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Contrôle du trafic intracellulaire des glycoprotéines d'enveloppe au cours de la morphogenèse virale.

Exemple du VIH-1.

Denys BRANDINSERM ERI 19: « Virus, pseudovirus: morphogenèse

et antigénicité » -Université de Tours

Contrôle du trafic intracellulaire des protéines d'enveloppe virale au cours de la morphogenèse du VIH-1

I- Généralités sur la morphogenèse du VIH-11- structure du VIH-1

bicouche lipidique empruntée à la cellule hôte

gp 120 SU

gp 41 TM

enveloppe

gp 41 TM

réverse transcriptase (RT)

matrice (p17 MA)

capside (p24 CA)

intégrase (IN)

ARN

nucléoprotéine

nef

tat

vpuvpr

vif

env

pol3‘ LTRgag5' LTR

rev


Précurseur gagp55

Matricep17

Capsidep24

Nucléocapsidep15

p9 et p6

Précurseur pol

Protéase

Transcriptase inverseP64/p53

Int égrase

Précurseur envgp160

Glycoprotéine de surface gp120

Glycoprotéine transmembranaire

gp41

Organisation du génome proviral

RRRRôle essentiel dansôle essentiel dansôle essentiel dansôle essentiel dans

l’assemblage et lel’assemblage et lel’assemblage et lel’assemblage et le

bourgeonnemmentbourgeonnemmentbourgeonnemmentbourgeonnemment

viralviralviralviral


2- Cycle de multiplication dans la cellule

corécepteur

récepteur CD4

Fusion

SSSSite de bourgeonnement ite de bourgeonnement ite de bourgeonnement ite de bourgeonnement

viral ?viral ?viral ?viral ?

Rétrotranscription

ADN proviral

Intégration ARN viralGAG-POL

RE - Golgi

ENV

Bourgeonnement

gp160 (synthèse RE)�� maturation (Golgi) + clivage (protéase cellulaire) et transport vers la surface cellulaire = trimère d’hétérodimères gp120 SU-gp41 TM (oligomères)


3- Assemblage et bourgeonnement viral

Rôle du précurseur Gag (myristilé). Assemblage Gag (Gag-Pol). Bourgeonnement (similitude avec le bourgeonnement vésiculaire observé dans les endosomes tardifs/MVB = machinerie de sortie des protéines endosomales ou endosomes tardifs/MVB = machinerie de sortie des protéines endosomales ou machinerie ESCRTs ″″″″Endosomal Sorting Complexe Required for Transport″″″″).

Matrice

. Région N-terminale du précursseur Gag = protéine de matrice- myristilation + domaine basique = association aux membranes cellulaires (« radeaux lipidiques »)- incorporation des glycoprotéines d’enveloppe

Précurseur Gag


Cellules BHK-21 infectées par un réplicon SVF exprimant les protéines de capside du VIH-1

(microscopie à balayage)SSSSite de ite de ite de ite de

bourgeonnement bourgeonnement bourgeonnement bourgeonnement

viral ?viral ?viral ?viral ?QuickTime™ et un

décompresseur TIFF (non compressé)sont requis pour visionner cette image.

Avis divergents selon les études:- uniquement à la membrane plasmique(Jouvenet et al., 2006, Welsch et al., 2007)

- uniquement dans les endosomes tardifs (Dong et al., 2005, Perlman & Resh, 2006)

- dépendant du type cellulaire(Ono & Freed, 2004, Grigorov et al., 2006)


4- Glycoprotéines d'enveloppe = rôle primordiale dans le cycle de multiplication virale

�� Entrée du virus dans la cellule hôte

�� Morphogenèse virale

gp41TM x 3

gp120SU x 3 Mécanisme permettant l’incorporation des

glycoprotéines d’enveloppe à la surface de virions ?

Dépend de la gp41

La glycoprotéine transmembranaire gp41 TM


domaine domaine domaine

gp 41gp 120

3 domaines :- domaine extracellulaire (peptide de fusion, oligomérisation de l’enveloppe)- domaine transmembranaire (ancrage)- domaine cytoplasmique: 150 aa (VIH, SIV) = différent des autres rétrovirus (20 à 40 aa)

domaine extracellulaire

domaine transmembranaire

domainecytoplasmique

Rôle du domaine cytoplasmique de la gp41 TM du VIH-1

� conformation de l’ectodomaine� capacité à induire la fusion� incorporation de l’oligomère d’enveloppe dans le virion = infectivité et


� incorporation de l’oligomère d’enveloppe dans le virion = infectivité et multiplication dans les cellules�� 2 modèles :

. incorporation passive (réalisation de « pseudotypes ») ?ou. interaction spécifique entre domaine cytoplasmique gp41 TM et GAG (délétions à l’extrémité C-terminale de la gp41 TM = �� incorporation, mutations domaine N-terminal GAG (matrice) = �� incorporation, polarisation du bourgeonnement, interaction directe entre gp41TM et matrice)

� contrôle du trafic intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe

Rôle du domaine cytoplasmique de la gp41 TM du VIH-1

domaine domaine domaine

gp 41gp 120


LLP-2 LLP-1

2 groupes de motifs

- LLP1 et LLP2 (« Lentivirus Lytic Peptide »): régions hydrophobes organisées en hélice ∝ qui pourraient s’associer à la membrane plasmiqueRôle notamment dans la capacité à induire la fusion de la gp41 et l’incorporation des glycoprotéines d’enveloppe

- motifs impliqués dans la régulation du trafic intracellulaire des gp d’enveloppe




Motif tyrosineY712SPL

Motif dileucine

LL

Motif Y802W803

Motifs impliqués dans le trafic intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe





1 motifs tyrosine de type YXXØ (Y: tyrosine, X: aa quelconque, Ø: aa hydrophobes), 1 motif diaromatique (YW), 1 motifs di-leucine de type LZ (L: leucine, Z: aa hydrophobe de type L, I, M) (liste non exhaustive)

Motifs tyrosine, diaromatique et dileucine = contrôle du trafic intracellulaire des protéines transmembranaires


II- Trafic intracellulaire des protéines transmembranaires1- Les signaux de trafic

� Deux grands familles de signaux de trafic intracellulaire ont été caractérisées: caractérisées:

�� motifs tyrosine de type YXX Ø (Ø: aa hydrophobe)ou NPXY (N: asparagine)

� Rôle dans l’internalisation des protéines transmembranaires,� Rôle dans le transfert des protéines transmembranaires vers les endosomes précoces (transferrine), vers les endosomes tardifs (recépteur au mannose 6-phosphate), vers l’appareil de Golgi (TGN38),� Rôle dans le ciblage vers le pôle basolatéral des cellules épithéliales polarisées


�� motifs di-leucine de type LZ (Z: aa hydrophobes L, I, M)

� Présents dans le domaine cytoplasmique de protéines telles que CD3γ, CD4, chaîne invariante du CMH, CXCR4, Nef (HIV), etc…� Même rôle que les motifs tyrosine

�� autres signaux

� « cluster » acide (répétition d’aa acides). Rôle dans le transfert des protéines des endosomes vers le Golgi (furine, glycoprotéine E (VZV), etc…)� doublet de résidus aromatiques FW.Rôle dans le transfert des protéines des endosomes vers le Golgi (MPR)� motif de conjugaison à l’ubiquitine.Rôle dans l’internalisation et le transfert des protéines notamment vers les lysosomes (récepteur à l’hormone de croissance, etc…)


AP2

endosomes

tardifs (MVB)

AP3

2- Les vésicules de transport

Différents types de vésicules selonla localisation intracellulaire:

. Vésicules à clathrine de type AP2=

med transcis

AP2Endosomes

précoces

AP1

AP3. Vésicules à clathrine de type AP2= Localisées à la membrane cytoplasmique (endocytose de protéines de la membrane plasmique vers les endosomes précoces)

. Vésicules à clathrine de type AP1= Localisées au niveau du TGN et des endosomes(transport entre ces deux compartiments)

. Vésicules à clathrine de type AP3= Localisées au niveau du TGN et des endosomes(transport entre TGN/endosomes et lysosomes)


3- Les complexes d’adaptine

Différentes vésicules à clathrine selon le type de complexe d’adaptine associé aux triskelions

µ1ββββ1

σσσσ1

γγγγ

complexe d’adaptine associé aux triskelions de clathrine

� AP1(chaîne lourde γ, β1, chaîne moyenne µ1, petite sous-unitéσ1)

� AP2(chaîne lourde α, β2, chaîne moyenne µ2, petite sous-unitéσ2)

� AP3(chaîne lourde δ, β3, chaîne moyenne µ2, petite sous-unitéσ3)

� AP4

µ2ββββ2

σσσσ2

αααα

µ3ββββ3

σσσσ3

δδδδ


Recrutement des protéines dans les vésicules à clathrine viales complexes d’adaptine

complexes d’adaptine

membrane plasmique

Protéine transmembranaire

� Interaction du complexe d’adaptine à la foisavec le triskelion de clathrine (sous-unité β) et avec le domaine cytoplasmique des protéinesmembranaires (chaînes µ des complexes AP1,AP2 (motifs YXX Ø) et AP3; chaînes ββββ)

Puits recouvert de clathrine

clathrine

Vésicules à clathrine


III- Trafic intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe du VIH-1

1- Interaction de la glycoprotéine d’enveloppe avec les complexes d’adaptine

Motifs très conservés entre les différents isolats viraux




Motif dileucine

LL


viraux

µ2-adaptine ββββ2-adaptine

Complexe AP-1 et AP2

Complexe AP-2


1.1- Exemples de techniques utilisées pour mettre en évidence les interactions gp41 TM/complexes d’adaptine et ses conséquences sur le trafic intracellulaire des gp d’enveloppe

domaine de liaison

domaine d’activation

chaînes des complexes

gp41TM domaine cytoplasmique

� Système double hybride dans la levurechaînes des complexes

d’adaptine


Interaction avec les complexes AP2

(chaîne µ2)

Berlioz-Torrent et al., J Virol. 1999.

Plus d’interactionpour la gp41TM

avec une mutationdu motif tyrosine

Y/A

Système double hybride dans la levure

� « GST pull down »(protéine de fusion avec la glutathion-S-transférase + protéines étudiées (épitope « flag »), incubation avec complexes AP ou chaînes isolées = purification sur colonne (glutathion) et WB)


Berlioz-Torrent et al., J Virol. 1999.

� Microscopie confocale


Distribution intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppeBerlioz-Torrent et al., J Virol. 1999.

� Microscopie confocale « co-localisation »


Distribution intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe

Blot et al., J Virol. 2003.

1.2- Impact des interactions glycoprotéines d’enveloppe/complexes d’adaptine sur le trafic, la distribution intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe et la multiplicationvirale

� Interaction motif tyrosine/AP-2 : endocytose des gp d’enveloppe présentes à la surface


� Interaction motif tyrosine/AP-2 : endocytose des gp d’enveloppe présentes à la surface cellulaire vers les endosomes- Mutation Y/A = � endocytose et � de l’expression de surface des gp

� Interaction motif LL/AP-1 : implication dans la circulation des gp entre l’appareil deGolgi et les endosomes


� Interaction gp41TM/complexes AP - impact sur la multiplication virale:

� ciblage des gp d’enveloppe (et du bourgeonnement viral) vers un pôle de la cellule (cellules polarisées MDCK, neurones) - ciblage contrôlé par le motif tyrosine

� mutation motif tyrosine (Y/A) = � infectivité et capacité réplicative du virus (lignées T, PBMC)

Day et al., J Virol. 2004.


2- Interaction des glycoprotéines d’enveloppe avec TIP47

� TIP 47 (tail-interacting-protein of 47 kDa) : de quoi s’agit’il ?

- assure (en association avec Rab-9-GTP) le retour des récepteurs du mannose-6 phosphate des endosomes tardifs vers le réseau trans-golgiendes endosomes tardifs vers le réseau trans-golgien

- reconnaît le motif F-W porté par le domaine cytoplasmique du récepteur du M6P

- reconnaît un motif diaromatique Y-W dans le domaine cytoplasmique de la gp41 du VIH-1

(Berlioz-Torrent et al., J Virol. 2003)




Motif dileucine

LL


Motif Y802W803


2.1- Exemples de techniques utilisées pour mettre en évidence les interactions gp41 TM/TIP-47 et ses conséquences sur le trafic intracellulaire des gp d’enveloppe

� Système double hybride dans la levure

� « GST pull down »


� Microscopie cofocale - Distribution après internalisation (transport rétrograde)


Incubation avec l’anticorps

primaire à 0°C

Incubation 1 h

Marqueur TGN

Incubation 1 hà 37°C

Fixation, perméabilisation

etincubation avec

l’anticorps secondaire

Microscopieconfocale

Marqueur TGN


2.2- Impact des interactions gp41 TM/TIP47 sur le trafic, la distribution intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe et la multiplication virale

� TIP-47 est impliqué dans le transport rétrograde des gp d’enveloppe des endosomes

vers le Golgi

TIP-47 est indispensable à la multiplication du VIH-1 dans la cellule et à son infectivité


� TIP-47 est indispensable à la multiplication du VIH-1 dans la cellule et à son infectivité

Cinétique de multiplication en cellule Jurkat Western-Blot anti gp-120

Pas d’incorporation de gp d’enveloppe

dans le virion


3- Bilan des signaux

connus pour contrôler


AP2

endosomes

tardifs (MVB)

AP3 TIP-47 connus pour contrôler

le trafic intracellulaire

des gp d’enveloppe

du VIH-1 = circulation

des gp entre TGN et

surface cellulaire med transcis

AP2 (motif YSPL)Endosomes

précoces

AP1 (motif LL)

AP3 TIP-47 (motif YW)

Peu de gp d’enveloppe à la surface cellulaire, bonne l’incorporation des gp dans les virions,éviter la dégradation dans les lysosomes


4- TIP-47 est un « connecteur entre Gag et les glycoprotéines d’enevloppe


Distribution intracellulaire des gp d’enveloppe(circulation des gp entre golgi et surface cellulaire)

GolgiEndosomes précoces

Endosomes tradifs (MVB) Surface cellulaire

Quels sont les autres signaux impliqués dans le trafic et la distribution intracellulaire des gp d’enveloppe ???

Problématique des glycoprotéines d’enveloppe de certains virus primaires/souches adaptées


TGN46 Enveloppe Superposition

Etude de la distribution intracellulaire des glycoprotéines d’enveloppe de virus primaires� Microscopie confocale « co-localisation »

VirusNL4-3

adapté

Virus523

primaire


IV- Trafic intracellulaire d’autres glycoprotéines d’enveloppe virale

� Nombreux rétrovirus (autres que les lentivirus) = signaux de trafic intracellulaire dans leur gp d’enveloppe

�� motif tyrosine�� motif tyrosine- rétrovirus humain HTLV-1 (régulation de l’expression de surface,polarisation du bourgeonnement)- oncorétrovirus MLV (virus de la leucémie murine) (polarisationdu bourgeonnement)- BLV (virus de la leucémie bovine) (infectivité virale et maintien d’unecharge virale élevée)- RSV (Rous sarcoma virus) - MPMV (Mason-Pfizer monkey virus)

�� motif tyrosine

- Herpesviridae


. Glycoprotéine E du HSV et glycoprotéines gE et gI du VZVLocalisées dans le TGN = résultat d’un trafic permanent entreTGN, endosomes et surface cellulaire (motifs tyrosine + autres signauxde tri)


Conclusion

� Virus = exploitation des différentes fonctions cellulaires et notamment de la machinerie permettant le trafic des protéines

Perspectives:Perspectives:

- poursuivre la caractérisation du trafic intracellulaire des gp d’enveloppe

- évaluer l’impact du trafic sur la morphogenèse virale

- analyser l’effet des autres protéines virales sur le trafic des gp (Nef par exemple dansle cas du VIH-1)

contrôle du trafic intracellulaire des glycoprotéines d ...etumaster.icmv.free.fr/cours/3.2/db...

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