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Tecnol. & Ciên. Agropec., João Pessoa, v.11, n.3, p.5-10, set. 2017 5

Teores de compostos nitrogenados transportados na seiva do xilema de soja nodulada sob deficiência de oxigênio

Junior Borella1*, Denis C. Vieira1, Daniele P. Duarte1, José H. N. Flores1, Giovana H. N. F. Correa1

e Luciano do Amarante1 1Departamento de Botânica, Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas (UFPel), 354, CEP 96160-000, Pelotas, RS, Brasil.

([email protected]) *autor correspondente

Resumo - O objetivo deste trabalho foi avaliar os teores de ureídeos e aminoácidos na seiva do xilema de soja sob condições de hipóxia e pós-hipóxia. Os genótipos Fundacep 53 RR e BRS Macota foram cultivados em vasos de 3L contendo vermiculita como substrato em associação com Bradyrhizobium elkanii em casa de vegetação. No estádio R2 o sistema radicular das plantas foi submetido à hipóxia pelo encaixe de um segundo vaso sem perfurações e inundado com solução nutritiva diluída a 1/3 da concentração original, por oito dias. Posteriormente foram retirados os vasos sem perfurações para avaliação da recuperação. A seiva foi coletada no 2º, 4º, 6º e 8º dias após a inundação ou recuperação, juntamente com os controles. Os dados foram submetidos à ANOVA e quando houve ajuste das curvas foram submetidos à análise de regressão. Em ambos os genótipos os teores de aminoácidos e ureídeos decresceram com a hipóxia ao longo dos oito dias de inundação e restabeleceram os níveis pré-hipóxicos com a recuperação. O alagamento afetou a fixação do nitrogênio, diminuindo os teores de ureídeos e aminoácidos transportados no xilema e o retorno a normóxia restabeleceu as concentrações dos compostos nitrogenados aos níveis das plantas não alagadas, em ambos os genótipos.

Palavras-chave: alagamento, ureídeos, aminoácidos, hipóxia.

Contents of nitrogen compounds transported in the xylem sap of nodulated soybean under oxygen deficiency

Abstract – The objective of this work was to evaluate the levels of ureides and amino acids in the xylem sap of nodulated soybean under conditions of hypoxia and post-hypoxia. The genotypes Fundacep 53 RR and BRS Macota associated with Bradyrhizobium elkanii were grown in 3L pots containing vermiculite as substrate under greenhouse conditions. Root system of plants at the R2 stage was subjected to hypoxia by blocking drainage of the pot, fitting a second one without holes and flooded with nutrient solution diluted one-third of the original. The flooding of the plants was carried out for eight days and after the pot without drilling was removed for recovery assessment. Non-waterlogged plants were kept as control. Data were analyzed by ANOVA and regression analysis. The Fundacep 53 RR and BRS Macota genotypes decreased the amino acids and ureides level with hypoxia over the eight days of flooding and restored the pre-hypoxic levels with recovery. The flooding has affected N fixation, decreasing ureides and amino acids levels transported in the xylem sap and normoxia restored the nitrogen compounds levels as non-waterlogged plants, in both genotypes. Keywords: flooding, ureides, amino acids, hypoxia.

Introdução

Os compostos nitrogenados transportados no xilema para a parte aérea podem refletir mudanças importantes no metabolismo nitrogenado na raiz. Como exemplo do transporte de grandes quantidades de ureídeos, única fonte de N resultante da fixação simbiótica de nitrogênio em certas leguminosas noduladas, em comparação com a sua ausência quase total em plantas não noduladas dependentes da assimilação de nitrato (Amarante et al., 2006; Amarante & Sodek, 2006).

Em soja, ureídeos são produtos da fixação simbiótica de nitrogênio, sintetizados pelas plantas nos nódulos e exportados como fonte de nitrogênio para outros tecidos. Alantoína e ácido alantóico são as principais formas de nitrogênio no tecido vascular de plantas fixadoras de

nitrogênio (Filippi et al., 2007). Esses compostos são sintetizados através da via de oxidação da purina e levados a folha e outros tecidos onde são quebrados e reassimilados na forma de nitrogênio (Camargos et al., 2009; Duran & Todd, 2012). Juntamente com os ureídeos, plantas noduladas transportam pequenas quantidades de aminoácidos, enquanto que plantas não noduladas transportam aminoácidos e nitrato (Amarante et al., 2006).

As plantas muitas vezes respondem ao estresse por alagamento com mudanças no metabolismo do N, principalmente no transporte de aminoácidos e ureídeos (Sousa & Sodek, 2003; Amarante et al., 2006), essas mudanças ocorrem devido à deficiência de oxigênio essencial ao metabolismo do sistema radicular (Drew, 1997). A fixação do nitrogênio em leguminosas

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simbióticas é sensível ao alagamento em vista da exigência do oxigênio para o funcionamento da nitrogenase, bem como podem ocasionar reduções na nodulação (Bacanamwo & Purcell, 1999; Amarante & Sodek, 2006). Estudos em soja revelam um decréscimo severo no acúmulo de N e no crescimento das plantas em função da forte diminuição da fixação de N2 sob condições de alagamento (Bacanamwo & Purcell, 1999).

A composição de aminoácidos e ureídeos da seiva é uma importante ferramenta para a monitoração da resposta do metabolismo de N primário do sistema radicular ao estresse, no caso da soja pode ser utilizado como ferramenta para seleção de genótipos (Amarante et al., 2006). Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar as concentrações de ureídeos e aminoácidos totais transportados na seiva do xilema de duas cultivares de soja submetidas a diferentes períodos de inundação (condição de hipóxia) e de recuperação (condição pós-hipóxia) a fim de verificar as mudanças no metabolismo do N do sistema radicular.

Material e Métodos

O experimento foi conduzido em casa de vegetação da

Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Sementes de soja [Glycine max (L.) Merril] de dois cultivares, Fundacep 53 RR e BRS Macota, ambos de ciclo precoce, fornecidas pela Embrapa Clima Temperado, foram semeadas em vasos de polietileno furados de três litros, contendo vermiculita média expandida lavada como substrato inerte. Oito sementes foram semeadas por vaso e, após a germinação, no estádio V0 (Fehr et al., 1971), foi realizado o desbaste, permanecendo três plântulas por vaso, e a inoculação com Bradyrhizobium elkanii, estirpe Semia 587 (cedida pela FEPAGRO). A inoculação foi realizada por pipetagem de 2,5 mL de meio líquido contendo os rizóbios ao redor de cada plântula. As plantas de soja foram nutridas duas vezes por semana com solução de Hoagland & Arnon (1938) sem nitrogênio mineral, na proporção de 250 mL por vaso e irrigadas sempre que necessário. No estádio R2 (Fehr et al., 1971), o sistema radicular foi submetido à inundação, através do encaixe de um segundo vaso, de mesmo modelo e sem perfurações, nos vasos contendo as plantas. A inundação foi feita com solução nutritiva diluída a 1/3 da concentração original, de forma a se manter uma lâmina de 20 mm sobre a superfície do substrato.

O teor de O2 na solução nutritiva dos vasos do tratamento de inundação foi monitorado diariamente com o auxílio de um oxímetro (Handylab OX1). Para a avaliação da recuperação, foi retirado o vaso sem perfurações do vaso contendo as plantas, de forma a permitir a rápida drenagem da solução de inundação. A seiva do xilema foi coletada para a dosagem de ureídeos e aminoácidos totais no 2º, 4º, 6º e 8º dia após a inundação, sendo que, após as plantas terem sido

submetidas a oito dias de inundação, foi restaurada a normóxia por meio da drenagem do substrato e realizadas coletas de seiva no 2º, 4º, 6º e 8º dia para dosagem de ureídeos e aminoácidos no período de recuperação. Foi realizado um corte no caule da planta em forma de bisel, logo abaixo do nó cotiledonar, conforme descrito por McClure & Israel (1979). Os exsudados foram coletados por até uma hora (das 12 as 13h) com auxílio de microcapilares de vidro, e transferidos para tubos eppendorf, em banho de gelo, até o armazenamento final, a -20 ºC.

A dosagem de ureídeos foi realizada a partir dos exsudados do xilema pelo método Vogels & Van der Drift (1970). Uma alíquota de 250 μL de amostras de seiva ou dos padrões de alantoína (0-150 nmol), devidamente diluídos e um branco (água), foram transferidos para tubos de ensaio, sendo posteriormente acrescentado 0,5 mL de água destilada e 0,25 mL de NaOH 0,5 N. Em seguida, os tubos foram tampados com bolas de vidro e incubados em banho-maria a 100 ºC por 8 min e resfriados em água corrente. Posteriormente foi acrescentado 0,25 mL de HCl 0,65 N. Os tubos foram então aquecidos a 100 ºC por 4 min e novamente resfriados. Após o resfriamento foi acrescentado 0,25 mL de tampão fosfato (Na2HPO4-KH2PO4 0,4M pH 7,0), mais 0,25 mL de fenilhidrazina 0,33%. Após repouso por 5 min, os tubos foram submetidos a banho de gelo seguido de adição de 1,25 mL de HCl concentrado a 0 ºC, 0,25 mL K3Fe(CN)6 1,65% e agitados em vórtex. Após 15 min, foram lidas as densidades ópticas (D.O.) das amostras a 535nm.

A dosagem de aminoácidos solúveis totais (AAs) foi realizada pelo método de Yemm & Cocking (1955), usando 1 mL de cada amostra e/ou dos padrões de leucina (0 - 200 nmol mL-1), devidamente diluídos, de um branco (água) em tubos de ensaio, acrescentando-se 0,5 mL de tampão citrato 0,2 M (pH5,0), 0,2 mL de reativo de ninhidrina 5% em metilcelusolve, 1 mL KCN-2% em metilcelusolve e após agitação, cobriu-se os tubos com bolas de vidro, sendo incubados em banho-maria a 100 ºC por 20 min e posteriormente transferidos para o escuro até atingir temperatura ambiente. Após resfriamento foi acrescentado 1,3 mL de etanol 60% por tubo, sendo novamente agitados para posterior leitura de D.O. a 570 nm.

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 4 (regime hídrico x período de inundação ou recuperação), com quatro repetições. A unidade experimental consistiu de um vaso com três plantas. As médias obtidas foram submetidas à ANOVA e regressão, quando houve ajuste das curvas. As análises foram realizadas com o auxílio do programa SAS 8.0 (SAS Institute, 2000).


Resultados

Os valores de O2 monitorados na solução nutritiva caíram de 6,5 mg L-1 sob condições de normóxia, para 1,5 mg L-1 no primeiro dia de inundação do sistema radicular das plantas, chegando aos níveis de 0,5 mg L-1 no quarto dia de inundação e 0,35 mg L-1 no oitavo dia, caracterizando a hipóxia no sistema de cultivo (Fig. 1).

Figura 1. Teores de O2 na solução nutritiva sob cultivo de

plantas de soja Fundacep 53 RR e BRS Macota em normóxia e após indução da hipóxia ao longo de oito dias de inundação

As concentrações de ureídeos encontrados na seiva do xilema variaram ao longo do período de inundação (Fig. 2). O teor de ureídeos totais foi menor em relação ao controle em todos os períodos de inundação, demonstrando o efeito inibitório do alagamento sobre a fixação do N2, tanto para a cultivar Fundacep 53 (Fig. 2A) quanto para BRS Macota (Fig. 2C). Com o avanço do período do estresse hipóxico para além de dois dias de alagamento, o efeito inibitório sobre a fixação biológica do N2 foi intensificado e permanente ao longo do experimento. Durante a recuperação, o período de quatro dias foi suficiente para ambos os genótipos restabelecerem a atividade de fixação de N2 nos nódulos em níveis próximos aos seus respectivos controles, demonstrando que o período de oito dias de inundação não foi suficiente para perda da funcionalidade dos nódulos tanto em Fundacep 53 (Fig. 2B) quanto em BRS Macota (Fig. 2D).

Figura 2. Teor de ureídeos totais em seiva do xilema de genótipos de soja submetido a diferentes períodos de inundação

(A e C) e recuperação (B e D) do sistema radicular. *p0,05; n=4

As concentrações de aminoácidos solúveis totais encontrados na seiva do xilema variaram ao longo do período de inundação, sendo observada resposta diferenciada ao déficit de O2 no sistema radicular entre os dois genótipos de soja avaliados. Para a cultivar BRS Macota houve tendência de decréscimo dos teores de aminoácidos com a hipóxia do sistema radicular ao longo dos oito dias de inundação (Fig. 3C), em relação ao seu

controle. Já a cultivar Fundacep 53 RR não apresentou variação dos teores de AA quando ao longo dos oito dias de inundação, no entanto houve redução significativa dos teores comparados ao controle (Fig. 3A).

No período de recuperação, ambos os genótipos responderam de forma diferenciada, sendo a cultivar Fundacep 53 RR que melhor respondeu ao período de recuperação, restabelecendo mais rapidamente os níveis


de aminoácidos na seiva logo nos primeiros dias de recuperação (Fig. 3B). A cultivar BRS Macota, embora tenha restabelecido os níveis de aminoácidos em relação

ao controle, demorou mais que Fundacep, retornando aos teores normais apenas no quarto dia de recuperação (Fig. 3D).

Figura 3. Teor de aminoácidos solúveis totais em seiva do xilema de genótipos de soja submetido a diferentes períodos

de inundação (A e C) e recuperação (B e D) do sistema radicular. *p0,05; n=4

Discussão

Embora os níveis de O2 não tenham se exaurido completamente na solução nutritiva, mesmo após 8 dias de hipóxia (Fig. 1), a quantidade que pode ser aproveitada pelas raízes é praticamente desprezível, pois os teores de O2 decresceram a valores mínimos e a sua taxa de difusão em água é 104 vezes menor do que no ar (Armstrong et al., 1994; van Dongen et al., 2003; Zabalza et al., 2009; Bailey-Serres et al., 2012).

A atividade da nitrogenase está altamente correlacionada com a massa de nódulos e a nodulação da soja, a medida que cai a nodulação diminui o acúmulo de biomassa (Sánchez et al., 2011). Em soja, certas condições de estresse levam a mudanças marcantes na exportação de N do sistema radicular (Justino & Sodek, 2013). Plantas de soja noduladas mostram uma queda imediata na exportação de compostos nitrogenados (ureídeos e aminoácidos) para a parte aérea sob alagamento, atribuído a fixação de N2 prejudicada pela falta de oxigênio (Amarante et al. 2006). Esses dados corroboram com os resultados obtidos na figura 2 (A e C) e 3 (A e C), visto que o alagamento reduziu drasticamente tanto os teores de ureídeos quanto os de aminoácidos em ambos os genótipos aos dois dias de inundação,

mantendo os baixos teores dos mesmos ao longo do período de oito dias.

Os efeitos do alagamento sobre os teores de ureídeos e aminoácidos em ambos os genótipos foram semelhantes, com queda drástica dos teores e mantendo-se ao longo período de inundação, a exceção dos teores de aminoácidos para BRS Macota (Fig. 3C), para esse genótipo os efeitos da inundação não ocasionaram reduções dos teores logo aos dois dias de inundação e a queda dos teores foi intensificada ao longo do período de oito dias de inundação.

O alagamento ocasiona rápidas mudanças nos teores de aminoácidos, mudando a composição dos teores transportados via xilema. Queda dos teores de aminoácidos observados, pode estar estritamente relacionado a queda dos teores de glutamina (Gln), principal efeito sob condições de hipóxia, e sua diminuição está relacionada a quedas na atividade da enzima nitrogenase no nódulo, responsável pela fixação de N2 como descrito por Amarante & Sodek (2006) e Justino & Sodek (2013). Os efeitos negativos do alagamento sobre a atividade da nitrogenase têm sido muito investigados pela estimativa do conteúdo de nitrogênio fixado. Sánchez et al. (2011) demonstraram tal efeito pelo decréscimo do conteúdo de nitrogênio fixado


por um período de 14 dias de alagamento em plantas de soja noduladas.

Queda dos teores de Gln é acompanhado por quedas nos teores de ureídeos em espécies transportadoras de ureídeos (Amarante et al., 2006). Além de diminuições nos teores de Gln, variações nos teores de Ala, Gaba, Asp e Ser também podem ser observados, também associados às condições de hipóxia que afetam a respiração da raiz e do nódulo. Em trabalhos, observou-se um aumento dos teores de Ala, Gaba e Ser produzidos pelas raízes e transportados via xilema, formados a partir de Asp (Souza & Sodek, 2003; Narsai et al., 2011; Shingaki-Wells et al.; 2011).

Estudos recentes têm demonstrado a presença de quatro genes envolvidos na codificação da enzima alantoinase que catalisa a conversão de alantoína a NH3 para ser reassimilado, em plântulas de soja. Em condições de alagamento observa-se uma drástica redução da expressão dos genes e atividade da enzima alantoinase, levando a um acúmulo de alantoato (ureídeos) em soja (Duran & Todd, 2012).

Consequentemente, com o retorno às condições de normóxia após oito dias de alagamento, a plantas restabeleceram os teores tanto de aminoácidos quanto de ureídeos (Fig. 2 e 3). O tempo de recuperação também depende do período de exposição a que as planta são expostas (Justino & Sodek, 2013) e, como observado, o período de oito dias não comprometeu a integridade do nódulo, em ambos os genótipos, permitindo que com o retorno à normóxia a nitrogenase pudesse voltar a fixar N2 restabelecendo os níveis pré-hipóxicos e transportando esses compostos a parte aérea para serem reassimilados como fontes de N em ambos os genótipos, bem como evidenciado em demais trabalhos (Amarante & Sodek, 2006; Justino & Sodek, 2013).

Os dados sugerem que os compostos nitrogenados em soja nodulada são produtos diretos da fixação do N2 e é um indicador útil da fixação simbiótica em plantas, assim como o alagamento impõe uma restrição imediata à atividade de fixação do N2 devido à disponibilidade limitada de oxigênio.

Conclusão

A hipóxia leva a uma diminuição considerável nas concentrações de ureídeos e aminoácidos durante o período de inundação para os genótipos de soja Fundacep 53 e BRS Macota, efeito este não revertido durante a condição de alagamento. No retorno à normóxia, os nódulos retomam a fixação, levando ao restabelecimento das concentrações de ureídeos e aminoácidos aos níveis das plantas não alagadas, em ambas as cultivares.

Agradecimentos

Ao convênio Embrapa/Monsanto pelo apoio financeiro e a Fepagro pela concessão da estirpe Bradyrhizobium elkanii.

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