cytoplasmic viscosity

7/28/2019 Cytoplasmic Viscosity

1/12

B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u m e 7 1 A u g u s t 1 9 9 6 1 1 4 0 - 1 1 5 1

C y t o p l a s m i c V i s c o s i t y N e a r t h e C e l l Plasma Membrane: T r a n s l a t i o n a lD i f f u s i o n o f a S m a l l F l u o r e s c e n t S o l u t e Measured by T o t a l I n t e r n a lR e f l e c t i o n - F l u o r e s c e n c e P h o t o b l e a c h i n g RecoveryR . S w a m i n a t h a n , S . B i c k n e s e , N . P e r i a s a m y , a n d A . S . VerkmanD e p a r t m e n t s o f M e d i c i n e a n d P h y s i o l o g y , C a r d i o v a s c u l a r R e s e a r c h I n s t i t u t e , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , San F r a n c i s c o , C a l i f o r n i a9 4 1 4 3 - 0 5 2 1 USAABSTRACT T o t a l i n t e r n a l r e f l e c t i o n - f l u o r e s c e n c e r e c o v e r y a f t e r p h o t o b l e a c h i n g ( T I R - F R A P ) was a p p l i e d t o measure s o l u t et r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n i n t h e aq u e o u s p h a s e o f m e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o p l a s m . T I R f l u o r e s c e n c e e x c i t a t i o n i n aqueouss o l u t i o n s a n d f l u o r e s c e n t l y l a b e l e d c e l l s was p r o d u c e d b y l a s e r i l l u m i n a t i o n a t a s u b c r i t i c a l a n g l e u t i l i z i n g a q u a r t z p r i s m ;m i c r o s e c o n d - r e s o l u t i o n FRAP was a c c o m p l i s h ed b y a c o u s t o - o p t i c m o d u l a t o r s a n d e l e c t r o n i c p h o t o mu l t i p l i er g a t i n g . Am a t h e m a t i c a l m o d e l was d e v e l o p e d t o d e t e r m i n e s o l u t e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t f r o m t h e t i m e c o u r s e o f p h o t o b l e a c h i n grecovery, b l e a c h t i m e , b l e a c h i n t e n s i t y , a n d e v a n e s c e n t f i e l d p e n e t r a t i o n d e p t h ; t h e m o d e l i n c l u d e d i r r e v e r s i b l e a n d r e v e r s i b l ep h o t o b l e a c h i n g processes, w i t h t r i p l e t s t a t e d i f f u s i o n . T h e v a l i d i t y a n d a c c u r a c y o f T I R - F R A P measurements were f i r s te x a r m i n e d i n a qu e o u s f l u o r o p h o r e s o l u t i o n s . D i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s f o r f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e - d e x t r a n s ( 1 0 - 2 0 0 0 k D a )d e t e r m i n e d b y T I R - F R A P ( r e c o v e r y t 1 l 2 0 . 5 - 2 . 2 m s ) a g r e e d w i t h v a l u e s m e a s u r e d b y c o n v e n t i o n a l s p o t p h o t o b l e a c h i n g .M o d e l p r e d i c t i o n s f o r t h e d e p e n d e n c e o f r e c o v e r y c u r v e s h a p e o n s o l u t i o n v i s c o s i t y , b l e a c h t i m e , a n d b l e a c h d e p t h werev a l i d a t e d e x p e r i m e n t a l l y u s i n g aq u e o u s f l u o r e s c e i n s o l u t i o n s . To s t u d y s o l u t e d i f f u s i o n i n c y t o s o l , MDCK e p i t h e l i a l c e l l s weref l u o r e s c e n t l y l a b el e d w i th t h e s m a l l s o l u t e 2 ' , 7 ' - b i s - 2 - c a r b o x y e t h y l - 5 - c a r b o x y f l u o r e s c e i n - a c e t o x y m e t h y l - e s t e r ( B C E C F ) . Areversible photobleaching process ( t 1 , 2 0.5 ms) wasidentified that involved triplet-state relaxation and could be eliminatedb y t r i p l e t - s t a t e q u e n c h i n g w i t h 100% oxygen. T I R - F R A P t 1 1 2 v a l u e s f o r i r r e v e r s i b l e BCECF b l ea c h i n g , r e p r es e n t i n g BCECFt r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n i n t h e e v a n e s c e n t f i e l d , were i n t h e r a n g e 2 . 2 - 4 . 8 ms ( 0 . 2 - 1 ms b l e a c h t i m e s ) , y i e l d i n g a BCECFd i f f u s i o n c o e f f i c i e n t 6 - 1 0 - f o l d l e s s t h a n t h a t i n w a t e r . T h e s e r e s u l t s e s t a b l i s h t h e t h e o r y a n d t h e f i r s t e x p e r i m e n t a l a p p l i c a t i o no f T i R - F R A P t o m e a s u r e a q u e o u s - p h a s e s o l u t e d i f f u s i o n , a n d i n d i c a t e s l o w e d t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n o f a s m a l l s o l u t e i nm m > r a n e - a d j a c e n t c y t o s o l .INTRODUCTIONT h e c y t o p l a s m i s a c r o w d e d a q u e o u s c o m p a r t m e n t c o n t a i n -i n g s m a l l s o l u t e s , m a c r o m o l e c u l e s , a n d o r g a n i z e d s k e l e t a ln e t w o r k s ( F u l t o n , 1 9 8 2 ; C l e g g , 1 9 8 4 ; P o r t e r , 1 9 8 4 ; V e r k -m a n , 1 9 9 1 ; L u b y - P h e l p s , 1 9 9 4 ) . T h e d i f f u s i o n a l m o b i l i t y o fs m a l l s o l u t e s a n d m a c r o m o l e c u l e s i n c y t o p l a s m h a s c o n s i d -e r a b l e i m p o r t a n c e i n c e l l m e t a b o l i s m a n d s i g n a l t r a n s d u c -t i o n . F o r e x a m p l e , t h e t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n o f s m a l l s o l -u t e s d e t e r m i n e s t h e r a t e a t w h i c h l i g a n d s r e a c h t a r g e te n z y m e s , m e t a b o l i t e s r e a c h m i t o c h o n d r i a , a n d n u c l e i c a c i d sr e a c h t h e n u c l e u s . T h e t r a n s l a t i o n o f s m a l l s o l u t e s may b e o fs p e c i a l i m p o r t a n c e i n c y t o s o l j u s t b e n e a t h t h e p l a s m a m e m -b r a n e t o p e r m i t r a p i d s i g n a l t r a n s d u c t i o n b y G - p r o t e i n -c o u p l e d m e c h a n i s m s ( A u s i e l l o e t a l . , 1 9 8 7 ; T h o m a s e t a l . ,1 9 9 1 ) . T h e d i f f u s i o n o f l a r g e r m a c r o m o l e c u l e s i s i m p o r t a n tf o r p r o t e i n / p r o t e i n a n d p r o t e i n / n u c l e i c a c i d i n t e r a c t i o n s , a sw e l l a s f o r t h e a s s e m b l y o f s k e l e t a l p r o t e i n s i n t o f u n c t i o n a l

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 7 D e c e mb e r 1 9 9 5 a n d i n f i n a l f o r m 1 2 May1 9 9 6 .A d d r e s s r e p r i n t r e q u e s t s t o A l a n S . V e r k m a n , M . D . , P h . D . , C a r d i o v a s c u l a rR e s e a r c h I n s t i t u t e , 1 2 4 6 H e a l t h S c i e n c e s E a s t T o w e r , U n i v e r s i t y o f C a l i -f o r n i a , S a n F r a n c i s c o , CA 9 4 1 4 3 - 0 5 2 1 . T e l . : 4 1 5 - 4 7 6 - 8 5 3 0 ; F a x : 4 1 5 - 6 6 5 -3 8 4 7 ; E - m a i l : v e r k m a n @ i t s a . u c s f . e d u .D r . P e r i a s a m y ' s p e r m a n e n t a d d r e s s i s C h e m i c a l P h y s i c s G r o u p , T a t aI n s t i t u t e o f F u n d a m e n t a l R e s e a r c h , Mumbai 4 0 0 0 0 5 , I n d i a .C 1 9 9 6 b y t h e B i o p h y s i c a l S o c i e t y0 0 0 6 - 3 4 9 5 / 9 6 / 0 8 / 1 1 4 0 / 1 2 $ 2 . 0 0

n e t w o r k s r e q u i r e d f o r o r g a n e l l e t a r g e t i n g a n d c e l ll o c o m o t i o n .

T h e c e n t r a l p r o b l e m i s t o q u a n t i f y t h e r a t e s o f t r a n s l a -t i o n a l a n d r o t a t i o n a l d i f f u s i o n o f s o l u t e s i n t h e c y t o s o l i cc o m p a r t m e n t . B e c a u s e o f s p a t i a l h e t e r o g e n e i t y i n t h e c o m -p o s i t i o n a n d o r g a n i z a t i o n o f t h e c y t o s o l , s e p a r a t e m e a s u r e -m e n t s a r e p r o b a b l y r e q u i r e d f o r " b u l k " c y t o s o l , " p e r i p h e r a l "c y t o s o l , a n d " m e m b r a n e - a d j a c e n t " c y t o s o l . T h e r h e o l o g y o fc y t o s o l h a s b e e n t h e s u b j e c t o f a s e r i e s o f b i o p h y s i c a li n v e s t i g a t i o n s b a s e d o n t h e a n a l y s i s o f v i s c o s i t y - s e n s i t i v ep r o b e s b y e l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e ( L e p o c k e t a l . , 1 9 8 3 ;M a s t r o a n d K e i t h , 1 9 8 4 ) a n d f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y( L u b y - P h e l p s e t a l . , 1 9 8 6 ; D i x a n d V e r k m a n , 1 9 9 0 ; F u s h i m ie t a l . , 1 9 9 0 ) . Two i n d e p e n d e n t a p p r o a c h e s h a v e e s t a b l i s h e dr e c e n t l y t h a t t h e " f l u i d - p h a s e " c y t o p l a s m i c v i s c o s i t y , de -f i n e d a s t h e v i s c o s i t y s e n s e d b y a s m a l l m o l e c u l e i n t h ea b s e n c e o f c o l l i s i o n s w i t h o r b i n d i n g t o c y t o s o l i c m a c r o -m o l e c u l e s ( V e r k m a n e t a l . , 1 9 9 1 ; Kao e t a l . , 1 9 9 3 ) , i s n o tmuch d i f f e r e n t f r o m t h e v i s c o s i t y o f w a t e r . F u s h i m i a n dV e r k m a n ( 1 9 9 1 ) f o u n d t h a t t h e p i c o s e c o n d r o t a t i o n a l c o r -r e l a t i o n t i m e s o f a q u e o u s - p h a s e f l u o r e s c e n t p r o b e s i n c y t o -p l a s m w e r e o n l y -30% g r e a t e r t h a n t h a t i n w a t e r . L u b y -P h e l p s e t a l . ( 1 9 9 3 ) r e a c h e d a s i m i l a r c o n c l u s i o n u s i n g a" v i s c o s i t y - s e n s i t i v e " f l u o r o p h o r e w h o s e q u a n t u m y i e l d wass e n s i t i v e t o f l u i d - p h a s e v i s c o s i t y .

Kao e t a l . ( 1 9 9 3 ) e x a m i n e d t h e t r a n s l a t i o n a l m o b i l i t y o f as m a l l f l u o r e s c e n t p r o b e , 2 ' , 7 ' - b i s - 2 - c a r b o x y e t h y l - 5 - c a r -

1 1 4 0


2/12

C y t o p l a s m i c V i s c o s i t y M e a s u r e d b y T I R - F R A Pb o x y f l u o r e s c e i n - a c e t o x y m e t h y l - e s t e r ( B C E C F ) , i n t h e c y t o -p l a s m o f S w i s s 3 T 3 f i b r o b l a s t s , u t i l i z i n g f l u o r e s c e n c e r e -c o v e r y a f t e r p h o t o b l e a c h i n g ( F R A P ) . T h e t r a n s l a t i o n a ld i f f u s i o n o f BCECF w a s -4 t i m e s s l o w e r i n b u l k a n dp e r i p h e r a l c y t o s o l t h a n i n w a t e r . T h r e e i n d e p e n d e n t l y a c t i n gf a c t o r s w e r e i d e n t i f i e d t h a t a c c o u n t e d q u a n t i t a t i v e l y f o r t h es l o w e d s o l u t e t r a n s l a t i o n i n c y t o s o l c o m p a r e d t o t h a t i nw a t e r : 1 ) s l o w e d d i f f u s i o n i n f l u i d - p h a s e c y t o s o l , 2 ) p r o b eb i n d i n g t o i n t r a c e l l u l a r c o m p o n e n t s , a n d 3 ) p r o b e c o l l i s i o n sw i t h i n t r a c e l l u l a r c o m p o n e n t s . T h e l a t t e r f a c t o r , p r o b e c o l -l i s i o n s , w a s d e t e r m i n e d t o b e t h e p r i n c i p a l d i f f u s i v e b a r r i e rt h a t s l o w e d s m a l l s o l u t e t r a n s l a t i o n . L u b y - P h e l p s e t a l .( 1 9 8 6 ) u t i l i z e d FRAP t o m e a s u r e t h e t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o no f a s e r i e s o f m i c r o i n j e c t e d , f l u o r e s c e n t l y l a b e l e d d e x t r a n sa n d f i c o l l s . As t h e d e x t r a n o r f i c o l l s i z e w a s i n c r e a s e d ,d i f f u s i o n i n c y t o s o l w a s d e c r e a s e d r e l a t i v e t o t h a t i n w a t e r ,s u g g e s t i n g a c y t o s o l i c " s i e v i n g " m e c h a n i s m t h a t w a s p r o -p o s e d t o i n v o l v e t h e s k e l e t a l m e s h . F u r t h e r s t u d i e s i n a r t i -f i c i a l s o l u t i o n s c o n t a i n i n g m a c r o m o l e c u l e s a n d a s s e m b l e dF - a c t i n n e t w o r k s h a v e b e g u n t o r e s o l v e t h e f a c t o r s t h a tc o n t r i b u t e t o t h e a p p a r e n t c y t o s o l i c s i e v i n g o f m a c r o m o l e -c u l e s ( H o u e t a l . , 1 9 9 0 ) .I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e p h y s i c a l s t a t e o f w a t e r i nc y t o p l a s m j u s t b e n e a t h t h e p l a s m a m e m b r a n e i s d i f f e r e n tf r o m t h a t i n b u l k o r p e r i p h e r a l c y t o p l a s m . M e m b r a n e - a d j a -c e n t c y t o p l a s m i s a s p e c i a l i z e d r e g i o n o f c y t o s o l b o u n d e db y a l i p i d m e m b r a n e p a c k e d w i t h i n t e g r a l p r o t e i n s , a s w e l la s b o u n d p r o t e i n s t h a t p r o v i d e s k e l e t a l a n c h o r a g e s i t e s ; t h i su n i q u e m i l i e u h a s b e e n p r o p o s e d t o c a u s e p a r t i a l o r e x t e n -s i v e o r g a n i z a t i o n o f m a c r o m o l e c u l e s , s m a l l s o l u t e s , a n de v e n w a t e r ( P a r s e g i a n a n d R a u , 1 9 8 4 ) . B i c k n e s e e t a l .( 1 9 9 3 ) u t i l i z e d e v a n e s c e n t f i e l d f r e q u e n c y - d o m a i n m i -c r o f l u o r i m e t r y t o q u a n t i f y t h e p i c o s e c o n d r o t a t i o n a l c o r r e -l a t i o n t i me o f s m a l l f l u o r e s c e n t p r o b e s i n m e m b r a n e - a d j a -c e n t c y t o s o l . F l u i d - p h a s e v i s c o s i t y w a s p r o b e d w i t h i n -50n m o f t h e c e l l m e m b r a n e b y e x c i t a t i o n o f c y t o p l a s m i cBCECF f l u o r e s c e n c e b y t o t a l i n t e r n a l r e f l e c t i o n ( T I R ) .P r o b e r o t a t i o n i n m e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o s o l d i d n o t d i f f e rs i g n i f i c a n t l y f r o m t h a t i n b u l k c y t o s o l , i n a g r e e m e n t w i t ht h e c o n c l u s i o n t h a t m a c r o m o l e c u l e s ( g r e a t e r t h a n -5 k D a )h a v e l i t t l e i n f l u e n c e o n f l u i d - p h a s e v i s c o s i t y , a s s e n s e d b yt h e m i c r o s c o p i c m o t i o n s o f s m a l l m o l e c u l es ( F u s h i m i a n dV e r k m a n , 1 9 9 1 ; P e r i a s a m y e t a l . , 1 9 9 2 ) . H o w e v e r , n o i n -f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e o n t h e m o r e i m p o r t a n t p a r a m e t e r ,t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n o f s o l u t e s i n m e m b r a n e - a d j a c e n tc y t o p l a s m .T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o m e a s u r e t h e t r a n s l a t i o n a ld i f f u s i o n o f a s m a l l f l u o r e s c e n t p r o b e i n c y t o p l a s m j u s tb e n e a t h t h e p l a s m a m e m b r a n e . T I R w a s u s e d t o e x c i t ef l u o r e s c e n c e s e l e c t i v e l y i n m e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o p l a s m ,a n d FRAP w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e k i n e t i c s o f r a p i df l u o r o p h o r e t r a n s l a t i o n n e a r t h e m e m b r a n e . A l t h o u g h T I R -FRAP h a s b e e n u s e d t o m e a s u r e t h e k i n e t i c s o f l i g a n db i n d i n g t o c e l l s u r f a c e s b a s e d o n t h e g e n e r a t i o n o f a f l u o -r e s c e n c e s i g n a l u p o n l i g a n d b i n d i n g ( A x e l r o d e t a l . , 1 9 8 6 ;H s i e h a n d T h o m p s o n , 1 9 9 4 , 1 9 9 5 ; S t o u t a n d A x e l r o d ,

d i f f u s i o n i n a t h r e e - d i m e n s i o n a l a q u e o u s p h a s e . B e c a u s e o ft h e s m a l l p e n e t r a t i o n d e p t h o f t h e e v a n e s c e n t f i e l d p r o d u c e db y t h e T I R e x c i t a t i o n , v e r y f a s t r e c o v e r y t i m e s w e r e p r e -d i c t e d . A m i c r o s e c o n d F RA P a p p a r a t u s c o n s i s t i n g o fa c o u s t o - o p t i c m o d u l a t o r s a n d a p h o t o m u l t i p l i e r g a t i n g c i r -c u i t w a s u s e d t o a c q u i r e TIR-FRAP r e c o v e r y c u r v e s . Am a t h e m a t i c a l m o d e l o f f l u o r e s c e n c e r e c o v e r y w a s d e v e l -o p e d t h a t i n c o r p o r a t e d d e t a i l s o f e v a n e s c e n t w a v e p e n e t r a -t i o n , p r o b e d i f f u s i o n d u r i n g a n d a f t e r t h e p h o t o b l e a c h i n gp u l s e , a n d r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g . T h e m e a s u r e m e n t o fa q u e o u s - p h a s e s o l u t e d i f f u s i o n b y TIR-FRAP w a s v a l i d a t e di n c e l l - f r e e a q u e o u s s o l u t i o n s a n d t h e n a p p l i e d i n l i v i n gc e l l s t o d e t e r m i n e t h e BCECF t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n c o e f -f i c i e n t . I n p e r f o r m i n g t h e c e l l s t u d i e s , a n o x y g e n - d e p e n d e n tr e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g p r o c e s s t h a t i n v o l v e d t r i p l e t - s t a t er e l a x a t i o n w a s i d e n t i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e d . F o r t u n a t e l y , i tw a s f o u n d t h a t t h e r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g p r o c e s s c o u l db e e f f e c t i v e l y e l i m i n a t e d b y c a r r y i n g o u t c e l l m e a s u r e m e n t si n a 1 0 0 % o x y g e n a t m o s p h e r e , p e r m i t t i n g i n t e r p r e t a t i o n o ft h e r e c o v e r y s i g n a l i n t e r m s o f BCECF d i f f u s i o n . T h er e s u l t s h e r e p r o v i d e t h e f i r s t m e a s u r e m e n t o f s o l u t e t r a n s -l a t i o n i n m e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o s o l a n d e s t a b l i s h t h e t h e -o r y a n d t e c h n i c a l d e t a i l s t o e x a m i n e t h e m o t i o n o f l a r g e rs o l u t e s n e a r b i o l o g i c a l i n t e r f a c e s .MATERIALS AND METHODSC e l l c u l t u r eMDCK c e l l s ( p a s s a g e s 5 2 - 5 8 , UCSF C e l l C u l t u r e F a c i l i t y ) w e r e g r o w n o n1 8 - m m - d i a m e t e r r o u n d f u s e d s i l i c a c o v e r s l i p s i n DME-H21 m e d i u m s u p -p l e m e n t e d w i t h 5 % f e t a l c a l f s e r u m , p e n i c i l l i n ( 1 0 0 u n i t s / m l ) , a n d s t r e p -t o m y c i n ( 1 0 0 , u g / m l ) . F u s e d s i l i c a w a s u s e d t o e l i m i n a t e p h o s p h o r e s c e n c e ,w h i c h w a s f o u n d i n a l l g l a s s a n d s a p p h i r e c o v e r s l i p s t e s t e d . C e l l s w e r eg r o w n a t 3 7 C i n 95% a i r , 5% C O 2 a n d u s e d 1 - 2 d a y s a f t e r p l a t i n g , a tw h i c h t i m e t h e y w e r e n e a r l y c o n f l u e n t . C e l l s w e r e l o a ded w i thBCECF-AM ( M o l e c u l a r P r o b e s ) b y a 1 0 - m i n i n c u b a t i o n i n c u l t u r em e d i u m .

F l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p yT h e o u t p u t o f a n a r g o n i o n l a s e r ( 4 8 8 n m , I n n o v a 7 0 - 4 ; C o h e r e n t I n c . ) w a sm o d u l a t e d b y s e r i a l a c o u s t o - o p t i c m o d u l a t o r s ( s e e b e l o w ) a n d d i r e c t e do n t o t h e s t a g e o f a n i n v e r t e d e p i f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e ( D i a p h o t , N i k o n )( F i g . 1 ) . T h e b e a m w a s f o c u s e d b y a 2 5 X d r y o b j e c t i v e l e n s ( w o r k i n gd i s t a n c e 1 . 6 c m , N . A . 0 . 3 5 ; L e i t z ) m o u n t e d o n a f o u r - a x i s m i c r o m a n i p u -l a t o r , a n d d i r e c t e d t o a f u s e d s i l i c a r i g h t t r i a n g u l a r p r i s m ( M e l l e s - G r i o t ) .L i g h t f r o m t h e u p p e r h a l f o f t h e o b j e c t i v e w a s b l o c k e d t o r e s t r i c t t h ea n g u l a r s p r e a d o f t h e i n c i d e n t b ea m . T h e p r i s m w a s i n o p t i c a l c o n t a c t w i t ht h e ( c e l l - f r e e ) s u r f a c e o f t h e c o v e r s l i p u s i n g s p e c t r o s c o p i c g r a d e g l y c e r o l .T h e b e a m i n c i d e n t a n g l e w a s d e t e r m i n e d f r o m t h e g e o m e t r y o f t h e o p t i c a lc o n f i g u r a t i o n . R e f r a c t i v e i n d i c e s o f t h e p r i s m a n d c o v e r s l i p ( n 4 8 8 n m =1 . 4 5 8 ) w er e u s ed t o c a l c u l a t e t h e i n c i d e n t a n g l e a t t h e d i e l e c t r i c : w a t e ri n t e r f a c e . T h e f o c u s e d l a s e r b e a m p r o d u c e d a n e l l i p t i c a l s p o t ( - 4 , u m w i d ea n d -70 Am l o n g ) i n t h e s a m p l e p l a n e . T h e s a m p l e a n d p r i s m w e r ep o s i t i o n e d o n t h e x , y t r a n s l a t i o n s t a g e o f t h e m i c r o s c o p e .

F o r m e a s u r e m e n t s i n a q u e o u s s o l u t i o n s , 1 0 0 - , u l s o l u t i o n v o l u m e s w e r e" s a n d w i c h e d " b et we en t w o c o v e r s l i p s u s i n g s p a c e r s . F o r c e l l m e a s u r e -m e n t s , t h e u p p e r c o v e r s l i p c o n t a i n e d t h e c u l t u r e d c e l l s ( f a c i n g d o w n w a r d ) .T h e s a m p l e w a s e n c l o s e d i n a l u c i t e c h a m b e r i n w h i c h t h e a t m o s p h e r ec o u l d b e c o n t r o l l e d ( a i r o r 1 0 0 % n i t r o g e n o r 1 0 0 % o x y g e n ) . I n s o m ee x p e r i m e n t s , t h e T I R p r i s m w a s r em o v e d f o r d i r e c t ( " t r a n s " ) s a m p l e

1 1 4 1S w a m i n a t h a n e t a l .

1 9 9 4 ) , i t h a s n o t b e e n u s e d p r e v i o u s l y t o s t u d y s o l u t e


3/12

V o l u m e 7 1 A u g u s t 1 9 9 6

FIGURE 1 S c h e m a t i c o f TIR-FRAPi n s t r u m e n t a t i o n . T h e b e a m f r o m a n A rl a s e r w a s m o d u l a t e d b y s e r i a l a c o u s -t o o p t i c m o d u l a t o r s a n d d i r e c t e d o n t ot h e s a m p l e t h r o u g h a 25 X o b j e c t i v el e n s a n d r i g h t t r i a n g u l a r f u s e d s i l i c ap r i s m . T h e s i g n a l w a s f i l t e r e d a n d d e -t e c t e d b y a g a t e d p h o t o m u l t i p l i e r . S e et e x t f o r d e t a i l s . ( R i g h t ) E x p a n d e d v i e wo f p r i s m s h o w i n g b e a m i n c i d e n t a n g l e4 ) a n d e v a n e s c e n t f i e l d d e p t h d .

_____AOM 1A r L a s e r i - .1 AOM 2

. . . . . . . . .

a i r o r O p o r N 2a t m o s p h e r ec o n t r o l

K. < prism g l y c e r o ls a m p l e

o b j e c t i v eAOM D r i v e r s

- - - - f i l t e r s

AOM c o n t r o lg a t i n gb l e a c h T p r o b e control A m p l i f i e ro l t a g e v o l t a g e A

- i - s i g n a l. C o m p u t e r-+ ~~~~~~~~-.. ( x ) ".x- d

x

e x c i t a t i o n , o r t h e i n c i d e n t b e a m w a s d i r e c t e d a l o n g t h e o p t i c a l a x i s o f t h em i c r o s c o p e f o r c o n v e n t i o n a l e p i i l l u m i n a t i o n ( V e r k m a n e t a l . , 1 9 9 1 ) . S a m -p l e f l u o r e s c e n c e w a s c o l l e c t e d b y a n o b j e c t i v e l e n s ( 2 0 X d r y , 0 . 7 5 N . A . ;N i k o n ) , p a s s e d t h r o u g h i n t e r f e r e n c e ( 5 2 0 1 5 n m ) a n d b a r r i e r ( S c h o t tg l a s s OG 5 1 5 ) f i l t e r s i n s e r i e s , a n d d e t e c t e d b y a p h o t o m u l t i p l i e r , t h e g a i no f w h i c h w a s s o f t w a r e c o n t r o l l e d ( s e e b e l o w ) . T h e i n t e r f e r e n c e f i l t e r i n t h ee m i s s i o n p a t h w a s i m p o r t a n t f o r e l i m i n a t i n g t h e d e t e c t i o n o f a u t o p h o s p h o -r e s c e n c e o f i n s t r u m e n t c o m p o n e n t s . No d i c h r o i c m i r r o r w a s u s e d f o r T I Ra n d t r a n s i l l u m i n a t i o n , a n d a 5 1 0 nm d i c h r o i c w a s u s e d f o r e p i i l l u m i n a t i o n .I n s o m e e x p e r i m e n t s , T I R f l u o r e s c e n c e i m a ge s w er e a c q u i r e d b y a c o o l e dCCD c a m e r a ( i m a g i n g s y s t e m d e s c r i b e d i n Z e n e t a l . , 1 9 9 2 ) u t i l i z i n g aI O O X w a t e r i m m e r s i o n o b j e c t i v e ( 1 . 2 N . A . ; L e i t z ) a n d a n u p r i g h t T I Rm i c r o s c o p e .

F l u o r e s c e n c e r e c o v e r y a f t e r p h o t o b l e a c h i n gT h e l a s e r b e a m w a s m o d u l a t e d b y t w o a c o u s t o o p t i c m o d u l a t o r s i n s e r i e su s i n g 2 - m m - d i a m e t e r p i n h o l e s t o i s o l a t e f i r s t - o r d e r b e a m s ( K a o a n d V e r k -m a n , 1 9 9 6 ) . Beam i n t e n s i t y w a s s o f t w a r e m o d u l a t e d b y i n t e n s i t y r a t i o s o fu p t o > 1 0 6 : 1 , w i t h r i s e a n d f a l l t i m e s o f - 1 . 5 , t s . F o r m o s t TIR-FRAPe x p e r i m e n t s , t h e l a s e r beam p o w e r w a s s e t t o 0 . 1 - 0 . 3 W ( 48 8 n m ), a n d t h ea t t e n u a t i o n r a t i o ( t h e r a t i o o f t h e b l e a c h b e a m i n t e n s i t y t o t h e p r o b e b e a mi n t e n s i t y ) w a s s e t t o 3 , 0 0 0 - 2 0 , 0 0 0 . F l u o r e s c e n c e w a s d e t e c t e d b y a p h o -t o m u l t i p l i e r ( 9 8 2 8 A ; Thom E M I ) c o n t a i n e d i n a c o o l e d h o u s i n g( F A C T 5 0 ) . P h o t o m u l t i p l i e r s i g n a l s w e r e a m p l i f i e d b y a t r a n s i m p e d a n c ea m p l i f i e r ( g a i n c o n v e r s i o n 1 0 5 V / A , 1 - g s r i s e t i m e ) a n d d i g i t i z e d a t 1 M Hzb y u s i n g a 1 4 - b i t a n a l o g - t o - d i g i t a l c o n v e r t e r . A g a t i n g c i r c u i t w a s u s e d t ot r a n s i e n t l y d e c r e a s e p h o t o m u l t i p l i e r g a i n f o r p r o t e c t i o n d u r i n g t h e p h o t o -b l e a c h i n g p u l s e . T h e g a t i n g c i r c u i t w a s a c t i v a t e d a t 2 , u s b e f o r e t h ep h o t o b l e a c h i n g p u l s e a n d d e a c t i v a t e d a t 3 , s a f t e r t h e p u l s e . T h e c i r c u i ts w i t c h e d t h e s e c o n d d y n o d e o f t h e p h o t o m u l t i p l i e r b e t w e e n i t s n o r m a lo p e r a t i n g v o l t a g e a n d 1 0 8 V m o r e n e g a t i v e t h a n t h e f i r s t d y n o d e , p r o d u c -i n g a - 1 6 0 0 - f o l d r e d u c t i o n i n p h o t o m u l t i p l i e r g a i n . T h e g a t i n g c i r c u i tg e n e r a t e d a b r i e f ( - 1 5 , s ) a n o d e c u r r e n t t r a n s i e n t t h a t w a s s u b t r a c t e d f o rm ea s u r e me n t o f v e r y f a s t r e c o v e r y c u r v e s .

S o f t w a r e w a s w r i t t e n i n M i c r o s o f t Q u i c k B a s i c 4 . 5 t o r e c o r d p r e b l e a c ha n d p o s t b l e a c h s i g n a l s , t o m o d u l a t e l a s e r b e a m i n t e n s i t y , a n d t o r e d u c ep h o t o m u l t i p l i e r g a i n d u r i n g p h o t o b l e a c h i n g . S i g n a l s w e r e s a m p l e d b e f o r et h e b l e a c h ( g e n e r a l l y 1 0 3 d a t a p o i n t s i n 1 0 0 m s ) a n d o v e r t h r e e d i f f e r e n tt i m e i n t e r v a l s a f t e r t h e b l e a c h : h i g h - r e s o l u t i o n d a t a ( 1 M Hz s a m p l i n g r a t e )o v e r 1 0 - 1 0 0 m s , l o w - r e s o l u t i o n d a t a ( g e n e r a l l y 1 0 4 p o i n t s ) o v e r 0 . 1 - 1 0 s ,a n d " f i n a l s i g n a l " d a t a ( 1 0 3 p o i n t s ) a t l a t e t i m e a f t e r n e a r l y c o m p l e t er e c o v e r y h a s o c c u r r e d . H i g h - a n d l o w - r e s o l u t i o n d a t a w e r e b i n n e d i n t o 2 0 0p o i n t s e a c h f o r s t o r a g e a n d a n a l y s i s . T h e s o f t w a r e p e r m i t t e d t h e r a p i da c q u i s i t i o n o f m u l t i p l e FRAP d a t a s e t s f o r s i g n a l a v e r a g i n g . G e n e r a l l y ,

d a t a f r o m 5 - 1 0 0 i n d i v i d u a l TIR-FRAP r e c o ve ry c u r v es w e r e a v e r a g e d ; i nc e l l s t u d i e s , e a c h r ec o v er y c u r ve w a s o b t a i n e d f r o m a d i f f e r e n t s p o t .

MATHEMATICAL MODELI n a FRAP e x p e r i m e n t , a f r a c t i o n o f f l u o r o p h o r e s i n a s m a l ls a m p l e v o l u m e i s b l e a c h e d b y a b r i e f i n t e n s e l a s e r p u l s e .F l u o r e s c e n c e i n t h e b l e a c h e d v o l u m e d e c r e a s e s d u r i n g t h ep h o t o b l e a c h i n g p u l s e a n d t h e n r e c o v e r s a s u n b l e a c h e d f l u -o r o p h o r e s d i f f u s e i n t o t h e b l e a c h e d z o n e . F o r s p o t p h o t o -b l e a c h i n g i n w h i c h f l u o r o p h o r e d i f f u s i o n o c c u r s i n t w od i m e n s i o n s , t h e t i m e c o u r s e o f f l u o r e s c e n c e r e c o v e r y h a sb e e n s o l v e d i n a n a l y t i c a l f o r m ( A x e l r o d e t a l . , 1 9 7 6 ) , a s -s u m i n g a G a u s s i a n o r u n i f o r m c i r c u l a r p r o f i l e w i t h o u t f l u -o r o p h o r e d i f f u s i o n d u r i n g t h e b l e a c h t i m e , a n d s u b s e q u e n t l yw i t h f l u o r o p h o r e d i f f u s i o n ( B e r t c h a n d K o p p e l , 1 9 8 8 ) . R e -c o v e r y c u r v e s h a v e b e e n c o m p u t e d n u m e r i c a l l y w h e r e t h e s ea s s u m p t i o n s a r e n o t v a l i d ( L o p e z e t a l . , 1 9 8 8 ) .

TIR-FRAP d i f f e r s f r o m s p o t p h o t o b l e a c h i n g i n t w o i m -p o r t a n t a s p e c t s : t h e g e o m e t r y o f t h e b l e a c h z o n e a n d t h en a t u r e o f i n t e r a c t i o n o f l i g h t w i t h t h e f l u o r o p h o r e s . T h ei n t e n s i t y o f t h e i n c i d e n t b e a m ( d u r i n g t h e b l e a c h a n d p r o b et i m e s ) d e c a y s e x p o n e n t i a l l y i n t h e s a m p l e w i t h a n e x p o n e n -t i a l " d i s t a n c e c o n s t a n t " ( d ) t h a t d e p e n d s u p o n b e a m w a v e -l e n g t h ( A ) a n d i n c i d e n t a n g l e ( ) ) , a n d t h e r e f r a c t i v e i n d i c e so f t h e p r i s m ( n p ) a n d a q u e o u s ( n a q ) p h a s e s ( F i g . 1 , r i g h t ;A x e l r o d e t a l . , 1 9 8 4 ; H e c h t , 1 9 8 7 ) ,

d = [ A / 4 7 r T ] ( n 2 s i n 2 4 - n 2 ) - 1 / 2 . ( 1 )P h o t o b l e a c h i n g t h e r e f o r e o c c u r s o n l y n e a r t h e i n t e r f a c e .B e c a u s e d a n d h e n c e t h e r e c o v e r y t i m e a r e v e r y s m a l l ,TIR-FRAP s t u d i e s g e n e r a l l y r e q u i r e a b l e a c h t i m e t h a t i ss m a l l c o m p a r e d t o t h e r e c o v e r y t i m e . An a d d i t i o n a l f a c t o rf o r s h o r t b l e a c h a n d r e c o v e r y t i m e s i s t h e p r e s e n c e o fr e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g i n w h i c h f l u o r e s c e n c e r e c o v e r yo c c u r s i n t h e a b s e n c e o f f l u o r o p h o r e d i f f u s i o n . R e v e r s i b l ep h o t o b l e a c h i n g i s n o t f u l l y u n d e r s t o o d , b u t ma y i n p a r tr e s u l t f r o m s p o n t a n e o u s a n d r a d i c a l - i n d u c e d r e c o v e r y f r o m

1 1 4 2 B i o p h y s i c a l J o u r n a l


4/12

C y t o p l a s m i c V i s c o s i t y M e a s u r e d b y T I R - F R A Pt h e t r i p l e t s t a t e ( V e l e z a n d A x e l r o d , 1 9 8 8 ; S c a l e t t a r e t a l . ,1 9 90 ; C o r be tt e t a l . , 1 9 9 4 ; S t o u t a n d A x e l r o d , 1 9 9 5 ; P e r i a -s a m y e t a l . , 1 9 9 6 ) .

B e c a u s e t h e t w o - d i m e n s i o n a l b e a m s p o t s i z e i s m u c hl a r g e r t h a n t h e d e p t h o f t h e e v a n e s c e n t f i e l d , t h e TIR-FRAPd i f f u s i o n - k i n e t i c e q u a t i o n c a n b e s o l v e d i n o n e d i m e n s i o n ,d c / d t = D d 2 c / d x 2 - k h ( t ) c e - x / d ( 2 )

w h e r e c ( x , t ) i s t h e f l u o r o p h o r e c o n c e n t r a t i o n a t d i s t a n c e xf r o m t h e i n t e r f a c e a n d t i m e t , D ( c m 2 / s ) i s t h e f l u o r o p h o r ed i f f u s i o n c o e f f i c i e n t , k ( s 1 ) i s a r a t e c o n s t a n t f o r i r r e v e r s -i b l e p h o t o b l e a c h i n g , a n d h ( t ) i s t h e s t e p f u n c t i o n : h ( t ) = 1f o r t < t b ( b l e a c h t i m e ) a n d h ( t ) = 0 f o r t > t b . T h e s e c o n dt e r m i n E q . 2 d e s c r i b e s t h e i n t e n s i t y - d e p e n d e n t b l e a c h i n gk i n e t i c s o f t h e f l u o r o p h o r e d u r i n g t h e b l e a c h p e r i o d , w h e r ee x p ( - x / d ) i s t h e e x p o n e n t i a l d e c a y o f e v a n e s c e n t f i e l di n t e n s i t y . I t i s a s s u m e d t h a t b e a c h i n g i s a f i r s t - o r d e r p r o c e s si n w h i c h t h e b l e a c h i n g e f f i c i e n c y d e p e n d s l i n e a r l y o n l i g h ti n t e n s i t y . E q u a t i o n 2 i s s u b j e c t t o t h e i n i t i a l c o n d i t i o n c ( x , 0 )= c O a n d b o u n d a r y c o n d i t i o n d c ( O , t ) / d x = 0 . T h e m e a s u r e ds a m p l e f l u o r e s c e n c e [ F ( t ) ] i s d e t e r m i n e d b y i n t e g r a t i n g t h ep r o d u c t o f c ( x , t ) a n d t h e e v a n e s c e n t f i e l d i n t e n s i t y ,

F ( t ) = F o j c ( x , t ) e - x / d d x , ( 3 )w h e r e t h e f a c t o r F o c o n v e r t s c o n c e n t r a t i o n t o f l u o r e s c e n c e .E q u a t i o n 2 a s s u m e s t h a t t h e f l u o r o p h o r e e x i s t s i n o n l yt w o f o r m s , f l u o r e s c e n t a n d i r r e v e r s i b l y b l e a c h e d . Whenr e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g o c c u r s , a s w a s f o u n d f o r r a p i dp h o t o b l e a c h i n g s t u d i e s i n c e l l s , t h e r i g h t - h a n d t e r m i n E q . 2c o n t a i n s t w o a d d i t i o n a l t e r m s : - k t e & 1 ( d h ( t ) c ( x , t ) + k T c T ( x ,t ) . T h e f i r s t t e r m d e s c r i b e s t h e f o r m a t i o n o f t r i p l e t s t a t ef l u o r o p h o r e d u r i n g t h e b l ea c h t i m e w i t h r a t e c o n s t a n t k t( s - 1 ) . T h e s e c o n d t e r m r e p r e s e n t s t r i p l e t d e c a y t o t h e a c t i v e( n o n b l e a c h e d ) g r o u n d s t a t e , w h e r e k T ( s - 1 ) i s t h e r a t e o ft r i p l e t d e c a y a n d C T ( X , t ) i s t h e t r i p l e t c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e .I t i s n o t e d t h a t a s e c o n d d i f f u s i o n e q u a t i o n ( s i m i l a r t o E q . 2 )i s r e q u i r e d t o d e s c r i b e c T ( x , t ) d i f f u s i o n .

E q u a t i o n 2 w a s s o l v e d n u m e r i c a l l y b y a d i s c r e t i z a t i o np r o c e d u r e s i m i l a r t o t h a t d e v e l o p e d f o r e l e c t r o c h e m i c a ld i f f u s i o n / r e a c t i o n p r o b l e m s ( F e l d b e r g , 1 9 6 9 ) . V o l u m e e l e -m e n t s w e r e t a k e n o f t h i c k n e s s A x p a r a l l e l t o t h e d i e l e c t r i ci n t e r f a c e l o c a t e d a t x = 0 . A t t = 0 , c ( x , 0 ) = c o . D u r i n ge a c h t i m e i n t e r v a l A t , k i n e t i c p r o c e s s e s ( i r r e v e r s i b l e a n dr e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g ) o c c u r i n e a c h v o l u m e e l e m e n t ,a n d f l u o r o p h o r e d i f f u s i o n o c c u r s i n a c c o r d a n c e w i t h F i c k ' sl a w . F o r d i s c r e t i z a t i o n , t h e b l e a c h t i m e ( t b , t y p i c a l l y 1 0 0 -5 0 0 0 , u s ) w a s d i v i d e d i n t o N ( g e n e r a l l y 1 0 3 ) e q u a l i n t e r v a l s .A x w a s c h o s e n t o a p p r o x i m a t e t h e c h a r a c t e r i s t i c d i f f u s i o nd i s t a n c e ( 2 D A t ) " 2 . A t w a s c h o s e n t o b e s u f f i c i e n t l y s m a l ls u c h t h a t A x < 0 . 1 d .

F l u o r o p h o r e c o n c e n t r a t i o n c ( x , t ) i n e a c h v o l u m e e l e m e n tw a s c a l c u l a t e d f o r t h e k i n e t i c a n d d i f f u s i v e p r o c e s s e s . T h ek i n e t i c t e r m f o r t h e i t h v o l u m e e l e m e n t f r o m t h e i n t e r f a c e i s

w h e r e g B i s t h e b l e a c h r a t e d e t e r m i n e d t o g i v e a s p e c i f i e db l e a c h e f f i c i e n c y . F l u o r o p h o r e d i f f u s i o n f r o m x i t o e a c hx - e l e m e n t d u r i n g t i m e i n t e r v a l t j t o t j + A t i sc ( x j + m , t j + , ) = 0 . 5 ( 7 T D A t ) / 2 c ( x ; , t j ) e x p ( - m 2 A x 2 / 4 D t j ) . ( 5 )T h e d i f f u s i o n o f t h e m o l e c u l e s n e a r t h e i n t e r f a c e i s t r e a t e db y a p p l i c a t i o n o f r e f l e c t i o n b o u n d a r y c o n d i t i o n s ( C h a n -d r a s e k a r , 1 9 4 3 ) . F o r c a l c u l a t i o n s , E q s . 4 a n d 5 w e r e a p p l i e da t e a c h t i w i t h a maximum x d e p t h o f 8 d . T h e c o m p u t e d xa n d t p r o f i l e s w e r e i n s e n s i t i v e t o a f i v e f o l d d e c r e a s e i n Axa n d A t , a n d a g r e e d q u a n t i t a t i v e l y w i t h a n a l y t i c a l s o l u t i o n st o t h e d i f f u s i o n e q u a t i o n w h e r e t h e k i n e t i c t e r m w a se x c l u d e d .

T h e p r e s e n c e o f a f l u o r o p h o r e - f r e e a q u e o u s l a y e r o ft h i c k n e s s h a n d r e f r a c t i v e i n d e x n r = 1 . 3 3 3 b e t w e e n t h es i l i c a ( n r = 1 . 4 5 8 ) a n d c y t o p l a s m ( n r = 1 . 3 8 ) w a s i n c o r p o -r a t e d i n t o t h e TIR-FRAP m o d e l b y s h i f t i n g t h e x = 0 p l a n et o t h e w a t e r / c e l l i n t e r f a c e ( s e e F i g . 7 A , l e f t ) a n d i n c l u d i n gt h e a p p r o p r i a t e e q u a t i o n f o r e v a n e s c e n t f i e l d i n t e n s i t y d e -c a y . As d e t a i l e d i n G i n g e l l e t a l . ( 1 9 8 7 ) , t h e o r y p r e d i c t s t h a tt h e e v a n e s c e n t f i e l d i n t e n s i t y d e c a y s e x p o n e n t i a l l y i n t h ec y t o p l a s m w i t h d i s t a n c e c o n s t a n t d g i v e n b y E q . 1 . T h ei n t e n s i t y a t t h e w a t e r / c y t o p l a s m i n t e r f a c e ( i g n o r i n g t h e - 4 -n m - t h i c k m e m b r a n e p h a s e ) i s d e t e r m i n e d f r o m t h e t h i c k -n e s s o f t h e a q u e o u s l a y e r , r e f r a c t i v e i n d i c e s , w a v e l e n g t h ,a n d b e a m i n c i d e n t a n g l e .

F o r e x p e r i m e n t a l d e t e r m i n a t i o n o f s o l u t e d i f f u s i o n c o e f -f i c i e n t D , m e a s u r e d F ( t ) w a s f i t t e d t o s i m u l a t e d F ( t ) ( b yl e a s t s q u a r e s ) , i n w h i c h D w a s v a r i e d w i t h f i x e d e x p e r i m e n -t a l p a r a m e t e r s ( b l e a c h t i m e , e v a n e s c e n t f i e l d p e n e t r a t i o nd e p t h , a n d b l e a c h d e p t h ; s e e b e l o w ) . F ( t ) a t i n f i n i t e t i m ew a s t a k e n a s 1 f o r c e l l - f r e e s o l u t i o n s t u d i e s a n d a s F ( 1 0 0t 1 1 2 ) i n c e l l e x p e r i m e n t s .RESULTSP r e d i c t i o n s o f t h e m a t h e m a t i c a l modelT h e m a j o r p r e d i c t i o n s o f t h e m a t h e m a t i c a l m o d e l f o r T I R -FRAP a r e s h o w n i n F i g . 2 . T h e f o u r i n d e p e n d e n t , e x p e r i -m e n t a l l y r e l e v a n t p a r a m e t e r s ( i n t h e a b s en c e o f r e v e r s i b l ep h o t o b l e a c h i n g ) i n c l u d e f l u o r o p h o r e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t( D ) , e v a n e s c e n t f i e l d p e n e t r a t i o n d e p t h ( d ) , b l e a c h t i m e ( t b ) ,a n d b l e a c h e f f i c i e n c y ( g B ) . T h e b l e a c h d e p t h , d e f i n e d a s t h ed e c r e a s e i n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a t t h e e n d o f t h e b l e a c hp u l s e , i s d e t e r m i n e d b y t h e f o u r i n d e p e n d e n t p a r a m e t e r s a n dc a n b e s p e c i f i e d b y a d j u s t i n g p a r a m e t e r g B . T h e b l e a c hd e p t h w a s g e n e r a l l y s e t t o 20% f o r t h e s i m u l a t i o n s u n l e s so t h e r w i s e s p e c i f i e d .F i g . 2 A s h o w s t h e t i m e e v o l u t i o n o f t h e f l u o r o p h o r e xc o n c e n t r a t i o n p r o f i l e [ c ( x , t ) / c . ] d u r i n g a 2 5 0 - , u s b l e a c hp e r i o d f o r D = 1 0 - 6 c m 2 / s a n d d = 1 0 0 n m . B e c a u s e o ff l u o r o p h o r e d i f f u s i o n d u r i n g t h e b l e a c h p u l s e , t h e r e i s w i t hi n c r e a s i n g b l e a c h t i me a n i n c r e a s e i n b l e a c h d ep t h a t t h eT I R i n t e r f a c e ( x = 0 ) a s w e l l a s i n t h e x p e n e t r a t i o n o f t h eb l e a c h p r o f i l e . F i g . 2 B s h o w s t h e c o r r e s p o n d i n g f l u o r o -p h o r e x c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s d u r i n g t h e p r o b e ( r e c o v e r y )

1 1 4 3w a m i n a t h a n e t a l .

C ( X i q t j + A t ) =c ( x i , t j ) [ I h ( t j ) g B A t e - " l d ] , ( 4 )


5/12

V o l u m e 7 1 A u g u s t 1 9 9 6A

0x,U

C

0

8

d i s t a n c e x ( n m )

1 0 0 -

9 5 .0U -_ 9 0 -00 8 5 -

8 0 - I

d i s t a n c e x ( p m )D

I LU -8t b =50sL S

1 ~ ~ ~ ~ ~ 0 0

I I 1 1 / I I I1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 00 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0( P t S ) t i m e ( i n s )

F

( i A s ) t i m e ( m s ) t i m e ( t s )H 1 0 5

0 1

1 0

i 0 4 -t s / 2( g s ) 1 0 3

1 n 21 0 - 7 1 0 - 6 1 0 - 5D ( c m 2 / s )

b= 1 0 - 7 c m 2 / s U

x 1 0 - 61 0 00

d ( n m )

FIGURE 2 P r e d i c t i o n s o f t h e m a t h e m a t i c a l m o d e l f o r c a l c u l a t i o n o f TIR-FRAP r e c o v e r y curves. ( A ) F l u o r o p h o r e x c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s [ c ( x , t ) / c 0 ] a ti n d i c a t e d t i n m e s d u r i n g b l e a c h f o r D = 1 0 - 6 c m 2 / s a n d d = 1 0 0 n m . A t 2 5 0 , u s , t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y [ F ( t ) ] wa s 8 0 % o f t h e i n i t i a l i n t e n s i t y . ( B )C o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s a t i n d i c a t e d t i m e s d u r i n g f l u o r e s c e n c e r e c o v e r y a f t e r a 2 5 0 - p s b l e a c h . C u r v e s c o r r e s p o n d t o t i m e s a t which t h e f l u o r e s c e n c e h a sr e c o v e r e d b y 10%, 2 5% , 5 0 % , 7 5 %, a n d 9 0 % . P a r a m e t e r s a r e t h e s a m e a s i n A . ( C ) F ( t ) as a f u n c t i o n o f b l ea c h t i m e ( t b ) f o r D = 10-6 c m 2 / s , d = 10 0n m , a n d gB a d j u s t e d t o g i v e 20% b l e a c h d e p t h . ( D ) R e c o v e r y cu rves as a f u n c t i o n o f f l u o r o p h o r e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t ( D ) f o r d = 10 0 nm a nd t b = 10 0, s . B l e a c h e f f i c i e n c y ( g B ) wa s a d j u s t e d t o g i v e 20 % b l e a c h d e p t h . ( E ) F ( t ) as a f u n c t i o n o f b l ea c h d e p t h ( b y v a r y i n g g B ) f o r t b 250 / i s , D= 1 0 - 6 c m 2 / s ,a n d d = 1 0 0 n m . ( F ) F ( t ) i n t h e presence r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g w i t h t T = 1 0 0 , u s , D = 1 O 7 c m 2 / s , t b = 25 0 u s , and d = 1 0 0 n m . P a r a m e t e r s g Ta n d g B were a d j t i s t e d t o v a r y t h e f r a c t i o n a l r e c o v e r y d u e t o r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g a n d t o m a i n t a i n 2 0 % b l e a c h d e p t h . ( G ) L o g - l o g p l o t o f t , 1 2 versusD f o r s i m u l a t ed f l u o r e s c en c e recovery cu rves w i t h i n d i c a t e d t b f o r d = 1 0 0 nm a n d 2 0 % b l e a c h d e p t h . ( H ) D e p e n d e n c e o f t r / 2 o n d f o r s i m u l a t e d r e c o v e r ycur ve s w i t h i n d i c a t e d D f o r t b =2 5 0 , u s a n d 20% b l e a c h d e p t h .

E

0L L .i L8

G

t i ' 2t 1 s ) 1 0 3i n 2 1 , -I1 0 - 8

1 1 4 4 B i o p h y s i c a l J o u r n a l

1 0 4 -


6/12

C y t o p l a s m i c V i s c o s i t y M e a s u r e d b y T I R - F R A Pp e r i o d , a t t i m e s when t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y h a s r e c o v -e r e d b y 1 0 , 2 5 , 5 0 , 7 5 , a n d 90% ( s e e l e g e n d ) . F l u o r o p h o r ec o n c e n t r a t i o n n e a r t h e i n t e r f a c e , a n d t h u s F ( t ) , i n c r e a s e sw i t h t i m e , w h e r e a s , i n t e r e s t i n g l y , f l u o r o p h o r e c o n c e n t r a t i o nf a r f r o m t h e i n t e r f a c e d e c r e a s e s w i t h t i m e . T h e c o n c e n t r a -t i o n p r o f i l e r e t u r n s t o t h e p r e b l e a c h p r o f i l e [ c ( x , t ) / c o = 1 ]o n l y a t i n f i n i t e t i m e ; h o w e v e r , i n p r a c t i c e , c o n v e c t i v e t r a n s -p o r t w o u l d d o m i n a t e d i f f u s i o n a l t r a n s p o r t a t v e r y l o n gt i m e s .F i g . 2 C s h o w s t h e d e p e n d e n c e o f t h e f l u o r e s c e n c e r e -c o v e r y c u r v e s [ F ( t ) ] o n b l e a c h t i m e ( t b ) f o r f i x e d d a n d D( s e e l e g e n d f o r p a r a m e t e r v a l u e s ) . T h e f l u o r e s c e n c e r e c o v -e r y i s c l e a r l y n o n e x p o n e n t i a l , h a v i n g a r a p i d i n i t i a l p h a s ef o l l o w e d b y r e m a r k a b l y s l o w r e c o v e r y a t l a t e r t i m e s . T h ee a r l y r i s e i n F ( t ) i s s l o w e d w i t h i n c r e a s i n g t b b e c a u s e o ff l u o r o p h o r e d i f f u s i o n d u r i n g t h e b l e a c h t i m e , a s s e e n i n F i g .2 A . F i g . 2 D d e m o n s t r a t e s t h e s e n s i t i v i t y o f F ( t ) t o f l u o r o -p h o r e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t ( D ) f o r f i x e d d a n d t b . T h er e c o v e r y p r o f i l e s d i f f e r r e m a r k a b l y , p r o v i d i n g t h e t h e o r e t i -c a l b a s i s f o r t h e e x p e r i m e n t a l d e t e r m i n a t i o n o f D b y T I R -FRAP. F i g . 2 E s h o w s F ( t ) f o r d i f f e r e n t b l e a c h d e p t h s i n t h er a n g e 1 0 - 5 0 % , w i t h a b l e a c h p e r i o d o f 2 5 0 , u s a n d f i x e d Da n d d . A l t h o u g h t h e a m p l i t u d e s o f t h e r e c o v e r y p r o f i l e sd i f f e r , t h e r e c o v e r y c u r v e s h a p e ( e . g . , r e c o v e r y h a l f - t i m e )g e n e r a l l y d e p e n d s w e a k l y o n b l e a c h d e p t h .T h e s i m u l a t i o n s i n F i g . 2 , A - E , w e r e c a r r i e d o u t f o rf l u o r o p h o r e p h o t o b l e a c h i n g b y a n e x c l u s i v e l y i r r e v e r s i b l em e c h a n i s m ( E q s . 1 - 3 ) . F i g . 2 F s h o w s t h e i n f l u e n c e o nr e c o v e r y c u r v e s h a p e o f a n a d d i t i o n a l r e v e r s i b l e p h o t o -b l e a c h i n g p r o c e s s ( E q s . 4 a n d 5 ) i n v o l v i n g t h e f o r m a t i o na n d d e c a y o f t r i p l e t s t a t e f l u o r o p h o r e d e f i n e d b y t w o p a -r a m e t e r s : t r i p l e t - s t a t e f o r m a t i o n e f f i c i e n c y ( g T ) a n d t r i p l e t -s t a t e l i f e t i m e ( t T = l / k T ) . T h e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f t h et r i p l e t w a s a s s u m e d f o r t h e s i m u l a t i o n t o b e i d e n t i c a l t o t h a to f t h e g r o u n d s t a t e . T h e p a r a m e t e r s f o r t h e s i m u l a t i o n i nF i g . 2 F w e r e t T = 1 0 0 , u s , D = 1 0 - 7 c m 2 / s , t b = 2 5 0 , u s ,a n d d = 1 0 0 n m , w i t h b l e a c h d e p t h s e t t o 2 0 % . T h ef r a c t i o n a l r e c o v e r y d u e t o r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g w a sv a r i e d b y a d j u s t i n g p a r a m e t e r s g T a n d g B . I n t h e a b s e n c e o fi r r e v e r s i b l e b l e a c h i n g ( g B = 0 ) , t h e r a p i d f l u o r e s c e n c e r e -c o v e r y w a s d u e e n t i r e l y t o t r i p l e t d e c a y . F o r t h i s s i m u l a t i o nt 1 / 2 w a s 6 7 , u s , i n a g r e e m e n t w i t h t h e t h e o r e t i c a l v a l u e o f 6 9, u s . A s t h e f r a c t i o n a l r e c o v e r y d u e t o i r r e v e r s i b l e p h o t o -b l e a c h i n g i n c r e a s e s ( g B > 0 ) , t h e f l u o r e s c e n c e r e c o v e r ya s s u m e s t h e m i x e d c h a r a c t e r o f t h e t w o m e c h a n i s ms . R e-c o v e r y d u e t o a p u r e l y i r r e v e r s i b l e b l e a c h i n g m e c h a n i s mi n v o l v i n g f l u o r o p h o r e d i f f u s i o n ( g T = 0 ) i s r e l a t i v e l y s l o w .T h i s s i m u l a t i o n u n d e r s c o r e s t h e n e e d t o e v a l u a t e w h e t h e rr e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g p r o c e s s e s a r e o c c u r r i n g f o r e x -p e r i m e n t a l d e t e r m i n a t i o n o f f l u o r o p h o r e d i f f u s i o n b y p h o -t o b l e a c h i n g r e c o v e r y t e c h n i q u e s ( P e r i a s a m y e t a l . , 1 9 9 6 ) .F i g . 2 G s h o w s t h e i n f l u e n c e o f D o n r e c o v e r y h a l f - t i m e( t 0 1 2 ) , d e f i n e d a s t h e t i m e a t w h i c h F ( t ) i s e q u a l t o [ 1 +F ( 0 ) ] / 2 . S i m u l a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t f o r v a r i o u s b e a c ht i m e s ( t b ) w i t h a f i x e d d o f 1 0 0 n m . A s i n t h e s i m u l a t i o n sa b o v e , t h e b l e a c h d e p t h w a s m a i n t a i n e d a t 20% b y a d j u s t i n g

i n t e n s i t y t o m a i n t a i n a s p e c i f i e d b l e a c h d e p t h . T h e p l o td e m o n s t r a t e s t h a t t 1 / 2 is most s e n s i t i v e t o c h a n g e s i n D f o rs m a l l t b . E x p e r i m e n t a l l y , b l e a c h t i m e s s h o u l d t h u s b es m a l l e r t h a n or s i m i l a r t o recovery t i m e s t o m e a s u r e Da c c u r a t e l y a n d t o r e s t r i c t t h e e f f e c t i v e p e n e t r a t i o n d e p t h o fb l e a c h p u l s e . F i g . 2 H s h o w s t h e d e p e n d e n c e o f t 1 / 2 o ne v a n e s c e n t f i e l d d e p t h ( d ) . W h e r e a s t 1 / 2 i s r e l a t i v e l y i n s e n -s i t i v e t o c h a n g e s i n d f o r h i g h D ( 5 X 1 0 - 6 c m 2 / s ) , t 1 1 2b e c o m e s very s e n s i t i v e t o d f o r s m a l l D . A p l o t o f t 1 / 2 versusd i s t h e r e f o r e p o t e n t i a l l y u s e f u l f o r a c c u r a t e d e t e r m i n a t i o no f D b y T I R - F R A P ; h o w e v e r , i n p r a c t i c e , t h e range o fa t t a i n a b l e v a l u e s f o r d i s l i m i t e d w i t h v a r i a b l e - a n g l e T I R ,p a r t i c u l a r l y when a n o b j e c t i v e l e n s i s u s e d t o i n c r e a s e beami n t e n s i t y .TIR-FRAP measurements i n aqueous s o l u t i o n sE x p e r i m e n t s were f i r s t c a r r i e d o u t i n c e l l - f r e e aque o uss o l u t i o n s t o v a l i d a t e t h e measurement o f f l u o r o p h o r e d i f f u -s i o n b y T I R - F R A P . F i g . 3 A s h o w s TIR-FRAP r e c o v e r yc u r v e s f o r a s e r i e s o f f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ( F I T C ) -l a b e l e d d e x t r a n s i n t h e m o l e c u l a r m a s s range 1 0 - 2 0 0 0 k D a .M e a s u r e m e n t s were p e r f o r m e d w i t h a 1 0 0 - , u s b l e a c h t i m ea n d a n i n c i d e n t l a s e r beam a n g l e o f 7 7 0 a t t h e q u a r t z -a q u e o u s i n t e r f a c e , p r o d u c i n g a n e v a n e s c e n t f i e l d o f pene-t r a t i o n d e p t h d = 1 1 2 n m . Beam i n t e n s i t y was a d j u s t e d t op r o d u c e -20% b l e a c h i n g . M o n o p h a s i c recovery c ur v e swere d e t e c t e d w i t h i n c r e a s i n g recovery h a l f - t i m e s ( t , / 2 ) f o rt h e d e x t r a n s o f i n c r e a s i n g m o l e c u l a r s i z e . F l u o r e s c e n c er e t u r n e d t o n e a r - i n i t i a l l e v e l s , i n d i c a t i n g t h a t e s s e n t i a l l y a l lo f t h e a q u e o u s f l u o r o p h o r e was m o b i l e ; f u r t h e r m o r e , t h ec o m p l e t e recovery i n d i c a t e s t h a t t h e s i g n a l ar o se e x c l u -s i v e l y f r o m e m i s s i o n o f f l u o r o p h o r e e x c i t e d b y T I R , b e -c a u s e a n y component o f t r a n s ( n o n - T I R ) e x c i t a t i o n w o u l dr e s u l t i n i n c o m p l e t e recovery o v e r a s h o r t t i m e s c a l e . F i g . 3B s h o w s recovery c ur v e s o b t a i n e d f o r t h e same a q u e o u ss o l u t i o n s b y s p o t p h o t o b l e a c h i n g ( b y e p i i l l u m i n a t i o n ) u s i n ga 20X o b j e c t i v e . T h e r e c o v e r y t i m e c o ur s e f o r s p o t p h o t o -b l e a c h i n g was r e m a r k a b l y s l o w e r t h a n t h a t f o r TIR-FRAPb e c a u s e o f t h e g r e a t e r c h a r a c t e r i s t i c d i f f u s i o n d i s t a n c e( - 2 0 0 0 nm f o r s p o t p h o t o b l e a c h i n g versus


7/12

V o l u m e 7 1 A u g u s t 1 9 9 6

AI-40D01C( D

~ Z 2 0 0 0 k D

1m s 4 m sI l

B C

NEbI DI0c x

1 5 4 0 kD

A 10 8 0 m s ,

, s p o t FRAP

FIGURE 3 TIR-FRAP d e t e r m i n a t i o n o f d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s o f F I T C -l a b e l ed d e x t r a n s . TIR-FRAP ( A ) a n d s p o t p h o t o b l e a c h i n g ( B ) recovery cur ve s f o rF I T C - d e x t r a n s ( 2 m g / m l ) o f i n d i c a t e d m o l e c u l a r s i z e i n P B S . F o r T I R - F R A P , t b = 1 0 0 , u s , d = 8 0 n m , a n d l a s e r beam i n t e n s i t y wa s a d j u s t e d t o g i v e - 2 0 %b l e a c h d e p t h . F o r s p o t p h o t o b l e a c h i n g , t h e s p o t wa s p r o d u c e d b y a 20 X o b j e c t i v e ( s p o t d i a m e t e r - 4 ,m) i n a n e p i i l l u m i n a t i o n c o n f i g u r a t i o n w i t h a b l e a c ht i m e o f 1 m s . ( C ) C o m p a r i s o n o f c o m p u t e d s o l u t e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s D d e t e r m i n e d b y TIR-FRAP a n d s p o t p h o t o b l e a c h i n g .

of recovery a p p e a r e d ( t , 1 2 75 , u s ) that wastoo fast to bea s c r i b e d t o s o l u t e d i f f u s i o n . T h i s process ar o se f r o m revers-i b l e p h o t o b l e a c h i n g o f t h e f l u o r e s c e i n t r i p l e t s t a t e i n v i s c o u sn o n d e o x y g e n a t e d s o l u t i o n s ( P e r i a s a m y e t a l . , 1 9 9 6 ) ; a ni d e n t i c a l f a s t component o f recovery was o b s e r v e d i n t h esame s a m p l e w h e n t h e TIR l a s e r s p o t wa s d e f o c u s e d , a n d i ns p o t p h o t o b l e a c h i n g ( n o t s h o w n ) , i n d i c a t i n g i t s o r i g i n f r o ma n o n d i f f u s i v e p r o c e s s . A f t e r s u b t r a c t i o n o f t h e ( a s s u m e ds i n g l e e x p o n e n t i a l ) r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g c o m p o n e n t ,t h e TIR-FRAP measurement o f f l u o r e s c e i n d i f f u s i o n i n t h e49% g l y c e r o l s o l u t i o n ( r e l a t i v e v i s c o s i t y 6 . 4 ) gave a D v a l u eo f 0 . 5 X 1 0 - 6 c m 2 / s . I n s u b s e q u e n t TIR-FRAP m e a s u r e -

A ,, 8 BI r l ~ ~ ~ ~ ~ ~ , / r n o = 1 . 0

0

ments i n c e l l s b e l o w , t h e c o n t r i b u t i o n o f r e v e r s i b l e p h o t o -b l e a c h i n g t o t h e o b s e r v e d recovery was i n v e s t i g a t e d b yr e m o v i n g t h e q u a r t z p r i s m t o e f f e c t t r a n s ( n o n - T I R ) - i l l u m i -n a t i o n i n w h i c h n o s i g n i f i c a n t d i f f u s i o n - r e l a t e d recoverys h o u l d o c c u r ( b e c a u s e many i n d i v i d u a l f l u o r e s c e n t l y l a -b e l e d c e l l s are i l l u m i n a t e d ) .F i g . 4 , B a n d C , s h o w s t h e d e p e n d e n c e o f TIR-FRAPrecovery o n b l e a c h t i m e a n d d e p t h . T h e b l e a c h t i m e s t u d ywa s p a r t i c u l a r l y i m p o r t a n t b e c a u s e i t c o n s t i t u t e s t h e mosts t r i n g e n t t e s t o f t h e m o d e l . R e c o v e r y s l o w e d a n d r e c o v e r yc u r v e s h a p e c h a n g e d w i t h i n c r e a s i n g b l e a c h t i m e ( F i g . 4 B ) ;h o w e v e r , f i t t e d D v a l u e s r e m a i n e d u n c h a n g e d ( i n c m 2 / s X

b l e a c hI29%bleachi bl~each

I 54%leachI i \ . 2 . 5 m s~ ~ 6 . 41 m s 4 m sIW I~ 5 0 0 i _ sl 4 msIW 5 0 0 R i sIW 4 msI1

FIGURE 4 D e p e n d e n c e o f TIR-FRAP r e c o v e r y c u r v e s h a p e o n s o l u t i o n v i s c o s i t y , b l e a c h t i m e , a nd bleach d e p t h . ( A ) Solutions contai ned 1 mMf l u o r e s c e i n i n P BS w i t h 0 % , 3 4 % , or 49% g l y c e r o l , g i v i n g r e l a t i v e v i s c o s i t i e s ( i r / i 1 ) o f 1 , 2 . 9 , a nd 6 . 4 , r e s p e c t i v e l y . TIR-FRAP p a r a m e t e r s : t b = 65 , u s ,i n c i d e n t beam a n g l e 7 7 0 , a n d b l e a c h d e p t h -20 % . ( B ) Bleach t i m e t b was v a r i e d f o r f l u o r e s c e i n i n PBS w i t h p a r a m e t e r s a s a b o v e . ( C ) Bleach d e p t h wa sv a r i e d a t a c o n s t a n t t b o f 6 5 , u s b y c h a n g e i n l a s er i l l u m i n a t i o n i n t e n s i t y .

D e x t r a n m o l e c u l a r s i z e ( k D a )

1 1 4 6 B i o p h y s i c a l J o u m a l

o w + o l l o v 1 0 kD


8/12

C y t o p l a s m i c V i s c o s i t y M e a s u r e d b y T I R - F R A P1 0 - 6 ) : 2 . 8 ( t b 6 5 , u s ) , 2 . 3 ( 1 m s ) , a n d 2 . 6 ( 2 . 5 m s ) . I nc o n t r a s t , t h e r e w a s l i t t l e c h a n g e i n r e c o v e r y c u r v e s h a p e( o n l y a m p l i t u d e ) w i t h i n c r e a s i n g b l e a c h d e p t h a s p r e d i c t e db y t h e m o d e l ; D v a l u e s ( i n c m 2 / s X 1 0 - 6 ) w e r e 2 . 3 ( 1 4 %b l e a c h d e p t h ) , 2 . 6 ( 2 9 % ) , 3 . 0 ( 3 3 % ) , a n d 2 . 6 ( 5 4 % ) . T a k e nt o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s e s t a b l i s h t h e v a l i d i t y o f TIR-FRAPf o r t h e m e a s u r e m e n t o f s o l u t e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t n e a r aTIR i n t e r f a c e .S o l u t e d i f f u s i o n i n f l u o r e s c e n t l y l a b e l e d c e l l sI n i t i a l TIR-FRAP m e a s u r e m e n t s o f B C E C F - l a b e l e d MDCKc e l l s r e v e a l e d a l a r g e - a m p l i t u d e r e c o v er y p r o c e s s w i t h ar e c o v e r y h a l f - t i m e o f 1 - 2 m s . T h e f a s t r e c o v e r y w a s s u r -p r i s i n g b e c a u s e i t i m p l i e d t h a t BCECF d i f f u s i o n i n c y t o s o lw a s s i m i l a r t o t h a t i n w a t e r , a r e s u l t c l e a r l y i n c o n s i s t e n t w i t hp r e v i o u s s p o t p h o t o b l e a c h i n g d a t a ( K a o e t a l . , 1 9 9 3 ) . How-e v e r , f u r t h e r s t u d i e s b y t r a n s i l l u m i n a t i o n ( w h e r e l i t t l e o r n or e c o v e r y w a s e x p e c t e d ) a n d b y e p i i l l u m i n a t i o n ( w h e r e s l o wr e c o v e r y o v e r t e n s o f m i l l i s e c o n d s w a s e x p e c t e d ) r e v e a l e dt h e s a m e f a s t r e c o v er y p r o c es s ( s e e F i g . 5 A , t o p c u r v e ) . T h er e c o v e r y p r o c e s s t h u s d i d n o t d e p e n d u p o n s o l u t e d i f f u s i o na n d h a d t o b e u n d e r s t o o d a n d / o r e l i m i n a t e d t o d e t e r m i n e t h ed i f f u s i o n c o e f f i c i e n t o f BCECF i n m e m b r a n e - a d j a c e n tc y t o s o l .

V a r i o u s t y p e s o f r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g h a v e b e e nd e s c r i b e d p r e v i o u s l y , i n c l u d i n g m i c r o s e c o n d r e c o v e r y i no x y g e n a t e d s o l u t i o n s ( V e l e z a n d A x e l r o d , 1 9 8 8 ; S c a l e t t a r e ta l . , 1 9 9 0 ; C o r b e t t e t a l . , 1 9 9 4 ) a n d s l o w ( h u n d r e d s o fm i l l i s e c o n d s ) r e c o v e r y o f a n i m m o b i l i z e d f l u o r o p h o r e( S t o u t a n d A x e l r o d , 1 9 9 5 ) . W e r e c e n t l y c h a r a c t e r i z e d ar e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g p r o c e s s f o r f l u o r e s c e i n i n a i r -s a t u r a t e d v i s c o u s a q u e o u s s o l u t i o n s t h a t i n v o l v e d t r i p l e ts t a t e f o r m a t i o n a n d d e c a y , a n d c o u l d b e s t r o n g l y a c c e l e r a t e db y t h e a d d i t i o n o f t r i p l e t - s t a t e q u e n c h e r s , i n c l u d i n g o x y g e n ,t r y p t o p h a n , a n d m a n g a n e s e ( P e r i a s a m y e t a l . , 1 9 9 6 ) . R e -v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g w a s a l s o o b s e r v e d f o r f l u o r e s c e i n -m a c r o m o l e c u l e c o n j u g a t e s a n d d e p e n d e d u p o n t h e d e t a i l e de n v i r o n m e n t o f t h e f l u o r o p h o r e a n d t h e o x y g e n d i f f u s i o nc o e f f i c i e n t i n t h e a q u e o u s m e d i u m . W e c o n c l u d e d t h a t t h ef a s t r e c o v e r y o b s e r v e d f o r BCECF i n MDCK c e l l s a l s oi n v o l v e d t r i p l e t - s t a t e f o r m a t i o n , a n d i f s o , i t m i g h t b e e l i m -i n a t e d b y t r i p l e t - s t a t e q u e n c h e r s s u c h a s o x y g e n .

F i g . 5 s h o w s p h o t o b l e a c h i n g s t u d i e s p e r f o r m e d i nB C E C F - l a b e l e d c e l l s b a t h e d i n s o l u t i o n s s a t u r a t e d w i t h a i r ,1 0 0 % n i t r o g e n , o r 1 0 0 % o x y g e n . M e a s u r e m e n t s w e r e c a r -r i e d o u t b y t r a n s i l l u m i n a t i o n ( w i t h t h e T I R p r i s m r e m o v e d )t o m i n i m i z e r e c o v e r y d u e t o s o l u t e t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n .T h e r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g p r o c e s s w a s o b s e r v e d u s i n g as h o r t p h o t o b l e a c h i n g t i m e , r e l a t i v e l y l o w b l e a c h b e a m i l l u -m i n a t i o n i n t e n s i t y , a n d r a p i d d a t a a c q u i s i t i o n ( F i g . 5 A ) . T h er e c o v e r y p r o c e s s w a s i n c r e a s e d i n a m p l i t u d e a n d s l o w e d i nt h e n i t r o g e n - s a t u r a t e d b u f f e r , b u t w a s e s s e n t i a l l y e l i m i n a t e di n t h e o x y g e n - s a t u r a t e d s o l u t i o n . F u r t h e r s t u d i e s s h o w e dt h a t f a s t p r o c e s s w a s n o t a f f e c t e d b y b e a m f o c u s , d e c r e a s e di n a m p l i t u d e w i t h i n c r e a s i n g b l e a c h t i m e , a n d w a s e l i m i -n a t e d b y 0 . 5 % h y d r o g e n p e r o x i d e ( d a t a n o t s h o w n ) . T a k e nt o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s i m p l i c a t e a r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n gp r o c e s s t h a t i n v o l v e s t r i p l e t - s t a t e f o r m a t i o n a n d o x y g e n -d e p e n d e n t t r i p l e t d e c a y ( s e e D i s c u s s i o n ) . O x y g e n - s a t u r a t e ds o l u t i o n s w e r e t h u s u s e d i n s u b s e q u e n t TIR-FRAP m e a s u r e -m e n t s t o e l i m i n a t e r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g . T h e i r r e v e r s -i b l e p h o t o b l e a c h i n g p r o c e s s w a s o b s e r v e d u s i n g a l o n g e rp h o t o b l e a c h i n g t i m e a n d r e l a t i v e l y h i g h b e a m i l l u m i n a t i o ni n t e n s i t y ( F i g . 5 B ) . A s p r e d i c t e d ( S o n g e t a l . , 1 9 9 5 ) , t h ee f f i c i e n c y o f i r r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g w a s i n c r e a s e d b yo x y g e n .

To m e a s u r e BCECF t r a n s l a t i o n i n b u l k c y t o s o l ( t o c o m -p a r e w i t h d a t a i n m e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o s o l ) a n d t o d e t e r -m i n e w h e t h e r 1 0 0 % o x y g e n a f f e c t s BCECF d i f f u s i o n ,FRAP m e a s u r e m e n t s w e r e c a r r i e d o u t b y e p i i l l u m i n a t i o n( F i g . 6 A ) . M e a s u r e m e n t s i n a i r - s a t u r a t e d s o l u t i o n s s h o w e da r e c o v e r y t 1 1 2 v a l u e o f 3 3 2 ms ( n = 6 ) w i t h -60%r e c o v e r y . T a k e n t o g e t h e r w i t h c a l i b r a t i o n m e a s u r e m e n t sp e r f o r m e d i n a q u e o u s s o l u t i o n s o f known v i s c o s i t y ( a sd e s c r i b e d i n Kao e t a l . , 1 9 9 3 ) , t h e BCECF d i f f u s i o n c o e f -f i c i e n t i n b u l k c y t o s o l w a s 3 . 8 - f o l d l e s s t h a n t h a t i n a q u e o u ss o l u t i o n . F i g . 6 A ( b o t t o m c u r v e ) d e m o n s t r a t e s n o s i g n i f i -c a n t e f f e c t o f 1 0 0 % o x y g e n o n BCECF d i f f u s i o n ( t 1 1 2 =3 2 3 m s , n = 6 ) .F i g . 6 B s h o w s TIR-FRAP m e a s u r e m e n t s o f BCECFd i f f u s i o n i n MDCK c e l l s b a t h e d i n a n o x y g e n - s a t u r a t e ds o l u t i o n . T h e t h r e e c u r v e s s h o w s i m i l a r r e c o v e r y k i n e t i c sf o r d i f f e r e n t p h o t o b l e a c h i n g t i m e s ( t b ) , e a c h much s h o r t e rt h a n t h e a v e r a g e r e c o v e r y t 1 1 2 o f - 4 . 5 m s . C o r r e s p o n d i n ge x p e r i m e n t s p e r f o r m e d b y t r a n s i l l u m i n a t i o n s h o w e d n o

FIGURE 5 O x y g e n d e p e n d e n c e o f r e v e r s i b l e a n d i r -r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g o f BCECF i n MDCK c e l l s .MDCK c y t o p l a s m w a s l o a d e d w i t h BCECF a s d e -s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . C e l l s w e r e b a t h e d i nPBS e q u i l i b r a t e d w i t h a i r , 1 0 0 % o x y g e n , o r 1 0 0 %n i t r o g e n . P h o t o b l e a c h i n g w a s p e r f o r m e d i n t h e t r a n sc o n f i g u r a t i o n . ( A ) R e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g o b t a i n e dw i t h 2 5 0 - , u s b l ea c h t i me a n d l o w l a s e r b e a m i n t e n s i t y .( B ) I r r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g o b t a i n e d w i t h 1 - m sb le a c h t i me a n d h i g h l a s e r b e a m i n t e n s i t y . N o t e t h ed i s a p p e a r a n c e o f t h e r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g s i g n a la n d i n c r e a s e d e f f i c i e n c y f o r i r r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n gi n t h e p r e s e n c e o f 1 0 0 % o x y g e n .

A a i r B

O D r. .0C D0 m ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ n i t r o g e n

1 0 . 2oxygen

.. e we-rw ~ ^ - , , T1 ms 1 0 msL1.

a i r

n i t r o g e n

o x y g e n

2 5 m s 2 5 0 ms~~~~l_ . -

1 1 4 7S w a m i n a t h a n e t a l .


9/12

V o l u m e 7 1 A u g u s t 1 9 9 6A a i r

4so xy genr0m s 2 0 0 m s

B t b = 0 . 2 m s5sa 1 )

C

D

C O )P 1 )0

C

D

0 . 6 ms

0 . 2 1 m s

2 ms 1 0 m s 5 s

2 ms 1 0 m s 5s

1 s0 . 5 ms 2 . 5 msL I I

FIGURE 6 T r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n o f BCECF i n MDCK c y t o s o l mea-s u r e d b y s p o t p h o t o b l e a c h i n g a n d T I R - F R A P . ( A ) S p o t p h o t o b l e a c h i n gmeasurement b y e p i i l l u m i n a t i o n u s i n g a 20 X d r y o b j e c t i v e . B l e a c h t i m ewas m s . C e l l s were b a t h e d i n PBS e q u i l i b r a t e d w i t h a i r ( t o p c u r v e ) or100% o x y g e n ( b o t t o m c u r v e ) . I n t h i s a n d s u b s e q u e n t curves, t h e a v e r a g e df l u o r e s c e n c e a t t h e i n d i c a t e d l a t e t i m e ( a f t e r w h i c h e s s e n t i a l l y a l l r e co ve r yh a s o c c u r r e d ) i s s h o w n . ( B ) TIR-FRAP measurements w i t h i n d i c a t e db l e a c h t i m e s . ( C ) M e a s u r e m e n t i d e n t i c a l t o t h a t i n B ( 1 - m s b l e a c h t i m e )w i t h p r i s m r e m o v e d ( f o r t r a n s i l l u m i n a t i o n ) . ( D ) TIR-FRAP measuremento f d i f f u s i o n o f f l u o r e s c e i n ( 1 m M ) i n P BS w i t h 0 . 1 - m s b l e a c h t i m e . S e et e x t f o r e x p l a n a t i o n s a n d f i t t e d d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s .

r a p i d recovery ( F i g . 6 C ) , i n d i c a t i n g t h a t r e v e r s i b l e p h o t o -b l e a c h i n g was n o t d e t e c t e d u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h e s ee x p e r i m e n t s . U t i l i z i n g t h e m a t h e m a t i c a l m o d e l , D v a l u e swere ( i n c m 2 / s X l 0 - 7 , n = 5 - 8 ) : 2 . 2 0 . 4 ( t b = 1 m s ) ,2 . 7 0 . 5 ( 0 . 6 m s ) a n d 2 . 9 0 . 3 ( 0 . 2 m s ) . T h i s c a l c u l a t i o na s s u m e s t h a t t h e recovery m e a s u r e d a t l a t e t i m e ( 5 s ) i s d u ee x c l u s i v e l y t o BCECF t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n i n t h e e v a n e s -c e n t f i e l d . I f t h e r e i s a n a d d i t i o n a l component o f f l u o r e s -c e n c e recovery ( a s e s t i m a t e d f r o m F i g . 6 C ) , t h e n c a l c u l a t e dD w o u l d b e g r e a t e r , u p t o - 4 x 1 0 - 7 c m 2 / s . T h e d i f f u s i o nc o e f f i c i e n t f o r f l u o r e s c e i n i n w a t e r , m e a s u r e d i n a p a r a l l e l

e x p e r i m e n t ( F i g . 6 D , t 1 / 2 - 0 . 4 m s ) , w a s 2 . 4 X 1 0 - 6 c m 2 / s ;i t w a s s h o w n p r e v i o u s l y t h a t f l u o r e s c e i n a n d t h e a c i d f o r mo f BCECF h a d t h e s a m e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s i n a q u e o u ss o l u t i o n s ( K a o e t a l . , 1 9 9 3 ) . From t h e s e r e s u l t s , a v e r a g e dc y t o p l a s m i c v i s c o s i t y i n m e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o p l a s m w a s6 - 1 0 - f o l d g r e a t e r t h a n w a t e r v i s c o s i t y . A r a n g e i s r e p o r t e dh e r e t o i n c l u d e t h e maximum u n c e r t a i n t y i n t h e f r a c t i o n a lr e c o v e r y d u e t o d i f f u s i o n i n t h e e v a n e s c e n t f i e l d . T a k e nt o g e t h e r w i t h t h e s p o t p h o t o b l e a c h i n g d a t a , t h e s e r e s u l t si n d i c a t e t h a t BCECF t r a n s l a t i o n d i f f u s i o n i n m e m b r a n e -a d j a c e n t c y t o p l a s m i s s i g n i f i c a n t l y s l o w e d c o m p a r e d t o t h a ti n w a t e r , a n d m o d e r a t e l y s l o w e d c o m p a r e d t o t h a t i n b u l kc y t o s o l .

I t w a s a s s u m e d i n t h e c o m p u t a t i o n o f BCECF d i f f u s i o nc o e f f i c i e n t t h a t t h e r e w a s c l o s e c o n t a c t b e t w e e n t h e f u s e d s i l i c as u b s t r a t e a n d t h e c e l l s u r f a c e . H o w e v e r , c o n t a c t i s q u i t e v a r i -a b l e f o r s o m e c e l l s , s u c h a s f i b r o b l a s t s ( L a n n i e t a l . , 1 9 8 5 ;B i c k n e s e e t a l . , 1 9 8 3 ) , y e t c l o s e i n o t h e r c e l l s , s u c h a s c h i c k e nh e a r t e m b r y o n i c c e l l s ( G i n g e l l e t a l . , 1 9 8 5 ) . F i g . 7 A ( l e f t )s h o w s a r e g i o n o f p o o r c o n t a c t b e t w e e n t h e s u b s t r a t e a n d c e l ls u r f a c e i n w h i c h a n a q u e o u s l a y e r ( n r 1 . 3 3 ) o f t h i c k n e s s h i sp r e s e n t b e t w e e n t h e f u s e d s i l i c a a n d t h e c e l l p l a s m a m e m b r a n e .I t w a s c o n c l u d e d b y G i n g e l l e t a l . ( 1 9 8 7 ) t h a t s u c h a l a y e rw o u l d a l t e r t h e i n t e n s i t y o f t h e e v a n e s c e n t f i e l d i n t h e c y t o -p l a s m ( n r 1 . 3 8 ) y e t n o t a f f e c t t h e e x p o n e n t i a l d e c a y o r t h ed i s t a n c e c o n s t a n t ( d ) w i t h i n t h e c e l l . F i g . 7 A ( r i g h t ) s h o w s t h eBCECF d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t c o m p u t e d f r o m t h e e x p e r i m e n t a ld a t a i n F i g . 6 B ( c u r v e f o r t b = 0 . 2 m s ) i n t h e p r e s e n c e o f a n( u n r e c o g n i z e d ) a q u e o u s l a y e r o f t h i c k n e s s ( h ) b e t w e e n 0 a n d1 0 0 n m . I n t e r e s t i n g l y , b e c a u s e d i s n o t a f f e c t e d b y t h e a q u e o u sl a y e r , t h e c o m p u t e d d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t w a s n e a r l y i n d e p e n -d e n t o f h . T h e p r e s e n c e o f a n a q u e o u s l a y e r d o e s a f f e c t t h ei n t e n s i t y o f t h e e v a n e s c e n t f i e l d a t t h e c e l l s u r f a c e ; f o r h o f 0 ,2 0 , 5 0 , a n d 1 0 0 n m , r e l a t i v e i n t e n s i t i e s w e r e ( c o m p u t e d f r o me q u a t i o n s 2 0 a n d 2 4 o f G i n g e l l e t a l . , 1 9 8 7 ) 1 , 0 . 7 5 , 0 . 4 9 , a n d0 . 2 5 . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e s o l u t e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n ti s i n s e n s i t i v e t o u n c e r t a i n t i e s i n t h e d e t a i l s o f t h e c e l l - s u b s t r a t ec o n t a c t .

TIR f l u o r e s c e n c e i m a g i n g w a s c a r r i e d o u t t o i n v e s t i g a t et h e n a t u r e o f t h e s u b s t r a t e - c e l l c o n t a c t , c o m p a r i n g S w i s s3 T 3 f i b r o b l a s t s ( F i g . 7 B - D , l e f t ) a n d MDCK e p i t h e l i a l c e l l s( F i g . 7 B - D , r i g h t ) . W h e r e a s B C E C F - l a b e l e d f i b r o b l a s t ss h o w e d v a r i a b l e s u b s t r a t e c o n t a c t w i t h d i s t i n c t r e g i o n s o ff o c a l c o n t a c t ( F i g . 7 B , l e f t ) , t h e c o n t a c t a p p e a r e d r e l a t i v e l yu n i f o r m f o r t h e MDCK c e l l s ( F i g . 7 B , r i g h t ) . A d d i t i o n o f al a r g e f l u o r e s c e n t d e x t r a n ( F I T C - d e x t r a n , 1 5 0 k D a ) t o u n l a -b e l e d c e l l s w a s e x c l u d e d f r o m t h e r e g i o n b e n e a t h b o t hf i b r o b l a s t s a n d MDCK c e l l s ( F i g . 7 C ) . H o w e v e r , a s m a l l e rd e x t r a n ( 4 k D a , - 4 . 4 - n m d i a m e t e r ) c o u l d p e n e t r a t e t h eu n d e r s u r f a c e o f f i b r o b l a s t s ( F i g . 7 D , l e f t ) b u t n o t MDCKc e l l s ( F i g . 7 D , r i g h t ) . Q u a n t i t a t i v e i m a g e a n a l y s i s c o m p a r -i n g i m a g e s f o r 1 5 0 kDa v e r s u s 4 kDa d e x t r a n s i n d i c a t e d t h a tt h e p e r c e n t a g e o f F I T C- de x t r a n p e n e t r a t i n g t h e u n d e r s u r -f a c e w a s - 8 5 % f o r f i b r o b l a s t s a n d


10/12

C y t o p l a s m i c V i s c o s i t y M e a s u r e d b y T I R - F R A P4

t o ' ' 3 . > 0 0E

0xa 1 T-0 2 0 5 0 1 0 0h ( n m )

FIGURE 7 E x a m i n a t i o n o f c e l l - s u b s t r a t e c o n t a c t . ( A ) S e n s i t i v i t y o fc o m p u t e d s o l u t e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t ( D ) on t h e t h i c k n e s s o f a n aq u e o u sl a y e r ( n r 1 . 3 3 3 ) b e t w e e n t h e f u s e d s i l i c a c o v e r s l i p ( n r 1 . 4 5 8 ) a n d c e l l ( n r1 . 3 8 ) . ( L e f t ) S c h e m a t i c o f t h e m u l t i l a y e r g e o m e t r y . ( R i g h t ) D i f f u s i o nc o e f f i c i e n t s ( c o m p u t e d f o r p a r a m e t e r s t b =0 . 2 ms a n d d = 1 1 2 n m ) as af u n c t i o n o f t h e t h i c k n e s s o f t h e aq u e o u s l a y e r ( h ) . T h e b l e a c h d e p t h v a r i e df r o m 22% ( h =0 ) t o 6% ( h = 1 0 0 n m ) f o r c o n s t a n t i n c i d e n t i n t e n s i t y . ( B )TIR f l u o r e s c e n c e i m a g e o f S w i s s 3 T 3 f i b r o b l a s t s ( l e f t ) a n d MDCK c e l l s( r i g h t ) l a b e l e d w i t h BCECF. N o t e t h e f o c a l c o n t a c t s f o r f i b r o b l a s t s a n df a i r l y u n i f o r m c o n t a c t f o r MDCK c e l l s . ( C a n d D ) TIR f l u o r e s c e n c e i m a g e s( d = 1 1 7 n m ) a s i n B . f o r u n l a b e l e d c e l l s b a t h e d f o r 1 5 m i n i n a s o l u t i o nc o n t a i n i n g F I T C - d e x t r a n ( 1 0 m g / m l ; C , 1 5 0 k D a ; D , 4 k D a ) . R e l a t i v e l yd a r k areas w h e r e c e l l s ar e l o c a t e d ( s o m e c e l l s l a b e l e d c ) a r e o b s e r v e db ec a u s e o f d y e e x c l u s i o n . S e e t e x t f o r e x p l a n a t i o n s .

DISCUSSIONTIR-FRAP h a s b e e n a p p l i e d p r e v i o u s l y t o measure t h eo n - o f f k i n e t i c s o f b i n d i n g o f f l u o r e s c e n t s u b s t r a t e s t o a g l a s ss u r f a c e ( A x e l r o d e t a l . , 1 9 8 6 ; H s i eh a n d T h o m p s o n , 1 9 9 4 ;

S t o u t a n d A x e l r o d , 1 9 9 4 ) . T h e s m a l l p e n e t r a t i o n d e p t h o ft h e e v a n e s c e n t f i e l d p r o d u c e d b y T I R i l l u m i n a t i o n p e r m i t sr e l a t i v e l y s e l e c t i v e e x c i t a t i o n o f s u b s t r a t e - b o u n d f l u o r o -p h o r es w i t h l i t t l e e x c i t a t i o n o f u n b o u n d f l u o r o p h o r e s i n t h eb u l k a q u e o u s p h a s e ( A x e l r o d , 1 9 8 1 ; G i n g e l l e t a l . , 1 9 8 5 ) .O u r s t u d y h e r e u t i l i z e d TIR-FRAP f o r t h e f i r s t t i m e t om e a s u r e s o l u t e t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n n e a r a n i n t e r f a c e - t h ed i f f u s i o n o f BCECF i n t h e c y t o s o l o f MDCK c e l l s c u l t u r e do n q u a r t z c o v e r s l i p s . T h e b i o l o g i c a l m o t i v a t i o n f o r t h i ss t u d y w a s t o a d d r e s s b a s i c q u e s t i o n s a b o u t t h e r h e o l o g y o fm e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o s o l a s d e s c r i b e d i n t h e I n t r o d u c t i o n .T h e a p p l i c a t i o n o f TIR-FRAP t o m e a s u r i n g s o l u t e d i f f u s i o nw a s p a r t i c u l a r l y c h a l l e n g i n g b e c a u s e o f t h e r a p i d r e c o v e r yr a t e s , w h i c h r e q u i r e d v e r y s h o r t b l e a c h t i m e s a n d f a s t d a t aa c q u i s i t i o n ; t h e c o m p l e x t i m e a n d s p a c e d e p e n d e n c e o f t h er e c o v e r y p r o c e s s , w h i c h r e q u i r e d t h e d e v e l o p m e n t o f ac o m p u t a t i o n a l m o d e l f o r d a t a a n a l y s i s ; a n d t h e p r e s e n c e o fa r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g p r o c e s s , w h i c h r e q u i r e d am e c h a n i s t i c a n a l y s i s a n d d e v e l o p m e n t o f a s t r a t e g y t o e l i m -i n a t e t h e p r o c e s s .S e v e r a l a p p r o x i m a t i o n s w e r e m a d e i n t h e a n a l y s i s o fTIR-FRAP d a t a . A s i n g l e - b e a m i n c i d e n t a n g l e , a n d t h u se v a n e s c e n t f i e l d p e n e t r a t i o n d e p t h , w a s a s s u m e d . T h e a c t u a lbeam c o n t a i n e d a s m a l l s p r e a d i n i n c i d e n t b e a m a n g l e sb e c a u s e o f t h e o b j e c t i v e l e n s , w h i c h w a s r e q u i r e d t o i n -c r e a s e b e a m i n t e n s i t y i n t h e s a m p l e p l a n e . We b e l i e v e t h a tt h e a s s u m p t i o n o f a s i n g l e d i s j u s t i f i e d b a s e d o n t h e g o o da g r e e m e n t b e t w e e n m e a s u r e d a n d e x p e c t e d d i f f u s i o n c o e f -f i c i e n t s f o r f l u o r o p h o r e s i n a q u e o u s s o l u t i o n s , a n d t h e i n -s e n s i t i v i t y o f r e c o v e r y c u r v e s t o r e p l a c e m e n t o f t h e 2 5 xo b j e c t i v e w i t h l O X a n d 4x o b j e c t i v e s ( n o t s h o w n ) , i nw h i c h b e a m a n g u l a r s p r e a d w a s r e d u c e d , a l t h o u g h s p o t s i z ew a s i n c r e a s e d . A s e c o n d a p p r o x i m a t i o n w a s t h e a s s u m p t i o no f o n e - d i m e n s i o n a l g e o m e t r y . F o r s o l u t e d i f f u s i o n , o n e -d i m e n s i o n a l d i f f u s i o n w a s c l e a r l y j u s t i f i e d b e c a u s e d w a smuch l e s s t h a n t h e d i a m e t e r o f t h e l a s e r b e a m i n t h e s a m p l ep l a n e . H o w e v e r , a s e c o n d- o r d e r e f f e c t o f i mp er f ec t x - yu n i f o r m i t y i n s a m p l e i l l u m i n a t i o n i s u n c e r t a i n t y i n a b s o l u t eb l e a c h d e p t h . We b e l i e v e t h a t t h e u n c e r t a i n t y i n b l e a c hd e p t h h a d l i t t l e i n f l u e n c e o n t h e q u a n t i t a t i v e r e s u l t s b e c a u s eo f t h e i n s e n s i t i v i t y o f r e c o v e r y c u r v e s h a p e t o b l e a c h d e p t h( F i g . 4 E ) , t h e g o o d a g r e e m e n t b e t w e e n m e a s u r e d a n de x p e c t e d d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t s , a n d t h e i n s e n s i t i v i t y o f r e -c o v e r y c u r v e s h a p e t o r e s t r i c t i n g t h e d e t e c t i o n a r e a t o t h ec e n t e r o f t h e e l l i p t i c a l s p o t ( n o t s h o w n ) .

A d d i t i o n a l a s s u m p t i o n s w e r e r e q u i r e d f o r t h e a n a l y s i s o fTIR-FRAP d a t a i n c e l l s . I t w a s n e c e s s a r y t o a s s u m e a s i n g l ee f f e c t i v e r e f r a c t i v e i n d e x f o r c y t o s o l b a s e d o n r e p o r t e dm e a s u r e m e n t s ( R e i c h e r t a n d T r u s k e y , 1 9 9 0 ; L a n n i e t a l . ,1 9 8 5 ) . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y ( G i n g e l l e t a l . , 1 9 8 7 ; B i c k -n e s e e t a l . , 1 9 9 3 ) , t h e a s s u m p t i o n o f m i c r o h o m o g e n e i t y i nt h e o p t i c a l p r o p e r t i e s o f c y t o s o l i s d i f f i c u l t t o e v a l u a t e a n dt h e r e f o r e r e p r e s e n t s a p o t e n t i a l l i m i t a t i o n f o r q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s o f i n t r a c e l l u l a r d i s t a n c e s b y T I R f l u o r e s c e n c e . Ana d d i t i o n a l a p p r o x i m a t i o n i n c e l l s w a s t h e a s s u m p t i o n o f as i n g l e e f f e c t i v e e v a n e s c e n t f i e l d p e n e t r a t i o n d e p t h . W h e r e a sc e l l - s u b s t r a t e c o n t a c t d i s t a n c e d i f f e r s c o n s i d e r a b l y a c r o s s

A1 1 4 9S w a m i n a t h a n e t a l .

I

~ .:

.~


11/12

1 1 5 0 B i o p h y s i c a l J o u r n a l V o l u m e 7 1 A u g u s t 1 9 9 6t h e u n de r s u r f a c e o f c u l t u r e d f i b r o b l a s t s ( L a n n i e t a l . , 1 9 8 5 ;B i c k n e s e e t a l . , 1 9 8 3 ) , t h e r e w a s r e l a t i v e l y u n i f o r m c o n t a c tf o r t h e MDCK e p i t h e l i a l c e l l s g r o w n o n a f u s e d s i l i c ac o v e r s l i p ( F i g . 7 , B - D ) , s i m i l a r t o f i n d i n g s f o r c h i c k e ne m b r y o n i c h e a r t c e l l s ( G i n g e l l e t a l . , 1 9 8 5 ) . I n a d d i t i o n ,b e c a u s e t h e e x p o n e n t i a l d e c a y o f t h e e v a n e s c e n t f i e l d i n -t e n s i t y i s n o t i n f l u e n c e d b y a n a q u eo u s l a y e r b e t w e e n t h es u b s t r a t e a n d p l a s m a m e m b r a n e ( G i n g e l l e t a l . , 1 9 8 7 ) , t h ec a l c u l a t e d s o l u t e d i f f u s i o n c o e f f i c i e n t w a s i n s e n s i t i v e t o t h ed e t a i l s o f t h e c e l l - s u b s t r a t e c o n t a c t ( F i g . 7 A ) . F i n a l l y ,b e c a u s e t h e d e c a y l e n g t h o f t h e e v a n e s c e n t f i e l d g e n e r a l l yu s e d i n t h e s e s t u d i e s ( - 1 0 0 n m ) w a s much g r e a t e r t h a n t h em e m b r a n e t h i c k n e s s ( 4 n m ) a n d t h e l i k e l y e x t e n t o f t h eg l y c o c a l y x , t h e c a l c u l a t e d BCECF d i f f u s i o n c o e f f i c i e n ts h o u l d h a v e b e e n o v e r e s t i m a t e d b y n o m o r e t h a n 12%( b a s e d o n c a l c u l a t i o n s u t i l i z i n g t h e m o d e l ) . T h i s u n c e r t a i n t yi s f u r t h e r r e d u c e d b y t h e h i g h e r r e f r a c t i v e i n d e x o f t h em e m b r a n e v e r s u s t h e c y t o s o l , s o t h a t t h e a c t u a l T I R i n t e r -f a c e w a s p r o b a b l y t h e m e m b r a n e - c y t o s o l b o u n d a r y .An u n a n t i c i p a t e d p r o b l e m f o r t h e TIR-FRAP m e a s u r e -m e n t s i n c e l l s w a s t h e p r e s e n c e o f r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n gi n t h e t i m e s c a l e o f t h e f l u o r e s c e n c e r e c o v e r y . R e v e r s i b l e

p h o t o b l e a c h i n g h a s b e e n o b s e r v e d p r e v i o u s l y i n p h o t o -b l e a c h i n g e x p e r i m e n t s u s i n g v a r i o u s d y e s ( V e l e z a n d A x -e l r o d , 1 9 8 8 ; S c a l e t t a r e t a l . , 1 9 9 0 ; S e l v i n e t a l . , 1 9 9 0 ) ,i n c l u d i n g f l u o r e s c e i n ( S t o u t a n d A x e l r o d , 1 9 9 5 ) , a n d i ns i n g l e t d e p l e t i o n s t u d i e s ( J o h n s o n a n d G a r l a n d , 1 9 8 2 ; Y o -s h i d a a n d B a r i s a s , 1 9 8 6 ) . R e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g h a sb e e n a t t r i b u t e d t o t h e f o r m a t i o n a n d d e c a y o f t h e t r i p l e t s t a t eb a s ed o n i t s o x y g e n d e p e n d e n c e ( J o h n s o n a n d G a r l a n d ,1 9 8 2 ; S c a l e t t a r e t a l . , 1 9 9 0 ) . R e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g w a sr e c e n t l y i d e n t i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e d i n a i r - s a t u r a t e d v i s c o u ss o l u t i o n s ; t h e r o l e o f t r i p l e t - s t a t e r e l a x a t i o n w a s c o n f i r m e db y a n a l y s i s o f b l e a c h k i n e t i c s a n d f r o m e f f e c t s o f o x y g e na n d o t h e r t r i p l e t - s t a t e q u e n c h e r s ( P e r i a s a m y e t a l . , 1 9 9 6 ) .T h e p r e s e n c e o f r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g i n c e l l s i s l i k e l yd u e t o a c o m b i n a t i o n o f r e d u c e d o x y g e n d i f f u s i o n i n t h ei n t r a c e l l u l a r m i l i e u a n d BCECF e n v i r o n m e n t e f f e c t s . R e -g a r d l e s s o f t h e e x a c t m e c h a n i s m , we f o u n d t h a t t h e r e v e r s -i b l e p h o t o b l e a c h i n g p r o c e s s w a s e f f e c t i v e l y e l i m i n a t e d b ys a t u r a t i n g t h e b a t h i n g s o l u t i o n w i t h 1 0 0 % o x y g e n . T h eo b s e r v e d r e c o v e r y c o u l d t h e n b e i n t e r p r e t e d i n t e r m s o fs o l u t e t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n .N o t w i t h s t a n d i n g t h e s e c a v e a t s , t h e r e s u l t s p r e s e n t e d h e r ee s t a b l i s h t h e v a l i d i t y o f TIR-FRAP f o r t h e m e a s u r e m e n t o fs o l u t e t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n v e r y n e a r a TIR i n t e r f a c e , a n dp r o v i d e t h e f i r s t d a t a o n s o l u t e t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n i nm e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o s o l . T h e d i f f u s i o n o f t h e s m a l l p o -l a r f l u o r o p h o r e BCECF i n m e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o s o l wa sm o d e r a t e l y s l o w e d c o m p a r e d t o t h a t m e a s u r e d i n b u l k c y -t o s o l b y s p o t p h o t o b l e a c h i n g . W e s h o w e d p r e v i o u s l y t h a tf l u i d - p h a s e v i s c o s i t y i n m e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o s o l o fMDCK c e l l s w a s n e a r u n i t y a n d t h a t m o s t o f t h e BCECFw a s u n b o u n d ( B i c k n e s e e t a l . , 1 9 9 3 ) . F r o m t h e s e r e s u l t s a n df o l l o w i n g t h e t h e o r y d e s c r i b e d i n K a o e t a l . ( 1 9 9 3 ) , i t i sc o n c l u d e d t h a t t h e s l o w e d BCECF t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n i nMDCK c y t o s o l i s p r i m a r i l y t h e c o n s e q u e n c e o f m o b i l e a n d

i m m o b i l e " o b s t a c l e s " i n t h e c y t o s o l ( p r o t e i n s , m e m b r a n e s ,e t c . ) . T h e r e f o r e t h e d e n s i t y o f s u c h n o n a q u e o u s o b s t a c l e s i nm e m b r a n e a d j a c e n t c y t o s o l i s g r e a t e r t h a n t h a t i n b u l kc y t o s o l . B e c a u s e t h e d a t a r e p o r t e d h e r e f o r s m a l l f l u o r o -p h o r e s p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n l y o n o b s t a c l e d e n s i t y w i t h o u tr e g a r d t o o b s t a c l e o r g a n i z a t i o n ( F u r u k a w a e t a l . , 1 9 9 1 ; Kaoe t a l . , 1 9 9 3 ) , f u r t h e r s t u d i e s o f s o l u t e d i f f u s i o n i n mem-b r a n e - a d j a c e n t c y t o s o l a r e n e e d e d u s i n g l a r g e r p r o b e m o l -e c u l e s s u c h a s F I T C - l a b e l e d d e x t r a n s . L u b y - P h e l p s e t a l .( 1 9 8 6 ) r e p o r t e d t h a t l a r g e m a c r o m o l e c u l e s a r e s i e v e d i nc y t o s o l b y a m e c h a n i s m p r e s u m a b l y i n v o l v i n g t h e c y t o s k e l -e t o n . W e p o s t u l a t e t h a t t h e h i g h d e n s i t y o f s k e l e t a l e l e m e n t si n m e m b r a n e - a d j a c e n t c y t o s o l s h o u l d s i g n i f i c a n t l y r e t a r dt h e t r a n s l a t i o n a l d i f f u s i o n o f r e l a t i v e l y l a r g e s o l u t e s . T h et h e o r y a n d e x p e r i m e n t a l m e t h o d o l o g y d e v e l o p e d h e r es h o u l d p e r m i t t h e d i r e c t e x a m i n a t i o n o f t h i s h y p o t h e s i s .

W e t h a n k D r . D a n i e l A x e l r o d f o r h e l p f u l a d v i c e o n T I R i n s t r u m e n t a t i o na n d r e v e r s i b l e p h o t o b l e a c h i n g r e c o v e r y .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y g r a n t DK43840 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o fH e a l t h .

REFERENCESA u s i e l l o , D . A . , J . H a r t w i g , a n d D . B r o w n . 1 9 8 7 . M e m b r a n e a n d m i c r o -f i l a m e n t o r g a n i z a t i o n a n d v a s o p r e s s i n a c t i o n i n t r a n s p o r t i n g e p i t h e l i a .S o c . G e n . P h y s i o l . S e r . 4 2 : 2 5 9 - 2 7 5 .A x e l r o d , D . 1 9 8 1 . C e l l - s u b s t r a t e c o n t a c t s i l l u m i n a t e d b y t o t a l i n t e r n a lr e f l e c t i o n f l u o r e s c e n c e . J . C e l l B i o . 8 9 : 1 4 1 - 1 45 .A x e l r o d , D . , T . P . B u r g h a r d t , a n d N . L . T h o m p s o n . 1 9 8 4 . T o t a l i n t e r n a lr e f l e c t i o n f l u o r e s c e n c e . A n n u . R e v . B i o p h y s . B i o e n g . 1 3 : 2 4 7 - 2 6 8 .A x e l r o d , D . , R . M . F u l b r i g h t , a n d E . H . H e l l e n . 1 9 8 6 . A d s o r p t i o n k i n e t i c so n b i o l o g i c a l m e m b r a n e s : m e a s u r e m e n t b y t o t a l i n t e r n a l r e f l e c t i o n f l u -o r e s c e n c e . I n A p p l i c a t i o n s o f F l u o r e s c e n c e i n B i o m e d i c a l S c i e n c e s . D .L a n s i n g T a y l o r , A . S . W a g g o n e r , F . L a n n i , R . F . M u r p h y , a n d R . R .B i r g e , e d i t o r s . A l a n R . L i s s , New Y o r k . 4 6 1 - 4 7 6 .A x e l r o d , D . , D . E . K o p p e l , J . S c h l e s s i n g e r , E . E l s o n , a n d W. W. W e b b .1 9 7 6 . M o b i l i t y m e a s u r e m e n t b y a n a l y s i s o f f l u o r e s c e n c e p h o t o b l e a c h i n g

r e c o v e r y k i n e t i c s . B i o p h y s . J . 1 6 : 1 0 5 5 - 1 0 6 9 .

cytoplasmic viscosity

Documents