tự miễn như thấp khớp, hen
suyễn, dị ứng quá mẫn v.v…, hIL-33 là một cytokine ít được nghiên cứu trên
thế giới nhưng Việt Nam đã thành công trong việc thử nghiệm ứng dụng điều
10
trị hen suyễn ở chuột. Hiện nhóm nghiên cứu của trung tâm Công nghệ sinh
học TP. HCM đang hướng đến mục tiêu tạo ra thuốc trị bệnh tự miễn như các
loại thuốc ngoại nhập đang có mặt trên thị trường, từng bước tiến đến tự sản
xuất thuốc phục vụ cho nhu cầu trong nước [2].
1.3. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN INTERLEUKIN 7 TÁI TỔ HỢP TRONG
CÂY THUỐC LÁ
Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp và thực vật chuyển gen đã
tạo nền tảng cho việc sản xuất protein từ thực vật hoặc tế bào thực vật. Những
kết quả đầu tiên đã được công bố từ thập niên 80 của thế kỷ 20 [5]. Việc sản
xuất thành công hormone tăng trưởng của người trong cây thuốc lá và hạt hướng
dương [10]; albumin trong thuốc lá và khoai tây [87] đã cho thấy hệ thống nuôi
cấy thực vật có thể được sử dụng để sản xuất các protein của động vật có vú,
trong đó có con người.
Erythropoietin là một trong những cytokine đầu tiên được sản xuất bằng
tế bào thực vật. cDNA mã hóa erythropoietin của người được biểu hiện qua
promoter 35S của virus khảm súp lơ (CaMV) trong tế bào thuốc lá BY2, tuy
nhiên năng suất còn thấp, chỉ đạt 0,0026% tổng số protein tan [51].
Tiếp sau erythropoietin thì yếu tố GM-CSF của người cũng được tập
trung nghiên cứu, biểu hiện ở thực vật. Ban đầu, chúng được biểu hiện trong
thuốc lá [21],[46] và dịch treo tế bào lúa [39], [40], [84]. Để tăng năng suất, các
loại muối khoáng hoặc 5% (w/v) gelatin đã được bổ sung vào môi trường nuôi
cấy, giúp sản lượng của hệ thống đạt 129 mg/l. Ngoài biểu hiện trên cây thuốc
lá và tế bào lúa thì yếu tố GM-CSF còn được biểu hiện trên một số cây trồng
khác như: trong lá mía chuyển gen là 0,02% [95], trong lá thuốc lá khoảng
0,22% của protein tan tổng số [28], trong hạt giống lúa chuyển gen GM-CSF
tái tổ hợp tích lũy lên tới 1,3% của protein tan tổng số [79], đặc biệt hàm lượng
GM-CSF biểu hiện cao nhất là ở khoai tây lên tới 2% protein tổng số với lớp
vỏ protein biến đổi [106]. Trong hầu hết các trường hợp, các hoạt tính sinh học
11
của GM-CSF tái tổ hợp đã được chứng minh ở mức độ phòng thí nghiệm, và
trên cơ thể sống trong mô hình chuột [61].
Bảng 1.1. Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật
Cytokine Cây
biểu hiện
Đặc điểm của
cassette biểu hiện
Hàm lượng
protein thu được
GM-CSF Mía Promoter Mubi-1 của ngô hoặc
Scubi-9 của mía
0,02% protein tan
tổng số [92].
GM-CSF Thuốc lá Promoter Gt1, Gt3 (glutelin) và tín
hiệu peptide, nos terminator
0,005 - 0,03% protein
tan tổng số [77].
GM-CSF Thuốc lá Promoter Gt1 và tín hiệu peptide,
nos terminator
1,3% protein tan tổng
số [78].
GM-CSF Lúa Promoter Gt3α, tín hiệu peptide
glutelin, nos terminator
0,5 - 14 µg/hạt [41],
[60].
Murine
GM-CSF Thuốc lá
Promoter RbcS1, tín hiệu peptide,
KDEL
19 µg/g lá tươi;
0,22% [28].
IL-2 Khoai tây Promoter patatin, nos terminator 115 U/mg protein
tổng số [69].
IL-4 Thuốc lá,
khoai tây Promoter 35S, KDEL
0,1% protein tổng số
ở thuốc lá; 0,08%
protein tổng số ở
khoai tây [49].
IL-10 Thuốc lá
Promoter 35S cùng trình tự tăng
cường, ELP, KDEL, nos
terminator
0,27% protein tan
tổng số [68].
IL-10 Thuốc lá (A). Promoter 35S CaMV, có hoặc
không có his tag, peptide lục lạp
(A). 7 ng/mg protein
tổng số (không có his
12
(B). Promoter 35S CaMV, his tag,
peptide ty thể
tag); 43 ng/mg (có his
tag).
(B). Không biểu hiện
[52].
IL-12 Thuốc lá Promoter 35S và terminator 40 ng/g [29].
IL-12 Cà chua Promoter 35s cùng trình tự
tăng cường, 35S terminator
7,3 µg/g ở lá; 4,3 ng/g
ở quả [30], [77].
IL-13 Thuốc lá Hai promoter 35S, KDEL, nos
terminator
0,15% protein tổng số
[91].
IL-18 Thuốc lá Promoter 35S, nos terminator
0,004 - 0,051%
protein tổng số, 351
ng/g [103].
IFN-α2b
IFN-α8 Khoai tây - 560 IU/g mô [65]
IFN-α2b Cà rốt
(A). Promoter 35S, nos terminator,
tín hiệu mục tiêu calreticulin
(B). Promoter MLL, nos
terminator, tín hiệu mục tiêu
calreticulin
(A). 26,8 x 103 U/g
FW của lá tươi
(B). 8,56 x 103 U/g
FW của rễ [48].
IFN-β
Biểu hiện
tạm thời
lá rau
diếp
Promoter 35S, nos terminator 3,1 x 104 IU/ml [34]
TNF-α Khoai tây Promoter 35S, trình tự SEKDEL 15 µg/g mô [66]
FGF8b Thuốc lá
Promoter 35S cùng hai trình tự
tăng cường, 35S terminator,
c-myc, his, KDEL
4,1% protein tổng số
[73].
13
Ngoài ra, một số loại cytokine khác cũng được nghiên cứu biểu hiện như:
IL-12 [29], [30], [77], [84], IL-13 [94], cardiotrophin 1 [42], IL-18 [103], yếu
tố hoại tử khối u TNF-α được biểu hiện trong khoai tây với hàm lượng tích lũy
đạt khoảng 15 µg/1g mô thực vật [66].
Những kết quả này mở ra hướng nghiên cứu sử dụng thực vật như các
bioreactor để sản xuất các protein có hoạt tính sinh học ổn định [32], ứng dụng
trong y học.
Ở Việt Nam, năm 2012, Phan Tường Lộc và cộng sự đã chuyển thành
công gen HIV-1 p24 và gen aadA vào lục lạp cây thuốc lá Virginia (V2), là
giống thuốc lá được nhập nội và thuần hóa ở Việt Nam cho năng suất cao.
Gen HIV-1 p24 mã hóa cho protein p24 kháng nguyên vỏ của HIV. Protein tái
tổ hợp p24 được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu như điều chế vaccine đa
thành phần và kit chẩn đoán HIV. Gen aadA quy định tính kháng hai loại
kháng sinh spectinomycin và streptomycin, được dùng làm marker chọn lọc
cây chuyển gen [3].
Hiện nay, ngoài phương thức biến nạp tạo cây chuyển gen, còn có thể sử
dụng phương pháp biểu hiện tạm thời để biểu hiện protein ở thực vật.
Hệ thống biểu hiện tạm thời cho thấy là một phương pháp thuận lợi để
phân tích khả năng biểu hiện của protein đích trong thực vật do phương pháp
này không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong hệ gen của thực vật, thời
gian thực hiện ngắn, cho kết quả nhanh và đặc biệt là có thể biểu hiện được tốt
ngay cả trên những mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá [24]. Hiện nay có hai
phương pháp để biểu hiện tạm thời là sử dụng virus thực vật làm vector và
phương pháp Agro-infiltration. Tuy nhiên, phương pháp Agro-infiltration tỏ ra
chiếm ưu thế hơn do mức độ biểu hiện protein cao, quy trình thực hiện đơn giản
và có thể chuyển những đoạn gen có kích thước lớn hơn so với phương pháp
sử dụng virus thực vật làm vector chuyển gen.
14
Phương pháp Agro-infiltration đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu
biểu hiện và sản xuất kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 với hàm
lượng cao tới 200 mg HA/kg lá tươi [101], 675 mg HA/kg lá tươi [56], 400 mg
NA/kg lá tươi [53] … Bằng cách sử dụng hệ thống biểu hiện tạm thời này,
Vaquero và đồng tác giả đã biểu hiện thành công scFv; chuỗi nặng, chuỗi nhẹ
của kháng thể [93]. Phân tử kháng thể đầy đủ có thể biểu hiện bằng cách tiêm
đồng thời hai chủng vi khuẩn Agrobacterium mang riêng biệt chuỗi nặng và
chuỗi nhẹ vào lá cây. Phương pháp biểu hiện tạm thời này phù hợp để kiểm tra
sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào thực vật, đồng thời cũng để kiểm
tra sự hoạt động của cấu trúc vector vừa thiết kế trước khi tiến hành tạo cây
chuyển gen [23].
Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy thực vật là hệ thống có nhiều ưu
điểm để biểu hiện protein trong đó có protein interleukin 7 tái tổ hợp.
15
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Cây thuốc lá N. benthamiana được cung cấp bởi phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ
Việt Nam.
2.1.2. Các chủng vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp từ Viện
Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam gồm:
Chủng vi khuẩn E. coli DH-5α, A. tumefaciens C58C1/pGV2260 mang
yếu tố phiên mã FUS3 được ứng dụng để đồng biểu hiện tạm thời với vector
đích chứa trong vi khuẩn Agrobacterium cho sự biểu hiện của protein tái tổ hợp
dưới sự kiểm soát của promoter CaMV 35S
Dòng tế bào 2E8 do Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp được sử
dụng để đánh giá bước đầu hoạt tính sinh học của interleukin 7.
2.1.3. Các gene và vector
Vector pBSK mang gene interleukin 7 tái tổ hợp đã được tối ưu mã để
biểu hiện ở thực vật.
Vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP [12] mang promoter 35S chứa
gene kháng kháng sinh ampicilin, trình tự 100xELP và đuôi Cmyc-tag, KDEL;
vector hỗ trợ biểu hiện protein pMON6530/Hc-Pro.
Vector chuyển gene pCB301 chứa gene kháng kháng sinh kanamycin.
2.1.4. Hóa chất và thiết bị máy móc
Thang DNA 1kb (Fermentas), marker protein, Master Mix 2X (Promega),
Kit tinh sạch DNA AccuPrep® Gel Purification, kit tách chiết plasmid (Bioneer).
16
Các loại hoá chất: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, agarose, trypton, KCl, Tris-
HCl, EDTA, SDS. Các loại kháng sinh kanamycin, chloramphenicol,
carbenicillin, spectinomycin của các hãng Fermentas, Invitrogen, … Các loại
enzyme sử dụng của hãng Fermentas: BamHI, NcoI, HindIII, T4 ligase…
Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: máy nghiền mẫu (Retsch), máy nuôi
lắc, máy ly tâm lạnh (Hettich), máy PCR (Thermo Scientific), bộ điện di
DNA(Biorad), bộ điện di protein, máy chụp ảnh gel (Cleaver Scientific), thiết bị
hấp khử trùng (Hirayama), máy đo quang phổ (Shimadzu), máy khuấy từ gia
nhiệt (Velp), máy đo pH (Horiba), cân kỹ thuật, cân phân tích (Sartorius), buồng
an toàn sinh học cấp II (Esco), máy sấy Speed-Vac, ELISA reader …
2.1.5. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong đề tài
Ký hiệu Trình tự nucleotide (5’ - 3’)
Sản
phẩm
(bp)
IL7_BamHI_R CCGGATCCTCCCTGAAAATACAGGTTTTCGTGGTGGTGG 564
IL7_BamHI_F GAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGATCC
35S-SQF CACTGACGTAAGGGATGACGC Gene
+ 250 35Sterm CTGGGAACTACTCACACA
2.1.6 . Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Các thí nghiệm trong đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm về
Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
17
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
RB NPT II T35S 100xELP Cmyc Interleukin 7 P35S LB KDEL His-tag Interleukin 7
Thay đổi mã di truyền, tổng hợp nhân tạo
Thiết kế vector chuyển gene mang gene Interleukin 7
Cây thuốc lá
Chuyển gene, chọn dòng và phân tích biểu hiện protein IL-7
18
2.2.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu
hiện ở thực vật
Cơ sở lý thuyết
Mã di truyền là phần mật mã quy định thông tin về trình tự các acid amin
được mã hóa dưới dạng các trình tự nucleotide trên gene, trong đó ba nucleotide
liên tiếp sẽ quy định một loại acid amin nhất định. Acid amin có thể được quy
định bởi nhiều bộ ba mã di truyền khác nhau [10], [43]. Do đó, để phù hợp và
tăng khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp của gene interleukin 7 trong hệ thống
thực vật, chúng tôi tiến hành thay đổi những mã di truyền hiếm của gene ngoại
lai interleukin 7 thành mã di truyền phổ biến trong thực vật mà không làm thay
đổi trình tự acid amin của protein.
Phương pháp
Quá trình thay đổi mã di truyền của gene interleukin 7 gồm các bước:
Bước 1: Khai thác thông tin trình tự nucleotide gene interleukin 7 trên
Ngân hàng Gene quốc tế, mã số 3574 [28] và trình tự mRNA, mã số J04156.1.
Bước 2: Thay thế các codon hiếm trong gene interleukin 7 bằng các
codon phổ biến ở thực vật bằng phần mềm Codon Optimization 2.0 dựa trên
thông tin tần suất các codon phổ biến ở thực vật trong cơ sở dữ liệu mã di truyền
Codon Usage Database [18]. Ngoài ra, trình tự ATTTA được loại bỏ và sử dụng
phần mềm Invitrogene để tối ưu nhằm giảm thiểu sự hình thành mRNA thứ
cấp.
Bước 3: Bổ sung các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn SacI, NcoI,
HindIII, BamHI vào trình tự gene nhằm phục vụ cho quá trình cắt và ghép nối
gene khi thiết kế vector chuyển gene.
Bước 4: Thêm đoạn trình tự mã hoá cho epitope c-Myc tag và His-tag
vào đầu 3’ của gene interleukin 7 để kiểm tra sự biểu hiện của protein
interleukin 7 tái tổ hợp trong thực vật thông qua các phương pháp lai miễn dịch
Western blot và phân tích ELISA.
19
Bước 5: Sử dụng phần mềm BioEdit để kiểm tra và so sánh trình tự
nucleotide và trình tự acid amin suy diễn của gene interleukin 7 trước và sau
khi đổi mã. Gene interleukin 7 tái tổ hợp được đặt tổng hợp nhân tạo tại hãng
Epoch Life Science (Mỹ) và được nhân dòng trong vector pBSK-IL7.
2.2.2. Thiết kế mồi
Sử dụng phần mềm BioEdit và trình tự gene interleukin 7 tái tổ hợp cùng
trình tự gene đã công bố trên Ngân hàng Gene quốc tế để thiết kế các cặp mồi
phục vụ nghiên cứu trong luận án, thể hiện tại bảng 2.1
2.2.3. Thiết kế vector chuyển gene mang gene interleukin 7 tái tổ hợp
Quá trình thiết kế vector chuyển gen gồm các bước chính sau: Bước 1.
Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng lai; Bước 2. Ghép nối các đoạn gene tạo
plasmid tái tổ hợp; Bước 3. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli
DH-5a để nhân dòng; Bước 4. Chọn dòng khuẩn lạc bằng phương pháp colony-
PCR và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn.
a. Nhân dòng gene IL-7
Đoạn gene IL-7 được nhân lên bằng phản ứng PCR sử dụng khuôn là
plasmid pBSK-IL7 với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R.
Phản ứng PCR được tiến hành trong điều kiện: 50 µl hỗn hợp phản ứng gồm
0,3 µM mồi, 0,2 µM dNTPs, 5 µl đệm 10X Pwo SuperYield PC, 2,5U Pwo
SuperYield DNA polymerase, 20 ng khuôn. Chu trình nhiệt: 940C/5 phút, 30
chu kỳ lặp lại các bước 940C/30 giây, 500C/30 giây, 720C/1 phút 30 giây. Sau
đó giữ 720C/10 phút và sản phẩm được giữ bảo quản ở 150C. Kết quả PCR được
kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
b. Ghép nối gene IL-7 vào vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP
* Phản ứng cắt enzyme giới hạn
Cơ sở lý thuyết
Enzyme giới hạn nhận biết các vị trí cắt đặc hiệu trên phân tử DNA. Chúng
phân hủy liên kết phosphodieste của bộ khung DNA nhưng không làm ảnh hưởng
20
tới bases. Các liên kết hóa học ở các gene bị enzyme giới hạn cắt có thể nối lại
nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau cùng sự xúc tác của enzyme ligases.
Phương pháp
Vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP và gene IL-7 được cắt đồng thời
bằng enzyme giới hạn BamHI theo bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 H2O deion 9,5
2 Buffer 10x 10
3 DNA (~1µg) 80
4 Enzyme BamHI 0,5
Phản ứng được ủ ở 370C trong vòng 2 - 4 giờ.
* Phản ứng lai ghép đoạn gene IL-7 với pRTRA 35S-100xELP
Sản phẩm tinh sạch - đoạn gene IL-7 được ghép nối vào vector pRTRA 35S-
100xELP tạo plasmid tái tổ hợp mang gene IL-7 (ký hiệu pRTRA 35S/IL7-cmyc-
histag-100xELP)
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng lai
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Nước 0
2 Buffer 10x 1
3 Sản phẩm cắt (vector) 5
4 Sản phẩm cắt (IL-7) 3
5 Enzyme T4 ligation 1
Tổng thể tích 10
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 220C trong 1 giờ 30 phút.
Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế
bào khả biến E.coli DH-5α.
21
c. Biến nạp sản phẩm ghép nối gene vào tế bào khả biến E.coli DH-5α
bằng phương pháp sốc nhiệt
* Chuẩn bị tế bào khả biến
Cơ sở lý thuyết
Tế bào nuôi cấy trên môi trường mới đến đầu pha log và được làm sạch
nhờ việc rửa nhiều lần bằng CaCl2 0,1M. Dưới tác dụng của muối CaCl2, thành
tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho DNA có thể
chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột. Tế bào chứa
DNA tái tổ hợp có khả năng biểu hiện các gene kháng kháng sinh nên được
chọn lọc trên môi trường chứa chất kháng sinh đó.
Phương pháp tạo tế bào khả biến
Tế bào khả biến E. coli DH-5α được tạo theo phương pháp của Sambrook
và cộng sự (1998) có cải tiến ở bước rửa cặn khuẩn trong CaCl2 0,1M sau khi ly
tâm. Bước này được lặp lại ba lần, để trong đá lần đầu và thứ hai 30 phút, lần
thứ ba 45 phút.
* Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli DH-5α
Vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP được biến nạp vào tế bào
khả biến E.Coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Quá trình biến nạp được
thực hiện như sau:
• Bổ sung 5 µl vector vào tế bào khả biến và đảo nhẹ
• Ủ trong đá 15 - 30 phút.
• Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phút 30 giây.
• Để trong đá 15 - 30 phút.
• Bổ sung 200 µl LB lỏng.
• Nuôi lắc 200v/phút ở 370C trong 1giờ.
• Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc
carbenicillin 50 mg/L.
• Nuôi qua đêm ở 370C
22
* Kiểm tra khuẩn lạc dương tính bằng kỹ thuật colony PCR
Kỹ thuật colony-PCR cũng giống như PCR, nhưng chỉ khác là mẫu DNA
được thay bằng khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị
phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho
phản ứng PCR nhân gene bằng cặp mồi đặc hiệu.
* Tách chiết plasmid từ tế bào vi khuẩn
Cơ sở lý thuyết
Dưới tác dụng của NaOH và SDS, thành tế bào vi khuẩn sẽ bị phá vỡ
giải phóng DNA genome, các phân tử protein và DNA genome sẽ bị biến tính.
Khi thay đổi độ pH của dịch tách chiết tế bào bằng kali acetae, các phân tử
protein và DNA genome sẽ bị kết tủa. Phần protein còn sót lại, cùng với các
mảnh vỡ của tế bào sẽ được tủa bằng hồn hợp chloroform : isoamylalcohol
(24:1 v/v), sau ly tâm sẽ được tách khỏi phần dung dịch DNA plasmid. DNA
plasmid nằm ở pha trên được thu lại bằng cách tủa trong isopropanol và rửa lại
bằng cồn 70%. Sau đó, sử dụng nước deion khử trùng có bổ sung RNase
10µg/µl để hòa tan DNA plasmid và loại bỏ RNA có trong dung dịch.
Phương pháp tách plasmid
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc mang vector pRTRA 35S/IL7-
cmyc-histag-100xELP đã được kiểm tra colony PCR trong môi trường LB
lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/L ở 370C qua đêm. Các tế bào E.coli mang
plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân bằng được cho vào ống eppendorf 2ml ly
tâm thu cặn. Bổ sung sol I (Glucose 50 mM, TrisHcl 25 mM; EDTA 10 mM
pH 8,0), voltex để hòa tan và ổn định tế bào. Tiếp tục bổ sung sol II (NaOH
0,2N; SDS 1%), đảo nhẹ để phá vỡ thành và màng tế bào bằng kiềm và chất
tạo sức căng bề mặt. Tiếp tục bổ sung sol III (CH3COOK 3M, CH3COOH 5M),
đảo nhẹ để biến tính và tủa DNA hệ gen và protein, phần tủa bị loại bỏ khỏi
dung dịch chứa DNA plasmid bằng ly tâm, thu 800 µl dịch nổi. Bổ sung 800 µl
chloroform : isoamylalcohol (24 : 1 v/v), đảo nhẹ, ly tâm 13.000 rpm trong 10
23
phút, thu 500 µl dịch nổi phía trên, chuyển sang ống epppendorf 1,5 ml. Bổ
sung 1 ml isopropanol, ủ 30 phút trong -200C, ly tâm thu cặn. Bổ sung 1ml
ethanol 70%, ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, thu cặn. Làm khô cặn bằng máy
Speed-vac trong 2 phút. Hòa tan DNA bằng 30 µl nước deion khử trùng có bổ
sung RNase 10 µg/µl. Bảo quản ở -200C.
*. Thiết kế cấu trúc tối ưu biểu hiện chuyển gen pCB301_IL7/ELP
Thực hiện phản ứng cắt vector pRTRA 35S-IL7-cmyc-histag-100xELP
và vector pCB301 bằng enzyme HindIII và loại bỏ gốc phosphate bằng enzyme
SAP. Sản phẩm ghép nối DNA vào vector pCB301 được biến nạp vào vi khuẩn
E.coli DH-5α và chọn lọc trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh
kanamycin 50 mg/l. Plasmid tái tổ hợp pCB301_IL7/ELP sau khi được chọn
dòng bằng PCR và cắt kiểm tra bằng enzyme NcoI sẽ được biến nạp vào vi
khuẩn A.tumefaciens C58C1/pGV2260 bằng xung điện để phục vụ cho nghiên
cứu biểu hiện tạm thời.
2.2.4. Biểu hiện tạm thời interleukin 7 ở cây thuốc lá
Quá trình biểu hiện tạm thời protein IL-7 gồm các bước chính sau:
Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn: Chủng vi khuẩn A.
tumefaciens mang vector pCB301_IL7/ELP mã hóa cho protein IL-7 và chủng
A.tumefaciens mang vector chứa gene mã hóa cho protein HcPro ức chế câm
gene hoạt động trong cây được nuôi cấy riêng trong 200ml môi trường YEB có
bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/ml và rifamycin 50 mg/ml, nuôi lắc qua
đêm ở 280C, 140 rpm. Sau 24 giờ, chuyển 50 ml dịch khuẩn sang bình lớn, bổ
sung 500 ml môi trường LB với kháng sinh thích hợp vào hai bình nuôi cấy,
nuôi thêm 24 giờ, ở 280C, 140 rpm. Ly tâm 4000 rpm, 10 phút, 40C để thu cặn
khuẩn, hòa trong buffer (10 mM 2 - N - morpholimo MES acid
ethanesulphonic, 10 mM MgSO4, pH 5,6). Trộn lẫn 2 dịch khuẩn, pha loãng
trong đệm để nồng độ khuẩn cuối cùng OD600 0,5 chuẩn bị cho quá trình biến
nạp vào cây thuốc lá N.benthamiana.
24
Bước 2. Chuẩn bị cây thuốc lá N. benthamiana
Cây con sau giai đoạn nuôi cấy invitro khoảng 4 tuần tuổi được tiến hành
ra cây bầu nhỏ. Sau 1 - 1,5 tuần chuyển cây từ bầu nhỏ sang bầu lớn, mỗi ngày
tưới 1 - 2 lần nước. Khi cây 4 - 6 tuần và có từ 8 đến 12 lá sẽ được sử dụng để
biến nạp infiltration.
Bước 3. Biến nạp
Tiến hành bọc nilon quanh bầu đất và úp ngược cây chìm trong bình chứa
dịch khuẩn; đặt vào bình hút chân không. Tiến hành hút chân không ở điều kiện
25 inches Hg trong 2 phút, sau đó xả từ từ. Các cây sau biến nạp được đặt trong
nhà kính ở 21oC - 26oC. Sau 6 ngày, tiến hành thu lá và bảo quản ở -80oC để
chuẩn bị kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp
western blot.
2.2.5. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử
2.2.5.1. Kỹ thuật PCR
DNA tổng số từ các dòng chuyển gene được tách chiết và sử dụng làm
khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R. Sản phẩm
PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
2.2.5.2. Lai Western blot
Cơ sở lý thuyết
Wertern blot hay còn gọi là protein immuno blot là kỹ thuật lai giữa
protein với protein (kháng nguyên - kháng thể). Protein kháng nguyên được
phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang. Phương pháp này sử
dụng điện di trên gel acrylamide để phân tách các protein theo độ dài của mạch
polypeptide. Sau đó, chuyển lên màng lai (thường dùng màng nitrocellulose
hoặc màng PVDF), ở đó chúng được gắn bằng các kháng thể đặc hiệu để phát
hiện protein mục tiêu.
25
Phương pháp
Tách chiết protein tan tổng số
Thu 1 gam sinh khối nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày
sứ, bổ sung đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X. Thu dịch nghiền vào
ống eppendorf 2ml, ly tâm 10.000 rpm ở 4oC, thu dịch protein ở phía trên.
Protein tổng số được định lượng bằng phương pháp so màu của Bradford
(1976) [20] dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự đổi màu xảy
ra khi CBB (Coomasie Brilliant Blue) liên kết với protein trong dung dịch acid.
Điện di protein tổng số và chuyển màng
Protein được phân tách bằng điện di SDS-PAGE 12% trong điều kiện
không khử, sau đó chuyển lên màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng Fast
blotter G2 (Thermo Scientific Pierce) ở 25V, 1,3A trong 20 phút. Tháo màng,
tráng bằng nước deion trong 5 phút.
Bảng 2.4. Thành phần gel SDS-PAGE
Thành phần Gel tách Gel cô
Bản kính 1ml Bản kính 1,5ml Bản kính 1ml Bản kính 1,5ml
Nước deion 0,55 ml 1,1 ml 0,45 ml 1,3 ml
Tris HCl 1,125 ml 1,25ml 0,2 ml 0,5 ml
Glycerol 50% 0,9 ml 1,8 ml - -
Acrylamid 30% 1,89 ml 3,78 ml 0,14 ml 0,35 ml
SDS 10% 45 µl 90 µl 4 µl 10 µl
APS 10% 30 µl 60 µl 8 µl 20 µl
TEMED 3 µl 6 µl 1 µl 2 µl
* Tris HCl 1,5M; pH 8,8 cho gel tách.
Tris HCl 0,5M, pH 6,8 cho gel cô.
Blocking protein
Protein trên màng lai được blocking bằng sữa tách béo 5% (pha trong
PBS 0,05% Tween); ủ với kháng thể 1 anti c-myc nồng độ 180 µg/ml pha loãng
26
tỷ lệ 1 : 100 qua đêm ở 40C, rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 5
phút; ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG cộng hợp HRP (Horseradish
Peroxidase) pha loãng tỷ lệ 1 : 10.000 trong 1 giờ. Rửa màng bằng dung dịch
PBST 3 lần, mỗi lần 10 phút
Hiện màu protein
Sự có mặt của protein interleukin 7 trong mẫu được phát hiện nhờ phản
ứng hiện màu bằng cơ chất DAB (Diaminobenzidine) trong 15 phút đến khi
hiện băng màu nâu.
2.2.5.3. Sử dụng kỹ thuật ELISA để phân tích sự tích lũy IL-7 tái tổ hợp
Kỹ thuật ELISA gián tiếp định lượng protein interleukin 7 thông qua
định lượng protein c-myc được tiến hành theo phương pháp của Sun và cộng
sự với một số cải tiến (2006) [88], gồm các bước chính: Bước 1: Pha loãng dịch
chiết protein tổng số của các mẫu chứa interleukin 7 đến nồng độ 200 µg/ml,
sử dụng 100 µl mẫu tra vào các ô trên đĩa microplate, mỗi mẫu lặp lại 3 lần;
Bước 2: Ủ qua đêm ở 40C; rửa đĩa 2 lần bằng PBS-T (Tween 0,05%); Bước 3:
Blocking bằng sữa tách béo 5% pha trong PBS trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng;
rửa đĩa 2 lần; Bước 4: Ủ với kháng thể 1 anti c-myc (180µg/ml) pha loãng 1:100
trong 2 giờ; lặp lại 3 lần; Ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG cộng hợp HRP
(Thermo scientific Pierce) pha loãng 1:10.000 trong 1 giờ và cơ chất hiện màu
là TMB; Bước 5: Dùng HCl 1N để dừng phản ứng màu; Đo màu ở bước sóng
630nm.
2.2.6. Tinh sạch protein tái tổ hợp interleukin 7
Để loại bỏ ảnh hưởng của các protein không đặc hiệu, đồng thời làm tăng
độ tinh sạch qua đó làm tăng hoạt tính và khả năng sử dụng của protein, chúng
tôi tiến hành tinh sạch protein IL-7. Dựa trên cấu trúc gene interleukin 7 tái tổ
hợp đã thiết kế, chúng tôi sử dụng phương pháp tinh sạch sử dụng cột sắc ký ái
lực Ni-NTA (IMAC) và phương pháp tinh sạch đảo chiều thuận nghịch qua
màng mITC.
27
2.2.6.1. Phương pháp tinh sạch IMAC
Cơ sở lý thuyết
Đây là phương pháp sử dụng ái lực giữa cấu tử gắn (ligand) và protein
cần tách. Cột sắc ký ái lực có chứa các hạt gel Sepharose có gắn ion Ni2+ trên
bền mặt. Khi tiến hành sắc ký, protein cần tách do có histidine nên sẽ gắn với
các ion Ni2+ trong khi các loại protein khác sẽ bị rửa trôi. Sau khi rửa sạch tạp
chất, protein cần tách được thu nhận lại bằng cách sử dụng Imidazole, chất này
sẽ cạnh tranh vị trí gắn với ion Ni2+. Kết quả giúp thu nhận được protein đích
với độ tinh sạch cao.
Phương pháp
* Chuẩn bị cột
Lắc đều lọ đựng Pro BondTM resin. Hút 2ml dung dịch cho vào cột tinh
sạch, để lắng dần hoặc ly tâm 800 rpm trong 1 phút, hút bỏ dịch.
Bổ sung 6 ml nước deion khử trùng, đảo đều. Để lắng hoặc ly tâm, hút
bỏ dịch. Bổ sung 6 ml Native binding buffer, đảo đều, ly tâm bỏ dịch, thực hiện
2 lần
* Tinh sạch
Thêm dung dịch đã siêu âm và lọc vào cột, đảo đều trong 30 - 60 phút.
Ly tâm, thu cặn; phần dịch để riêng. Tiếp tục bổ sung 8 ml Native wash
buffer vào cột. Ly tâm thu cặn; phần dịch để riêng. Lặp lại 4 lần.
Bổ sung 8 - 12 ml Native Elution buffer, thu từng phân đoạn 1 ml để điện
di kiểm tra.
2.2.6.2. Phương pháp tinh sạch mITC
Nghiền 100 g lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Bổ sung 200 ml Tris-
HCl 50 mM (pH 8) lạnh. Ly tâm 25.000 rpm trong 30 phút ở 4oC. Bổ sung NaCl
đến nồng độ 2M. Ly tâm 25.000 rpm trong 30 phút ở 4oC. Dung dịch đưa qua
màng polyethersulfone (PES) 0,22 µm ở 40C để thu dịch chiết trước xử lý. Dịch
chiết được làm ấm đến nhiệt độ phòng và lọc qua màng cellulose acetate 0,2 µm
28
sử dụng máy bơm. Rửa màng 2 lần bằng NaCl 2M để loại protein lẫn. Nước
Milipore-Q lạnh được chuyển qua màng lọc để thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp.
2.2.7. Đánh giá hoạt tính protein interleukin 7 tái tổ hợp
Chúng tôi sử dụng dòng tế bào 2E8 để bước đầu đánh giá hoạt tính của
protein Interleukin 7 tái tổ hợp. 2E8 là một dòng tế bào hoàn toàn phụ thuộc
vào interleukin 7 để tồn tại, sinh trưởng và sinh sản [69].
Cơ sở lý thuyết
Tế bào 2E8 là tế bào phụ thuộc hoàn toàn vào interleukin 7. Khi môi
trường nuôi cấy không được bổ sung IL-7 thì tế bào sẽ chết sau 48 giờ. Vì thế,
dòng tế bào 2E8 được sử dụng là dòng chuẩn để xác định hoạt tính sinh học
của protein IL-7 tự nhiên cũng như protein tái tổ hợp. Khi bổ sung IL-7 vào
môi trường nuôi cấy tế bào 2E8, tùy theo hoạt tính sinh học của protein IL-7
mà tế bào 2E8 sẽ duy trì sự sống và khả năng hoạt hóa quá trình sinh trưởng,
phát triển và sinh sản của tế bào, hoạt tính của protein IL-7 càng mạnh thì khả
năng sống sót và hoạt hóa của tế bào 2E8 càng cao.
Phương pháp
a. Nuôi cấy, bảo quản dòng tế bào 2E8
Môi trường nuôi cấy tế bào: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s
medium) có bổ sung 4 mM L-glutamin, 1.5 g/l sodium bicarbonate, 0.05 mM
2-mercaptoethanol, 1 ng/ml interleukin 7 và 20% fetal bovine serum.
Nuôi cấy, duy trì: Tế bào nuôi ở dạng hỗn dịch với chu kỳ cấy chuyển là
từ 3 - 5 ngày và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 370C và 5% CO2.
b. Thử nghiệm hoạt tính protein IL-7 tái tổ hợp
Lựa chọn dòng IL-7 tái tổ hợp tốt nhất để thử nghiệm hoạt tính sinh học.
Sử dụng màng lọc có kích cỡ 0.22 µm để lọc khuẩn, sau đó pha loãng bằng
PBS đã khử trùng để đạt nồng độ gốc là 0.1 mg/ml.
Hai ngày sau khi cấy chuyển, tế bào 2E8 được rửa sạch 3 lần bằng môi
trường IMDM cơ bản (không có huyết thanh và không có IL-7). Sau đó, tiếp
29
tục hòa trong môi trường IMDM với nồng độ 1 x 105 tế bào/ml và chuyển vào
96 giếng, thực hiện phản ứng ELISA (190 µl/giếng). Bổ sung mẫu protein IL-
7 tái tổ hợp vào các giếng với các nồng độ khác nhau. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
Các giếng đối chứng âm chỉ có tế bào 2E8 và môi trường nuôi cấy IMDM cơ
bản có bổ sung huyết thanh, không bổ sung IL-7.
Các giếng được ủ trong tủ ấm CO2 với điều kiện 370C, 5% CO2. Sau 48
giờ bổ sung thêm 30 µl dung dịch thuốc nhuộm trong bộ kit Non-radioactive
proliferation để định tính và định lượng protein IL-7. Tiếp tục ủ trong tối 4 giờ
và đọc kết quả bằng máy ELISA reader bước sóng 525 nm.
2.2.8. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm
Kết quả nghiên cứu của luận án được phân tích thống kê bằng phần mềm
Microsoft Excel 2016, Table Curve theo các tham số thống kê: giá trị trung
bình, độ lệch chuẩn (σ), sự sai khác giữa các giá trị trung bình được kiểm định
bằng giới hạn sai khác nhỏ nhất LSD của Fisher với α=0,05, chỉ số ED50 v.v...
30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Thay đổi mã di truyền gene Interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật
Chúng tôi sử dụng trình tự gene interleukin 7 ở người được công bố trên
Ngân hàng Gene có mã số: J04156.1 và bảng tần suất các codon phổ biến ở
thực vật (Codon Usage Database) [36], cùng với phần mềm Codon
Optimization 2.0 để loại bỏ và thay thế khoảng 10% các codon hiếm trong gen
IL-7 bằng các codon phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi thành phần
và trật tự các acid amin. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành loại bỏ trình tự
ATTTA trên gen IL-7 được cho là gây bất ổn trong quá trình phiên mã mRNA,
kết hợp sử dụng phần mềm của Invitrogene để giảm thiểu sự hình thành cấu
trúc mRNA thứ cấp.
Kết quả thể hiện trên hình 3.1 cho thấy, chúng tôi đã thành công trong
việc thay đổi mã di truyền của gene interleukin 7 để phù hợp và nâng cao hiệu
quả biểu hiện trong thực vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin so với
gene gốc, với độ tương đồng nucleotide là 63,6 %, độ tương đồng acid amin là
100%. Ngoài ra, để chuẩn bị cho việc cắt và ghép nối gene trong quá trình thiết
kế vector chuyển gene, các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, SacI,
HindIII đã được thêm vào đầu 5’ và 3’ của gene interleukin 7. Đồng thời, chúng
tôi cũng thêm các trình tự nucleotide mã hóa cho protein c-myc và epitope his-
tag cũng được gắn vào đầu 3’ của gene.
Trình tự nucleotide gene interleukin 7 sau khi được tối ưu có kích thước
536bp, được đặt tổng hợp nhân tạo tại hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) và
được nhân dòng trong vector pBSK/IL7.
31
Hình 3.1. Trình tự gene interleukin 7 trước và sau khi thay đổi mã di truyền
32
3.2. Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 tái tổ hợp vào cây thuốc lá
3.2.1. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
Cấu trúc vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
được thiết kế kế thừa từ vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP
bằng cách loại bỏ và thay thế gene TBAG bằng gene IL-7 được mô phỏng như
hình 3.2
Hình 3.2. Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP
Chúng tôi tiến hành nhân gene IL-7 từ vector pBSK/IL7 bằng phản ứng
PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R. Sản phẩm PCR
được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.A
cho thấy, chúng tôi thu được một băng có kích thước khoảng 564bp tương ứng
với kích thước tính toán lý thuyết.
Vector pRTRA 35S/TBAG-histag-cmyc-100xELP được xử lý với
enzyme cắt giới hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả
thể hiện trên hình 3.3.B cho thấy, tại đường chạy 1 xuất hiện 2 băng có kích
thước khoảng 5051 bp và 1152 bp tương ứng với kích thước của vector pRTRA
35S-histag-cmyc-100xELP mở vòng và gene TBAG theo tính toán lý thuyết.
Chúng tôi tiến hành thôi gel và tinh sạch đoạn DNA có kích thước 5051 bp để
sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Tiến hành lai ghép gene IL-7 vào vector pRTRA 35S-histag-cmyc-
100xELP tạo vector tái tổ hợp pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP với sự
xúc tác của enzyme T4 ligase ở 220C trong 1 giờ 30 phút. Plasmid tái tổ hợp
sẽ được biến nạp vào tế bào E.coli DH 5α để nhân dòng bằng phương pháp
sốc nhiệt.
33
Để chọn lọc các dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc có mang
vector chứa gene mã hóa protein IL-7, chúng tôi thực hiện phản ứng colony
PCR với cặp mồi đặc hiệu để check chiều 35S-SQF và IL7_BamHI_R. Kết quả
thể hiện trên hình 3.3.C cho thấy, trong 10 dòng khuẩn lạc thí nghiệm, có dòng
2, 4, 5, 7, 8, 9 dương tính với băng có kích thước khoảng 0,8kb gồm kích thước
của gene mã hóa protein IL-7 (564bp) cộng kích thước của một đoạn promoter
(250bp). Để loại bỏ khả năng dương tính giả của phản ứng colony PCR, chúng
tôi tiến hành tách plasmid các khuẩn lạc dương tính và thực hiện phản ứng cắt
bằng enzyme cắt giới hạn BamHI.
A B C D
Hình 3.3. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép
tạo vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
(A). Kết quả PCR nhân gene IL-7 bằng IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R; (B). Kết
quả cắt vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme BamHI; (C):
Kết quả colony PCR bằng cặp mồi 35S-SQF và IL7_BamHI_R, 1-10: mẫu khuẩn,
(-). Đối chứng âm (pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP), (+). Đối chứng
dương (pBSK/IL7); (D). Kết quả cắt kiểm tra vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-
100xELP bằng enzyme giới hạn BamHI
Theo tính toán lý thuyết, vector pRTRA tái tổ hợp khi cắt bằng enzyme
giới hạn BamHI sẽ cho 2 băng khi kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Tại đường
34
chạy 1 trên hình 3.3.D xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 5 kb và 0,56 kb
tương ứng với kích thước vector pRTRA mở vòng (5051bp) và gene IL-7
(564bp). Điều này khẳng định, vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
đã được thiết kế thành công. Cấu trúc này sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E.coli
DH5α để nhân dòng và sử dụng làm nguyên liệu để thiết kế vector pCB301
35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.
3.2.2. Thiết kế vector chuyển gene pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP
Plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 được xử lý
đồng thời bằng enzyme cắt giới hạn HindIII. Với plasmid pBC301 để tránh
hiện tượng tự đóng vòng, sản phẩm cắt với enzyme HindIII sau khi tinh sạch
được xử lý tiếp bằng enzyme SAP. Các sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên
gel agarose 0,8%. Trên hình 3.4.A cho thấy, ở đường chạy 1 (sản phẩm cắt
pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP) xuất hiện 2 băng có kích thước
khoảng 2.9 kb và 2.6 kb; ở đường chạy 2 (sản phẩm cắt pCB301 đã xử lý qua
SAP) có 1 băng có kích thước khoảng 5.6 kb. Điều này chứng tỏ đã cắt thành
công plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 bằng
HindIII. Tiến hành thôi gel, tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thước 2.9 kb
và 5.6 kb chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp theo.
Tiến hành phản ứng lai ghép casette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào
vector mở vòng pCB301 tạo vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP tái
tổ hợp và được biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào vi khuẩn E.coli DH5α
để chọn lọc, nhân dòng.
Chọn 5 khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc, tiến hành phản ứng
colony PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, kết quả
thể hiện trên hình 3.4.B cho thấy, ở các đường chạy xuất hiện 1 băng có kích
thước khoảng 564bp tương ứng với kích thước gene IL-7 theo tính toán lý
thuyết. Để tránh khả năng dương tính giả của PCR, chúng tôi tiến hành tách
plasmid và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn HindIII. Kết quả thể hiện trên
35
hình 3.4.C, trên đường chạy 1 xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 2.9 kb
và 5.6 kb theo đúng kích thước tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ chúng
tôi đã thiết kế thành công vector pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP tái
tổ hợp.
A B C
Hình 3.4. Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép
tạo vector chuyển gene pCB301/IL7/100xELP
(A). Kết quả xử lý vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và vector pCB301
bằng enzyme giới hạn HindIII; (B). Kết quả kiểm tra colony PCR pCB301/IL7-
cmyc-histag-100xELP bằng cặp mồi IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, (-). Đối
chứng âm (pCB301), (+). Đối chứng dương (pBSK/IL7); (C). Kết quả cắt kiểm tra
vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme giới hạn HindIII
Do chỉ sử dụng một enzyme cắt giới hạn khi tạo đầu dính giữa vector
pCB301 và cassette 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP nên chúng tôi sử dụng
enzyme giới hạn NcoI để kiểm tra chiều cassette chuyển vào so với chiều của
vector pCB301. Vector pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP tái tổ hợp có
hai vị trí nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, một vị trí nằm trên vector và một
36
vị trí nằm trên cassette, do đó khi xử lý bằng NcoI sẽ cho ra 2 băng có kích thước
khác nhau tùy theo cassette gắn xuôi chiều hay ngược chiều với vector pCB301.
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra
vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme NcoI
M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1. Sản phẩm cắt ngược chiều; 2. Sản cắt xuôi chiều
Kết quả thể hiện trên hình 3.5 cho thấy, ở đường chạy 1 xuất hiện 2 băng
có kích thước khoảng 3.6 kb và 4.9 kb tương ứng với kích thước tính toán lý
thuyết khi cassette gắn ngược chiều với chiều của vector pCB301, còn ở đường
chạy 2 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 6.9 kb và 1.6 kb tương ứng với
trường hợp cassette gắn xuôi chiều với vector pCB301. Sau đó, lựa chọn những
vector tái tổ hợp có chứa cassette ngược chiều sau khi cắt kiểm tra để biến nạp
vào tế bào A.tumefaciens C58C1 bằng xung điện để chuẩn bị cho thí nghiệm
tiếp theo.
3.3. Biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng
phương pháp Agro-infiltration
3.3.1. Tạo dòng tế bào A.tumefaciens C58C1/pGV2260 mang vector pCB301
35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
Từ kết quả ở mục 3.2.5, vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP
tái tổ hợp đã được thiết kế thành công, sẽ được chuyển vào chủng vi khuẩn
37
Agrobacterium tumefaciens C58C1/pGV2260 bằng phương pháp xung điện
(mục 2.2.3.2.f). Sản phẩm của quá trình biến nạp được cấy trải trên môi trường
LB đặc có bổ sung kháng sinh rifamycin 50 mg/l, carbemycin 50 mg/l và
kanamycin 50 mg/l trong 2 ngày.
Chúng tôi lựa chọn 5 khuẩn lạc mọc riêng rẽ, tròn đều phát triển trên môi
trường chọn lọc để kiểm tra bằng phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu
IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R và phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn NcoI.
Kết quả thể hiện trên hình 3.6 và 3.7.
Hình 3.6. Kết quả colony PCR bằng cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R
M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1 - 5. Các dòng khuẩn lạc;
(-). Đối chứng âm; (+). Đối chứng dương
Hình 3.7. Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI
Trên hình 3.6 cho thấy, tại các đường chạy 1 - 5 xuất hiện một băng có
kích thước khoảng 564 bp, tương ứng với kích thước gene IL-7 nhân bằng cặp
38
mồi IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, đồng thời giếng đối chứng âm không có
băng nào, đối chứng dương là plasmid pBSK/IL7 cũng xuất hiện một băng kích
thước khoảng 564 bp. Điều này chứng tỏ phản ứng colony PCR đã thành công
và mẫu không bị nhiễm.
Để khẳng định chắc chắn cho kết luận, chúng tôi tiến hành tách plasmid
các dòng khuẩn dương tính với phản ứng colony PCR và cắt bằng enzyme giới
hạn NcoI. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy, tại đường chạy số 1 xuất hiện hai
băng có kích thước khoảng 3,6 kb và 4,9 kb đúng theo tính toán lý thuyết của
vector pCB301 và cassette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.
Từ những kết quả trên cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công vector
pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào vi khuẩn A.tumefaciens
C58C1/pGV2260.
3.3.2. Biểu hiện tạm thời protein IL-7 bằng phương pháp Agro-infiltration
Quá trình biến nạp vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào
cây thuốc lá được thực hiện theo quy trình đã trình bày tại mục 2.2.4.
Sau 6 ngày biến nạp, tiến hành thu lá, bảo quản ở -800C để chuẩn bị cho
các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-
100xELP và biểu hiện tạm thời của protein IL-7 tái tổ hợp với sự hỗ trợ của
protein Hc-Pro ức chế cơ chế câm gene hoạt động trong cây bằng phương pháp
western blot.
Hình 3.8. Quá trình biến nạp pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào cây thuốc lá
A. Sơ đồ lắp đặt cây và thiết bị chuẩn bị biến nạp; B. Cây thuốc lá trước và sau khi biến nạp
39
3.4. Đánh giá biểu hiện tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp
Để kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành
tách chiết protein tổng số và đo nồng độ theo phương pháp của Bradford (1976),
sau đó sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot trên các vị trí biểu hiện tạm
thời ở lá non, lá bánh tẻ và lá già. Qua thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy khả năng
biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp khác nhau ở các lá có độ tuổi khác nhau, trong
đó biểu hiện mạnh nhất ở lá non; điều này có thể giải thích do ở lá non có tốc độ
sinh trưởng mạnh, sinh tổng hợp protein mạnh hơn so với lá bánh tẻ và lá già.
Kết quả thể hiện trên hình 3.9 cho thấy ở các đường chạy 1, 2, 3 xuất
hiện một băng có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein
IL-7 tái tổ hợp theo tính toán lý thuyết, trong khi ở đường chạy đối chứng âm,
cây thuốc lá không chuyển gene không xuất hiện băng này
Hình 3.9. Kiểm tra biểu hiện protein IL-7 tái tổ hợp trong lá thuốc lá bằng Western blot
M. Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); 1. Lá non, 2. Lá bánh tẻ, 3. Lá
già; (-). Đối chứng âm (lá thuốc lá không chuyển gene)
3.5. Phân tích định lượng và tinh sạch protein Il-7 tái tổ hợp
Sau khi biểu hiện thành công protein IL-7 tái tổ hợp trong thuốc lá, chúng
tôi tiến hành tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ion cố định kim loại
(niken) để tinh sạch và định lượng protein IL-7 tái tổ hợp. Đây là phương pháp
hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp liên kết với his-tag. Phương pháp này
40
dựa trên nguyên lý histidine tạo phức hợp với các kim loại hoá trị II (niken) ở
nồng độ pH trung tính. Sự tương tác của protein liên kết his-tag với kim loại
phụ thuộc vào nồng độ pH. Protein đích sau khi liên kết với cột tinh sạch, sẽ
được hoà tan thu lại bằng cách giảm pH dung dịch hoặc tăng nồng độ của đệm
ion hoặc nồng độ của đệm EDTA hoặc imidazole.
Sau khi tinh sạch, chúng tôi kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ
hợp bằng điện di SDS-PAGE và phương pháp lai miễn dịch Western blot. Kết
quả thể hiện trên hình 3.10 cho thấy, chúng tôi chỉ thu được một băng protein
có kích thước khoảng 64 kDa, đúng theo tính toán lý thuyết.
Hình 3.10. Kết quả tinh sạch và định lượng protein IL-7 bằng phương pháp IMAC
(A). Điện di SDS-PAGE: 1A. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A. Dịch chiết
thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3A. Protein IL-7 sau tinh sạch
(B). Kết quả Western blot: 1B. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B. Dịch chiết
thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3B. Protein IL-7 sau tinh sạch
(C). Định lượng protein IL-7 bằng western blot và sử dụng phần mềm ImageJ: 1C,
2C, 3C, 4C: đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng, 5C. Dịch
chiết thô chứa protein IL7-ELP trước xử lý, 6C. protein IL-7 sau tinh sạch (30 µg
protein tổng số/giếng.
Từ 1kg mẫu lá tươi, sau khi tinh sạch theo phương pháp IMAC và thu
nhận lại protein IL-7 tái tổ hợp bằng concentrator iCONTM, nồng độ protein
41
tổng số được định lượng theo phương pháp của Badford và protein IL-7 được
định lượng bằng phần mềm ImageJ trên màng lai. Kết quả thu được 252 mg
protein IL-7 tinh sạch/8 gram protein hòa tan tổng số, đạt tỷ lệ 3,15%, tương
đương nồng độ protein IL-7 tái tổ hợp là 252 mg/kg lá tươi. So sánh với một
số nghiên cứu biểu hiện protein tạm thời khác thì sự biểu hiện của protein IL-
7 trong cây thuốc lá N. Benthamiana của chúng tôi là tương đối cao.
Kết quả này cho thấy hiệu quả của phương pháp biểu hiện tạm thời và
tinh sạch protein IL-7 từ cây thuốc lá N. benthamiana trong thời gian ngắn,
dễ thực hiện.
Để có thể thu được protein IL-7 tái tổ hợp với hàm lượng cao hơn,
chúng tôi tiếp tục định lượng và tinh sạch bằng phương pháp mITC dựa trên
đặc tính của sự gắn kết giữa ELP với protein đích IL-7.
Chúng tôi sử dụng 100 gam lá thuốc lá đã được biến nạp bằng phương
pháp agroinfiltration để tinh sạch thu nhận protein IL-7 tái tổ hợp theo
phương pháp mITC (mục 2.2.6.2).
Chúng tôi tiến hành thu lại dịch chiết protein sau mỗi bước tinh sạch
gồm dịch chiết thô trước tinh sạch, dịch ra khỏi màng sau khi đưa dịch chiết
thô qua màng và dịch tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp tách khỏi màng khi rửa
màng bằng nước milipore Q lạnh. Dịch thu được sau từng bước được đo nồng
độ protein theo phương pháp Bradford (1976) và phân tích bằng phương pháp
lai miễn dịch western blot để kiểm tra protein tinh sạch và đánh giá hiệu suất
thu hồi protein. Kết quả thể hiện trên bảng 3.1 và hình 3.11.
Kết quả trên hình 3.11 cho thấy, ở đường chạy 3 xuất hiện 2 băng có
kích thước khoảng 64 kDa và 130 kDa (trạng thái dimer) của protein có gắn
đuôi ELP; còn ở đường chạy 2 là dịch chiết protein ra khỏi màng lọc sau khi
đưa dịch protein thô ban đầu qua màng không xuất hiện băng protein nào,
điều này chứng tỏ protein IL7 có gắn đuôi ELP đã được giữ lại trên màng lai
42
không bị rửa trôi cùng các protein khác. Ở đường chạy số 1 là dịch chiết sau
khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh ở nồng độ ion thấp chỉ có một băng
protein có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein IL-7
tái tổ hợp theo tính toán.
Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC
Dịch chiết protein Protein
tổng số (mg)
Protein
tái tổ hợp (mg)
Hiệu suất
thu hồi (%)
Độ tinh sạch
(%)
Dịch thô
trước tinh sạch 1634,7 38,3 100 X
Dịch IL-7
đã tinh sạch 45,8 36,7 95,82 86,3
Hình 3.11. Kết quả tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC
M. Thang protein chuẩn; 1. Protein IL-7 tinh sạch sau khi rửa màng bằng nước
lạnh; 2. Dịch chiết ra khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua màng; 3. Dịch chiết
protein chứa IL7/ELP trước tinh sạch
43
Hình 3.12. Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp lai miễn dịch
1. Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước khi tinh sạch (30 µg/giếng);
2. Protein IL-7 tách khỏi màng khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh;
3, 4, 5, 6. Đối chứng dương với các nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng.
Từ kết quả xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi protein
IL-7 bằng phương pháp mITC đạt 95,82 %, độ tinh sạch đạt 86,3%. Hàm lượng
protein IL-7 tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số là 2,34%, kết quả này tương
đương với những nghiên cứu trước đó về hàm lượng protein tái tổ hợp trên
protein hòa tan tổng số: 2% [47], [143]; 2,2% [1]; 3% [29].
Phương pháp gắn kết ELP vào protein đích tỏ ra có nhiều ưu điểm như
dễ dàng thu nhận và tinh sạch protein tái tổ hợp nhờ tính chất đặc biệt của ELP,
đồng thời hàm lượng protein tái tổ hợp thu được thường khá cao. Shoj và cộng
sự (2009) đã thu nhận được 200 mg HA/kg lá tươi, Mortimer và cộng sự (2012)
cũng thu nhận được 675 mg HA/kg lá tươi khi sản xuất kháng nguyên của virus
cúm gia cầm H5N1 bằng phương pháp này. Trong nghiên cứu biểu hiện protein
IL-7 tái tổ hợp gắn kết ELP, chúng tôi cũng đã thu nhận được 367 mg/kg lá
tươi. Kết quả này cho thấy sự biểu hiện tạm thời của protein IL-7 tái tổ hợp
trong cây thuốc lá N. benthamiana khá cao, là cơ sở để chúng tôi tiến hành sản
44
xuất lượng lớn protein IL-7 tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng
trong y học.
3.6. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp
Để đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 chúng tôi tiến hành thí
nghiệm theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.7 với các nồng độ IL-7 là: 0,125
µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; 1 µg/ml; 1,5 µg/ml; 2 µg/ml; 2,5 µg/ml. Kết
quả thu được được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.13.
Bảng 3.2. Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 bằng interleukin 7
Nồng độ protein IL-7 % hoạt hóa dòng tế bào 2E8
0.125 µg/ml 35.7
0.25 µg/ml 45.3
0.5 µg/ml 53.5
1 µg/ml 65.8
1.5 µg/ml 73.6
2 µg/ml 82.5
2.5 µg/ml 79.3
Giá trị ED50 (µg/ml) 0.35
Qua bảng 3.2 và hình 3.13 cho thấy, protein IL-7 tái tổ hợp có hoạt tính
sinh học trong việc hỗ trợ sinh trưởng và hoạt hoá dòng tế bào 2E8, với khả
năng hoạt hóa đạt 82,5% so với đối chứng âm (dòng tế bào 2E8 không bổ sung
IL-7 vào môi trường nuôi cấy). Ở các nồng độ chất thử IL-7 tăng dần, % hoạt
hóa tế bào của mẫu cũng tăng theo, cho thấy hoạt tính sinh học của mẫu thử
khá ổn định; trong đó, khả năng hoạt hóa cao nhất đạt được ở nồng độ 2 µg/ml
là 82,5%, sau đó khả năng hoạt hóa không tăng mà lại giảm đi, điều này có thể
giải thích do interleukin 7 khi ở liều lượng cao có thể gây ức chế cho sự sinh
sản và hoạt hóa tế bào, thậm chí gây chết cho tế bào.
45
Qua kết quả trên, có thể bước đầu khẳng định protein IL-7 tái tổ hợp có
khả năng thể hiện hoạt tính sinh học giống với tự nhiên, mở ra khả năng sản
xuất lượng lớn protein IL-7 tái tổ hợp phục vụ trong y học nhằm đáp ứng nhu
cầu chữa bệnh cho con người.
35.7
45.3
53.3
63.8
73.6
82.579.3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0.125 0.25 0.5 1 1.5 2 2.5
% h
oạt h
óa d
òng
tế b
ào 2
E8
Nồng độ mẫu thử (µg/ml)
Protein IL-7
Hình 3.13. Hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp
46
Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. Biểu hiện tạm thời protein interleukin 7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá
Thực vật hiện nay được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu biểu hiện
protein tái tổ hợp. Protein tái tổ hợp có thể được biểu hiện trong thực vật thông
qua hai phương pháp: tạo cây chuyển gen và biểu hiện tạm thời. Trong phương
pháp tạo cây chuyển gen, gen tái tổ hợp được nhân bản trong vector biểu hiện
và chuyển vào hệ gen thực vật. Do đó, gen tái tổ hợp sẽ được di truyền qua các
thế hệ tiếp theo và có thể sản xuất quy mô lớn protein tái tổ hợp [19], [74].
Trong phương pháp biểu hiện tạm thời, thay vì tích hợp vào hệ gen của thực
vật thì gen chuyển sẽ nhanh chóng tạo ra protein tái tổ hợp. Phương pháp này
có lợi thế về mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp cao hơn rất nhiều so với
phương pháp khác, cũng như thời gian sản xuất protein nhanh hơn, không bị
ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen trong tế bào thực vật, đặc biệt không gặp phải vấn
đề an toàn sinh thái như phương pháp tạo cây chuyển gen [42].
Tuy nhiên, phương pháp biểu hiện tạm thời do gen chuyển không được
gắn vào hệ gen của thực vật nên thường bị cơ chế câm gen (RNAi) dịch mã và
sau dịch mã tác động, dẫn đến hàm lượng protein tái tổ hợp thu nhận được
không cao. Đây là cơ chế phản ứng của thực vật trước sự xâm nhập của DNA
ngoại lai, dẫn đến sự phá hủy trình tự gen đặc hiệu và làm giảm sản phẩm
protein do gen mã hóa [96].
Trong nghiên cứu của luận án, để tránh gặp phải hiện tượng RNAi có thể
làm giảm hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp, chúng tôi đã biểu hiện đồng thời
cả protein đích interleukin 7 và protein hỗ trợ Hc-Pro của virus khoai tây Y
nhằm chống lại hiện tượng câm gen ở thực vật bằng cách ngăn cản sự phân giải
mRNA và RNA sợi đôi, từ đó giảm lượng siRNA hoặc phá hỏng chức năng cắt
của enzyme cắt sợi đôi Dicer và RISC [104]. Kết quả, chúng tôi đã thu được
protein IL-7 tái tổ hợp biểu hiện ở lá cây thuốc lá với hàm lượng khá cao.
47
4.2. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC
Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp ở thực vật thường không cao là
một trong những giới hạn khi nghiên cứu biểu hiện protein ở thực vật. Đã có
nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm vượt qua giới hạn đó để tăng cường khả
năng biểu hiện protein tái tổ hợp khi biểu hiện ở thực vật bằng nhiều phương
pháp như: tối ưu hóa codon [16], kết hợp với một thành phần hỗ trợ như enzyme
lichenase [53], ELP [16], [25].
Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi đã sử dụng 100xELP cùng với
protein IL-7 dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35 nhằm tăng cường khả
năng biểu hiện protein IL-7 ở thực vật. Kết quả của chúng tôi phù hợp với một
số nghiên cứu khác như: Patel và cộng sự (2007) đã tăng cường sự biểu hiện
của interleukin 4 của người lên 19 lần và interleukin 10 lên 15 lần khi kết hợp
với 27xELP [68]; nghiên cứu của Floss (2009) cũng cho thấy, mức độ biểu hiện
của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể kháng HIV (2F5 và 2G12) cao hơn
khi không có sự kết hợp với ELP [25]. Từ những kết quả này cho thấy sự tích
lũy các protein tái tổ hợp là do hiệu ứng của ELP chứ không phải do vị trí của
gen chuyển.
Sự tăng cường biểu hiện của protein kết hợp với ELP có thể được giải
thích là do các protein kết hợp ELP khó bị protease của tế bào chủ phân cắt
hoặc thủy phân hơn. Điều này dẫn tới hàm lượng protein tái tổ hợp cao hơn so
với bình thường, góp phần nâng cao hiệu quả của các phương pháp tinh sạch
và thu nhận protein tiếp theo.
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp nhằm tinh sạch và thu nhận các loại
protein tái tổ hợp đạt nồng độ cao và tinh khiết như: phương pháp sắc ký lọc
gel, phương pháp sắc ký ái lực (IMAC), sắc ký trao đổi ion, phương pháp đảo
chiều thuận nghịch mITC. Tùy thuộc vào nghiên cứu và loại protein,người ta
lựa chọn phương pháp tinh sạch tối ưu nhất để thu được hàm lượng protein tái
tổ hợp cao nhất.
48
Phương pháp tinh sạch protein đảo chiều thuận nghịch mITC dựa trên
tính chất đảo ngược chuyển từ trạng thái tan sang trạng thái không tan và ngược
lại khi nhiệt độ môi trường thay đổi của ELPylated tỏ ra có nhiều ưu điểm và
được ứng dụng ngày càng rộng rãi do hàm lượng protein tái tổ hợp thu nhận
được nhiều với độ tinh sạch cao, các bước tiến hành nhanh và đơn giản do sự
kết tinh của các protein gắn kết ELP được giữ lại trên bề mặt màng và dễ dàng
được khử khỏi màng.
Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi sử dụng hai phương pháp để
tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp là phương pháp sắc ký ion cố định kim loại
(IMAC) và phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC). Đối với
phương pháp sắc ký ion cố định kim loại, chúng tôi thu được hàm lượng protein
IL-7 tái tổ hợp đạt 252 mg protein IL-7 tinh sạch/8 gram protein hòa tan tổng
số, đạt tỷ lệ 3,15%, tương đương nồng độ protein IL-7 tái tổ hợp là 252 mg/kg
lá tươi. Đối với phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng đảo chiều thuận
nghịch qua màng (mITC), chúng tôi thu được hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp
đạt 367 mg/kg lá tươi với hiệu suất thu hồi đạt 95,82 % và độ tinh sạch đạt
86,3%. Qua số liệu thu được cho thấy, phương pháp đảo chiều thuận nghịch
qua màng (mITC) dựa trên đặc tính của ELP có hiệu suất thu hồi cao hơn hẳn
các phương pháp khác; kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với
những nghiên cứu trước đó về biểu hiện protein tái tổ hợp có gắn kết ELP như
Scheller và cộng sự (2006) đã tổng hợp được protein scFV tái tổ hợp với hàm
lượng tăng gấp 40 lần so với thông thường, không gắn với ELP [81], Theo Floss
(2009), việc gắn kết với ELP có thể làm tăng mức độ biểu hiện của các kháng
thể vô hiệu hóa HIV biểu hiện trong hạt [25]; ELP kết hợp với các protein tái
tổ hợp ở đầu C cũng làm tăng sự tích lũy của nhiều loại protein biểu hiện trong
lá [16], [17], [68].
Từ những kết quả trên cho thấy, việc biểu hiện protein tái tổ hợp gắn kết
với ELP và tinh sạch bằng phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng
49
mITC cho hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp với độ tinh sạch cao hơn so với
các phương pháp khác. Mở ra một hướng nghiên cứu nhiều triển vọng cho mục
đích thu nhận protein tái tổ hợp của người sản xuất ở thực vật nhằm phục vụ
trong y dược học, chữa bệnh cho con người.
50
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
1. Kết luận
1. Mã di truyền của gen hIL-7 được thay đổi phù hợp với hệ thống biểu
hiện ở thực vật với độ tương đồng nucleotide là 63,6 % và độ tương đồng acid
amin là 100%.
2. Các cấu trúc vector chuyển gen pET32c(+)/IL7; pENTR221/IL7/cal;
pK7WG2D.1/cal/IL7; pRTRA 35S-IL7-100xELP; pCB301_IL7/ELP được
thiết kế phục vụ chuyển gen vào tế bào vi khuẩn E.coli rosetta-gami B, dòng tế
bào huyền phù BY-2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá để biểu hiện protein
interleukin 7 tái tổ hợp.
3. Hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp thu được qua hệ thống nuôi cấy cao
nhất đạt 367 mg/kg lá tươi khi biểu hiện tạm thời ở cây thuốc lá và thu nhận bằng
phương pháp tinh sạch mITC; thấp nhất khi biểu hiện qua hệ thống nuôi cấy
huyền phù BY-2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số.
4. Hoạt tính sinh học của protein IL-7 đạt 82,5% ở nồng độ 2 µg/ml.
2. Đề nghị
Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu đã đạt được, để tiếp tục phát triển
các kết quả nghiên cứu sâu hơn; chúng tôi đề xuất một số đề nghị sau:
1. Tiếp tục thử nghiệm protein IL-7 tái tổ hợp đã tinh sạch ở mức độ
động vật thí nghiệm và trên lâm sàng nhằm đánh giá sâu hơn hoạt tính sinh học
của protein IL-7 trước khi sản xuất trên diện rộng.
2. Nghiên cứu biểu hiện protein IL-7 ở một số loài thực vật khác để làm
phong phú nguồn nguyên liệu tổng hợp protein IL-7 tái tổ hợp.
51
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
1. Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc,
Lê Văn Sơn (2014). Interleukin 7 và vai trò trong hệ thống miễn dịch ở người.
Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên. Tập 118 số 04, trang
153-156.
2. Nguyễn Huy Hoàng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn (2015).
Thiết kế vector mang cấu trúc gen Interleukin 7 phục vụ chuyển gen trong hệ
thống thực vật. Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên. Tập
134 số 04, trang 25-28.
3. Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2017).
Biểu hiện tạm thời protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá (Nicotiana
benthamiana domin) bằng phương pháp Agro-Infiltration. Tạp chí Sinh học.
4. Hoang,N.H., Ha,C.H., Ngoc,P.B. and Son,L.V. (2017), IL7 human gene is
optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank:
MF170526.1
52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Trương Nam Hải (2010), Nghiên cứu đánh giá hiệu lực của interleukin-2
tái tổ hợp sản xuất tại Việt Nam dùng trong hỗ trợ điều trị ung thư, Báo
cáo tổng kết đề tài khoa học cấp Nhà nước, Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2. Mi Hoàng (2015), “Bước tiến trong điều trị bệnh tự miễn”, Tạp chí Thông
tin Khoa học và Công nghệ, 9, tr. 28-30.
3. Phan Tường Lộc, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Thị Thanh (2012), “Biểu hiện
gen HIV-1 p24 ở cây thuốc lá chuyển gen lục lạp”, Tạp chí phát triển
Khoa học và Công nghệ, 15(1), tr. 52-61.
Tiếng Anh
4. Adam W. P., Daniel T. P., Jung H. S., Emma-Kate L., François J., Steven
F. Z., Ninan A. (2012), “Interleukin-7, but not thymic stromal
lymphopoietin, plays a key role in the T cell response to influenza A
virus”, PLoS One, 7(11), PP. 1-8, doi: 10.1371/journal.pone.0050199.
5. Agnieszka S., Tomas V., Anna G., Patrycja R. (2011), “Recombinant
Cytokines from Plants”, Int. J. Mol. Sci., 12(6), pp: 3536-3552,
doi:10.3390/ijms12063536.
6. Alkayyal A. A., Tai L. H., Kennedy M. A., Tanese S. C., Zhang J., Lefebvre
C., Sahi S., Ananth A. A., Mahmoud A. B., Makrigiannis A. P., Cron G. O.,
Macdonald B., Marginean E. C., Stojdl D. F., Bell J. C., Auer R. C. (2017),
“NK-cell recruitment necessary for eradication of peritoneal carcinomatosis
with an IL12-expressing maraba virus cellular vaccine”, Cancer Immunol
Res, 5(3), pp. 211-221, doi: 10.1158/2326-6066.CIR-16-0162.
7. Appasamy P. M. (1999), “Biological and clinical implications of interleukin-
7 and lymphopoiesis”, Cytokines Cell. Mol. Ther., 5(1), pp. 25-39.
53
8. Azizi H., Kazemi B., Bandehpour M., Mohebali M., Khamesipour A.,
Aryaeipour M., Yaghoobi H., Rokni M. B. (2016), “Modulation of the
immune response to DNA vaccine encoding gene of 8-kDa subunit of
echinococcus granulosus antigen B using murine interleukin-12 plasmid
in BALB/c Mice”, Iran J Parasitol, 11(4), pp.480-489.
9. Baird A. M., Lucas J. A., Berg L. J. (2000), “A profound deficiency in
thymic progenitor cells in mice lacking Jak3”, J Immunol, 165(7),
pp.3680–3688, PubMed: 11034372.
10. Barta A., Sommergruber K., Thompson D., Hartmuth K., Matzke M. A.,
Matzke A. J. M. (1986), “The expression of a nopaline synthase-human
growth hormone chimaeric gene in transformed tobacco and sunflower
callus tissue”, Plant Mol. Biology, 6(5), pp. 347–357.
11. Beilharz M. W., Cummins M. J. (2010), “Oromucosal administration of
interferon to humans”, Pharmaceuticals, 3(2), pp.323-344.
12. Budzianowski J. (2010), “Tobacco a highly efficient producer of
vaccines”, Przegl. Lek., 67(10), pp. 1071-1076.
13. Cao X., Shores E. W., Huli J., Anver M. R., Kelsall B. L., Russell S. M.,
Drago J., Noguchi M., Grinberg A., Bloom E. T., Paul W. E., Kayz S. I.,
Love P. E., Leonard W. J. (1995), “Defective lymphoid development in
mice lacking expression of the common cytokine receptor-γ chain”,
Immunity, 2(3), pp. 223-238, PubMedID: 7697543.
14. Chen Y., Chauhan S. K., Tan X., Dana R. (2017), “Interleukin-7 and -15
maintain pathogenic memory Th17 cells in autoimmunity”, J Autoimmun,
77, pp. 96-103, doi: 10.1016/j.jaut.2016.11.003, PubMedID: 27899224.
15. Chong D. K. X., Langridge W. H. R. (2000), “Expression of full-length
bioactive antimicrobial human lactoferrin in potato plants”, Transgenic
Res, 9(1), pp. 71-78.
54
16. Conley A. J., Joensuu J. J., Jevnikar A. M., Menassa R., and Brandle J. E.
(2009), “Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression
and purification of recombinant proteins in plants”, Biotechnology
Bioeng, 103(3), pp. 562-573, doi: 10.1002/bit.22278.
17. Conrad U., Plagmann I., Malchow S., Sack M., Floss D. M., Kruglov A.
A., Nedospasov S. A., Rose-John S., Scheller J. (2011), “ELPylated anti-
human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal
septic shock”, Plant Biotechnol. J., 9(1), 22-31, doi: 10.1111/j.1467-
7652.2010.00523.x.
18. Costello R., Imbert J., Olive D. (1993), “Interleukin-7, a major
Tlymphocyte cytokine”, Eur. Cytokine Netw., 4(4), pp. 253-262.
19. Davies H. M. (2010), “Review article: commercialization of whole-plant
systems for biomanufacturing of protein products: evolution and
prospects”, Plant Biotechnol J., 8(8), pp. 845-861, doi: 10.1111/j.1467-
7652.2010.00550.x.
20. Disanto J. P., Muller W., Guygrand D., Fischer A., Rajewsky K. (1995),
“Lymphoid development in mice with a targeted deletion of the
interleukin-2 receptor-γ chain”, Proc Natl Acad Sci USA, 92(2), pp. 377-
381, PubMed: 7831294.
21. Eddie A. J., Changlin W., Zeping W., Raymond R., Joong H. S., Nancy
S. M., James M. L. (2000), “Production and characterization of
biologically active human GM-CSF secreted by genetically modified
plant cells”, Protein Expression and Purification, 19(1), pp: 131–138, doi:
https://doi.org/10.1006/prep.2000.1232.
22. Faller E. M., Ghazawi F. M., Cavar M., MacPherson P. A. (2010), “IL-7
induces clathrin-mediated endocytosis of CD127 and subsequent
degradation by the proteasome in primary human CD8 T cells”,
Immunology and Cell Biology, 165(2), pp. 11-23.
55
23. Fischer R., Emans N. (2000), “Molecular farming of pharmaceutical
proteins”, Transgenic Research, 9(4-5), pp. 279-299.
24. Fischer R., Schumann D., Zimmermann S., Drossard J., Sack M.,
Schillberg S. (1999), “Expression and characterization of bispecific
single-chain Fv fragments produced in transgenic plants”, Eur. J.
Biochem, 262(3), pp.810-816.
25. Floss D. M., Sack M., Arcalis E., Stadlmann J., Quendler H., Rademacher
T., Stoger E., Scheller J. R., Fischer R., Conrad U. (2009), “Influence of
elastin-like peptide fusions on the quantity and quality of a tobacco-
derived human immunodeficiency virus-neutralizing antibody”, Plant
Biotechnology J., 7(9), pp. 899-913, doi: 10.1111/j.1467-
7652.2009.00452.x.
26. Funk P. E., Stephan R. P., Witte P. L. (1995), “Vascular cell adhesion
molecule 1-positive reticular cells express interleukin-7 and stem cell
factor in the bone marrow”, Blood, 86, pp. 2661-2671.
27. Gao P., Zhang C., Bian X., Guo Y., Wei Y., Zhang L., Liu Z., Wang X.,
Huang S. (2016), “The increasingly anti-tumor effect of a colonic
carcinoma DNA vaccine carrying HER2 by the adjuvanticity of IL-12”,
Immunopharmacol Immunotoxicol, 38(6), pp. 441-446, doi:
http://dx.doi.org/10.1080/08923973.2016.1233426.
28. Gora-Sochacka A., Redkiewicz P., Napiorkowska B., Gaganidze D.,
Brodzik R., Sirko A. (2010), “Recombinant mouse granulocyte-
macrophage colony-stimulating factor is glycosylated in transgenic
tobacco and maintains its biological activity”, J. Interferon Cytokine Res.,
30(3), pp. 135-142, doi: 10.1089/jir.2009.0053.
29. Gutierrez-Ortega A., Avila-Moreno F., Saucedo-Arias L. J., Sanchez-
Torres C., Gomez-Lim M. A. (2004), “Expression of a single-chain
56
human interleukin-12 gene in transgenic tobacco plants and functional
studies”, Biotechnology Bioeng., 85(7), pp. 734-740.
30. Gutierrez-Ortega A., Sandoval-Montes C., de Olivera-Flores T. J., Santos-
Argumedo L., Gomez-Lim M. A. (2005), “Expression of functional
interleukin-12 from mouse in transgenic tomato plants”, Transgenic Res.,
14(6), pp. 877–885, doi: 10.1007/s11248-005-1464-8.
31. Heufler C., Topar G., Grasseger A., Stanzl U., Koch F., Romani N.,
Namen A. E., Schuler G. (1993), “Interleukin 7 is produced by murine and
human keratinocytes”, J. Exp. Med., 178(3), pp. 1109-1114.
32. Jha S., Sanyal I., Amla D. (2015), “High-level expression and purification
of a therapeutic recombinant serine protease inhibitor from transgenic
tomato plants”, International Journal of Advance Research In Science
And Engineering 4(1), pp. 1158-1176.
33. Jiang Q., Li W. Q., Aiello F. B., Mazzucchelli R., Asefa B., Khaled A. R.,
Durum S. K. (2005), “Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin”,
Cytokine Growth Factor Rev, 16(4-5), pp. 513–533, doi:
10.1016/j.cytogfr.2005.05.004.
34. Jing L., Min C., Xian-Wei L., Hou-Cheng Z., Fa F. S., George P. W.
(2007), “Transient expression of an active human interferon-beta in
lettuce”, Scientia Horticulturae, 112(3), pp. 258-265,
http://doi.org/10.1016/j.scienta.2006.12.047.
35. Kariminia A., Ivison S. M., Leung V.M., Sung S., Couto N., Rozmus J.,
Rolf N., Narendran A., Dunn S. E., Reid G. S., Schultz K. R. (2017), “Y-
box-binding protein 1 contributes to IL-7-mediated survival signaling in
B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia”, Oncology Letters, 13(1),
pp. 497-505. doi: 10.3892/ol.2016.5437. PubmedID: 28123588.
36. Kazusa DNA Res. Inst. (2017), Codon usage database,
http://www.kazusa.or.jp/codon, ngày 7/01/2017.
57
37. Khaled A. R., Li W. Q., Huang J., Fry T. J., Khaled A. S., Mackall C. L.,
Muegge K., Young H. A., Durum S. K. (2002), “Bax deficiency partially
corrects interleukin-7 receptor-alpha deficiency”, Immunity, 17(5), pp.
561-573.
38. Kim H. J., Park S. M., Lee H., Kim Y. S. (2016), “Membrane-bound p35
Subunit of IL-12 on Tumor Cells is Functionally Equivalent to
Membrane-bound Heterodimeric Single Chain IL-12 for Induction of
Anti-tumor Immunity”, Immune Netw, 16(5), pp. 305-310, doi:
10.4110/in.2016.16.5.305.
39. Kim N. S., Kim T. G., Jang Y. S., Shin Y. J., Kwon T. H., Yang M. S.
(2008), “Amylase gene silencing by RNA interference improves
recombinant hGM-CSF production in rice suspension culture”, Plant Mol.
Biol., 68(4-5), pp. 369–377, doi: 10.1007/s11103-008-9376-7.
40. Kim N. S., Kim T. G., Kim O. H., Ko E. M., Jang Y. S., Jung E. S., Kwon
T. H., Yang M. S. (2008), “Improvement of recombinant hGM-CSF
production by suppression of cysteine proteinase gene expression using
RNA interference in a transgenic rice culture”, Plant Mol. Biol., 68(3), pp.
263–275, doi: 10.1007/s11103-008-9367-8.
41. Kim T. G., Lee H. J., Jang Y. S., Shin Y. J., Kwon T. H., Yang M. S.
(2008), “Co-expression of proteinase inhibitor enhances recombinant
human granulocyte-macrophage colony stimulating factor production in
transgenic rice cell suspension culture”, Protein Expr. Purif., 61(2),
pp.117–121, doi: 10.1016/j.pep.2008.06.005.
42. Komarova T. V., Baschieri S., Donini M., Marusic C., Benvenuto E.,
Dorokhov Y. L. (2010), “Transient expression systems for plant-derived
biopharmaceuticals”, Expert Rev Vaccines, 9(8), pp. 859-876, doi:
10.1586/erv.10.85.
58
43. Kowalczyk T. , Lucka M., Szemraj J., Sakowicz T. (2016), “Hairy roots
culture as a source of valuable biopharmaceuticals”, Postepy Hig Med
Dosw (Online), 70, pp. 1-9, doi: 10.5604/17322693.1192186.
44. Krzystek-Korpacka M., Zawadzki M., Neubauer K., Bednarz-Misa I.,
Górska S., Wiśniewski J., Witkiewicz W., Gamian A. (2017), “Elevated
systemic interleukin-7 in patients with colorectal cancer and individuals
at high risk of cancer: association with lymph node involvement and tumor
location in the right colon”, Cancer Immunol Immunother, 66(2), pp. 171-
179. doi: 10.1007/s00262-016-1933-3, PubmedID: 27866242.
45. Kwon T., Kim Y., Lee J., Yang M. (2003), “Production and secretion of
biologically active human granulocyte-macrophage colony stimulating
factor in transgenic tomato suspension cultures”, Biotechnology Letters
25(18), pp. 1571-1574, doi: 10.1023/A:1025409927790.
46. Lee J. H., Kim N. S., Kwon T. H., Jang Y. S., Yang M. S. (2002),
“Increased production of human granulocyte-macrophage colony
stimulating factor (hGM-CSF) by the addition of stabilizing polymer in
plant suspension cultures”, J. Biotechnol., 96(3), pp: 205–211.
47. Link A., Vogt T. K., Favre S., Britschgi M. R., Acha-Orbea H., Hinz B.,
Cyster J. G., Luther S. A. (2007), “Fibroblastic reticular cells in lymph
nodes regulate the homeostasis of naive T cells”, Nat Immunol,
8(11):1255–1265, doi:10.1038/ni1513.
48. Luchakivskaya Y., Kishchenko O., Gerasymenko I., Olevinskaya Z.,
Simonenko Y., Spivak M., Kuchuk M. (2011), “High-level expression of
human interferon alpha-2b in transgenic carrot (Daucus carota L.) plants”,
Plant Cell Rep., 30(3), pp. 407-415, doi: 10.1007/s00299-010-0942-5.
49. Ma S., Huang Y., Davis A., Yin Z., Mi Q., Menassa R., Brandle J. E.,
Jevnikar A. M. (2005), “Production of biologically active human
59
interleukin-4 in transgenic tobacco and potato”, Plant Biotechnol. J.,
2005, 3(3), pp. 309-318, doi:10.1111/j.1467-7652.2005.00125.x.
50. Mauro F. R., Gentile M., Foa R. (2002), “Erythropoietin and chronic
lymphocytic leukemia”, Rev Clin Exp Hematol, 1, pp. 21-31.
51. Matsumoto S., Ikura K., Ueda M., Sasaki R. (1995), “Characterization of
a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco
cells”, Plant Mol. Biol., 27(6), pp: 1163–1172.
52. Menassa R., Kennette W., Nguyen V., Rymerson R., Jevnikar A., Brandle
J. (2004), “Subcellular targeting of human interleukin-10 in plants”, J.
Biotechnol., 108(2), pp. 179-183.
53. Mett V., Musiychuk K., Bi H., Farrance C. E., Horsey A., Ugulava N.,
Shoji Y., de la Rosa P., Palmer G. A., Rabindran S., Streatfield S. J.,
Boyers A., Russell M., Mann A., Lambkin R., Oxford J. S., Schild G. C.,
Yusibov V. (2008), “A plant-produced influenza subunit vaccine protects
ferrets against virus challenge”, Influenza Other Respi. Viruses, 2(1), pp.
33-40, doi: 10.1111/j.1750-2659.2008.00037.x.
54. Morrissey P. J., Conlon P., Braddy S., Williams D. E., Namen A. E.,
Mochizuki D. Y. (1991a), “Administration of IL-7 to mice with
cyclophosphamide-induced lymphopenia accelerates lymphocyte
repopulation”, J. Immunol, 146(5), pp. 1547-1552.
55. Morrissey P. J., Conlon P., Charrier K., Braddy S., Alpert A., Williams
D., Namen A. E., Mochizuki D. (1991b), “Administration of IL-7 to
normal mice stimulates B-lymphopoiesis and peripheral
lymphadenopathy”, J. Immunol, 147(2), pp. 561-568.
56. Mortimer E., James M. M., Sandiswa M., Amelia B., Anna-Lise W., Inga
I. H., Edward P. R. (2012), “Setting up a platform for plant-based
influenza virus vaccine production in South Africa”, BMC Biotechnol,
12:14. doi: 10.1186/1472-6750-12-14.
60
57. Nahed E., Ronald E. G. (2010), “An Overview of IL-7 Biology and Its
Use in Immunotherapy”, J Immunotoxicol, 7(1), pp. 1-7,
doi:10.3109/15476910903453296.
58. Namen A. E., Lupton S., Hjerrild K., Wignall J., Mochizuki D. Y.,
Schmierer A., Mosley B., March C. J., Urdal D., Gillis S. (1988a),
“Stimulation of B-Cell progenitors by cloned murine interleukin- 7”,
Nature, 333(6173), pp. 571-573, doi: 10.1038/333571a0.
59. Namen A. E., Schmierer A. E., March C. J., Overell R. W., Park L. S., Urdal
D. L., Mochizuki D. Y. (1988b), “B cell precursor growth-promoting
activity. Purification and characterization of a growth factor active on
lymphocyte precursors”, J. Exp. Med., 167(3), pp. 988-1002.
60. Ngoc P. B. (2009), Production and Secretion of Recombinant Sweet-
Tasting Thaumatin from Suspension Cells and Hairy Roots of Nicotiana
tabacum, University of Heidelberg, Germany.
61. Ning T., Xie T., Qiu Q., Yang W., Zhou S., Zhou L., Zheng C., Zhu Y.,
Yang D. (2008), “Oral administration of recombinant human granulocyte-
macrophage colony stimulating factor expressed in rice endosperm can
increase leukocytes in mice”, Biotechnology Letter, 30(9), pp. 1679-1686,
doi: 10.1007/s10529-008-9717-2.
62. Nosaka T., Vandeursen J. M. A., Tripp R. A., Thierfelder W. E., Witthuhn
B. A., McMickle A. P., Doherty P. C., Grosveld G. C., Ihle J. N. (1995),
“Defective lymphoid development in mice lacking Jak3”, Science,
270(5237), pp. 800-802.
63. O'Connor A. M., Crawley A. M., Angel J. B. (2010), “Interleukin-7
enhances memory CD8+ T-cell recall responses in health but its activity
is impaired in human immunodeficiency virus infection”, Immunology,
131(4), pp. 525-536, doi: 10.1111/j.1365-2567.2010.03325.x.
61
64. Ohbo K., Suda T., Hashiyama M., Mantani A., Ikebe M., Miyakawa K.,
Moriyama M., Nakamura M., Katsuki M., Takahashi K., Yamamura K.,
Sugamura K. (1996), “Modulation of hematopoiesis in mice with a
truncated mutant of the IL-2 receptor-γ chain”, Blood, 87(3), pp. 956-967.
65. Ohya K., Matsumura T., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C. (2001),
“Expression of two subtypes of human IFN-alpha in transgenic potato
plants”, J. Interferon Cytokine Res., 21(8), pp. 595-602, doi:
10.1089/10799900152547858.
66. Ohya K., Itchoda N., Ohashi K., Onuma M., Sugimoto C., Matsumura T.
(2002), “Expression of biologically active human tumor necrosis factor-
alpha in transgenic potato plant”, J. Interferon Cytokine Res., 22(3), 371-
378, doi: 10.1089/107999002753675802.
67. Oliver P. M., Wang M., Zhu Y., White J., Kappler J., Marrack P. (2004),
“Loss of Bim allows precursor B cell survival but not precursor B cell
differentiation in the absence of interleukin 7”, J. Exp. Med., 200(9), pp.
1179-1187, doi: 10.1084/jem.20041129, PubMed ID: 15520248.
68. Patel J., Zhu H., Menassa R., Gyenis L., Richman A., Brandle J. (2007),
“Elastin-like polypeptide fusions enhance the accumulation of
recombinant proteins in tobacco leaves”, Transgenic Res., 16(2), pp. 239-
249, doi: 10.1007/s11248-006-9026-2.
69. Park Y., Cheong H. (2002), “Expression and production of recombinant
human interleukin-2 in potato plants”, Protein Expr. Purif., 25(1), pp.
160-165, doi: 10.1006/prep.2002.1622.
70. Park S. Y., Saijo K., Takahashi T., Osawa M., Arase H., Hirayama N.,
Miyake K., Nakauchi H., Shirasawa T., Saito T. (1995), “Developmental
defects of lymphoid cells in Jak3 kinase-deficient mice”, Immunity, 3(6),
pp. 771-782. PubmedID: 8777722.
62
71. Pellegrini M., Calzascia T., Elford A. R., Shahinian A., Lin A. E.,
Dissanayake D., Dhanji S., Nguyen L. T., Gronski M. A., Morre M.,
Assouline B., Lahl K., Sparwasser T., Ohashi P. S., Mak T. W. (2009),
“Adjuvant IL-7 antagonizes multiple cellular and molecular inhibitory
networks to enhance immunotherapies”, Nature Medicine, 15, pp. 528-
536, doi:10.1038/nm.1953.
72. Plasson C., Michel R., Lienard D., Saint-Jore-Dupas C., Sourrouille C., de
March G., Gomord V. (2009), “Production of recombinant proteins in
suspensioncultured plant cells”, Methods Mol Biol., 483, pp. 145-161,
doi:10.1007/978-1-59745-407-0_9.
73. Potula H. H., Kathuria S. R., Ghosh A. K., Maiti T. K., Dey S. (2008),
“Transient expression, purification and characterization of bioactive
human fibroblast growth factor 8b in tobacco plants”, Transgenic
Res.,17(1), pp. 19-32, doi: 10.1007/s11248-007-9072-4.
74. Qiang C. (2011), “Expression and manufacture of pharmaceutical proteins
in genetically engineered horticultural plants”, Transgenic Horticultural
Crops: Challenges, and Opportunities-Essays by Experts. Boca Raton:
Taylor & Francis, pp. 83-124, doi: 10.1201/b10952-5.
75. Rich B. E., Campos-Torres J., Tepper R. I., Moreadith R. W., Leder P.
(1993), “Cutaneous lymphoproliferation and lymphomas in interleukin 7
transgenic mice”, J. Exp. Med., 177(2), pp. 305-316.
76. Rodig S. J., Meraz M. A., White J. M., Lampe P. A., Riley J. K., Arthur C.
D., King K. L., Sheehan K. C. F., Yin L., Pennica D., Johnson E. M. J.,
Schreiber R. D. (1998), “Disruption of the Jak1 gene demonstrates
obligatory and non-redundant roles of the Jaks in cytokine-induced
biologic responses”, Cell, 93(3), pp. 373-383, PubMed: 9590172.
77.Sanchez-Hernandez C., Gutierrez-Ortega A., Aguilar-Leon D., Hernandez-
Pando R., Gomez-Lim M., Gomez-Garcia B. (2010), “In vivo activity of
63
plant-based interleukin-12 in the lung of Balb/c mouse”, BMC Res. Notes,
3:151, doi: 10.1186/1756-0500-3-151.
78. Santos R. B., Abranches R., Fischer R., Sack M., Holland T. (2016),
“Putting the Spotlight Back on Plant Suspension Cultures”, Front Plant
Sci., 7:297, doi: 10.3389/fpls.2016.00297.
79. Sardana R., Dudani A. K., Tackaberry E., Alli Z., Porter S., Rowlandson
K., Ganz P., Altosaar I. (2007), “Biologically active human GM-CSF
produced in the seeds of transgenic rice plants”, Transgenic Res., 16(6),
pp. 713-721, doi:10.1007/s11248-006-9062-y.
80. Savino A. M., Izraeli S. (2017), “Interleukin-7 signaling as a therapeutic
target in acute lymphoblastic leukemia”, Expert Rev Hematol., 10(3), pp.
183-185, doi: 10.1080/17474086.2017.1292121.
81. Scheller J., Leps M., Conrad U. (2006), “Forcing single-chain variable
fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like
polypeptides”, Plant Biotechnol. J., 4(2), pp. 243-249, doi:
10.1111/j.1467-7652.2005.00176.x.
82.Schwertschlag U. S., Trepicchio W. L., Dykstra K. H. (1999),
“Hematopoietic, immunomodulatory and epithelial effects of interleukin-
11”, Leukemia, 13(9), pp. 1307-1315.
83. Seddon B., Tomlinson P., Zamoyska R. (2003), “Interleukin 7 and T cell
receptor signals regulate homeostasis of CD4 memory cells”, Nature
Immunol, 4(7), pp. 680-686, doi: 10.1038/ni946.
84. Shin Y. J., Hong S. Y., Kwon T. H., Jang Y. S., Yang M. S. (2003), “High
level of expression of recombinant human granulocyte-macrophage
colony stimulating factor in transgenic rice cell suspension culture”,
Biotechnol. Bioeng, 82(7), pp.778-783, doi:10.1002/bit.10635.
85. Shiroki F., Satoshi M., Tomomitsu D., Mari F., Yoshito M., Takashi K.,
Harumi S., Shigeo K. (2007), “The p85α regulatory subunit of class IA
64
phosphoinositide 3-kinase regulates beta-selection in thymocyte
development”, Journal of Immunology, 178(3), pp. 1349–1356, doi:
10.4049/jimmunol.178.3.1349.
86. Silva M. R., Hoffman R., Srour E. F., Ascensao J. L. (1994), “Generation
of human natural killer cells from immature progenitors does not require
marrow stromal cells”, Blood, 84, pp. 841-846.
87. Sijmons P. C., Dekker B. M., Schrammeijer B., Verwoerd T. C., van den
Elzen P. J., Hoekema A. (1990), “Production of correctly processed
human serum albumin in transgenic plants”, Nature Biotechnology, 8, pp.
217-222, doi:10.1038/nbt0390-217.
88. Matsuyama R., Goto K., Kadokura T., Sato M., Mori R., Kumamoto T.,
Taguri M., Miyasho T., Endo I. (2017), “IL-7 and procalcitonin are useful
biomarkers in the comprehensive evaluation of the severity of acute
cholangitis”, J Hepatobiliary Pancreat Sci, 24(2), pp. 81-88,
doi:10.1002/jhbp.420. PMID: 28002647
89. Suzuki K., Nakajima H., Watanabe N., Kagami S., Suto A., Saito Y., Saito
T., Iwamoto I. (2000), “Role of common cytokine receptor-γ chain- and
Jak3-dependent signaling in the proliferation and survival of murine mast
cells”, Blood, 96(6), pp. 2172–2180.
90. Sweeney E. B., Foss F. M., Murphy J. R., Spek J. C. (1998), “Interleukin 7
(IL-7) receptor-specific cell killing by DAB389 IL-7: a novel agent for the
elimination of IL-7 receptor positive cells”, Bioconjug chem.,9(2), pp. 201
- 207, doi: 10.1021/bc9701757.
91. Vandana K., Laura A. P., Yevgeniy Y., Florian M. B., Surojit S. (2015),
“Quiescence of Memory CD8(+) T Cells Is Mediated by Regulatory T Cells
through Inhibitory Receptor CTLA-4”, Immunity, 42(6), pp. 1116-1129.
92. Van den Bergh J. M., Lion E., Van Tendeloo V. F., Smits E. L. (2017), “IL-
15 receptor alpha as the magic wand to boost the success of IL-15
65
antitumor therapies: The upswing of IL-15 transpresentation”,
Pharmacology & Therapeutics, 170, pp. 73-79, doi:
10.1016/j.pharmthera.2016.10.012.
93. Vaquero C., Sack M., Chandler J., Drossard J., Schuster F., Monecke M.,
Schillberg S., Fischer R. (1999), “Transient expression of a tumor-specific
single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves”, Proc
Natl Acad Sci U S A, 96(20), pp. 11128-11133.
94. Wang D. J., Brandsma M., Yin Z., Wang A., Jevnikar A. M., Ma S. (2008),
“A novel platform for biologically active recombinant human interleukin-
13 production”, Plant Biotechnology J., 6(5), pp. 504–515, doi:
10.1111/j.1467-7652.2008.00337.
95. Wang M. L., Goldstein C., Su W., Moore P. H., Albert H. H. (2005),
“Production of biologically active GM-CSF in sugarcane: A secure
biofactory”, Transgenic Res., 14(2), pp. 167-178.
96. Wang X. B., Wu Q., Ito T., Cillo F., Li W. X., Chen X., Yu J. L., Ding S.
W. (2010), “RNAi-mediated viral immunity requires amplification of
virus-derived siRNAs in Arabidopsis thaliana”, Proc Natl Acad Sci U S
A, 107(1), pp. 484-9, doi: 10.1073/pnas.0904086107.
97. Watanabe M., Ueno Y., Yajima T., Iwao Y., Tsuchiya M., Ishikawa H.,
Aiso S., Hibi T., Ishii H. (1995), “Interleukin 7 is produced by human
intestinal epithelial-cells and regulates the proliferation of intestinal
mucosal lymphocytes”, J. Clin. Investigation, 95(6), pp. 2945-2953, doi:
10.1172/JCI118002.
98. Wikipedia, Interleukin 7, https://en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_7, ngày
01/01/2017.
99. Wiles M. V., Ruiz P., Imhof B. A. (1992), “Interleukin-7 expression during
mouse thymus development”, Eur. J. Immunology, 22(4), pp. 1037-1042,
doi: 10.1002/eji.1830220424.
66
100. World Health Organization (2016), Vietnam has among world’s highest
cancer fatality rates,
https://www.vietnambreakingnews.com/2016/10/vietnam-has-among-
worlds-highest-cancer-fatality-rates/, ngày 01/01/2017.
101. Yoko S., Hong B., Konstantin M., Amy R., April H., Gourgopal R., Brian
G., Moneim S., Christine E. F., Barbara T., Nutan M., Natalia U. (2009),
“Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection
with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza”, Vaccine, 27(7), pp.
1087-1092, doi:10.1016/j.vaccine.2008.11.108.
102. Yoseph S., Yoram T. (2016), “Plant specific N-glycan do not have proven
adverse effects in humans”, Nature Biotechnology, 34, pp. 706-708,
doi:10.1038/nbt.3556.
103. Zhang B., Yang Y. H., Lin Y. M., Rao Q., Zheng G. G., Wu K. F. (2003),
“Expression and production of bioactive human interleukin-18 in
transgenic tobacco plants”, Biotechnology Letter, 25(19), pp. 1629-1635.
104. Zhang X., Du P., Lu L., Xiao Q., Wang Q., Cao X., Ren B., Wei C., Li Y.
(2008), Contrasting effects of HC-Pro and 2b viral suppressors from
Sugarcane mosaic virus and Tomato aspermy cucumovir us on the
accumulation of siRNAs, Virology, 374(2), pp. 351-360, doi:
10.1016/j.virol.2007.12.045.
105. Zhong H., Gu X., Dai Y., Wang Z., Fu D., Guo X., Wu H., Wang D., Lu
Z. (2016), “Interleukin-7 in Patients With Chronic Hepatitis B May Have
Effect on T Follicular Helper Cells and Specific Cellular Immunity”,
Hepat Mon, 16(9): e36068, doi:10.5812/hepatmon.36068.
106. Zhou F., Wang M. L., Albert H. H., Moore P. H., Zhu Y. J. (2006),
“Efficient transient expression of human GM-CSF protein in Nicotiana
benthamiana using potato virus X vector”, Appl. Microbiology
Biotechnology, 72(4), pp. 756-762, doi: 10.1007/s00253-005-0305-2.
67
107. Ziegler S. F., Liu Y. J. (2006), “Thymic stromal lymphopoietin in normal
and pathogenic T-cell development and function”, Nature Immunology,
7(7), pp. 709-714, doi: 10.1038/ni1360.
68
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Thành phần một số dung dịch đệm
Dung dịch đệm Thành phần
Đệm xử lý mẫu
(Treatment buffer 6X)
Tris HCl 1M
Glycerol 100%
SDS
2-mercaptoethanol
Bromophenol blue
pH
3,75 ml
6 ml
1,2 g
0,9 ml
1,2 mg
6,8
Đệm chạy điện di protein
(running buffer protein)
Tris HCl
Glycine
SDS
25 mM
250mM
0,1%
1 lít running buffer 1X: 3g Tris, 18,8 g glycine, 1g SDS
Đệm Staining buffer
CBBR - 250
Methanol
Acid axetic
0,25%
30%
10%
Đệm Destaining buffer Methanol
Acid axetic
30%
10%
Đệm chiết DNA tổng số
Tris-HCl 1M
NaCl 5M
EDTA 0.5M
CTAB
pH
50 mM
300 mM
20 mM
4%
8.0
69
Phụ lục 2. Các vector sử dụng trong luận án
* Sơ đồ cấu trúc vector pBSK/IL7
* Sơ đồ cấu trúc vector pCB301 35S/IL7-histag-cMyc-100xELP