CIENCIAS GENMICAS CRISTALIZACIN DE PROTENAS EN MEDIOS DIFUSIVOS1 Juan Manuel Garca Ruiz, Fermn Otlora Muoz Una tcnica imprescindible para comprender el funcionamiento de las macromolculas biolgicas. 1 http://lec.ugr.es/mundo_cientifico/texto.htm Lacristalizacindegrandesmolculas biolgicas es un problema de gran dificultad queseabordautilizandodesdelasteoras clsicasdecrecimientocristalinohastalas ltimastecnologasdeinvestigacin espacial. Su importancia reside en que es el pasoineludibleparadesvelarlaestructura ntima y para comprender el funcionamiento deestasmolculas,protagonistas indudables de la ciencia del siglo XXI.Cristales de Protena... Para qu? Elconocimientodelaestructura moleculartridimensionaldeuncompuesto es a menudo la condicin sine qua non para avanzarendeterminadaslneasde investigacin, particularmente en ciencia de materiales,qumicaybioqumica.Durante estesiglo,sehanidodesarrollandouna seriedetcnicasespectroscpicasyde difraccinparaladeterminacindela estructuraaescalaatmicadelamateria. Desafortunadamente,conformeaumentala complejidaddelamolcula(engeneralel nmerodetomos),lacantidadde informacinexperimentalnecesariapara elucidarsuestructuratambinaumenta haciendoque,paraunadeterminada tcnica,primerosepierdaprecisinenel clculo y, posteriormente, se haga imposible determinarlaestructura.Lastcnicasbasadas enladifraccindelosrayosXpor monocristales son actualmente las que con ms eficaciaproporcionanlainformacinnecesaria paraladeterminacindeestructuras moleculares,permitiendoelclculocasi rutinariodelaestructuradepequeas molculas y siendo las nicas disponibles para abordarlaestructuradelasgrandes macromolculasbiolgicas(Figura1).Para hacernos una idea de esto, basta con echar una ojeada al ProteinDataBank (la mayor base de datosdeestructurasdemacromolculas biolgicas,http://pdb.ccdc.cam.ac.uk/):allhay registradas 8278 estructuras (a fecha de hoy) el 82.1%delascualessehaobtenidopor difraccin de rayos X, el 15.6% por Resonancia MagnticaNuclear(NMR)yel2.3%hansido propuestas por modelos tericos. Hastaaqulasbuenasnoticias,lamalaes que, a partir de un determinado compuesto, no siempreesfcil(oinclusoposible)obtenerun cristaldeltamaoycalidadsuficientespara realizarunexperimentodedifraccinderayos X.Significaestoquehemoscambiadoun problema por otro? No, aunque a primera vista asparezca.Losproblemasconque tropezamoscuandointentamoscristalizarun compuesto, por descorazonadores que puedan resultar,nuncasondebidosaunalimitacin fundamentalirresolubledelatcnica,sinoal desconocimientoolacomplejidaddela fisicoqumicadelasinteraccionesaescala molecularoalusodetcnicasde cristalizacinnoadecuadasencadacaso concreto. Porquestandifcilobtenercristales adecuadosdedeterminadoscompuestos? Cuandosecristalizaunasustancia,loque hacemos es favorecer que las molculas se ordenenenunentramadoperidico tridimensional.Enesaordenacinjuegan fundamentalmentedosprocesos consecutivoseneltiempo.Elprimerode ellos es el transporte de las molculas hacia lascarasdelcristalpordifusino conveccin,mientrasqueelsegundoesla incorporacin de esas molculas a aquellas posiciones sobre la superficie del cristal que mejorseadaptanalordenperidico tridimensional.Elxitodelacristalizacin est pues ligado ntimamente a la velocidad relativadelosprocesosdetransportede molculashaciaelcristalyde reordenamientodelasmismasenla superficiedelcristal.Tetris,unvideojuego tanpopularcomoadictivo,ilustraala perfeccinesteimportanteconcepto2[1].En este juego nos enfrentamos al reto de apilar enlaparteinferiordelapantallaunaserie depiezasdediferentesformasquecaen desdelapartesuperioraunavelocidad creciente.Enestaanaloga,elapilamiento ordenado de piezas representa la estructura deuncristal,laspiezasquecaen corresponden a las molculas o unidades de crecimiento(habitualmenteoligmeros)en lasolucin,lavelocidadalaquecaenlas piezasrepresentalacinticadetransporte delasunidadesdecrecimientohaciael cristal y la pericia del jugador representa la cintica de superficie del cristal. J ugando al Tetris se puede comprobar la importancia de larelacin"velocidaddetransporte"/ "cintica de superficie" ("velocidad de cada defichas"/"periciadeljugador")enla calidad del cristal resultante. Si llamamos J el nmero de piezas por unidad de tiempo que caen,paravaloresdeJ pequeos,eljugador, porpocahabilidadquetenga,tienetiempode trasladarlasy/orotarlasparaqueseacoplen perfectamente a las posiciones adecuadas para formarunagregadocorrecto.AmedidaqueJaumenta,laspiezascaenamayorvelocidady aljugadorleserdadavezmsdifcil colocarlasenposicincorrecta,porloque empiezaaaparecerciertogradodedesorden con huecos cuyo nmero ser mayor a medida queJ aumenta,esdecir,elcristalquese obtieneesmsdefectuoso.Enellmite,a valoresdeJ muyaltos,aljugadorleresulta imposibleapilarlaspiezascorrectamenteylo queobtieneesunamontonamiento desordenado,esdecirunslidoamorfo. Resumiendo, si queremos crear una estructura peridicaperfectanecesitamossuministrarlas unidadesdecrecimientoaunavelocidadms lentaquelanecesariaparaquestasse coloquen en la posicin correcta.Lapregunta,portanto,esCulesta velocidadptima?Tetrisnosproporcionala respuesta correcta: si la velocidad de cada de fichasestanaltaquenopodemosordenarlas, perdemos enseguida y nos aburrimos; en el otro extremo, si las fichas caen a una velocidad tan bajaquenossobramuchotiempodespusde rotarydesplazarlaficha,tambinnos aburrimos(enTetrishayunateclaparadejar caerunafichaqueyaestacorrectamente orientada;desafortunadamenteconlas molculasenunasolucinesonofunciona). Porlotanto,elexperimentodecristalizacin ideal ser aquel en el que las molculas lleguen alasuperficiedelcristalconvelocidadigualo menoraladesureorganizacinenla superficie.Elproblemaencualquiercasoes asegurarqueeltransportedemolculashacia el cristal sea lo ms lento posible. Por eso, los grupos de crecimiento de cristales tratamos de utilizarmediosdifusivos.Ladifusin,el mecanismodetransportedemasamslento, consiste en un flujo direccional que se produce, curiosamente,debidoalmovimientoaleatorio (nodireccional)delasmolculasaescala microscpicadentrodeungradientede concentracin. Para hacer que los procesos difusivos dominen el transporte de masa de talformaqueselimiteeltransporte convectivo,muchomsrpidoycatico, existen dos posibilidades: a)hacerquelasfuerzasgravitatoriassean de menor intensidad que otras fuerzas no direccionales.Enlaprcticaseusan fuerzascapilaresconfinandolasolucin en volmenes pequeos dentro de a1)capilares(porejemplocapilaresmuy transparentesalosrayosX,que puedenutilizarsedirectamenteparala obtencin de datos estructurales).a2) geles, puesto que el entramado slido deungel,queencierraunsistema poroso relleno de un fluido, permite la difusindereactivosalavezque reduceenormementeelefectodelas fuerzasgravitacionalessobrela solucin. b)crecerloscristalesenmicrogravedad, una tecnologa costosa que an tiene un ciertonmerodeproblemasaresolver peroqueobviamenteeselescenario ideal(elmslimpio)pararealizar experimentosenmediosdifusivos tridimensionales.Pero esto no es todo Todaslastcnicashabitualesde cristalizacinpuedenimplementarse utilizando cualquiera de estas posibilidades. Asegurandounmediodetransportede masa difusivo, bastara pues seleccionar las condicionesinicialesidneasparaalcanzar lentamentelasobresaturacinadecuada paralacristalizacin.Culessonesas condicionesidneas?Esteeselprincipal problemadelcrecimientodecristalesylas tcnicashoyendautilizadaspara resolverloconsistenenelmejordelos casosenunscreeningdelascondiciones experimentales o simplemente en el ensayo y error, lo que en ambos casos significa cientos o miles de experimentos hasta dar con el juego de condiciones ptimas. En nuestro laboratorio hemos desarrollado en los ltimos aos una tcnica de crecimiento de cristalesquesepuedeimplementartantoen capilares como en geles o en el espacio y que reduceyenalgunoscasosevitaesatediosa bsqueda.Latcnicasebasaenla contradifusindelcompuestoquesequiere cristalizar y de su agente precipitante, es decir elcompuestoutilizadoparadisminuirla solubilidaddelcompuestoacristalizar.Su implementacinnecesitaportantodedos recipientes,enunodeellossecolocauna solucin del compuesto a cristalizar y en el otro unasolucindelagenteprecipitante.Ambos recipientesseconectanatravsdeuntercero queserellenaconunlquidoquenointerfiera enlareaccindeprecipitacin,porejemploel solventeutilizadoparapreparalassoluciones. Eltrucoenestatcnicaconsisteenescoger unascondicionesinicialesquemantenganel sistemalejosdelequilibrio,esdecirjustoal contrariodeloquehabitualmentesehaceen losexperimentosdecristalizacin.Si conectamosambosrecipientes,lasdos solucionesempezarnadifundirunacontrala otra.Debemosasegurarqueunadelasdos (concretamenteladelagenteprecipitante) avance ms rpido de tal forma que invada a laotra.Enelcasodelacristalizacinde macromolculas,elhechodequelaconstante dedifusindelamacromolculaseamucho mayorqueladesuagenteprecipitante (habitualmente una sal) asegura este requisito. Enelcasodecompuestoscondifusividades similaresalosdesuagenteprecipitante,el mismoefectoseconsigueaumentandola concentracinrelativadelagenteprecipitante. Elsegundorequisitoesprovocarunafuerte precipitacintanprontoseencuentrenambas soluciones,demaneraqueseformeun precipitadoamorfo.Estoseconsigue simplementeutilizandounasolucinconuna concentracinmuyaltadelcompuestoa cristalizar. Si nos aseguramos (tercer requisito) dequelacmaradeprotenasea suficientemente larga, la tcnica estar lista para funcionar. La Figura 2 muestra el funcionamiento de estatcnica.Hastaquelasdossoluciones noseencuentran,tansoloexisteun transportedemasaalolargodelreactor, hacialaderechaelagenteprecipitante, hacia la izquierda la protena, se produce un mximo de sobresaturacin que se desplaza enladireccinenquelohaceelreactivo que difunde ms rpido (en este caso la sal) (figura2,arriba).Lasobresaturacindel compuestoacristalizardependerdela solubilidaddelcompuestoenfuncindela concentracindelagenteprecipitante.Tan pronto como ambas soluciones se mezclan, lasobresaturacincrecerpidamente puestoquelascondicionesinicialesestn muyalejadasdelequilibriohastaque alcanzaelvalorcrticoparalanucleacin delcompuestoproducindoseun precipitadoamorfo.Estaprecipitacin provocalacadalocaldelvalorde sobresaturacinhasta1(equilibrio)al reducirselaconcentracindelreactivoque estprecipitando.Comoelagente precipitanteviajamsrpido(primer requisito),unsegundomximode sobresaturacin se producir algo ms a la izquierda que la sobresaturacin crtica para lanucleacinmslentamenteloque provocarlaformacindeunprecipitado algomsordenado,unprecipitado policristalino.Elnuevomximode sobresaturacinsedesplazarnuevamente hacia adelante y su velocidad de avance se hacemslenta,porloqueacontinuacin precipitarn algunos cristales pequeos. En laiteracindeesteprocesohaciael equilibrio, el sistema terminar encontrando unascondicionesenlasqueseformarn grandescristalesaisladosdeptima calidad.Elefectoglobalesportantouna ondadesobresaturacinqueavanzaalo largo del recipiente que contiene la solucin delcompuestoacristalizarprobandoun ciertonmerodecondicionesde cristalizacinhastaencontrarlas condicionesptimasdesobresaturaciny velocidaddeavancedelasobresaturacinsin tenerquerecurriratediososexperimentosde screening. Usando capilares Paraimplementarunsistemade contradifusinenmedioscapilareshemos ideado,especialmenteparalacristalizacinde protenas,unatcnicamuysencilla.Enprimer lugar,sepreparaungelenunrecipiente.Una vez que ste ha gelificado, se rellena un capilar delosutilizadoscorrientementepararayosX conlasolucindeprotena,ysesellaunode susextremosconceradeabejaoconun materialplstico.Acontinuacinsepinchael capilar en el gel de tal forma que se mantenga perpendicular a la superficie del gel y se vierte sobrestalasolucindeagenteprecipitante. Con esta tcnica que denominamos "Mtodo de AcupunturaenGel"porrazonesobvias,se consiguenexcelenteresultadosconcapilares de dimetro menor de 0.6 mm, puesto que con mayoresdimetrosnoesposibleevitarlos flujosconvectivos.Conellahemosconseguido cristales que llegan a rellenar completamente el dimetrodelcapilar(Figura3). Sorprendentemente,cuandoestoocurresu crecimientonosedetiene,puestoquela estructura atmica de los cristales de protena, con enormes poros, permite a las molculas del agenteprecipitantedifundira travs del cristal, que continua creciendo puesto que el cristal no taponaelaccesodelagenteprecipitante.As hemoslogradocrecercristalescilndricosde numerosas protenas de hasta 12 mm de largo. Lacalidaddeestoscristaleseslamsalta conseguida hasta el momento. Usando geles Siqueremosobtenercristalesdemayor dimetro(quenolongitud)sehandeutilizar solucionesgelificadas,puestoqueaumentarel dimetrodelcapilaraumentaratambinla contribucin del transporte convectivo. Los dos tipos de gel ms utilizados son los de agarosa (ungeltrmicodepolimerizacinreversible)o los de slice (un gel qumico irreversible). La implementacindeunsistema contradifusivo es tambin fcil en este caso. Basta con gelificar la solucin de la protena alpHadecuado(quevaraconcada protena), se coloca entonces sobre ella una solucin gelificada al mismo pH sin protena ni agente precipitante y, finalmente, se vierte sobre este ltimo gel la solucin del agente precipitante.Elgelidealparaestetipode experimento sera un entramado poroso que nointeraccionaraconlasmolculasde protenasniconladelagenteprecipitante. Aunque se consiguen resultados adecuados utilizandogelesdeslicefabricadoscon tetramethoxisilanoogelesdeagarosade bajo contenido en sulfato, este gel ideal no existe actualmente. Usando microgravedad Finalmente,latcnicadecontra-difusin puede ser implementada sin usar geles y sin limitaciones de espesor si los experimentos serealizanencondicionesdegravedad reducida en aviones de vuelo parablico, en cohetes sondas, en lanzaderas espaciales o enestacionesorbitales.Enlaslanzaderas espaciales,losvaloresdelagravedadson entrediezmilyunmillndevecesms pequeosqueenlasuperficiedelatierra, porloquelasedimentacines prcticamentedespreciablealigualquela conveccinquesegenerapordiferencias dedensidaddentrodelasolucin.El transportedemasaesportanto prcticamentedifusivo,unescenarioideal paraexperimentosdecristalizacin.De hecho, desde hace diez aos, las agencias espacialesdeEuropa,Amrica,China, J apnyCanadvienenrealizando experimentosdecristalizacindeprotenas encondicionesdemicrogravedad.Los resultadoshansidoengeneral prometedores,peroanquedamuchopor comprenderantesdepoderexplotar comercialmentelacristalizacinde protenasenlaEstacinInternacionaldel Espacio(ISS)queentraren funcionamientoenel2002.Elefectodela aceleracin residual, la recogida de cristales, la dependenciadelacalidadcristalinasobrelos mecanismosespecficosdecrecimiento,etc., sonproblemasanabiertos.Trasvariosaos deinvestigacinespacialencrecimientode cristalesdemacromolculasporpartede gruposdetodoelmundo,elvolumende informacindisponibleestalcanzandoun volumencrticoquepermiteempezara comprenderyaislaralgunospuntoscruciales para el futuro de las tcnicas de microgravedad. Elprximooctubre,lalanzaderaespacial DiscoverydelaNASAenlamisinSTS-95, llevarabordounaseriedeexperimentosde distintosgruposeuropeosfinanciadosporla AgenciaEspacialEuropeaquegenerarn nueva informacin sobre la cristalizacin de las protenasenelespacio.Losexperimentosse llevarn a cabo en la APCF (Advanced Protein Crystallization Facility), un instrumento diseado yconstruidoenEuropa(verrecuadro"La APCF").Enestevuelovamosarealizaruna seriedeexperimentos,continuacinlgicade nuestros trabajos en tierra y de un vuelo previo en 1996 (LMS, misin STS-78), encaminados a comprenderlosprocesosdecontradifusinen microgravedadylosfactoresquelosafectan. Puestoqueelobjetivodelosexperimentoses comprendermejorlafsicadelprocesode crecimiento,hemosseleccionadoparasu realizacinunaseriedeprotenas"modelo" (lisozima,ferritinayapoferritina)conun comportamientofisicoqumicobastantebien conocido. Experimento1.Gradientedeconcentracin alrededor del cristal En primer lugar, es imprescindible tener una visinclaradelosgradientesdifusivosquese forman alrededor de los cristales en crecimiento como consecuencia del consumo de molculas de protena por parte del cristal. Este gradiente, ascomosucomportamientoduranteel crecimiento son fundamentales para entender el rgimen cintico en que crece el cristal, lo que a suvezcondicionarlasventajas,entrminos decalidaddecristal,obtenidasalcrecerel cristal en microgravedad. STS-95 ser la segunda misin en la que laAPCFvolarequipadaconun interfermetroMach-Zehnderparaestudiar laconcentracindelosreactivosdentrode lacmaradeprotena.Elinterfermetro Mach-Zehnder basa su funcionamiento en la separacindedoshacescoherentesde lser con frente plano, uno de los cuales se hacepasaratravsdelasolucinque queremos estudiar. Despus de atravesar la solucin,elfrentedeondaestar distorsionadodebidoalasvariacionesdel ndice de refraccin en diferentes partes de lasolucincondiferentesconcentraciones delosreactivosy,alrecombinarloconel haz de referencia, se observa un patrn de interferenciasquecontieneinformacin sobre la concentraciones de los reactivos en diferentespartesdelasolucin.Los resultados de interferometra que obtuvimos delaprimeramisinen1996,indicanel gran potencial de esta tcnica, pero tambin hacenpatenteslasdificultadespara interpretarlosresultadosenexperimentos "normales"conlosreactoresdelaAPCF. En particular, el alto nmero de cristales que se suelen obtener, el hecho de que stos se muevan(verexperimento3)ysupequeo tamaohacendifcilelanlisisdedatos interferomtricos.Parasubsanarestos problemas, realizaremos un experimento en elqueunsolocristal,completamentefijo, crezcaapartirdelasolucin.Estoser posibleusandoporprimeravezenel espacio tcnicas de inseminacin (seeding). Elprincipalproblemadelastcnicasde inseminacinconcristalesdeprotena consisteenlaestabilidadmecnicadelos cristales,extremadamenteplsticosymuy pocoresistentes.Parasolucionaresto hemosdesarrolladounatcnicapara obtener cristales reforzados de protena este reforzamientoseobtienencreciendolos cristalesenunamatrizgelificada (contradifusinengeles)aalta concentracin, con lo que el entramado del gel queda incluido dentro del cristal de protena reforzndolo. Este cristal reforzado es recrecido dentrodelreactorcuandoelexperimentose activa.Paraevitarquelanucleacindeotros cristalesinterfieraenlasmedidas,las condicionesexperimentalesseajustarndetal maneraquenoseproduzcanucleacinde nuevoscristalessinoslocrecimientodela semilla. Experimento 2. Movimiento de cristales. Unavezestablecidoungradientealrededor delcristal,elcrecimientodelcristalcontinuar enunrgimenestablecontroladopordicho gradienteyquecondicionarlacalidaddel cristal.Paraestoescondicinindispensable que el cristal permanezca fijo con respecto a la solucin, algo que intuitivamente cabra esperar delosexperimentosenmicrogravedad.Sin embargo,comopusimosdemanifiesto recientemente,apesardequelosnivelesde gravedadexistentesdurantelosexperimentos enlaAPCFsondeentrediezmilsimasy millonsimasdeg,loscristalessemueven duranteelexperimento.Estehechohasido explicadocualitativamenteapelandoalas pequeasaceleraciones(residualymareal)a queestsometidoeltransbordadorespacial durantesurbitaascomoalaspequeas aceleraciones"accidentales"aqueseve sometida la nave debido a la actividad a bordo de la misma. Ningn estudio cuantitativo ha sido realizadohastaahora,enpartedebidoala dificultad en la correlacin de datos y a que las imgenesobtenidassonproyecciones bidimensionales del experimento, con lo que se pierdeinformacinsobrelatrayectoria tridimensionaldeloscristales.Paraobtener valorescuantitativosdelosvectores desplazamiento,locualesimprescindiblepara intentar correlacionar correctamente los valores deaceleracinconlosmovimientosdelos cristales,esnecesarioteneralmenosdos imgenes de la cmara de protena obtenidas a diferentengulo.Aestefin,diseamosun nuevo reactor APCF que, gracias a un sistema dedobleperiscopio,permiteobtenerdos imgenesdelexperimentodesdedirecciones perpendiculares(Figura9).Estosreactores tambinpuedenserusadospararealizar reconstruccionestridimensionalesde cristales en crecimiento. Para la realizacin deesteexperimentoesnecesariodisponer deunregistroaceleromtricoqueaporte valores cuantitativos de las aceleraciones a las que se ve sometida la APCF durante el vuelosegntresdirecciones perpendiculares. En este experimento se crecern cristales delisozima,ferritinayapoferritina;la primeradeellashasidoseleccionada porqueyadisponemosdedatossobre movimiento de cristales de lisozima mientras quelasotrasdoshansidoseleccionadas portenerelmismohabitocristalinopero diferentesdensidades,unasituacinideal para estudiar la repuesta de los cristales al mismo entorno de aceleraciones. Experimento3.Cmarasdecrecimiento largas. Comoyadijimos,unodelosrequisitos paralarealizacindeexperimentosque explotentodaslasventajasdela contradifusinesquelacmarade crecimientosealarga.Estoesnecesario para que la "onda de sobresaturacin" tenga espacioparaavanzarbuscandolas condicionesidneasparaelcrecimientode loscristales.Unodelosresultadosms sorprendentesdenuestrasinvestigaciones previasconreactoresAPCFesqueel tiemponecesarioparalahomogeneizacin del agente precipitante dentro del reactor es inferior(enlascondicioneshabitualmente utilizadas) al tiempo necesario para obtener ncleos cristalinos. Por ello, a pesar de que losreactoresAPCFsedisearonpara implementartcnicasdifusivasde crecimientodecristales,sufuncionamiento noaprovechalascaractersticasdelas tcnicas de contradifusin. Esteexperimentoserealizarusando reactoresexpresamentediseadosen nuestrolaboratorioparadisponerenlaAPCF decmarasdecrecimientolosuficientemente largascomoparamantenerungradientede contradifusindelaprotenayelagente precipitanteduranteuntiemposuficientemente largocomoparaquelaprecipitacindelos cristalesseproduzcasiguiendoelpatrn espaciotemporaltpicoenlosexperimentosde contradifusin.Estereactor,queocupael espacio de tres reactores convencionales, tiene una cmara de protena con una longitud de 67 mm, un orden de magnitud mayor que ninguna cmara disponible para crecimiento de cristales demacromolculasenelespacioypuedeser observado mediante vdeo e interferometra. Observandoelprocesodecrecimientode cristalesenestosreactoresascomolos gradientesdelosreactivosinvolucrados (medianteinterferometra)ycomparandoestos resultadosconlosobtenidosentierrausando otrasimplementacionesdelastcnicasde contradifusin(gelesycapilares)yconlas simulacionesdeordenadorcompletaremos nuestra visin de las tcnicas de contradifusin yestaremosmscercadesercapacesde adaptar las tcnicas de crecimiento de cristales demacromolculasenmediosdifusivosalos requerimientoscadavezmsaltosparala explotacintantocientficacomocomercialde estas tcnicas. La APCF LaAdvancedProteinCrystallisationFacility (APCF)esellaboratorioenminiaturaconque se ha dotado la Agencia Espacial Europea para desarrollarlacristalizacindegrandes molculasbiolgicasencondicionesde microgravedadenEuropa.Estelaboratorioha sidoutilizadopreviamenteencuatromisiones desde1993pordiferentesgruposde investigacinpararealizarexperimentosa bordo del transbordador espacial de la NASA y previsiblementecontinuaroperandoenel mduloeuropeodelaEstacinOrbital Internacionalapartirdelao2000,donde estaracompaadoporundesarrolloms reciente, la Protein Crystallisation Diagnostic Facility (PCDF) actualmente en su fase final de diseo. LaAPCF,construidaymantenidapor DornierGbmHesuncontenedor automatizado de unos 40 Kg que puede ser montadoenelShuttlemiddeckdel transbordadorespacialdelaNASA,yel Express rack de la ISS. La agencia espacial Europea dispone de dos modelos de vuelo. En el interior de cada uno de ellos, hasta 48 experimentos(12deellosconobservacin devdeoeinterferometra)puedenser realizadosenreactoresespeciales construidosparaimplementarlastres tcnicasdecrecimientodecristalesde protenasdisponiblescuandosediseola APCF, esto es: dilisis, difusin de interfase libreygotacolgante.Losexperimentos comienzansimultneamenteconlapuesta enmarchadelaunidadacargodel especialistademisinunavezenrbita, conloquecomienzalaejecucindeuna secuenciapreprogramadadepasosque incluyenlaactivacindelosreactores, diferentes operaciones de comprobacin de condicionesexperimentales,laadquisicin deimgeneseinterferogramasdealgunos delosreactoresy,finalmente,la desactivacin de los reactores. Tras el aterrizaje del transbordador, la APCF esdesmontadadelrackyabierta,los reactoressonextradosyenviadosbajo condicionescontroladasalosgruposde investigacinparaestudiarloscristales obtenidos.Algntiempodespus,los gruposdeinvestigacinquetenan asignados recursos de observacin en vdeo ointerferometrarecibenunCD-ROMcon las imgenes obtenidas durante el vuelo. Y este es el material de que se dispone para estudiar que pas durante el experimento. Para saber ms: A.DucruixyR.Giege(eds),ProteinandNucleic AcidCrystallization.APracticalApproach;IRL Press: Oxford, 1992 A.Macpherson,PreparationandAnalysisofProtein Crystals. Krieger Publ. Malabar, Florida, 1989. J .Drenth,PrinciplesofProteinX-RayCrystallography, Springer Verlag Publ.,1994.Nuestra pgina web