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Tese de DoutoradoDr. Mario Killner
Profa. Dra. Bernadette D.G. M. Franco
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Ciência dos Alimentos - Área de Bromatologia
Paralelos entre Métodos Fenotípicos, Imunológicos e
Genotípicos para Detecção Rápida de Salmonella spp em
Matizes Alimentares sem Contaminação Experimental:
Avaliação em Condições Reais e Simultâneas de Uso
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INTRODUÇÃO
Respostas rápidas: monitoração de processos de
produção e/ou produtos terminados;
Por quê métodos rápidos?
Redução de custos: performance (estocagem,
otimização de processos, segurança alimentar);
Facilidade de treinamento dos analistas.
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INTRODUÇÃO
Avaliações nem sempre foram realizadas com matrizes alimentares sem contaminação experimental;
Limitações dos trabalhos encontrados
Foram desenvolvidas em condições laboratoriais artificiais, não reproduzindo condições de trabalho de rotina.
Ausência de informações quanto a eventuais diferenças de desempenho dos kits, face à contaminação experimental ou artificial.
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OBJETIVO
1. Avaliar criticamente diferentes métodos de detecção de Salmonella spp em alimentos, nas seguintes condições de uso:
Matrizes naturais, sem contaminação experimental;
Emprego simultâneo dos sistemas em avaliação paraanálise de uma mesma amostra de alimento, tendo a ISO6579:2002, como método de referência;
2. Contribuir com informações adicionais, que possam subsidiar oslaboratórios na seleção de novos métodos para detecção deSalmonella spp em alimentos.
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MATERIAIS E MÉTODOS
Métodos e número de amostras de alimentos utilizados no estudo
Métodos Número de Amostras
ISO 6579:2002 244
BAX Salmonella 244
TECRA UNIQUE SALMONELLA 145
VIP Salmonella 85
Transia Plate Salmonella Gold 85
VIDAS Salmonella (SLM) 88
Singlepath Salmonella 87
1-2 Test 87
Total de análises realizadas 1.065
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Amostras sem contaminação experimental
MATERIAIS E MÉTODOS
Distribuição dos grupos de amostras analisadas
Grupos Número de Amostras
Frango, ovos e produtos avícolas 143 58,6 %
Farelo de soja 44 18,0 %
Carnes e produtos cárneos 37 15,2 %
Outros produtos 20 8,2 %
Total 244 100,0 %
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Pré –enriquecimentoNão seletivo para todos
Seletivo quando esta-belecido na metodologia
Amostra
ISO 6579:2002
BAX Salmonella
TECRA UNIQUE Salmonella
VIP Salmonella
Transia Plate Salmonella Gold
VIDAS Salmonella (SLM)
Singlepath Salmonella
1-2 Test
MATERIAIS E MÉTODOS
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MATERIAIS E MÉTODOS
Determinação do limite de detecção
carne,
leite e
gelatina
Matrizes utilizadas:
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MATERIAIS E MÉTODOS
Determinação do limite de detecção
Sorovares utilizados: (pool)
Salmonella Infantis,
Salmonella Typhimurium,
Salmonella Heidelberg e
Salmonella Enteritidis
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MATERIAIS E MÉTODOS
Determinação do limite de detecção
Níveis de inóculo por matriz:
1,0 (UFC/25 g)
4,0 (UFC/25 g)
9,3 (UFC/25 g)
12,7 (UFC/25 g) e
33,3 (UFC/25 g)
Determinações realizadas em triplicata.
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MATERIAIS E MÉTODOS
Determinação do limite de detecção
Análises envolvidas:
3 x 5 x 8 x 3 = 360 análises
Matrizes utilizadas 3Níveis de inóculo por matriz 5Métodos avaliados 8Determinações realizadas 3
(triplicata)
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RESULTADOS
RESULTADOS
Positividade encontrada para Salmonella spp nos diferentes grupos de amostrasanalisadas pela metodologia ISO 6579:2002
Grupos de amostrasNúmero de amostras
analisadas
Positividade para Salmonella spp Distribuição das amostras positivas
para Salmonella spp por grupo de matriz
analisadaNúmero de amostras positivas
Percentual de amostras positivas no
grupo
Frango, ovos e produtos
avícolas143 15 10,5% 30,0%
Farelo de soja 44 9 20,5% 18,0%
Carnes e produtos cárneos 37 21 56,8% 42,0%
Outros produtos 20 5 25,0% 10,0%
Total 244 50 20,5% 100,0%
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RESULTADOS
Porcentagem de concordância dos resultados presuntivos positivos para Salmonellaspp nos métodos rápidos avaliados em relação aos resultados positivos pela
metodologia ISO 6579:2002, nos diferentes grupos de amostras analisadas
Métodos
Grupos BAX Unique VIP Transia VIDAS Singlepath 1-2 Test
Frango, ovos e produtos avícolas 93,3% 64,3% 64,3% 90,9% 92,9% 57,2% 42,3%
Farelo de soja 100% 77,8% 88,9% 88,9% 100% 44,5% 55,6%
Carnes e produtos cárneos 90,5% 50,0% 85,0% 90,0% 90,0% 85,0% 90,0%
Outros produtos 80,0% 100% 100% 100% 100% 75,0% 80,0%
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RESULTADOS
Métodos
Grupos BAX Unique VIP Transia VIDAS Singlepath 1-2 TestFrango, ovos e produtos avícolas 6,6% 35,7% 35,7% 9,1% 7,2% 42,9% 53,8%
Farelo de soja 0% 22,2% 11,1% 11,1% 0% 55,6% 44,4%
Carnes e produtos cárneos 9,5% 50,0% 15,0% 5,0% 10,0% 15,8% 5,3%
Outros produtos 20,0% 0% 0% 0% 0% 25,0% 0%
Total 8,0% 35,4% 18,8% 6,7% 6,2% 31,9% 26,7%
Resultados falso-negativos para Salmonella spp nos métodos rápidos avaliados em relação aosresultados positivos pela metodologia ISO 6579:2002, nos diferentes grupos de amostras analisadas (a)
(a) Valores calculados considerando as amostras analisadas pelo método avaliado em relação ao método ISO 6579:2002, descontando-se os resultados duvidosos
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RESULTADOS
Resultados analíticos consolidados dos diferentes métodos avaliados na pesquisa de Salmonella spp emamostras de carne, leite em pó integral e gelatina granulada artificialmente contaminadas com um “pool”de cepas de Salmonella Enterica em 5 níveis de inóculo.
ISO 6579:2002
BAX VIDAS Tran-sia Vip Single-
path1-2
Test Unique
Porcentagem de concordância (a) 100% 97,7% 100% 100% 93,2% 81,8% 95,5% 75,0%
Resultados presuntivos positivos (b) 44(d) 43 44 44 41 36 42 33
Resultados negativos (c) 0 1 0 0 3 8 2 11
Resultados duvidosos Não aplicável 0 0 0 0 0 0 0
Total de amostras analisadas 44 44 44 44 44 44 44 44
(a) Porcentagem de concordância com a positividade encontrada pela metodologia ISO 6579:2002, nos 5 níveis de inóculo, em relação às amostras analisadas pelo método avaliado.(b) Resultados presuntivos positivos coincidentes com os resultados positivos pela metodologia ISO 6579:2002(c) Resultados negativos encontrados nas metodologias analisadas, nos 5 níveis de inoculo, nas diferentes amostras(d) Para o método ISO 6579:2002, estes resultados são positivos confirmados
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RESULTADOS
Porcentagem de concordância dos resultados presuntivos positivos para Salmonella spp nos
métodos rápidos avaliados em relação aos resultados positivos pela metodologia ISO 6579:2002
em amostras de alimentos sem contaminação experimental e amostras de alimentos
artificialmente contaminadas
ISO 6579:2002 BAX VIDAS Transia VIP Single-
path 1-2
Test Unique
Amostras sem contaminação experimental 100% 92,0% 93,8% 91,1% 81,3% 68,1% 68,8% 63,8%
Amostras artificialmente contaminadas 100% 97,7% 100% 100% 93,2% 81,8% 95,5% 75,0%
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CONCLUSÕES
Nas condições em que este presente trabalho foi desenvolvido pode-se concluir que:
o desempenho dos métodos rápidos avaliados na detecção de
Salmonella spp em alimentos sem contaminação experimental pode
diferir substancialmente daquele apresentado em alimentos
artificialmente contaminados;
os métodos rápidos avaliados devem ser utilizados unicamente para
fins de triagem, sendo que uns têm maior capacidade do que outros
para indicar em curto espaço de tempo quais amostras de alimento
poderiam estar contaminadas com Salmonella spp;
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CONCLUSÕES
os métodos rápidos avaliados podem dar resultados falso-positivos,
em porcentagens que variam de acordo com a matriz alimentar
analisada, ou seja, podem indicar falsamente a presença de Salmonella
spp, implicando na necessidade de confirmação do resultado antes da
liberação do resultado final. O laboratório deverá estar capacitado para
o atendimento destas situações;
os métodos rápidos avaliados podem dar resultados falso-negativos,
portanto apresentam o perigo de não detectar Salmonella spp,
eventualmente presente, nas amostras analisadas, levando à liberação
de resultados equivocados;
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CONCLUSÕES
o desempenho dos métodos rápidos avaliados pode variar com a matriz
alimentar analisada. Assim, a seleção do método rápido a ser utilizado
para a pesquisa de Salmonella spp, em um dado tipo de alimento
depende de uma avaliação prévia de seu desempenho nesse tipo de
alimento;
a adoção de um método rápido para detectar Salmonella spp em
determinada matriz alimentar tem um risco intrínseco. A seleção de um
dado método rápido só deve ser feita após a determinação do grau de
risco que se queira assumir.