controle de qualidade biológico e microbiológico de produtos farmacêuticos e cosméticos teste de...
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Controle de Qualidade Biológico e Microbiológico de Produtos Farmacêuticos
e Cosméticos
Teste de Endotoxinas bacterianas
Prof. Fernando Henrique Andrade Nogueira
Teste de Endotoxinas bacterianas
É considerado um método alternativo ao dos coelhos (USP XX – 1980)
Mais rápido e mais sensível → endotoxina
Teste in vitro – ausência da resposta fisiológica do animal ao pirogênio.
Dúvidas quanto à deteção de pirogênio não oriundo de bactérias Gram (-)
Teste de Endotoxinas bacterianas
O lisado do amebócito do caranguejo Limulus polyphemus coagula em contato com endotoxinas bacterianas
O sangue do caranguejo é drenado e centrifugado
Os amebócitos são separados e lisados com o uso de solução hipotônica ou métodos mecânicos
O lisado é então estabilizado e liofilizado, sendo estável por 3 anos a 4 oC
Teste de Endotoxinas bacterianas
Princípio da técnica:
Reação enzimática entre o lisado (LAL) e a endotoxina resultando em coagulação
Temperatura ótima – 37 a 39 oC
pH ótimo – 6,0 a 7,0
Teste de Endotoxinas bacterianas
Materiais:
Todos os materiais devem ser apirogênicos (30 minutos a 250 oC ou equivalente)
Água reagente para LAL: deve-se utilizar água estéril para injetáveis ou outra que não reaja com o LAL no limite de sensibilidade deste
Teste de Endotoxinas bacterianas
Os reagentes são disponibilizados em kits
Reagente LAL: padronizado para detectar 0,03; 0,06; 0,125 e 0,25 unidades de endotoxina (UE) por ml
A quantidade de LAL utilizada é fixa (0,1 ml)
Pode ser congelado a -4 oC e utilizado em até 4 semanas
Teste de Endotoxinas bacterianas
Endotoxina bacteriana: reconstituir com 5 ml de água estéril e apirogênica e agitar em vórtex por 5 minutos. Guardar em 2 a 8 oC por até 4 semanas
São preparadas diluições seriadas do padrão de endotoxina para a determinação da sensibilidade do lisado (LAL) e para comparação no teste propriamente dito.
Teste de Endotoxinas bacterianas
Amostra: deve ter o pH ajustado para a faixa de 6,0 a 7,5; a menos que citado diferentemente na monografia
Podem ser empregadas soluções apirogênicas e estéreis de NaOH ou HCl 0,1 M ou mais diluídas
Teste de Endotoxinas bacterianas
Método semi-quantitativoConfirmação da sensibilidade do LAL (antes do
teste)
Sensibilidade do LAL: menor quantidade de endotoxina detectável pelo reagente
Teste realizado em quadruplicata
Controle negativo: água + LAL
Teste de Endotoxinas bacterianas
Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste)
Diluições seriadas do padrão de endotoxina compreendendo 0,25; 0,5; 1 e 2 vezes a sensibilidade rotulada (λ) do lisado
Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml Concentrações de endotoxina: 0,03; 0,06; 0,12 e
0,24 UE/ml
Teste de Endotoxinas bacterianas
Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste)
Incubar por 1 hora a 37 oC
Reação positiva: gel firme mesmo quando invertido a 180º
Reação negativa: não forma gel firme ou forma gel viscoso que não mantém a integridade quando invertido
Teste de Endotoxinas bacterianas
Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste)
Ponto final – maior diluição da endotoxina que apresenta resultado positivo
Sensibilidade do lisado = antilogaritmo da média dos 4 pontos finais convertidos em log
Deve estar entre 0,5 e 2 vezes a sensibilidade rotulada do lisado (λ)
Teste de Endotoxinas bacterianas
Confirmação da sensibilidade do LAL (antes do teste)
Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml10-1,075 = 0,08 UE/ml; de acordo (0,06 – 0,24)
Réplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03 Ponto final Log10 do ponto final 1 + + + + 0,06 -1,222 2 + + + 0,12 -0,921 3 + + + + 0,06 -1,222 4 + + + 0,12 -0,921
média = -1,0715
Teste de Endotoxinas bacterianas
Teste propriamente dito
A quantidade do reagente LAL é a mesma em todos os tubos (0,1 ml)
A endotoxina é diluída em série geométrica que deve compreender a faixa de 0,5 a 2 λ
A amostra é diluída em série até que o ponto final seja alcançado
Teste de Endotoxinas bacterianas
Teste propriamente dito
Soluções preparadas em duplicata (exceto o controle negativo)
Agitar levemente os tubos e incubar a 37 oC por 1 hora. Os tubos não podem sofrer vibração
Reação positiva, negativa e ponto final da mesma maneira que no teste de sensibilidade do lisado
Teste de Endotoxinas bacterianas
Teste propriamente dito
Controle negativo: água + LAL
Controle positivo da amostra: endotoxina + amostra + LAL – verificar a interferência da amostra com a sensibilidade do lisado – 0,5 a 2 λ
Padrão: diluições endotoxina + LAL - 0,5 a 2 λ
Amostra: diluições produto + LAL → UE/ml
Teste de Endotoxinas bacterianas
Cálculos e interpretação
Sensibilidade do lisado - antilogaritmo da média dos 2 pontos finais convertidos em log
Concentração de endotoxina na amostra: sensibilidade rotulada do lisado multiplicado pela diluição da amostra na última reação positiva
A concentração de endotoxina na amostra deve ser inferior à especificada na monografia individual
Teste de Endotoxinas bacterianas
Exemplo: Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml Controle negativo: água + LAL Controle positivo da amostra:
10-0,921 = 0,12 UE/ml (0,06 – 0,24)
Réplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03Ponto final
Log10 do ponto
final
1 + + + 0,12 -0,921
2 + + + 0,12 -0,921
média = -0,921
Teste de Endotoxinas bacterianas
Exemplo: Sensibilidade rotulada do lisado (λ) = 0,12 UE/ml Controle positivo – padrão
10-1,072 = 0,08 UE/ml (0,06 – 0,24)
Réplicas 0,50 0,25 0,12 0,06 0,03Ponto final
Log10 do ponto
final
1 + + + 0,12 -0,921
2 + + + + 0,06 -1,222
média = -1,072
Teste de Endotoxinas bacterianas
Exemplo: Sensibilidade rotulada do lisado (λ)= 0,12 UE/ml Amostra: 10-1,054 = 0,088 // 1/0,088 = 11,4
Réplicas 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64Ponto final
Log10 do
ponto final
1 + + + 1/8 = 0,125
-0,903
2 + + + + 1/16 = 0,0625
-1,204
média = -1,054
Teste de Endotoxinas bacterianas
Cálculo da concentração de endotoxina
Multiplica-se a concentração de endotoxina pela sensibilidade do lisado rotulada (λ)
0,12 x 11,4 = 1,37 UE/ml
Esse valor deve ser inferior ao especificado na monografia individual
Teste de Endotoxinas bacterianas
Máxima diluição válida (MDV)
A amostra não pode ser diluída indefinidamente. Prejuízo da detecção de endotoxina
Se o limite é expresso em UE/mg ou UE/UI, utilizar a fórmula acima
Se o limite é expresso em UE/ml, basta dividi-lo por λ
lisadodorotuladaadeSensibilid
produtodoãoConcentraçendotoxinadeLimiteMDV
Teste de Endotoxinas bacterianas
Máxima diluição válida (MDV)
O resultado da diluição da amostra não deve ser maior que a MDV → mais diluído que a MDV
Pode se utilizar reagente LAL de sensibilidade maior, permitindo soluções amostra mais diluídas
lisadodorotuladaadeSensibilid
produtodoãoConcentraçendotoxinadeLimiteMDV
Teste de Endotoxinas bacterianas
Fatores críticos para o teste utilizando LAL:
Tempo: 60 ± 2 minutos. Temperatura: 37 ± 1 oC (banho-maria ou estufa)
Não expor os tubos a vibrações – resultados falso-negativos
pH: 6,0 a 7,5. Perda de sensibilidade do lisado
Perda de água por evaporação - concentração
Teste de Endotoxinas bacterianas
Fatores críticos para o teste utilizando LAL:
Concentração adequada de cátions divalentes – já adicionados no reagente LAL