Biomaterials Research (2008) 12(1) : 29-34

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Biomaterials

Research

C The Korean Society for Biomaterials

온열치료효과 분석을 위한 CRL-1888 마우스 종양 세포주의 배양 온도 변화에

따른 증식 특성 연구

Proliferation Characteristics of the CRL-1888 Mouse Tumor Cell-line for Hyperthermia Analysis with Respect to Culturing Tempera-tures

황은미·김영곤*

Eun Mi Hwang and Young Kon Kim*

인제대학교 의용공학과Dept. of Biomedical Engineering, Inje University, Kimhae 621-749 Korea(Received Feburay 14, 2008/Accepted February 22, 2008)

The purpose of this study is to investigate the proliferation characteristics of CRL-1888 mouse tumor cell line for stan-dardization of the hyperthermic animal model. Proliferation characteristics of the CRL-1888 mouse tumor cell line athyperthermic environment was tested at eleven different culturing temperatures (36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45,46oC) and for seven different culturing times (24, 48, 72, 96, 120, 144, 168hours). The result shows that the pro-liferation curves of the CRL-1888 mouse tumor cell line are well in accord with the theoretical formula LogN = LogN0

+ kt. Where N is a measured number of cells, N0 is the initially inoculated number of cells and k is the proliferationcharacteristic constant which was calculated from the interpolated slope of the proliferation curves. The maximumvalue of the proliferation constant was 0.021 at 39oC incubation test. However, it was 0.011 for normal incubationtest temperature of 37oC. These results were well in accord with the results of the microscopic observation for CRL-1888 proliferation tests. And the value of the proliferation constant k was conversed to negative value at the tem-perature above 42oC. Therefore, the effectiveness of hyperthermia treatment for CRL-1888 can be expected at thetemperature above 42oC.

Key words: Hyperthermia, CRL-1888 mouse tumor cell line, Proliferation characteristics, Cytotoxicity

서 론

양의 온열치료란 생리적으로 체온조절 기능을 유지하면

서 생체 기관이나 생체 조직 일부의 온도를 41oC에서

45oC정도로 유지하여 치료하는 방법이다. 온열치료 효과는

1989년 Hornback의 발표에 의하면1) 온열에 의한 암 치료 효

과가 1866년 Busch에 의하여 단독(erysipelas)으로부터 발생되

는 고열로 인하여 육종(sarcoma)이 퇴행된 사실이 처음으로 보

고 되었으며 1893년에는 Coley에 의하여 암 환자에게 반복

접종하여 체온을 인위적으로 38~42oC로 상승시키면 골육종과

종양치료에 효과가 있음을 발표되었다. 1957년에는 Gilchrist가

위장간의 전이성 암의 치료를 위하여 림프절 내부에 자성물질

을 삽입한 후 유도자기장의 자기이력현상으로 온열치료를 시도

한 결과 효과가 있음을 보고하였으며,2) 1967년 Cavaliere에

의하여3) 배양조직이나 실험동물 체내의 악성종양조직이 일반

조직보다 열에 민감함이 보고 되었다. 이들의 보고에 의하면

세포증식 과정 중 열에 의한 손상 정도는 가하여진 열 충격

시간과 온도에 의존될 뿐만 아니라 세포조직마다 고유한 열 민

감성을 나타낸다.

온열치료에 관한 기전은 1988년 Gerweck이4) 온열치료를

실시할 경우에 정상조직에서는 열 발산이 잘 되지만 종양세포

는 복잡한 맥관 구조를 이루고 있기 때문에 혈액순환이 저하

되어 열 발산 정도가 줄어들고 종양조직의 온도도 높아져서 종

양조직의 세포 활성도가 증가되고, 따라서 혈액 순환의 부족

때문에 산소 공급 부족에 의한 hypoxia상태가 되며, 종양조직

에 존재하는 이산화탄소량의 증가로 조직이 산성화가 되어 쉽

게 손상되며 열민감성이 증가되고 영양분 결핍상태가 동반됨을

보고하였다. 온열치료시 방사선요법이나 화학요법과 같은 종양

치료를 병행하게 될 경우에 세포독성이 증진되어 종양의 치료

효과를 높일 수 있다는 연구가 Overgaard에 의하여 보고 되

었으며5) malignant melanoma에 대하여 온열치료와 방사선

요법을 병행하여 실시하면 세포의 방사선 민감도가 증가되고

세포독성이 증가되어 온열치료 효과가 증진됨을 발표하였다.

1999년 Urano에 의하면 40.5oC~43oC를 유지하면서 화학요*책임연락저자: ykkim@bme.inje.ac.kr

종

30 황은미·김영곤

Biomaterials Research 2008

법으로 치료하면 세포독성이 높아짐이 보고되었다.6) 그러나

Cameliet는 종양조직을 구성하는 세포들은 높은 삼투압으로 인

해 치료 약물이 종양조직 내로 침투하기가 어렵기 때문에 화

학요법은 종양 치료 효과가 크지 않음을 주장하였다.7) 종양

세포를 온열치료 온도 조건인 40oC 이상에서 배양하면 세포의

물질대사에 다양한 변화가 일어난다. 1990년 Knox는 온열치료

시 세포 중심소체 주변 물질이 결집되며, 세포가 용해되거나

미세소관을 형성하는 과정에 이상을 유발시켜 세포의 괴사를

도모하게 됨을 보고하였다.8) 그 외에도 온열치료를 실시하면

단백질 합성이 억제되고, 열충격 단백질을 생성하며, 에너지 물

질대사를 억제하고, DNA를 손상시키며, 염색체의 이상을 야기

시켜 세포막의 구조와 기능을 변화시킬 수 있음이 보고 되었

다.9) 종양세포가 40oC 이상의 고온 환경에서 생존력이 저하되

는 이유는 신생 종양세포 대부분이 정상세포가 지닌 열에 대

한 방어 시스템과 변성된 단백질의 재활성, 비정상 단백질의

분해 및 분비 억제와 같은 기능을 돕는 열충격 단백질을 갖고

있지 않기 때문이다.10) 열충격 단백질(Heat shock proteins)은

세포성장 및 분화과정에서 단백질 변성을 조절할 수 있는 물

질로서 세포의 항상성과 생존을 유지시켜준다. 만약 세포가 고

온 자극이나 열 충격에 노출될 경우에 열 내성이 증진되고 열

충격 단백질이 형성되어 생존경로가 충분히 확보되면 세포는

생존하게 되며, 반면에 괴사경로가 더 많아지면 세포는 괴사하

게 된다.11)

이와 같이 종양세포의 온열증식 특성 변화에 대한 연구가 많

이 진행되어 왔음에도 불구하고 아직까지 온열치료 온도 조건

이 변화될 경우에 종양세포의 증식특성에 미치는 영향에 관한

연구와 시험용 동물모델에 침입형 임플란트를 삽입하여 온열치

료를 실시하는 연구는12-14) 미흡한 편이다. 따라서 본 연구에서

는 마우스에 종양을 유발시키는 CRL-1888 세포주를15) 사용하

여 다양한 온도조건에서 세포의 증식특성 변화를 고찰하여 온

열치료효과를 판단하는 기준을 제시하고자 하였다.

재료 및 방법

CRL-1888 Cell Line

본 실험에서는 세포독성시험 및 온열치료의 동물시험모델로

안전하게 적용할 수 있고 마우스에서 주로 전이되는 CRL-

1888(Mus musculus cell) 종양 세포주를 American Type

Culture Collection (USA)으로부터 분양받아 사용하였다. CRL-

1888 세포의 증식 특성을 고찰하기 위하여 배양 온도와 배양

시간을 조절하여 배양시험을 실시하였다.

Cell Medium

세포 배양에 필요한 배지는 실온의 무균실에서 제조하였으

며, Dulbecco's Modified Eagle's Medium-low glucose(Gibco,

USA)에 10%의 Fetal Bovine Serum(Gibco, USA)과 1%의

Penicillin-Streptomycin(Gibco, USA) 그리고 1%의 200 mM

L-glutamine(Gibco, Japan)을 혼합하여 제조하였다.

Cell Preparation

다음으로 액체질소에 냉동 보관되었던 CRL-1888 세포주를

37oC의 항온조(Koma Biotech, Korea)에서 해동한 뒤, 50 mL

Eppendorf tube(Corning, USA)에 10 mL PBS(Gibco, USA)

와 교반하여 혼탁액을 만들었다. 이 혼탁액을 원심분리기

(MF80, Hanil, Korea)을 사용하여 원심분리(1000 rpm, 3

min)하고 흡인기로 상층액을 제거하는 방법으로 세포를 분리하

였다. 이렇게 분리된 CRL-1888 세포주에 배지를 첨가하고 충

분히 교반해서 배양용 세포 혼탁액을 준비하였다. 준비된 10

mL의 세포 혼탁액을 Cell-culturing T75 Flask(Corning, USA)

에 주입하고 CO2 Incubator(BINDER CB-50, Germany)에서

37oC, 5% CO2 조건으로 8회 계대 배양을 실시하여 실험에

필요한 6×106개의 CRL-1888세포를 확보하였다.

Proliferation Test

CRL-1888세포의 증식 특성시험은 ϕ100 mm Cell-culturing

Petri dish에 CRL-1888세포 1×104개를 파종하고 배양온도를

달리한 11개의 온도 조건(36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,

44, 45, 46oC)과 배양시간을 달리한 7개의 시간 조건(24, 48,

72, 96, 120, 144, 168 hours)에서 배양을 실시하였다. 각

시험 조건에 해당하는 배양 시편의 개수는 3개씩으로 하였다.

배양시험을 진행함에 있어서 배양온도는 무작위로 선정한 순서

대로 시험을 진행하였다.

Microscopy Assay

배양이 완료된 시편들은 세포의 증식특성을 조사하기 위하여

광학현미경(CK40-F200, Olympus, Japan)을 사용하여 200배로

세포의 형태 변화를 관찰하였다.

Cellular Viability

각 시편들의 cellular viability를 측정하기 위해 살아있는 세

포에는 염색이 되지 않고 죽은 세포에만 염색이 되는 Trypan

blue exclusion method를 이용하였다.11) 각 시편의 세포를

10 mL pH 7.2 PBS로 두 번 씻어낸 후, 10 mL PBS에 1

mL Trysin-EDTA(Gibco, USA)을 첨가하여 ϕ100 mm Cell-

culturing Petri dish로부터 세포를 떼어내었다. 이렇게 ϕ100

mm Cell-culturing Petri dish로부터 떼어낸 세포는 50 mL

Eppendorf tube로 옮겨 1000 rpm으로 3분간 원심분리를 시

킨 후 흡인기로 상층액을 제거하여 세포를 분리하였다. 분리된

세포를 10ml PBS와 교반하여 세포 혼탁액을 준비하였다. 준비

된 세포 혼탁액 0.2 mL에 PBS 0.2 mL와 0.4% Trypan

Blue Solution(Jeil Biotechservices Inc., Korea) 0.5 mL를 첨

가하여 충분히 교반하였다. Trypan blue solution이 충분히 세

포에 염색될 수 있도록 5분간 기다린 후, Hemocytometer

(Marienfeld, Germany)의 양 cover-slipped chamber에 피펫

을 사용하여 10 µL씩 넣고 염색이 되지 않은 세포수를 3번씩

계수하여 기록하고 분석하였다.

온열치료효과 분석을 위한 CRL-1888 마우스 종양 세포주의 배양 온도 변화에 따른 증식 특성 연구 31

Vol. 12, No. 1

결과 및 고찰

CRL-1888 마우스 종양 모델의 효과적인 온열치료 조건을 찾

기 위해서 배양 온도와 배양 시간을 조절하며 배양시험을 실

시하고 증식된 CRL-1888세포의 수를 측정하고 분석하기 위해

서 결과들을 종합하여 Figure 1에 도식화하였다. 37oC에서 24

시간동안 CRL-1888 세포주를 배양한 결과 계수된 세포의 수

는 2.9×104개 이었으며 파종 초기 값인 1×104

개의 약 2.9배

로 증식되었다. 같은 조건으로 계속해서 168시간을 배양하니

세포의 수가 약 66.2×104개로 증식되어 초기 값의 약 66배가

되었다. Figure 1에 나타난 세포수의 증가곡선 결과들을 종합

한 결과 CRL-1888세포는 모든 배양 조건에서 지수적으로 증

식됨을 알 수 있었다. 이러한 온도에 따른 세포의 증식 특성을

규명하고자 그래프에 제시한 자료들을 사용하여 CRL-1888세포

의 수 N과 배양된 t 시간과의 상관관계를 분석하여 식 (1)과

같은 관계식이 성립함을 알 수 있었다.

LogN = LogN0 + kt (1)

N: Number of Cells

t: Incubation Time(hour)

k: Proliferation Constant

식 (1)은 CRL-1888세포주가 본 배양 조건에서 시간이 경과

함에 따라서 일정한 비율로 증가하는 first-order proliferation

임을 보여준다. 또한 그래프에 표시한 추세선의 기울기는 CRL-

1888세포가 나타내는 고유한 증식 특성이라고 볼 수 있으며

배양온도 조건에 따라서 변화되고 있다. 이와 같은 세포증식의

고유특성인 추세선 기울기를 CRL-1888세포의 ‘증식특성계수 k’

라고 명명하였다. 각 배양조건에서 k 값을 계산하고 종합하여

Figure 2에 나타내었다.

37oC에서 증식특성계수 k 값은 0.011이었으며 배양온도가

증가함에 따라서 점차 증가하여 39oC에서 최대값인 0.021을

나타내었다. 즉 39oC에서 CRL-1888세포의 증식이 37oC에서

증식보다 약 2배 정도 많이 일어남을 보여준다. 다시 말하자

면 CRL-1888세포는 39oC에서 가장 잘 증식됨을 알 수 있었

다. 이와 같이 세포의 증식이 잘 일어나는 현상은 배양온도가

증가되어 세포의 열 민감성이 높아지지만 세포독성이 유발될

만큼 충분한 열 충격이 가해지지 않았고 세포의 활성도만 높

아졌기 때문이라고 판단된다. 그러나 배양 온도가 39oC보다 높

아지게 되면 증식특성계수 k 값은 점차 감소되어 42oC 이상에

서 음의 값으로 변화된다. 즉, CRL-1888 세포는 42oC 이상

에서 세포의 활성도가 증가할 뿐만 아니라 열민감성이 증가되

어 세포독성이 유발되기 때문에 세포가 사멸되기 시작하고 궁

극적으로 파종된 세포의 수보다 감소되어 소멸될 수 있음을 의

미한다. 따라서 CRL-1888 세포를 42oC 이상의 온도에서 배양

하게 되면 세포의 수는 점차 감소되며 배양온도가 높아질 수

록 사멸 속도는 더욱 빨라지게 된다. 본 실험조건에서 CRL-

1888 세포는 42oC에서 최대 5일까지 생존하였으며 43oC와

44oC에서는 3일까지만 생존하였다. 특히 45oC와 46oC에서는

CRL-1888 세포가 24시간 이내에 모두 사멸됨이 확인되었다.

따라서 CRL-1888세포로 BALB/c 마우스에 종양을 유발시킨 동

물모델에 침입형 임플란트를 삽입한 후 유도가열법으로 온열치

료를 실시하고자 한다면 열영향부위의 온도는 적어도 42oC 이

상으로 유지되어야만 종양조직의 증식을 효과적으로 억제할 수

Figure 1. Cell counts of the CRL-1888 after incubations at eleven different temperatures.

32 황은미·김영곤

Biomaterials Research 2008

가 있을 것으로 판단된다.

CRL-1888세포를 37oC에서 배양 후 광학 현미경으로 관찰한

결과 세포의 수는 시간이 경과할 수 록 점차 증가 되어서

168시간 후에는 거의 모든 배양접시 표면에 세포가 부착될 정

도로 증식 되었다. 39oC에서는 120시간 만에 세포들이 배양접

시 표면에 가득하게 부착되어 37oC 조건보다 세포증식이 더

빨리 이루어졌음을 확인하였다.

Figure 3은 1×104 cells/dish의 세포 수로 파종한 CRL-

1888세포를 6가지 온도조건(36, 37, 39, 41, 43, 45oC)에서

48시간 동안 배양 후 200배 현미경으로 세포를 관찰한 사진

들이다. 본 실험조건의 대조군에 해당하는 배양온도인 37oC에

서 CRL-1888 세포를 증식한 결과와 실험군에 해당하는 36oC,

39oC, 41oC, 43oC, 45oC에서 증식한 결과들을 비교해 보면,

36oC에서는 37oC에 비해 세포 증식이 덜 이루어 졌으며,

39oC에서는 세포 증식이 더 많이 일어났다. 그러나 41oC에서

는 증식된 세포의 수가 감소되었으며, 43oC와 45oC에서는 세

포의 증식은 관찰되지 않고 괴사된 세포만이 관찰되었다. 이러

한 현미경 관찰 결과는 Figure 2에서 나타난 증식특성계수 k

값의 변화와도 잘 일치한다. 증식특성계수 k 값이 가장 큰 조

건인 39oC에서는 가장 많은 세포 증식이 관찰되었고, 음의 k

값을 갖는 43oC와 45oC에서는 세포 괴사가 관찰되었다.

1988년 Gerweck의 보고에 의하면4) 온열치료 조건인 42oC

이상이 되면 종양조직세포의 활성도가 증가되고 혈액순환과 산

소공급량이 부족하게 되어 hypoxia상태가 되고 용존 이산화탄

소량의 증가로 인하여 산성화가 되어 종양조직이 쉽게 파괴된

다고 한다. 따라서 본 연구결과에서 얻어진 42oC 이상에서 증

식특성계수 k 값이 음의 값으로 전환되어 CRL-1888세포의 증

식이 억제될 수 있다는 특성과 Gerweck이 주장한 42oC 이상

에서 온열치료시 종양조직이 파괴됨은 동일한 기전에 의한 결

과라고 판단된다. 다시 말하자면 CRL-1888 마우스 종양세포를

사용하여 BALB/c 마우스에 종양을 유발시키고 42oC 이상으로

유지하는 온열치료를 실시하게 된다면 종양조직이 감소될 것이

라고 예상되며 향후 추가 연구에 의하여 확인할 필요성이 있

다고 사료된다.

본 연구와 유사한 결과는 2000년에 Raaphorst가 mel-3

human cell이 40oC와 41oC로 60분간 유지할 경우에 세포의

생존율이 감소된다는 결과를 발표하였으며16) 2003년에 Ahn은

Mammalian carcinoma cell(SCK)이 43oC에서 120분간 유지

할 경우에 세포생존율이 10%로 감소되는 결과를 발표하였

다.17) 그러나 2000년에 Fukao에 의하여 보고된 Human

umbilical vein endothelial cells(HUVECs)의 경우에는 43oC에

서 120분간 유지할 경우에 세포의 생존율이 오히려 110%로

증가되어 본 연구결과와 상반되는 결과를 발표하였다.18) 또한

1999년 Remania가 발표한 Human cervical carcinoma(Hela

cells)을 41oC에서 120분간 유지할 경우에 세포의 생존율이 약

100%를 유지한다는19) 결과도 본 연구결과와 상반되는 주장이

다. 2000년 Raaphorst가16) 발표한 온열치료 조건에서 정상세

포인 human fibroblast AG1522 normal cell과 종양세포인

human SK-mel melanoma cell line을 40oC와 41oC로 가열

하여 증식효과를 비교한 결과 정상세포에서는 괴사가 발생

하지 않았지만 종양세포에서는 괴사가 발생되어 종양세포가

열에 더 민감하다는 결과도 본 연구와 동일한 결과인 것으

로 판단된다. 그러나 1984년 Rofstad의 연구보고에 의하면20)

Melanoma를 증식함에 있어서 in vivo와 in vitro 조건에서

Figure 2. Proliferation constants of the CRL-1888 mouse tumor cell for hyperthermic incubation test.

온열치료효과 분석을 위한 CRL-1888 마우스 종양 세포주의 배양 온도 변화에 따른 증식 특성 연구 33

Vol. 12, No. 1

열민감성의 차이가 나타나기 때문에 CRL-1888을 사용하여 동

물모델을 구성하여 온열치료 연구를 실시할 경우에 반드시 시

험방법의 영향도 고려할 필요가 있다고 사료된다.

세포증식에 관한 타 연구자들의 결과들을 종합하면 세포마다

배양온도를 변화시키면 증식특성이 변화됨을 알 수 있다. 이와

같이 세포의 종류와 배양온도 조건에 따라서 세포의 증식 특

성이 다르게 됨을 보고하고 있지만 세포나 조직의 열 민감성

을 정량화한 보고를 발견하지 못하였다. 본 연구에서 제시된

세포의 증식특성계수 k 값이 양의 값에서 음의 값으로 변화되

면 세포증식을 더 이상 기대할 수가 없다. 그러므로 증식특성

계수 k 값이 천이되는 온도를 온열치료 유효온도라고 정의할

수 있으며, 이러한 증식특성계수 k를 사용하면 세포마다 고유

한 배양 천이온도를 정량화할 수가 있게 되어 효과적으로 온

열치료계획을 수립할 수 있을 것으로 사료된다. 증식특성계수

k 값을 비교하면 세포 종류와 배양조건의 변화에 따라서 나타

나는 증식특성을 쉽게 비교할 수 있을 것으로 판단된다.

이상의 결과로부터 CRL-1888 세포주는 39oC에서 가장 활발

한 증식 특성을 나타내며 42oC 이상의 온도에서 온열치료 효

과를 기대할 수 있는 증식특성계수 k 값이 음수로 전환됨을

알 수 있으며 CRL-1888 세포주로 종양모델을 유발하고 온열

치료를 실시할 경우에는 42oC 이상의 온도로 유지하여야 온열

치료효과를 기대할 수 있을 것으로 판단된다.

Figure 3. Photographs of the proliferated CRL-1888 for 48 hours at six different temperatures; (a) 36oC, (b) 37oC, (c) 39oC, (d) 41oC, (e) 43oC,and (f) 45oC (×200, bar: 10 µm).

34 황은미·김영곤

Biomaterials Research 2008

결 론

CRL-1888 종양세포를 사용하여 배양온도와 시간을 달리하며

배양시험을 실시한 결과 증식된 세포의 수 N과 배양시간 t는

일정한 관계식이 성립되며 관계식은 LogN = LogN0 + kt로 표

시할 수 있다. 온도 증가에 따라서 증식특성인자 k의 부호가

음으로 변화되는 온도를 세포들이 지닌 고유한 온열치료 특성

온도라고 간주할 수가 있다. CRL-1888 종양세포의 경우 39oC

에서 k 값이 0.021로 가장 크게 나타나며 42oC 이상의 온도

에서 k값이 음의 값으로 전환되기 때문에 CRL-1888 세포로

동물시험 모델을 구성하고 침입형 임플란트로 온열치료를 실시

할 경우에는 적어도 42oC 이상의 온도로 가열하여야 효과적인

온열치료 효과를 기대할 수 있다.

감사의 글

본 연구는 2006년 사업자원부 지역산업공통기술개발사업의

지원으로 이루어졌으며 이를 감사드립니다.

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