comparison dna in dry tamarind leaves at various...

Journal of Science & Technology Phetchabun Rajabhat University 2018

Journal of Science & Technology Phetchabun Rajabhat University (JSTPCRU) ISSN : 1960-3830, January-June, Volume-3, Issue-1, pp-42-55

www.sci.pcru.ac.th

การเปรยบเทยบปรมาณดเอนเอในใบมะขามแหงทอณหภมและระยะเวลาตางกน โดยใชกระดาษเซลลโลสเมทรกซ

Comparison DNA in Dry Tamarind Leaves at Various Temperatures and Times Using Cellulose Matrix Card (FTA® Card)

มาหามะซปยน แดเบาะ1 สรเชษฐ เอยมส าอาจ1 เบญจพร ศรสวรมาศ2และ กาญจน คมทรพย3*

Mahamasupyan Daebok1, Surachate Iamsamang1, Benjaporn Srisaivramas2, and Kan Khoonsab3* 1* สาขาวชาชววทยา คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏเพชรบรณ เพชรบรณ 67000

2 รองศาสตราจารย สาขาวชาวทยาศาสตรศกษา คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏเพชรบรณ เพชรบรณ 67000 3 ผชวยศาสตราจารย สาขาวชาวทยาศาสตรศกษา คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏเพชรบรณ เพชรบรณ 67000

บทคดยอ การศกษาหาปรมาณดเอนเอในใบมะขาม 4 พนธปลก ไดแก ขนต สทอง ประกายทอง และศรชมภ ทอณหภมในการท าใหแหง 40ºC 45ºC และ 50ºC และระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกน คอ 1 7 14 และ 30 วน เพอหาอณหภมทท าใหแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาสารพนธกรรมหรอดเอนเอทเหมาะสม และศกษาการสกดแยกดเอนเอดวยวธการใชกระดาษเซลลโลสเมทรกซ แลวน าไปเพมปรมาณดเอนเอดวยปฏกรยา PCR ท าการตรวจสอบคณภาพของดเอนเอทสกดไดดวยวธเจลอะกาโรสอเลคโตรโฟเรซสและวดปรมาณดเอนเอดวย Spectrophotometer พบวา ทใชอณหภม 40°C ในการอบแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาท 1-7 วน ของมะขามพนธประกายทองและสทอง มปรมาณดเอนเอมากทสด ค าส าคญ : ดเอนเอ มะขาม กระดาษเซลลโลสเมทรกซ

ABSTRACT The objective of this study is to examine DNA in tamarind leaves including 4 varieties Khuntee, Sritong, Prakaitong and Srichompoo which were cultivated in drying temperature with different preservation time: 40°C, 45 °C and 50 °C with 1,7,14 and 30 days, respectively for

กาญจน คมทรพย และคณะ

w w w . s c i . p c r u . a c . t h

หนา 43

finding the optimum of drying temperature and appropriate period for genetic material or 'DNA' storage. In addition, DNA was studied after extract with cellulose matrix card. DNA quantity would be raised by PCR and quality monitoring was done by Agarose gel electrophoresis and quantity measurement was done by spectrophotometer. It was found that the most DNA quantity belongs to Prakaitong and Sritong strains with 40°C of drying temperature and 1-7 days of preservation. Keywords : DNA, Tamarind, Cellulose matrix card บทน า ปจจบนวทยาการทางดานวทยาศาสตรชวภาพ (Biological sciences) พฒนากาวหนาไปอยางไมหยดยง โดยเฉพาะการศกษาทางชววทยาโมเลกล (Molecular biology) นน มกจะมงไปสการศกษาเกยวกบดเอนเอ (DNA) ซงเปนสารพนธกรรม (Genetic material) ในนวเคลยสของสงมชวต การสกดแยกดเอนเอจากสงมชวตจงเปนขนตอนทส าคญอยางยง ส าหรบวธการเกบรกษาสารพนธกรรมหรอดเอนเอนนมวธการหนงทไดรบการพฒนาขน คอการเกบตวอยางสารพนธกรรมบนกระดาษ (Cards) โดยในขนตอนแรกนนไดเกบบนกระดาษทเรยกวา Guthrie card (Guthrie and Susi, 1963) แตขนตอนการน าสารพนธกรรมออกจาก Guthrie card มาใชในปฏกรยา PCR (Polymerase chain reaction) คอนของตองใชเวลาและขนตอนมาก โดยตองบมกระดาษกบสารละลายอนทรย (Organic solvent) เปนเวลานานและตองใชเครองมออนเขามาเกยวของ (อญชลวรรณ เมธนยพร และคณะ, 2542) ซงในปจจบนไดมการพฒนาคณสมบตของการดและขนตอนการท าสารพนธกรรมใหบรสทธโดยอาศยกระบวนการทางอนทรย (Organic method) ซงเปนวธใหม โดยใชกระดาษเซลลโลสเมทรกซ (FTA® card)เปนกระดาษซงเคลอบดวยบฟเฟอรเขมขน Physical denaturants และสารส าหรบจบ อนมลอสระในปรมาณท เหมะสม (Burgoyne, 1996) ส าหรบยอยสลายเมนเบรนของเซลล ท าใหโปรตน เสอมสภาพและสามารถปองกนและรกษากรดนวคลอกทตดอยบนกระดาษเซลลโลสเมทรกซจากเอนไซมนวคลเอส (Nuclease) ปฏกรยาออกซเดส (Oxidase) และแสงอลตราไวโอเลต (Ultraviolet) ได นอกจากนนยงพบวากระดาษเซลลโลสเมทรกซน มคณสมบตในการปองกนการเจรญเตบโตของเชอรา แบคทเรย และเชอจลนทรยตาง ๆ ซงกระดาษเซลลโลสเมทรกซ สามารถถกท าลายไดงายโดยกระบวนการธรรมชาต กระดาษเซลลโลสเมทรกซ มประโยชนในการจบและยดกรดนวคลอกอยางงายดาย เพยงขนตอนเดยว โดยกรดนวคลอกทเกบบนกระดาษเซลลโลสเมทรกซ สามารถคงสภาพท อณหภมหองไดนานเปนเวลาหลายปและไมจ าเปนตองเกบตวอยางในอปกรณท าความเยนจงเปนการลดพนทการใชงาน สงผลใหเกดความสะดวกในการขนสงตวอยางและเปนการลดการปนเปอน ระหวางขนสง โดยไมตองแชเยน เพอปองกนการเสอมสภาพของตวอยาง ลดเวลาและขนตอนในการทดสอบ สามารถเกบรกษาสารพนธกรรมไดจากตวอยางหลายชนด เชน เลอด เซลลเพาะเลยง แบคทเรย พชและไวรส เปนตน (วรนตรา ยอดไธสง และคณะ, 2549) ส าหรบพชนนมกนยมสกดแยกดเอนเอจากใบ เพราะเปนสวนทมปรมาณดเอนเอมากและมความบางมากกวาสวนอน ซงเปนการงายตอการสกดแยกดเอนเอ แตมกมปญหาเกยวกบการเกบใบเนองจากมความ



หนา 44

บอบบางและเกดการเสอมสภาพไดงาย โดยเฉพาะการเกบใบมาจากปาหรอบรเวณทอยหางไกลจากหองปฏบตการ ซงไมสามารถสกดแยกดเอนเอทนท จงจ าเปนตองผานกระบวนการเกบรกษา (Preservation) ดวยวธการเกบรกษาทงายทสด คอการแชน าแขง แตมกมปญหาเกยวกบการละลายของน าแขงและบางพนทกหาน าแขงไดยากล าบากหรอไมสามารถหาน าแขงไดเลย ซงการเกบรกษาตวอยางใบพชดวยการท าใหแหงกเปนอกวธหนงทท าไดงายทสามารถเกบสารพนธกรรมได (อญชลวรรณ เมธนยพร และคณะ, 2542) การวจยครงน ผวจยไดท าการศกษาหาปรมาณและหาความบรสทธของดเอนเอจากใบมะขามทอณหภมในการอบแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกน 4 พนธปลก ไดแก ประกายทอง สทอง ขนต และศรชมภ ทไดจากการสกดดวยกระดาษเซลลโลส เมทรกซโดยบดตวอยางดวยโกรงโดยใชไนโตรเจนเหลว จากนนเพมปรมาณดเอนเอ ยนทใชในการศกษาดวยปฏกรยา PCR กบไพรเมอร ทมความจ าเพาะกบมะขามทกพนธปลก เมอสนสดปฏรยาจงตรวจสอบผลตภณฑ PCR ดวย Agarose gel electrophoresis แลวตรวจสอบความบรสทธและวดปรมาณของดเอนเอทสกดได ดวยวธ Spectrophotometer วสดและวธการ 1.คดแยกเมลดพนธมะขาม ตรวจสอบความสมบรณของเมลดพนธ แลวจงคดเมลดพนธทดเพอใหไดเมลดพนธทมอตราการงอกสง โดยจะเตรยมเมลดพนธมะขามแตละพนธปลก ประมาณ พนธปลกละ 100 เมลด และน าเมลดพนธทคดแลวไปแชในน าสะอาดนานประมาณ 1-2 วน 2. เพาะเมลดพนธ น าเมลดพนธทไดจากขอท 1 ไปปลกในถงด าทเตรยมไวซงจะมสวนผสมของดนกบแกลบอยางละครง โดยจะน าเมลดพนธของแตละพนธปลกไปปลกในถงด า ถงละ 2 เมลด จ านวน 50 ถง จากนนจะรดน าทกวนๆ ละ 2 ครง เชา-เยน จะท าแบบนตลอดจนอายของตนออนถง 3 เดอนจากนนจงเปลยนการรดน าเปนวนละ 1 ครง ตอนเยนและจะใหปย 2 สปดาห ตอ 1 ครง 3. การเตรยมตวอยาง โดยจะเลอกเกบใบทออนหรอใบทไมแกจนเกนไป กจะน าไปอบดวยตอบลมรอน (hot air oven) ทอณหภม 40ºC 45ºC และ 50ºC ท 58 ชวโมง และจะใชระยะเวลาในการเกบรกษาท 7 14 และ 30 วน 4. การสกดดเอนเอโดยใชกระดาษเซลลโลสเมทรกซ (What man, UK) ใชใบมะขามแหง 1-3 ใบ บดในโกรงโดยเตมไนโตรเจนเหลวลงไปแลวจงบดใหละเอยด จากนนจงเตม TE buffer1X 300 µl แลวจงบดตอ จากนนจงใชชอนตกสาร ตกแบงใสหลอด Microcentrifuge tube ขนาด 1.5 ml 50 mg TE buffer1X 50 µl จงผสมใหเขากน



หนา 45

การหยดลงบนกระดาษกระดาษเซลลโลสเมทรกซจะดดตวอยางทผสมกนแลว หยดลงบนกระดาษใหทว แลวจงตงทงไวทอณหภมหอง 15-30 นาท จงใชเครองเจาะกระดาษ (Puncher) ขนาดเสนผานศนยกลาง 2 mm เจาะบรเวณทมตวอยางมา 2 อน ตอตวอยาง จากนนจงใสลงในหลอด Microcentrifuge ขนาด 1.5 ml อนใหม การลาง จะท าการลางดวย Purification Reagent 3 รอบๆละ 100 µl แลวจงน าไปเขยาดวยเครองเขยาสาร (Vortex mixer)3 ครง แลวจงดดน ายาออก จากนนจะลางดวย TE buffer1X 3 รอบๆ ละ 100 µl แลวจงน าไปเขยาดวยเครองเขยาสาร (Vortex mixer)3 ครง แลวจงดดน ายาออก น าไปปนเหวยงดวยเครองหมนเหวยง (Centrifuge) ทความเรว 1,300 rpm ประมาณ 3 นาท จากนนดดน ายาทอยทกนหลอดออกใหหมด น าไปท าใหแหงดวยเครอง Dry block หรอ Thermo block ทอณหภม 60ᵒC ประมาณ 5 นาท เตม Elution ลงไป 100µl ตอ 1 ตวอยาง ตงทงไวทอณหภมหอง 10 นาท แลวจงน าไปปนเหวยงดวยเครองหมนเหวยง (Centrifuge) ทความเรว 1,300 rpm ประมาณ 3 นาท จะไดดเอนเอทอยในสารละลายแลวจงน าไปตรวจสอบขนาดของดเอนเอและวดดเอนเอตอไป 5. การวดปรมาณดเอนเอดวย Spectrophotometer (A260 และ A280) โดยวดการดดกลนแสงทความยาวคลน 260 นาโนเมตร เนองจากดเอนเอสามารถดดกลนแสงไดมากทสดทความยาวคลน 260 นาโนเมตร ดเอนเอทมความบรสทธควรมอตราสวนอยในชวง 1.6-1.8 ถงจะแสดงวาดเอนเอทสกดไดบรสทธหรอมคณภาพดหากต ากวา 1.6 แสดงวามโปรตน และฟนอลปะปนอยในสารละลายถามากกวา 1.8 แสดงวาม RNA ปนอยในสารละลาย 6. การเพมปรมาณดเอนเอ ดวยปฏกรยา PCR น ากระดาษทเจาะและทผานการลางและท าใหแหงแลว มาเพมปรมาณดเอนเอ โดยใชค ไพรเมอรRbcl-Tam-F03, Rbcl-Tam-R04และผสมกบ PCR Buffer มสวนผสมดงน 2X Taq 25 µL, Forward primer 1.25 µL, Reverse primer 1.25 µL, DNA Template และ Nuclease-fee water17.5 µL เตมสารทงหมดลงในหลอด Microcentrifuge ขนาด 0.6 ml น าไปปนบน Vortex ใหเขากน แลวแบงใสหลอด ขนาด 0.2 หลอดละ 45 µlจากนนท าปฏกรยา PCR ในเครองควบคมปฏกรยา PCR โดยตงโปรแกรมดงน ขนท 1 Initial denaturation ทอณหภม 95ᵒC เปนเวลา 2 นาท ขนท 2 Denaturation ทอณหภม 95ᵒC เปนเวลา 40 วนาท 35 รอบ ขนท 3 Primer annealing ทอณหภม 50ᵒC เปนเวลา 40 วนาท 35 รอบ ขนท 4 Primer extension ทอณหภม 72ᵒC เปนเวลา 1 นาท ขนท 5 Final extension ทอณหภม 72ᵒC เปนเวลา 5 นาท



หนา 46

ขนท 6 Hold temp ทอณหภม 4ᵒC จนกวาจะน าตวอยางออกจากตวเครอง หลงสนสดปฏกรยา น าผลตภณฑ PCR มาวเคราะหดวย Electrophoresis (Sambrook และคณะ, 1989) 7. การตรวจสอบคณภาพของดเอนเอดวยวธเจลอะกาโรสอเลคโตรโฟเรซส ละลาย Agarose 0.7 g ละลายใน 1X TBE 70 ml จากนนน าไปละลายในไมโครเวฟจนละลาย โดยสงเกตจากการเขยาแลวไมเกดฟองอากาศเลก ๆ ทกน Flask แสดงวาละลายหมดแลว จากนนตงทงไว 5-10 นาท เทลงในถาดเจล (Tray) ทเตรยมไวแลวเสยบหว (Comb) จากนนเกลยฟองอากาศออก ตงทงไวใหเจลแขงประมาณ 20 นาทแลวยกหวออกเบา ๆ ระวงอยาใหเจลแตก วางถาดเจลลงใน Electrophoresis Chamber ทม 1X TBE buffer โดยหนดานทมหลม (Origin) อยทางขวลบ ท าการ Load PCR Product ท ผสมกบ 6X Novel juice DNA Staining dye ( โ ดย ใช 10 µL ผลตภณฑ PCR ผสมกบ 2 µL 6X Novel juice DNA staining dye)ลงในแตละ Well จ านวน 12 µL โดย Well แรกจะ Load marker จากนนจง Load PCRProduct ลงไปใน Well ถดไป ท าการ Run Gel ใน 1X TBE buffer โดยใชกระแสไฟฟา 100 mV เปนเวลา 30 นาท น าถาดเจลขนจาก Buffer แลวตรวจสอบผลผลตของปฏกรยาจากแผนเจลภายใตแสง UV ของเครอง Gel Documents และวดขนาดผลตภณฑ PCRเทยบกบแทบดเอนเอมาตรฐานททราบขนาด (DNA marker) ผลการวจยและอภปรายผล จากการสกดดเอนเอจากใบมะขาม 4 พนธปลก คอ ขนต สทอง ประกายทอง และศรชมภ ทอณหภมในการท าใหแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกน โดยจะใชใบออนจากตนมะขามทอยในระยะ 3 ใบ ซงเปนระยะทใบมะขามยงไมแกจนเกนไป หลงจากลางท าความสะอาดใบเพอก าจดสงปนเปอนทอาจจะมผลตอดเอนเอ กจะน าไปอบดวยตอบลมรอน (hot air oven) ทอณหภม 40ºC, 45ºC, และ 50ºC ท 58 ชวโมง และจะใชระยะเวลาในการเกบรกษาท 1, 7, 14 และ 30วน แลวจงน าใบมะขามมาบดและสกดโดยใชกระดาษเซลลโลสเมตทรกซตามขนตอนเพอเปรยบเทยบปรมาณดเอนเอของใบมะขามทอณหภมในการท าใหแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกน แลวท าการตรวจสอบคณภาพของจโนมกดเอนเอทสกดไดดวยวธเจลอะกาโรสอเลคโตรโฟเรซสและวดปรมาณดเอนเอดวย spectrophotometer



หนา 47

ผลการศกษาหาปรมาณความเขมขนของจโนมกดเอนเอในใบมะขาม 4 พนธปลก ทอณหภมในการท าใหแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกน คอ 40ºC 45ºC และ 50ºC และ1, 7, 14 และ 30 วน เมอน าจโนมกดเอนเอทสกดดวยวธกระดาษเซลลโลสเมตทรกซของใบมะขามทง 4 พนธปลกทอณหภมในการท าใหแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกน ท าการตรวจสอบคณภาพของจโนมกดเอนเอดวยวธเจลอะกาโรสอเลคโตรโพเรซส พบวาไมแสดงแถบดเอนเอ ซงสอดคลองกบการทดลองของ Hirokazu และคณะ (2005) ทแสดงใหเหนวา ส าหรบพชบางชนดโดยเฉพาะตน Gramineae การรวบรวมดเอนเอในแผนกระดาษเซลลโลสเมตทรกซท าไดยากเนองจากเนอเยอทสกดออกมาจากใบของตน Gramineae มจ านวนนอย อยางไรกตาม แผนกระดาษเซลลโลสเมตทรกซไมสามารถใชกบตน Gramineae จงควรการเลอกใบออนทยงไมคลใบเตมท เพราะเปนแหลงของดเอนเอทแทจรง และสอดคลองกบการทดลองของ Michiels และคณะ (2003) ทไดศกษาการสกดจโนมกดเอนเอจากใบของพชโดยการเปรยบเทยบระหวางการสกดจโนมกดเอนเอของใบออนและใบแก พบวาใบพชออนจะมองคประกอบของสารประกอบประเภทพอลแซคคาไรด (polysaccharides) และพอลฟนอลก (polyphenolic compounds) นอยกวาใบแก ซ งสารประกอบเหลานจะมผลตอปฏกรยากบโปรตนหรอกรดนวคลอกในรปของตะกอนทไมละลายน า นอกจากนสารประกอบพอลแซคคาไรดและพอลฟนนอลกยงมผลในการยบยงดเอนเอในขนตอนการสกดอกดวย ซงสอดคลองกบ Lim และคณะ (1997) การสกดจากใบสดของพช โดยใบทก าลงเจรญเตบโตจะใหปรมาณดเอนเอดทสด สวนใบทยงออนมากจะใหปรมาณดเอนเอนอยเกนไป ในขณะทใบทโตเตมทแลวจะใหปรมาณดเอนเอทมคณภาพต าเนองจากมการปนเปอนของสารบางชนดทพชสงเคราะหขน เชน คารโบไฮเดรทและไขมน Lodhi และคณะ (1994) ภายหลงจากการตรวจสอบผลโดยวธอเลกโทรโฟรซสในอะกาโรสเจล พบวา ไมสามารถเหนแถบดเอนเอ เนองจากไดปรมาณดเอนเอนอยและอาจมการปนเปอนของสารทตยภม (secondary metabolite) หรอสารพวกโพลแซคคาไรด(polysaccharide) ทมอยในพช และจากการรายงานของ อญชลวรรณ เมธนยพร และคณะ(2542) ไดศกษาวจยการเกบรกษาใบฝรงส าหรบสกดแยกดเอนเอ พบวาใบฝรงทผานการท าแหงโดยการอด herbanium อบแหงทอณหภม 60ºC และใชซลกาเจลนน ใหดเอนเอทมปรมาณและคณภาพทดอยกวาใบฝรงสดและใบฝรงทเกบไวในตเยน 4 – 8 ºC 7 วน การวดคณภาพของดเอนเอสามารถวดคาการดดกลนแสงโดยใชเทคนค spectrophotometer เนองจากดเอนเอสามารถดดกลนแสงทความยาวคลน 260 นาโนเมตร (OD260) ได การตรวจสอบคณภาพของสารละลายดเอนเอทบรสทธท าไดโดยเปรยบเทยบคา OD260 และ OD280 (คาอตรา OD260/OD280) ทอยในชวง 1.6-1.8 บงบอกถงความบรสทธของดเอนเอ จากตาราง 2 ดเอนเอทไดดวยวธกระดาษเซลลโลสเมตทรกซ คาอตราสวน OD260/OD280 มคาต ากวา 1.6 บงบอกวา สารละลายดเอนเอทไดอาจมการปนเปอนของสารกลมโปรตนและ ฟนอลบางสวน และคาอตราสวน OD260/OD280 ทมคามากกวา 1.8 บงบอกวา สารละลายดเอนเอทไดมปรมาณอารเอนเอจอปนอย นอกจากนผลการวดคาการดดกลนแสง สามารถค านวณเปนคาความเขมขนของดเอนเอดงแสดงดงตารางท 1พบวาปรมาณดเอนเอมปรมาณไกลเคยงกน อยางไรกตาม ผลของทดลองวดคาดดกลนแสงอตราไวโอเลตอาจไมสอดคลองกบผลการตรวจสอบโดยวธเจลอะกาโรสอเลคโตรโพเรซส โดยอาจมอารเอนเอหรอสารทตยภม (secondary metabolite) อน ๆ



หนา 48

ปนเปอนในสารละลายดเอนเอบางสวน อาจไปบดบงการดดกลนแสงของโมเลกลดเอนเอ ท าใหมผลรบกวนตอคาการดดกลนแสงทวดได (Drabkova และคณะ, 2002) ตารางท 1 ความเขมขนจโนมกดเอนเอและคาA260/A280ของใบมะขาม เมออบแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกน

หมายเหต : ตวอกษรทแตกตางกนในแนวตงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตท (p<0.05) จากตารางท 1จะเหนไดวาปรมาณความเขมขนดเอนเอทไดทสกดไดในแตละตวอยางมความแตกตางกนอยางมมยส าคญทางสถต (p<0.05) วธโดยใชกระดาษเซลลโลสเมตทรกซพบวาพนธปลกประกายทองใหปรมาณดเอนเอสงสด รองลงมาคอ สทอง ขนต และศรชมภ มความเขมขนเทากบ 1351.6±25.9, 1173.3±92.9, 943.3±25.6 และ 910.0±22.9 (ng/µl) ตามล าดบ การศกษาหาอณหภมทท าใหแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาสารพนธกรรมหรอดเอนเอทเหมาะสม จากการศกษาอณหภมทท าใหแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาสารพนธกรรมทเหมาะสม พบวา พนธประกายทองทใชอณหภมในการอบแหงท 40ºC เปนเวลา 58 ชวโมงและเกบรกษาท 1 วน มปรมาณดเอนเอมากทสด คอ 1351.6±25.9 และหาความบรสทธของดเอนเอท A260/A280 ซงไดมากกวา 1.8 คอ 5.8ซงหมายความวามปรมาณอารเอนเอจอปนอย เนองจากอารเอนเอกเปนกรดนวคลอกเชนกน ดงนนจงมเบสทสามารถดดกลนแสงอลตราไวโอเลตไดเชนกน จงท าใหคาการดดกลนแสงอลตราไวโอเลตมากขน ดงตารางท 2 สวน PCR product พบวา พนธสทองทใชอณหภมในการอบแหงท 40 องศา เปนเวลา 58 ชงโมง และเกบรกษาท 1-7 วน มปรมาณดเอนเอมากทสด คอ 850±50.0 และ 800±50.0 และหาความบรสทธของดเอนเอท A260/A280ซงไดนอยกวา 1.6 คอ 1.1และ 0.9 ซงหมายความวามถาดเอนเอทสกดไดมโปรตนปนเปอนอยจะ

พนธปลก อณหภมทใชในการอบแหง

ความเขมขนของจโนมกดเอนเอ (A260) (ng/µl) A260/A280(ng/µl) ระยะเวลาในการเกบรกษา (วน) ระยะเวลาในการเกบรกษา (วน)

1 7 14 30 1 7 14 30

ประกายทอง 40 1351.6±25.9a 1088.3±99.2a 406.6±24.6a 101.6±35.4a 5.8 7.3 1.3 0.5 45 1100.0±61.7a 208.3±46.4b 128.3±2.8b 48.3±20.8b 4.3 0.8 0.1 0.1 50 76.0±62.1c 76.0±62.1b 65.0±23.0b 45.0±18.2b 0.2 0.2 0.2 0.1

สทอง 40 1173.3±92.9a 770.0±34.6a 256.6±24.6a 208.3±35.4a 1.5 9.2 2.5 1.2 45 925.0±32.7b 461.6±2.8b 68.3±2.8b 43.3±20.8b 4.6 3.4 0.2 0.6 50 838.3±12.5b 68.3±2.8c 51.6±23.0b 26.1±18.2b 3.3 0.2 0.3 0.1

ขนต 40 943.3±25.6a 943.3±15.0a 821.6±20.2a 765.0±10.0a 14.1 17.9 7.0 4.1 45 913.0±25.6ab 876.6±20.2a 753.3±10.4ab 615.0±18.0b 18.2 4.0 3.7 2.8 50 870.0±18.0b 846.6±76.5a 601.6±142.9b 50.0±37.7c 7.4 6.3 3.6 0.2

ศรชมพ 40 910.0±22.9a 826.6±57.9a 645.0±49.2a 250.0±50.0a 18.2 9.9 4.8 0.7 45 826.6±57.9b 736.6±30.5a 573.3±15.2b 166.6±28.8b 9.9 22.1 2.4 0.4 50 735.0±27.8c 601.6±63.7b 518.3±16.0b 16.6±2.88c 6.3 12.0 2.0 0.1



หนา 49

มคาอตราสวนนอยกวา 1.6 เนองจากโปรตนมหมทสามารถดดกลนคลนแสงไดทความยาวคลน 280 นาโนเมตรดงตารางท 2 ตารางท 2ความเขมขนPCR product และคาA260/A280ของใบมะขาม เมออบแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกน

หมายเหต : ตวอกษรทแตกตางกนในแนวตงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทางสถตท (p<0.05) จากตารางท 2จะเหนไดวาปรมาณความเขมขนดเอนเอทไดทสกดไดในแตละตวอยางมความแตกตางกนอยางมยนนส าคญทางสถต (p<0.05) วธโดยใชกระดาษเซลลโลสเมตทรกซพบวาพนธปลกสทองใหปรมาณดเอนเอสงสด รองลงมาคอ ศรชมพ ประกายทอง และขนต มความเขมขนเทากบ 850.00±50.0, 505.00±8.6, 483.3±28.8 และ433.33±28.8 (ng/µl) ตามล าดบ การศกษาดเอนเอของใบมะขามแหง 4 พนธปลก หลงจากการเพมปรมาณดวยปฏกรยา PCR เมอน าดเอนเอทสกดไดจากใบมะขามทใชอณหภมในการท าใหแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกนไปท าปฏกรยา PCR โดยใชไพรเมอร TamF03-TamR04 แลวท าการตรวจสอบคณภาพของ PCR product ดวยวธเจออะกาโรสอเลคโตรโฟเรซส และวดปรมาณความเขมขนของ PCR product ดวย spectrophotometer ดเอนเอทสกดแยกไดจากมะขามทใชอณหภมในการท าใหแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกน พบวาสามารถใหการตอบสนองตอปฏกรยา PCR แตใหผลการตอบสนองไมดเทาทควร เนองจากดเอนเอทสกดแยกไดจากใบมะขาม ทใชอณหภมในการอบแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาทแตกตางกน มการแตกหกเสยหายเปนสวนใหญและเกด primer dimer ซงสอดคลองกบ อญชลวรรณ เมธนยพรและคณะ(2542) รายงานวาดเอนเอทสกดแยกจากใบฝรงทผานการท าใหแหงโดยการอด herbanium

พนธปลก อณหภมทใชในการอบแหง

ความเขมขนของPCR product (A260) (ng/µl) A260/A280(ng/µl)

ระยะเวลาในการเกบรกษา (วน) ระยะเวลาในการเกบรกษา (วน)

1 7 14 30 1 7 14 30

ประกายทอง 40 483.3±28.8a 483.3±28.8a 333.3±28.8a 166.66±76.3a 2.4 2.4 3.3 2.0 45 450.0±50.0ab 300.0±50.0b 250.0±50.0ab 116.66±28.8a 1.7 0.9 0.9 0.5 50 383.3±28.8b 266.6±28.8b 200.0±50.0b 66.66±28.8a 1.4 1.1 0.7 0.7

สทอง 40 850.00±50.0a 800.00±50.0a 516.67±28.8a 83.33±57.7a 1.1 0.9 1.1 1.3 45 683.33±28.8b 466.67±57.7b 383.33±28.8b 66.67±28.8a 1.2 1.2 1.6 0.7 50 366.67±28.8c 283.33±28.8c 283.33±28.8c 66.67±28.8a 1.3 1.3 1.9 0.8

ขนต 40 433.33±28.8a 433.33±28.8a 383.33±76.3a 383.33±28.8a 1.5 1.6 1.2 1.9 45 383.33±28.8a 316.66±28.8b 283.33±104.0ab 150.00±0.0b 4.6 1.7 2.1 0.9 50 316.66±28.8b 150.00±50.0c 133.33±57.7b 83.33±28.8c 1.9 1.5 0.9 0.5

ศรชมพ 40 505.00±8.6a 503.33±28.4a 266.67±28.8a 136.67±22.5a 2.2 2.3 1.3 0.6 45 476.67±20.2ab 376.67±5.7b 216.67±57.7ab 30.00±5.0b 1.9 5.5 1.1 0.1 50 445.00±30.9b 338.33±32.4b 166.67±28.8b 16.67±2.8b 1.6 1.7 0.8 0.1



หนา 50

อบแหงทอณหภม 60˚C และโดยใชซลกาเจลนน ใหการตอบสนองตอปฏกรยา PCR ได แตใหผลการตอบสนองไมเหมอนกบดเอนเอทสกดแยกไดจากใบฝรงสด ทงนเนองจากดเอนเอทสกดแยกไดมคณภาพไมดเทาทควร เนองจากดเอนเอทสกดแยกไดจากใบฝรงทผานการท าแหงทง 3 วธมการแตกหกเสยหายเปนสวนใหญ การวดคณภาพของดเอนเอสามารถวดคาการดดกลนแสงโดยใชเทคนค spectrophotometer เนองจากดเอนเอสามารถดดกลนแสงทความยาวคลน 260 นาโนเมตร (OD260) ได การตรวจสอบคณภาพของสารละลายดเอนเอทบรสทธท าไดโดยเปรยบเทยบคา OD260 และ OD280 (คาอตรา OD260/OD280) ทอยในชวง 1.6-1.8 บงบอกถงความบรสทธของดเอนเอ จากตาราง 2 ดเอนเอทไดดวยวธกระดาษเซลลโลสเมตทรกซ คาอตราสวน OD260/OD280 มคาต ากวา 1.6 บงบอกวา สารละลายดเอนเอทไดอาจมการปนเปอนของสารกลมโปรตนและฟนอลบางสวน และคาอตราสวน OD260/OD280 ทมคามากกวา 1.8 บงบอกวา สารละลายดเอนเอทไดมปรมาณอารเอนเอเจอปนอย นอกจากนผลการวดคาการดดกลนแสง สามารถค านวณเปนคาความเขมขนของดเอนเอดงแสดงดงตารางท 2พบวาปรมาณดเอนเอมปรมาณไกลเคยงกน อยางไรกตาม ผลของทดลองวดคาดดกลนแสงอตราไวโอเลตอาจไมสอดคลองกบผลการตรวจสอบโดยวธเจลอะกาโรสอเลคโตรโพเรซส โดยอาจมอารเอนเอหรอสารทตยภม (secondary metabolite) อน ๆ ปนเปอนในสารละลายดเอนเอบางสวน อาจไปบดบงการดดกลนแสงของโมเลกลดเอนเอ ท าใหมผลรบกวนตอคาการดดกลนแสงทวดได (Drabkova และคณะ, 2002)



หนา 51

ภาพท 1 ผลการตรวจสอบ PCR product ST คอ สทอง C คอ องศาเซลเซยส D คอ วน PKT คอประกายทอง M คอ Marker



หนา 52

ภาพท 2 ผล การตรวจสอบ PCR product SCP คอ ศรชมภ C คอ องศาเซลเซยส D คอ วน KT คอขนต M คอ Marker สรป จากการทดลองสามารถสรปไดวา วธการสกดแยกดเอนเอดวยวธกระดาษเซลลโลสเมทรกซ ทใชอณหภม 40°C ในการอบแหงและระยะเวลาในการเกบรกษาท 1-7 วน ไดแกพนธประกายทองและสทองมดเอนเอมากทสด แตดเอนเอทไดนนมคณภาพไมดเทาทควร เพราะมการแตกหกเปนสวนใหญ เนองจากตวอยางทไดถกท าใหแหงโดยผานการอบดวยอณหภม 40ºC 45ºC และ 50ºC เปนเวลา 58 ชวโมงซงการทดลองในขนตอนดงกลาวเปนการหวงผลในการท าใหเกดความสะดวกตอกระบวนการเกบรวบรวมตวอยางและท าใหตวอยางถกดงน าออกเพอจ ากดกระบวนการเมแทบอรซม แตอาจท าใหเกดการลดปรมาณของดเอนเอทไดหรอท าใหดเอนเอทไดมสภาพไมสมบรณ มการแตกหกเสยหาย เนองจากความรอนมผลโดยตรงตอความสมบรณและความคงอยของดเอนเอหรออาจมการปนเปอนของสารทตยภม กลมโปรตน สารประกอบฟนอล และเศษเซลลตางๆ ซงสงผลตอความบรสทธและความสามารถในการเคลอนตวผานเจลอเลกโทรโฟรซสในระหวางทดเอนเอมการเคลอนท จงท าใหการตรวจสอบคณภาพดเอนเอผานเจลอเลกโตรโฟเรซสอาจใหผลไมดเทาทควร จากผลการทดลองดงกลาว เปนแนวทางเพอหาขอบกพรองของวธการสกดดเอนเอดวยวธการใชกระดาษเซลลโลสเมทรกซ และปรบปรงใหวธการใหสามารถใชสกดดเอนเอใหมประสทธภาพทสงขนกวาเดมตอไป



หนา 53

กตตกรรมประกาศ การวจยนส าเรจลลวงไปไดดวยค าแนะน าตาง ๆ จากอาจารยหลกสตรสาขาวชาชววทยา คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏเพชรบรณทใหความชวยเหลออยางดยง รวมถงขอเสนอแนะตาง ๆ อนเปนประโยชนตอการด าเนนการวจยครงน เอกสารอางอง อญชลวรรณ เมธนยพร, นฤมล ธนานนตและธระชย ธนานนต. (2542). การเกบรกษาใบฝรงส าหรบสกดแยกดเอนเอ. ภาควชาเทคโนโลยชวภาพ คณะวทยาศาสตรและเทคโนโนยมหาวทยาลยธรรมศาสตร. กรงเทพฯ. วรนตรา ยอดไธสง แสงแข พงษธเนศ อ าไพรนทร มงมาตร วษณ วรรณแสวง และนวตร จนทรศรพรชย. (2549). การเปรยบเทยบประสทธภาพของกระดาษเซลลโลสเมทรกซ ในการเกบรกษาสารพนธกรรมของมยโคพลาสมา กลปลเซพตกม ทอณหภมและเวลาแตกตางกน. สตวแพทยสาร ฉบบท 1 :2557. Burgoyne, L.A. (1996). Solid medium and method for DNA storage. US patent 5, 496, 562. Drabkova, L. J. Kirschner and C. Vlcek. (2002). Comparison of seven DNA extraction and amplification protocols in historical herbarium specimens of Juncaceae. Plant Molecular Biology Reporter. 20: 161-75. Guthrie, R. and Susi, A. (1963). A simple phenyllanine method for the detecting phenyl ketone urine in large population of new born infants. J.Pediatr. 32: 338-3343. Hirokazu T., Yu, L., Makiko, K. and Hideaki, O. (2005). Large-scalegeneral collection of wild-plant DNA in Mustang, Nepal.Tokyo,Japan. Lim, S.H., Liew, C.F., Lim, C.N., Lee, Y.H. and Goh,C.J. (1997). A simple and efficient method of DNA isolation from orchid species and hybrids.Biologia Plant. 41(2): 313- 316. Lodhi, A. M., Guang-Ning, Y., Norman F.W., and Bruce I.R.. (1994). A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species an Ampelopsis.Plant Molecular Biology Reporter 12(1): 6-13. Michiels, A., Van den Ende, W., Tucker, M.,Liesbet, V.R., and Laere, A.V. (2003). Extractionofhigh-quality genomic DNA from latex containing plants. Analytical Biochemistry, 315:85-89.



หนา 54

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,USA, chapter 6.