control of viral safety for medicinal products by deep ...€¦ · i have no potential conflicts of...

Control of Viral Safety for Medicinal Products

by Deep Sequencing Technology

Keisuke YusaKobe University

CASSS Symposium

Dec 12, 209 @ Tokyo Marriott Hotel

COI Disclosure

Keisuke Yusa, Kobe University

I have no potential conflicts of interest in relation to this presentation

Agenda

1. Conventional tests for endogenous viruses and adventitious viruses

2. Endogenous retrovirus generated from CHO cells

3. Fetal bovine serum as raw material and its safety

4. Virus testing by deep sequencing technology (NGS, HTS, MPS)

Virus Substrate Source Product or Company Reference

MVM(Minute Virus of Mice)

BHK cells Contaminated FCS Wellcome Foot-and- Mouth Disease Vaccine Laboratory

Nettleton & Rweyemamu, 1980

Bluetongue Virus Undisclosed Unknown Multivalent modified live vaccine against canine distemper virus, adenovirus, and parvovirus vaccines

Akita et al., 1994

EHDV(Epizootic Hemorrhagic Disease Virus)

CHO Cells Contaminated raw material Bioferon GmbH & Co. Recombinant protein for phase I clinical trials

Burstyn, 1996

MVM CHO Cells Contaminated raw material Pulmozyme®, Genentech Garnick, 1996

Vesivirus 2117 CHO cells Contaminated FBS Boehringer IngelheimPharmaceuticals

Oehmig et al., 2003

Reovirus Unprocessed bulk harvest (CHO cells)

Contaminated FBS Undisclosed Nims et al., 2006

CVV (Cache Valley Virus) CHO cells Contaminated FBS Undisclosed Nims et al., 2008

Vesivirus 2117 CHO cells Contaminated raw material Cerezyme® and Fabrazyme®, Genzyme

Genzyme Corporation, 2009

Porcine circovirus rotavirus vaccineRotaTeq (Merk)Rotarix (GlaxoSmithKline)

Gilliland et al., 2012

Viral Contamination Related to Cell Lines and Human and Animal Biologics

Risk of Virus Contamination for Biotechnological Products

Construction of cell bank Cell Culture Purification process

Transfection of the expression plasmid

Selection of clones

Cell bank

WCB (frozen vial)

Culture volume expansion

Production culture

Culture fluid

Unprocessed bulk (centrifugation/depth filtration)

Chromatographic purification-Low pH treatment -Virus filtration

Drug substance• Virus-infected cells are used

to generate cell banks.• Virus is used for establishment

of cell lines.• Cell bank inherently produce

endogenous virus like particles.• Cells are contaminated

through raw materials used for cell culture.

• Cells are contaminated with adventitious viruses when manipulating.

• Purification substrate is

contaminated with virus.

• Intermediate is contaminated

with virus when manipulating

• Cells are contaminated through raw materials.

• Cells are contaminated with adventitious viruses when manipulating.

Virus tests for cell bankTesting for viruses in unprocessed bulk

Evaluation and characterization of viral clearance

Cell Bank System• In order to use the same material for all of production, cell substrate should

be frozen and stored as cell bank. → MCB (Master Cell Bank)

• WCB (Working Cell Bank) should be prepared from MCB. The cell bank

system ensures a stable quality of products.

Gene transfer /

Cloning /StoreMCB WCB

実験器具イラスト

ELISAキットZIPファイルです(1.7M)

エッペンチューブエッペンチューブ８連PCRチューブ

８連PCRチューブ遠心管： 15ml 遠心管： 50ml 寒天培地

寒天培地：菌寒天培地２寒天培地２：菌ピペット

96ﾏｲｸﾛｳｪﾙﾌﾟﾚﾄーマウス用ゾンデ注射器注射器：採血

カラムセットトリミングしてお使い下さい

シーケンサー蛋白結晶化ﾌﾟﾚﾄー蛋白質析出

Beluga for vet students

T-75フラスコ

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product manufacturing

CAL (Cells at the limit of in vitro cell

age used for production)

➢ Cell bank is a common substrate for biopharmaceuticals, vaccines, gene therapeutic products,

and cell based products,

➢ For viral safety of the final products, virus testing of cell bank is indispensable.

Transfection/ cloning/amplification and stock

MCB WCB

Virus Testing for Cell bank










T-75フラスコ

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MCB

• Tests for retroviruses

• In vitro assay

• In vivo assay

• Antibody Production tests

• Cell specific virus tests

Thawing &

expansionPurification

process

WCB/CAL

• Tests for retroviruses

• In vitro assay

• In vivo assay

CAL (Cells at the limit of in vitro cell age used for production)

Virus testing for Cell Bank

>$64,000~$73,000

(>7~8,000,000 yen)

>2 month

Test

In vitro assay • CPE (cytopathic effect) observation of MRC-5 cells with cell lysate• CPE (cytopathic effect) observation of Vero cells with cell lysate

(hemagglutination (HA) / adsorption test at endpoint)

In vivo assay • Adult mice inoculated with cell lysate and collect organs in 28 days• Suckling mice inoculated with cell lysate in 14 days, and the cell lysate is inoculated in

adult mice in 28 days• Allantoic cavity of chick embryonated eggs inoculated with cell lysate, and HA test

(chicken, guinea pig, human type O erythrocytes). Inoculation of cell lysate into yolk sac of eggs and observed for 10 days

Retrovirus assay • S+L- Focus assay using mink S+L- cells (Xenotropic mouse retrovirus test)• Extended XC plaque assay using SC-1 cells (Ecotropic mouse retrovirus test)• Observation of cells with transmission electron microscope to detect presence of

retrovirus particles• Reverse transcriptase activity in cell lysate

Tests for viruses derived from bovine

• CPE (cytopathic effect) observation of Bovine turbinate cells with cell lysate for 14 days.

Current Virus Testing

• ICH Q5A provides the design of viral tests and experiments for

the assessment of viral clearance.

• The conventional virus tests require time, high cost and BSL2

facilities/technical experts to use alive viruses.

• A virus detection window of each assay is restricted.

Agenda





Endogenous Retrovirus

CHO cell derivatives have been broadly used as cell substrate

due to their advantages for production of recombinant proteins,

however, they constitutively produce retrovirus-like particles

(RVLPs).

RVLPs Generated from CHO and Murine Hybridoma

表２ CHO細胞とハイブリドーマに見られるウイルス様粒子の比較

CHO murine hybridoma

Localization cytoplasm intracellular vesicles

Cell culture fluid ＜103-106 /mL ~106-108 /mL

Infectivity not infectiouspositive in S+L- focus assay/not infectious to human and primate cells

Adamson, S.R.: Dev Biol Stand, 93, 89-96(1998).

Endogenous Retrovirus Genes Have Been Isolated from CHO Cells

but They Were not Responsible for RVLP Production

Sequence Similarities & size GenesLibrary and Cloning Probe

ERV RNA

references

CHIAP.ML10 0.95 kbpol (RNase) CHO VLP cDNA Library

MLV probe＋

Anderson et al. (1991) J.Virol.181: 311

CHIAP Ⅰ*

SW2 (68%) , 1.9 kbYL6 (69%) , 1.6 kb

p27-∆-envp27-∆-env

CHO cDNA library with Sirian hamster IAP probe ＋

Anderson et al.(1990) J.Virol. 64: 2021- 2032Anderson et al.(1991) Dev. Biol. Stand. 75:123-132

CHIAP Ⅱ*YL7 (54%) , 2.2 kbYL9 (59%) , 2.2 kb

p12-propro-rt

CHO cDNA library with Sirian hamster IAP probe

＋

Anderson et al.(1991) Dev. Biol. Stand. 75: 123-132

CHIAP34

6.4 kbgag, pro-pol, env

gag (1.6 kb ORF)-pol (1.1 kb ORF)-env (-)

CHO genomic librarySHIAP (H18, pol) probe

−

Dorner et al. J. Virol. (1991) 65: 4713-4719

U09104

ML2G, 9.6 kbgag, pro-pol, env

gag-pol-envNo gag ORF

CHO genomic library ML10 probe

＋

Lie et al. J. Virol. (1994) 68: 7840-7849

assemblytranscription translationbudding & release

>565 ERV copies in

C. griseus genome

estimated by

LTRharvest

62 ERV transcripts

containing gag like

seq in C. griseus

mRNA database

5 of 62 ERV

polypeptides from

gag ORF

3 of 5 ERV RNA

identified in VLPs

CHO Cells Generate 3 RVLPs: CHERV-1b, CHERV-2g, CHERV-3g

50 nm

CHERV-1b

CHERV-2g

CHERV-3g

Phylogenetic Tree of CHO RVLP Genes

CHERV-1

b

CHERV-2

g

CHERV-3

g

CHIA

P-3

4

U09

104

CHERV-1

b

CHERV-2

g

CHERV-3

g

CHIA

P-3

4

U09

104

0

2000

4000

6000

8000

10000

RN

A c

op

ies/m

L

CHO-K1 CHOΔRVLP

<1

Yuan et al., unpublished data

Endogenous Retroviruses from CHO K-1 Cells

• We found that three RVLP genes are still active to generate

RVLPs, and designated as CHERV-1b, CHERV-2g, and CHERV-3g.

• RVLP gene knockout CHO should be safer substrate for

manufacturing recombinant proteins and antibodies.

Agenda





➢ BVDV is a highly prevalent infection of cattle and its presence in

bovine serum cannot completely be avoided except in serum from

specifically controlled donor herds or from cattle from BVDV-free

geographic areas.

➢ Bovine polyoma virus (BPyV) is a common contaminant of bovine

serum.

EMA 2013. Guideline on the use of bovine serum in the manufacture of human biological medicinal

products (EMA/CHMP/BWP/457920/2012 rev.1)

FBS Is Highly Contaminated with Bovine Virus Nucleic Acids

Virus genomes are detected in 16 lots of fetal bovine serum

NZL GTM FRA IRL FRA FRA AUS USA unknown USA USA CHL CHL DMA FRA USA*

BRSV (bovine RS virus)

Paramyxovirus– – – – – – – – – – – – – – – – 0%

BTV (bluetongue virus)

Reovirus– – – – – – – – – – – – – – – – 0%

BVDV1（Bovine viral diarrhea virus 1）Flavivirus

+ + + + + + + + + + + + + + + + 100%

BVDV2（Bovine viral diarrhea virus 2）Flavivirus

+ + + + + + + – – + + + + + + + 88%

BPV1 (bovine papillomavirus）Papillomavirus

– – – – – – – – – – – – – – – – 6.3%

RV (reovirus)

Reovirus– – – – – – + – – – – – + – – – 12.5%

BAdV (bovine adenovirus)

Adenovirus– – – – – – – – + + – – – – – – 12.5%

Rabies virus

Rhabdovirus– – – – – – – – – – – – – – – – 0%

BPIV3 (bovine parainfluenza type3)

Paramyxovirus+ – – – – – – – – – – – – – – – 6.3%

BEV2 (bovine enterovirus)

Enterovirus+ – – – – – – – – + – – – – – – 12.5%

Bpylma (bovine polyomavirus)

Polyomavirus+ + + + + + + + + + + + + + + + 100%

CVV (Cache valley virus)

Bunyavirus– – – – – – – – – – – – – – – – 0%

Virus nucleotides were detected by sequencing or nested PCR．


1

10

100

1,000

10,000

100,000

1,000,000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

FBS

BV

DV

, R

NA

Co

py N

um

be

r /m

L

Virus Genomes Are Detected in 16 FBS Lots

BVDV1

BVDV2

detection limit

1

10

100

1000

10000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

FBS

Bo

vin

e P

oly

om

aV

iru

s

DN

A C

op

y N

um

be

r /m

L

detection limit


Viral Safety on Bovine Serum

Bovine serum should be tested based on FDA 9CFR113.53

or EMA/CHMP/BWP/457920/2012 rev.1, and gamma-

irradiated for minimizing the risk of virus contamination.

1. Title 9 of the Code of Federal Regulations(CFR 113.53

Requirements for ingredients of animal origin used for production

of biologics.

2. EMA 2013. Guideline on the use of bovine serum in the

manufacture of human biological medicinal products

(EMA/CHMP/BWP/457920/2012 rev.1)

Agenda





New Assay Technologies for Viral Safety

Are Described in Q5A

• The conventional assays described in ICH Q5A should be regarded as assay protocols recommended, but not all-inclusive or definitive.

• Since the most appropriate techniques may change with scientific progress, proposals for alternative techniques may be acceptable, when accompanied by adequate supporting data.

• Manufacturers are encouraged to discuss these alternatives with the regulatory authorities.

Q.

NGS is expected to provide a rapid, sensitive and

comprehensive test to detect virus nucleic acids.

Can we replace certain part of conventional virus

tests with an alternative test using NGS?

+ RNA – DNA + DNA

+ DNA

+ mRNA + RNA

– RNA

– RNA+ RNA

Targets of Virus Nucleic Acids by NGS

Retrovirus

Coronavirus

Flavivirus

Picornavirus

Toga virus

Calicivirus

Herpes virus

Adenovirus

Polyoma virus

Poxvirus

Hepadnavirus

Reovirus

Circovirus(– or ±)

Parvovirus(–, + or ±)

– DNA or

Bornavirus

Orthomyxovirus

Filovirus

Paramyxovirus

Rhabdovirus

Types and forms of nucleic

acids contained in virus

particles

Targets for Detection of Viruses in Infected Cells

viral DNA

Virus particle,vRNA or vDNA

•PCR •RT-PCR•RT activity•WB•ELISA

•TEM•PCR, •RT-PCR•TEM

Method

NDRNA virus

RNA virus and DNA virus are detecteddifficult to detect latent virus?

ND latent virus

NGS

Target

*sRNA is an alternative RNA pool for detection of virus.

viral RNAviruspolypeptide

ProvirusIntegrated retroviral genomeIn host genome

transcription translationassembly

budding release

ex.RetrovirusInfected cells

virusshape

Total RNA of Cell bank as Starting Material for Virus

Detection by NGS Method

Advantages:

• Both DNA virus and RNA virus can be detected.

• Diversity of host RNA (background including endogenous retroviral RNA) is always stable (ex. Human transcripts <~ 25,000).

Disadvantages:

• Detection of latently infected viruses may be difficult.

• The presence of virus nucleic acid does not always mean the presence of infectious viruses.

• Compared to the PCR method, it takes longer time.

RNA

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NextSeq 5 5 0システム

NextSeq 5 5 0システムは、全ゲノム、エクソーム、 RNA解析など次世代シーケンサー

にアレイスキャン機能を追加したハイブリッドシステムです。新しいNextSeq v2試薬

ではシーケンス試薬の最適化とクラスターケミストリーの改良に成功し、研究者が期待

するデータ品質を達成します。シーケンサーを用いた詳細な解析とマイクロアレイを用

いた低コストな解析を 1台で行うことができます。

● 特長

◆1ランでヒト全ゲノムシーケンスを可能にする唯一のデスクトップ型システム

◆クラスター形成、シーケンサーが一体となったコンパクトデザイン

◆カートリッジ型試薬キットとタッチパネルで簡単操作

◆選択可能なフローセルと迅速なランで、幅広いアプリケーションとサンプル数に対

応

◆アレイスキャナーとシーケンサーのハイブリッドシステム

● 仕様　最新の仕様はお問い合せください

シーケンサー

◆スループット：～1 2 0 Gb　約2 9時間

◆リード長： 1 5 0 b p×2

◆リード数：～8億（ペアエンド法使用時）

◆解析レーン数： 4レーン

◆ 解析サンプル数：最大3 8 4プレックス/ラン

アレイスキャナー

◆対応マイクロアレイ：細胞遺伝学アレイ　

フレキシブルパワー

サンプルに合わせて次世代シーケンサーとマイクロアレイを使い分け

■仕様

シリーズ NextSeq 5 5 0システム

型番 SY-4 1 5 -1 0 02

本体のサイズ

(W )x (D )x (H )m m5 3 4×6 3 5×58 4

重さ 8 3 kg

電源 1 0 0 V　 5 0 /6 0 Hz

希望小売価格お問い合わせ

※価格及び製品仕様は予告なく変更されることがあります。

※価格に消費税は含まれておりません。

※日本国内への販売に限らせていただきます。また、製品によっては、当社から直接販売ができない地域がございます。

※会社名及び製品名は各社の商標または登録商標です。

※製品の設置状況や付加機能を分かりやすく表現するため、製品に含まれない商品をあわせて掲載している場合があります。

※表示金額以外に運送費、荷造費、搬入・据付費、組立設置費などを別途加算させていただくことがございます。

※製品本来の使用目的に合わせてご利用ください。

※製品によっては理化学実験の専門的な知識を必要とするものがあります。

TOP 0 1 .遺伝子実験機器次世代シーケンサー

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次世代シーケンサー N e x tSeq 5 5 0システム

Cop yrig h t © SH IKOKURIKA CO.,LTD.










T-75フラスコ

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96ﾏｲｸﾛｳｪﾙﾌ゚ﾚーﾄマウス用ゾンデ注射器注射器：採血


シーケンサー蛋白結晶化ﾌ゚ﾚーﾄ蛋白質析出


エッペンチューブ

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NGS用検体RNA










T-75フラスコ

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2 h

2 h 3 h

2 d 3 d 1 w

total ~5 h

total >2 w

Technical improvements

will save time

Development of automatic data

processing will save time

Deep sequencing (NGS) currently requires longer time for virus detection

NGS

PCR

Detection of virus nucleic acids in a cell bank by deep sequence (NGS) method

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RNA-seq data~20-25 M

viral-y.3.2 (>16 x104 virus seq data)

detected virus seqs

Cost for sequencing reagent ¥of virus detection using NGS

(HiSeq 2500, Illumina)

Reagents / analysis 価格１sample

RNA purification

(RNeasy plus universal mini kit)

44,500 yen(50 samples） 890 yen

Template preparation kit T

(TruSeq RNA Sample Prep Kit v2)

628,000 yen(48 samples）

1,3083 yen

(=628,000/48)

Flow cell

(TruSeq SR Cluster Kit v3)

666,000 yen/run（RNA-seq, 20M reads; 9 samples/１

lane, 8 lane, 9 x 8 =72 samples/run)

9,250 yen

(=666,000/72)

Reaction reagent

(TruSeq SBS Kit v3 – HS, 50 Cycle)391,000 yen/run

5,430 yen

(=391,000/72)

RNA-seq virus detection data

analysis- yen

total (28,653＋α) yen

Cost for sequencing reagent: $263/ sequencing

Workflow for detection of adventitious virus sequences

Excluding simple repeat

sequences (sr-bg_1.0)

Remove cell-specific

background(cs-bg_3.0)

RNA-seq data

Identify viruses by

mapping etc.

Excluding reads from

host transcripts (hg38,

etc)

Detect virus-like reads

(viral-y3.2)

AdV93.32%

AdV63.32%

other virus-like 2.60%

FCV 32.95%

virus-like reads 0.36%73,356 reads


total 20,446,693 readsUninfected HEK293 cells

total 29,316,414 readsFCV-infected HEK293 cells

Detection of virus sequences in RNA-seq data(model cell: HEK293, model virus: FCV, 24 h p.i. at m.o.i. 1)

Host reads 98.37%Host reads

97.85%

other virus-like4.8%

unmappedreads 1.27%unmapped

reads 1.53%

HERV-K1.77%

HERV-K1.05%

Yuan & Yusa, unpublished data

0

1000

2000

3000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

0

1000

2000

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

FCVF4

FCVUrbana

Viral_y1.1

non-structural protein CDS structural protein CDS

Nu

mb

er

of R

ea

ds

Viral_y.2.1

Mapping of FCV reads hit by virus database viral-y.2.1


AdV93.32%

AdV63.32%

other virus-like 2.60%

FCV 32.95%



total 20,446,693 readsUninfected HEK293 cells

total 29,316,414 readsFCV-infected HEK293 cells

Detection of virus sequences in RNA-seq data(model cell: HEK293, model virus: FCV, 24 h p.i. at m.o.i. 1)

Host reads 98.37%Host reads

97.85%

other virus-like4.8%

unmappedreads 1.27%unmapped

reads 1.53%

HERV-K1.77%

HERV-K1.05%


Cell specific background reads are obstacles to identify true virus reads

• Uninfected cells have their specific background reads (endogenous virus reads, etc.).

• The background delay final decision of true virus contamination in RNA-seq data.

Adenovirus (93.32%):HEK293 cells inherently harbor partial AdV DNA

Others (4.8%): simple repeated reads, common reads shared between virus and mammalian, etc.

HERV-K (1.77%): all of HERV transcripts could not removed by hg38

ex. Background reads in virus-free HEK293 cells (0.36%, 73,356 reads):

E1A E1B

E1B 55K

IX19K

ITR repeat region

1 1000 2000 3000 4000

0

1000

2000

3000

4000

0 10000 20000 30000 40000 AdV 5

35,938 bp

1

Nu

mb

er

of R

ea

ds

Detected Adenovirus Reads Were Mapped in 4.5 kb of Viral Genome

1. HEK293 cell line was established by transfection with Adenovirus type 5 DNA from human fetal kidney (Graham FL et al. J. Gen. Virol. 36: 59–74, 1977)．

2. Adenovirus type 5 DNA (4.5 kb) is detected in chromosome 19 (Louis N et al. Virology 233: 423–429, 1997)．

3. The detected reads were derived from the transcripts of the inserted viral DNA.

Yuan & Yusa, unpublished data

BVDV Recombination with Bovine Transcript (1)

Becher, et al. J Virol. 1998, 72: 8697-8704.

BVDV CP Rit contains the sequence of bovine Ub and

ribosome 40S component protein S27a as a result of

recombination with ubi-S27a mRNA derived from the

host.

Npro C E E1 E2 NS2-3 NS4B NS5BNS5A

NS4AP7

NS4BNS4ANS3NS4BNS2-3 NS4A

S27aubi

(Ubi* 100%, S27a* >99% identity)

bovine ubi-S27a mRNA

BVDV CP Rit

BVDV

Total RNA prepared from a cell bank

rRNA removal

↓

NGS analysis

RNA-seq data

↓

Virus read extraction with virus data base viral-y3.2

Detection of virus sequences by NGS

Infectious virus

background

Cell-specific

background

subtraction

Infectious virus

detection

virus identification by mapping to

the viral genome

104

105

106

107

108

Nu

mbe

r of R

ea

ds

0

20

40

60

80

100

Re

ad

s o

f F

CV

(%

)

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

12 h p.i. 24 h p.i.

Efficient Concentration of Adventitious Virus Readsby Subtraction of Host Specific Background ( 1 )

RNA-seq data

subtract host transcripts (hg38)

extract virus reads (viral_y.2.1)

remove simple repeat reads (sr-bg_1.0)

subtract host specific background (293-bg_3.0)

1

2

3

4

5

identification of infected viruses

cell: HEK293, virus: FCV at 12 h and 24 h p.i.at m.o.i. 1

Conclusion

The model virus could be detected in RNA-seq data from the

infected cells. Subtraction of cell specific database efficiently

reduce pseudo positive reads.

Our virus detection pipeline using NGS provide a versatile

platform for control of viral safety for biologics including

biopharmaceuticals, gene therapeutic products and cell-based

products.

Acknowledgements

Yuan Yuzhe, Kobe University

Kazuhisa Uchida, Kobe University

Yoji Sato, NIHS

Yosuke Maeda, Kumamoto University

control of viral safety for medicinal products by deep ...€¦ · i have no potential conflicts of...

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