colina luz, obtención de derivados de quitosano
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Obtención de quitosano y Películas e hidrogeles de quitosano:TRANSCRIPT
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REPBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS
MAESTRA EN QUMICA
OBTENCIN DE DERIVADOS DE QUITOSANO CON POSIBLES PROPIEDADES FUNGICIDAS Y
BACTERICIDAS
Trabajo presentado para optar al grado de Magister Scientiarum en Qumica.
Autora: Lcda. Ana Carmen Valbuena Inciarte
Tutora: Dra. Marinela Colina
Maracaibo, Marzo 2013
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Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Qumica Ambiental I y II de la Universidad del
Zulia (LUZ), y en el Laboratorio de Fitopatologa del Instituto de Estudios Avanzados (IDEA).
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" I have a theory, my theory is about moments, moments of impact. My theory is that these
moments of impact, these flashes of high intensity that completely turn our lives upside down
actually end up defining who we are.
The Vow
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8
A Dios, Yavh, Jehova, Allah,
The Forze, El alfa y el omega, Shiddartha.
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AGRADECIMIENTOS
Dios mo gracias a ti estoy una vez ms en al camino. A mi mama y a mi papa gracias a ellos soy
la persona que soy hoy en da, me ensearon constancia y perseverancia los amo, soy a su imagen
y semejanza, mis hermanitos Eduardo y Francisco gracias por los momentos de complicidad,
especialmente quiero agradecer a mi hermanita Carmen, porque sin ella no hubiese culminado,
este trabajo de investigacin, eres mi pilar y mi orgullo, pasaste de ser una nia a una adolescente
y ahora una gran mujer y profesional.
A mi esposo Otto, porque gracias a su apoyo he cumplido una meta ms, este logro tambin es
tuyo, representas mi pasado, presente y futuro, te amo.
A la Universidad del Zulia, por la formacin recibida en ella
A FONACIT por el apoyo financiero brindado para el desarrollo de esta tesis.
A la Dra. Marinela Colina y a la Dra. Nelly Daz, gracias por las oportunidades brindadas.
Es difcil llegar a esta recta final sin esa familia a la que decidi tener a nuestros amigos
hermanos de cuaderno en fin, esos seres especiales que sirven de pilar. Quiero empezar
agradeciendo a mis amigos de hace ms de 10 aos, que se han mantenido intactos para mi
durante todo este tiempo y me han dado apoyo incondicional, Lurayni (brujita), Patricia (mi pa)
gracias por ser mi persona, Mara (maryita) gracias por escuchar siempre mis gritos de ayuda,
Solsiret amiga ma eres mi ejemplo a seguir algn da quisiera tener tu fortaleza y valenta, me
quito el sombrero ante ti, Johanna (bruja) lo nico que le pido a dios todos los das es ser como
tu cuando sea grande, Alexis (gordo) gracias por ponerme una sonrisa en mi boca en cada uno de
nuestros encuentros.
A mis compaeros de Laboratorio de qumica ambiental, Adrian, Josu, Erwin, Gerine, Andrs,
Brinolfo y Jos Alejandro. Muy especialmente a mis hijos acadmicos Carlos, Luis y Beltriz,
aunque el camino ha sido difcil continuamos en el sin desfallecer, los aprecio mucho.
A la familia de Agricultura y Soberana Alimentaria del Instituto de Estudios Avanzados (IDEA)
deje una familia a quien visitar cada vez que vaya a Caracas, Diamarys, Alan (malpi), Laura,
Cindy, Sandy, Daynet, Hctor, Mara Alejandra (maz), Daro (vida), Sr. Jos, Jos A., Juan M.,
Sra. Mara muy especialmente a mi Ta Esperanza y para finalizar a las personas que nos sacaron
de su corazn, gracias por hacer tan maravillosa nuestra estada por all.
A mis amigos del Laboratorio de Electrnica Molecular (LEM) y del Departamento de
Investigacin y Tecnologa de Materiales y Ambiente (DITeMA), por adoptarme y hacerme
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10 sentir como un integrante ms del laboratorio, Miguel (Mickey), Miguel I., Atilio, Nstor, Jelem
y Joan, en especial al Dr. Ysaas Alvarado por permitirme culminar parte de mi trabajo
experimental en su laboratorio, infinitas gracias.
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11
NDICE DE CONTENIDO
Pg.
DEDICATORIA 8
AGRADECIMIENTOS 9
RESUMEN 14
ABSTRACT 15
1. INTRODUCCIN 16
2. FUNDAMENTOS TERICOS 18
2.1. Generalidades del Quitosano 18
2.1.1 Origen y Propiedades 18
2.1.2. Obtencin 19
2.1.3. Aplicaciones 20
2.2. Caracterizacin Espectroscpica del Quitosano y Derivados 20
2.3 Caracterizacin Fisicoqumica del Quitosano y Derivados 23
2.4. Derivados de Quitosano como Fungicidas y Bactericidas 26
2.4.1. Caractersticas Fungicidas y Bactericidas del Quitosano 26
2.4.2. Degradacin Oxidativa de Quitosano 27
2.4.3 Iminas a partir de Quitosano 30
3. OBJETIVOS 33
3.1.1 Objetivo General 33
3.1.2. Objetivos Especficos 33
4. PARTE EXPERIMENTAL 34
4.1. Muestras, Reactivos y Materiales 34
4.2. Equipos 34
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12 4.3. Obtencin de Quitosano 35
4.3.1. Purificacin del Quitosano 35
4.3.2. Degradacin Oxidativa de Quitosanos de diferentes grados de
desacetilacin
35
4.3.3. Preparacin de Iminas de baja masa molecular 36
4.4. Caracterizacin del Quitosano y Derivados 36
4.4.1. Espectroscopia Infrarroja 36
4.4.2. Difraccin de Rayos-X 36
4.4.3 Anlisis Elemental 37
4.4.4 Masas moleculares viscosimtricas 37
4.4.5 Anlisis calorimtrico diferencial de barrido 37
4.5 Pruebas Microbiolgicas 37
4.5.1. Pruebas Bactericidas 38
4.5.2 Pruebas Fungicidas 39
5. RESULTADOS Y DISCUSIN 42
5.1 Obtencin del Quitosano 42
5.2 Caracterizacin del Quitosano 42
5.2.1. Espectro Infrarrojo FT-IR 42
5.2.2. Difraccin de Rayos X 44
5.2.3 Determinacin de masas molares promedios viscosimtricas 45
5.3. Pruebas Antimicrobianas de Quitosanos de Distintos Grados de Desacetilacin
Frente a S. Aureus y E. Coli. 46
5.4. Pruebas Antimicrobianas de Quitosanos de Distintos Grados de Desacetilacin
Frente a Saccaromyces Cervisiae y Neurospora Crassa. 56
5.5. Degradacin Oxidativa de Quitosano 61
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13 5.6. Obtencin de (N)-Bencil Quitosanos de Baja Masa Molecular con Diferentes
Grados de Desacetilacin
73
6. CONCLUSIONES 78
7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 79
8. NDICE DE FIGURAS 86
NDICE DE TABLAS 89
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14 Valbuena I; Ana C.Obtencin de derivados de quitosano con posibles propiedades fungicidas y bactericidas Trabajo de Grado. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Divisin de Estudios para Graduados. Laboratorio de Qumica Ambiental. Maracaibo, Venezuela, 2013, 89p
RESUMEN
Se sintetizaron 9 tipos de quitosano con grados de desacetilacin comprendidos entre 73 97 %. Se determin el grado de desacetilacin a travs de espectroscopia infrarroja y se corrobor por Anlisis Elemental. Se realiz la determinacin del ndice de cristalinidad a travs de difraccin de rayos X, observndose la disminucin del mismo a medida que aumentaba el grado de desacetilacin. Se obtuvo quitosanos de alta y de mediana masa molar, caracterizados por medidas viscosimtricas. Se realiz una degradacin oxidativa de las muestras de 82 %, 88 % y 97 % de grado de desacetilacin, con H2O2 activado con HCl. Se determin que las fracciones degradadas mantienen las sealas caractersticas de quitosanos de altos grados de desacetilacin y alto grado de cristalinidad, as mismo, a nivel espectral se mostro una nueva banda correspondiente a la deformacin fuera del plano del grupo N=CHCOO- ,. Se logro establecer la importancia del grado de desacetilacin en la despolimerizacin qumica con sistemas con H2O2, ya que para sistemas de altos grados de desacetilacin se obtienen quitosanos de baja masa molecular. As mismo, se sintetizaron y caracterizaron derivados Iminas a partir de quitosano de baja masa molecular. Los quitosanos de diferentes grados de desacetilacin presentaron importante actividad antimicrobiana de amplio espectro para E. Coli, S. Aureus, S. Cervisiae y N. Crassa, sin embargo, solo mostraron actividades del tipo bactericidas para E. Coli y S. Aureus y fungistticas para S. Cervisiae y N. Crassa. Los quitosanos derivados Iminas de baja masa molecular, mostraron las mejores actividades bactericidas y fungicidas. Palabras claves: Quitosano, grado de desacetilacin, iminas, bactericidas, fungicidas, degradacin Correo electrnico: [email protected]
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15 Valbuena I, Ana C.. Obtencin de derivados de quitosano con posibles propiedades fungicidas y bactericidas Trabajo de Grado. Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Divisin de Estudios para Graduados. Laboratorio de Qumica Ambiental. Maracaibo, Venezuela, 2013, 89p
ABSTRACT
Nine different degree of deacetylation chitosans comprised between 73 97 % were synthesized. The degree of deacetylation was determined by FTIR and it was confirmed by elemental analysis. The crystallinity index determination was performed by X-Ray diffraction, observing decreasing of its index with increasing of degree of deacetylation. High and middle molecular masses were found in the chitosans obtained which were characterized by viscosimetric measurements. An oxidative degradation of the samples 82%, 88 % and 97% degree of deacetylation , was done subsequently using H2O2 activated with HCl . The fractions obtained were characterized by XRD and FTIR techniques. It was found that the degraded fractions can maintain the chitosan characteristic signals at high degrees of deacetylation and high index of crystallinity and, also, the spectral level showed a new band corresponding to a deformation outside the plane of N- CHCOO- group. It was established the importance of the degree of deacetylation chemical depolymerization using H2O2 systems, Low molecular weight chitosans can be obtained from high degrees of deacetylation chitosans. Likewise, imines were synthesized from low molecular weight chitosan and characterized by FTIR. A broad spectrum antimicrobial activity to E. Coli, S. Aureus, S. Cerevisiae and N. Crassa, was found for different degrees of deacetylation chitosans. However, only bactericidal activity was showed for E. Coli and S. aureus, and fungistatic activity for S.Cerevisiae and N. Crassa. Imines were synthesized from low molecular weight chitosan this type of derivative behaved as fungicide and bactericide. Keywords: Chitosan, degree of deacetylation, imines, antifungal, bactericidal, degradation Correo electrnico: [email protected]
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1. INTRODUCCIN
Un gran nmero de agentes fungicidas y bactericidas disponibles en el mercado presentan
caractersticas no compatibles con el medio ambiente y generan problemas de salud en los seres
humanos, es por esta razn que diversos grupos de investigacin estn desarrollando estrategias
alternativas para la obtencin de fungicidas y bactericidas a partir de biomasa especficamente a
travs de uno de los componentes importantes de sta como lo es el quitosano.1,2
La quitina es el segundo polisacrido ms abundante en la naturaleza despus de la celulosa.
Es un tipo de recurso natural renovable, que presenta un nmero especfico de propiedades, como
biocompatibilidad, biodegradabilidad y actividad no toxica hacia ciertas aplicaciones, por lo que
constituye una materia prima en potencia para obtencin de agentes antifngicos y bactericidas.2
Se encuentra en los crustceos, en el exoesqueleto de algunos insectos y en las paredes celulares
de muchos hongos y algas. El quitosano es su derivado, su principal fuente de produccin es a
partir de la hidrlisis de la quitina en medio alcalino; el quitosano es un heteropolisacrido y es la
forma desacetilada de la quitina. Est compuesto de dos subunidades D-glucosamina y N-acetil-
D-glucosamina, las cuales estn conectadas por la unin (14) glicosdica.3,4
Actualmente, numerosos autores1-4 han establecido que la actividad del quitosano ante entes
biolgicos depende de su distribucin de masa molecular, grado de desacetilacin, modificacin
qumica, grado de sustitucin, pH, longitud y posicin de los sustituyentes en las unidades
repetitivas de glucosamina y por supuesto del organismo objetivo. Estas variaciones podran
conllevar dos mecanismos diferentes de interaccin del quitosano con el microorganismo
especifico, el primero es la adsorcin del quitosano en las paredes celulares formando un
revestimiento de quitosano, rompimiento de la membrana y filtracin de este a travs de la pared;
el segundo es la penetracin del quitosano dentro de las paredes conllevando a la inhibicin de
varias enzimas y la interferencia con la sntesis del ARN y protenas.1-3
La variedad de grupos funcionales presentes en el quitosano tales como: grupos aminos y
grupos del tipo hidroxilo, ha hecho del quitosano uno de los materiales ms verstiles que se
pueden estudiar, por la posibilidad de realizar una amplia variedad de modificaciones qumicas,
obtenindose derivados que mejoran el desempeo del quitosano como agente antifngico y
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17 bactericida.5-6 Entre los derivados del quitosano se encuentran: N-(sulfonados), N-
(sulfobenzoilos), N,N,N-trimetil, N,O-(acilos), O-(acilos), dimetilpiperazinas, carboximetilados,
N heterociclos, complejos de quitosano con metales de transicin; adems de derivados a partir
de la degradacin oxidativa para la obtencin de fracciones ms pequeas de baja masa
molecular.1,2
Basados en las caractersticas estructurales y la aplicabilidad biocompatible de este
heteropolisacarido, en este trabajo se planteo la modificacin qumica del quitosano pudindose
generar productos con mejor desempeo fungicida y bactericida. Es importante resaltar, que el
uso del quitosano ha tomado mayor relevancia debido a que es un producto natural
biodegradable, no toxico y con propiedades antimicrobianas, por tanto este podra alcanzar las
necesidades mundiales de la agricultura sustentable.7
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18
2. FUNDAMENTOS TERICOS
2.1 Generalidades del Quitosano
2.1.1 Origen y Propiedades
La estructura de la quitina puede ser modificada mediante la eliminacin de los grupos
acetilo, que se vincula a los radicales amino en la posicin C2 del anillo glucopiranosidico, por
medio de una hidrlisis qumica en solucin alcalina concentrada a temperatura elevada para
producir una forma desacetilada (Figura 1). Cuando la fraccin de grupos amino acetilado se
reduce a 40-35 %, el copolmero resultante, (14)-2-amino-2-desoxi--D-glucano y (14)-
2-acetamida -2-desoxi--D-glucano, se conoce como quitosano. Pueden ser consideradas como
pertenecientes a la familia de los glicosaminoglicoles (GAG). Los glicosaminoglicoles son
particularmente interesantes debido a que expresan bioactividad.
O
NH
O
O
OH
O
O
OH
H2NHO
O
100-GAGA
12
3
4
56
124 5
6
3
Figura 1. Unidades repetitivas quitina y quitosano. La quitina est compuesta principalmente por la unidad N-acetil-glucosamina (GlcNAc) (GA); el quitosano est compuesto predominantemente por la unidad glucosamina (GlcNH2) (100 - GA).8
El quitosano se caracteriza fundamentalmente por su masa molar expresada como masa
molar promedio viscosimtrica (Mv) y por el grado de acetilacin (GA). Comercialmente este
presenta un porcentaje mayor a 85% de unidades desacetiladas (GA
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19 solubilidad del quitosano depende de su origen biolgico, de la masa molecular y grado de
acetilacin. 9-11
2.1.2 Obtencin
La quitina es producida bsicamente a partir de las cutculas de los crustceos, especialmente
a partir del cangrejo y el camarn. Otra fuente importante lo representan los esqueletos de los
cefalpodos. El mtodo para obtencin de quitosano a partir de quitina consiste en extracciones
sucesivas. El primer paso consiste en la desproteinizacin, esta se basa en colocar el material en
medio alcalino a una concentracin de aproximadamente 10 % m/v, a una temperatura controlada
no mayor a 80 C.12 La segunda se refiere a la desmineralizacin relacionada con la presencia de
una cantidad ms o menos significativa de carbonato de calcio en los caparazones.12 Este paso es
realizado con cidos minerales. Debe realizarse con cuidado, particularmente cuando se trata de
aplicaciones mdicas para lo cual la parte mineral debe ser eliminada, ya que se ha reportado que
los polisacridos se hidrolizan fcilmente en medio cido.11-12
El quitosano es producido a partir de la N-desacetilacin de la quitina.13,14 El mtodo ms
utilizado, consiste en el uso de soluciones altamente concentradas de NaOH (30 al 50%) a
temperaturas alrededor de los 90 C por tiempos de aproximadamente de una 1 hora. Estas
condiciones permiten obtener en un paso un GA del 10 al 15%. Si se repite una vez, la
desacetilacin puede encontrarse entre 95 y 96%. As mismo, se puede lograr una completa
desacetilacin con un proceso de tres pasos. Sin embargo, operar cada paso en condiciones
relativamente drsticas contribuye a un importante descenso de la masa molecular. Para evitar
este problema, se ha propuesto el uso de tiofenolato de sodio, el cual cataliza la reaccin y evita
la degradacin de la cadena. Este mtodo permite tambin la disminucin considerable de la
cantidad de hidrxido de sodio utilizada15. En la Figura 2 se observan los pasos elementales para
la obtencin del quitosano:
Figura 2. Esquematizacin del proceso obtencin de quitina, quitosano y quitano.16
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20 2.1.3 Aplicaciones
Debido a la variedad de grupos funcionales, en los que se encuentran grupos aminos en la
cadena polimrica y grupos del tipo hidroxilo, ha hecho del quitosano uno de los materiales ms
verstiles que se pueden estudiar, por la posibilidad de realizar una amplia variedad de
modificaciones qumicas que le confiere propiedades especficas que permiten aprovecharla en
diferentes campos, como se muestra en la Tabla 1.17
Tabla 1. Principales aplicaciones del quitosano.17
rea Aplicacin
Agrcola
Mecanismos defensivas en plantas. Simulacin de crecimiento de
plantas. Revestimiento para semillas en estaciones heladas.
Tiempo de liberacin de fertilizantes y nutrientes dentro de la
soya.
Tratamiento de aguas
Floculante como clarificador del agua (filtros de agua y piscinas).
Remueve iones metlicos. Polmeros ecolgicos (elimina
polmeros sintticos). Buen adsorbente (reduce hedores).
Alimentos
No es digerido por el hombre (dieta a base de fibra). Enlaza
lpidos (reduce el colesterol). Preservativos, Estabilizante y
espesante para salsas. Revestimiento para frutas como
proteccin, antifngico y bactericida.
Cosmetologa
Humectacin de la piel. Tratamientos para acn. Reduce la
esttica en el cabello. Mejora la flexibilidad del cabello. Tnicos
para piel. Cuidado oral (pasta de dientes, goma de mascar).
Biofarmacuticas Inmunolgicas, antitumorales. Hemostticos y anticoagulantes.
Sanaciones y bacteriosttico.
2.2 Caracterizacin Espectroscpica del Quitosano y Derivados
La quitina y el quitosano presentan numerosas e interesantes propiedades fsico-
qumicas, biolgicas, y mecnicas, con un gran potencial de aplicaciones que estn relacionadas
con el GA, ya que este es un parmetro fundamental que influye en las propiedades y en el
-
21 comportamiento de los mismos.18 Para los dos copolmeros es esencial el estudio de sus
estructuras qumicas, es as como la caracterizacin espectroscpica por FTIR (Siglas en ingles
de: Infrarrojo con Transformada de Fourier) es una tcnica relativamente rpida para una
evaluacin cualitativa del GA a travs de la determinacin de las reas de absorcin.19 En la
Tabla 2 se muestran algunas bandas de absorcin en el infrarrojo correspondiente a la quitina y
quitosano.1,18-21
Tabla 2. Asignacin de seales en la regin infrarroja para el quitosano y quitina.
Numero de onda (cm-1) Grupo funcional
3200-3500 (O-H y N-H)
2940-2930 C-H aliftica (grupos CH y CH2)
1727-1690 C=O (de acetamido)
1648 Amida I
~ 1623 C=O (de degradacin)
1597 -NH2
1555 Amida II
1480 C=O de COCH3
1458 C-H aliftica (grupos CH o CH2)
1425-1420 C-H aliftica (grupos CH3)
1254 O-H
1160-1140 C-O (alcohol secundario)
1089 O-H
1044 C-O (alcohol primario)
1028 C-O-C vibracin del anillo de la glucosa
895 y 1153 Bandas de absorcin glucosidcas (14)
777,5 Deformacin fuera del plano N=CHOO- al doble enlace N=C
: Estiramiento, : deformacin
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22
El GA se determina como se describe a continuacin: (1) por la determinacin de la relacin
de AM / AR: donde AM es la intensidad de una banda objetivo, que es la medida que corresponde
al contenido N-acetil o amina; y AR es la intensidad de una banda de referencia, con una
intensidad que no cambia con la GA. El GA de muestras desconocidas se puede estimar
comparando los valores de AM / AR con respecto a la relacin de muestras patrones con un GA
conocido, (2) por la obtencin de una curva de calibracin representando grficamente la relacin
de absorcin de la quitina/quitosano en funcin de GA conocido y no conocido, el GA de las
muestras desconocidas se estima a partir de la curva de calibracin. Las muestras para este tipo
de anlisis se preparan formando una pelcula delgada, hecha de una mezcla de KBr y quitina /
quitosano. Existen distintas relaciones de reas de absorcin que se han propuesto durante el
tiempo para determinar el GA dentro de las cuales se destacan: A1560/A2875, A1655/A2875,
A1655/A3450, A1320/A3450, A1655/A1070, A1655/A1030, A1560/A1160, A1560/A897, y A1320/A1420 .18
Por otro lado el quitosano soluble en medio acuoso, puede ser caracterizado a travs de la
espectroscopa ultravioleta-visible,19 en esta regin del espectro, el polisacrido presenta
absorbancias en el rango de 190-220 nm correspondiente al grupo acetilo de quitina o quitosano.
Sin embargo, existen mtodos propuestos que permiten la caracterizacin realizando la primera
derivada del espectro entre 202 y 208 nm donde existen mnimas interferencias, esta primera
derivada del espectro UV presenta valores correspondientes a concentraciones de GLuNAc,
especficamente a 203 nm, que se establece como longitud de onda de mxima absorcin.24
As mismo, existen dos unidades repetitivas en el quitosano, en cada unidad existen seis
carbono (C1-C6) identificados de acuerdo a la posicin de la unin piranosidica, y siete tomos
de hidrogeno estos tomos forman enlaces C-H, ubicados en la unidad GluNAc y
GluNH2. Adems, cada unidad del polmero tiene cuatro tomos de hidrgeno que estn unidos
con cuatro tomos de oxgeno formando grupos del tipo O-H. Cada uno de estos enlaces ubicados
en las unidades repetitivas que poseen caractersticas propias que se modifican en diferentes
ambientes qumicos proporcionando distintos desplazamientos qumicos en Resonancia
Magntica Nuclear (RMN) como puede observarse en la Tabla 3.22-25
-
23
Tabla 3. Asignacin de seales en resonancia magntica nuclear para muestras de quitina y quitosano.23
Desplazamiento qumico(, ppm) Tipo de Protn o Carbono
4,62 4,85 H1 (H1 de GluNAc)
4,85 4,97 H1 (H1 de GluNH2)
3,18 3,24 H2 (H2 de GluNH2)
3,38 3,65 H2 (H2 de GluNH2)
3,52 3,87 H3 (H3 de GluNH2)
3,52 3,65 H3 (H3 de GluNAc)
3,74 4,34 H3, H4, H5, H6, H6
1,95 2,09 HN-COCH3
2,09 2,11 CH3COOH (AcOH)
102,7 105,7 C1
55,2 57,6 C2
73,1 - 75,7 C3
80,9 85,7 C4
73,1 75,7 C5
59,6 60,8 C6
22,8 29,3 N-CH3 (C7)
173,6 173,8 N-C=O (C8)
2.3. Caracterizacin Fisicoqumica del Quitosano y Derivados
El quitosano es un polisacrido que posee distintas propiedades fisicoqumicas; la respuesta
del quitosano frente a distintas aplicaciones depende de su masa molar, y de la distribucin de
masas molares, DPM. Si la masa molar es conocida, junto con buena comprensin de la
conformacin del polmero, se pueden estimar una gran variedad de propiedades, reolgicas y
mecnicas. Para la determinacin del DPM generalmente se estiman ( v, n y w). Sin
embargo, la determinacin de la masa molar viscosimtrica v, es un mtodo que proporciona
una informacin ajustada del valor de masa molar. La viscosidad intrnseca de una solucin de
-
24 polmero se relaciona con la masa molecular de acuerdo a la ecuacin (1) de Mark-Houwink-
Sakurada.
[] = KMv (1)
donde [] es la viscosidad intrnseca, Mv es la masa molecular viscosimtrica, K y son las
constantes para un determinado sistema soluto-solvente.26 Estas constantes depende del GD del
quitosano, del solvente y de la temperatura empleada.
K = 1,64 x 10-30 GD44 (2)
= -1,02 x 10-2 GD + 1,82 (3)
Para calcular el Mv, generalmente se usan soluciones de CH3COOH/NaCl 0,2 M a 25 C.27
Las constantes K y son necesarias para: determinar la masa molar viscosimtrica, asi mismo, es
posible usar esta informacin para construir una curva de calibracin universal en SEC (Siglas en
ingles de: cromatografa de exclusin por tamao), determinar el volumen hidrodinmico de
polmeros []Mv, para interpretar los datos de SEC que se transforman en DPM y para los datos
de masa molar a partir del uso de patrones de polmeros, extrapolar propiedades y as caracterizar
un polmero con caractersticas desconocidas. Por lo tanto, la evaluacin de la masa molar
viscosimtrica de un polmero a partir de mediciones de la viscosidad intrnseca es prctica, til y
certera.26-30
Otras tcnicas que permiten proporcionar informacin sobre las caractersticas fisicoqumicas
del quitosano, son las tcnicas de anlisis trmico, para el caso del anlisis trmico diferencial de
barrido (DSC) en muestras de quitosano a una temperatura de 70 C aparece un pico relacionado
por el agua que interacciona con el quitosano, luego a una temperatura alrededor de 200 C se
observa generalmente la Tg temperatura de transicin vtrea del heteropolisacarido y
aproximadamente despus de los 290 C este tipo de muestras experimentan una degradacin
trmica antes de fundir. As mismo, para el caso del anlisis termogravimtrico (TGA) en
condiciones de atmsfera de nitrgeno , estos tipos de anlisis indican que el quitosano tiene tres
etapas caractersticas de desprendimiento de masa, en la primera pierde aproximadamente el 10%
de la masa que corresponde al agua adsorbida, esta se evapora a temperaturas por debajo de 100
C. Esto significa que el agua esta adsorbida fsicamente y/o enlazada dbilmente por enlaces de
-
25 hidrgeno a molculas de quitosano (Etapa 1). La descomposicin comienza inmediatamente a
partir de la prdida del 10% en masa, que comienza por encima de 100 C y en 168 C alcanza la
velocidad mxima (Etapa 2). El estado mximo de degradacin trmica aparece a partir de 230
(con un valor mximo a 274 C) durante los cuales generalmente hay una prdida de masa
equivalente al 43 % (Etapa 3). Esto es causado por la despolimerizacin de las cadenas de
quitosano, la descomposicin de los anillos de piranosa a travs de la deshidratacin, la
desaminacin y finalmente la apertura del anillo. Es preciso aadir que la degradacin trmica del
quitosano se produce principalmente a travs del mecanismo de radicales libres. Productos
intermediarios radicales pueden recombinarse espontneamente como resultado de la formacin
de estructuras reticuladas. Las redes reticuladas son ms estables que las cadenas lineales y por lo
tanto pueden estar presentes en el residuo carbonaceo. 31-32
La cristalinidad es una caracterstica muy importante de los compuestos qumicos, esta puede
ser determinada por difraccin de rayos X, un patrn general de difraccin de rayos X para el
quitosano generalmente muestra dos picos a 2 = 10,33 y 19,80 correspondientes a las
reflexiones (020) y (100). Hasta ahora, se han propuesto seis polimorfos para quitosano:
quitosano ligamento, requemado, 1 -2, L-2, forma reducida-I y forma-II. La forma I cristalina es
una celda ortorrmbica con una unidad de a = 7,76; b = 10,91 y c = 10,30 .El mximo de
reflexin a (100) aparece a 2 = 11,4. La forma cristalina II es tambin una celda ortorrmbica
con una unidad de a = 4,4, b = 10,0 y c = 10,3 (eje de la fibra). El mximo de reflexin a (100)
aparece a 2 = 20,1. En la unidad de quitosano, hay 11 tomos de H, 6 tomos de C, 1 tomo de
N, y 4 tomos de O, por tanto para el clculo de cristalinidad se considera que el grado de
desacetilacin del quitosano es de 100 %, y se establece la ecuacin (4) mostrada a
continuacin.27
f2 = 11 fH 2 +6 fC 2 + 4 fO 2 + fN 2 (4)
Donde f es el rea de los picos de cristalinidad, referentes a cada unidad del quitosano. De
esta manera, se puede calcular el grado de cristalinidad de una muestra.
-
26 2.4 Derivados de Quitosano como Fungicidas y Agentes Bactericidas
2.4.1 Caractersticas Fungicidas y Bactericidas del Quitosano
La quitina y el quitosano en diferentes presentaciones tales como: soluciones, pelculas y
materiales compuestos, han sido investigados como un material bactericida contra una amplia
gama de organismos: algas, bacterias, levaduras y hongos in vivo e in vitro. Generalmente, el
quitosano acta como un bactericida o bacteriosttico (obstaculiza el crecimiento de bacterias
sin implicar la aniquilacin de las mismas) a menudo no se puede distinguir entre algunas de
las actividades. Sin embargo, el quitosano tiende a ser identificado como bacteriosttico ms
que bactericida, aunque el mecanismo exacto no se conoce del todo, existen otros factores que
pueden contribuir a la accin antibacteriana, entre los cuales se encuentran.
1. Concentracin utilizada, es decir, una alta o baja inhibicin en el desarrollo del hongo est
ligada simultneamente a la dosis aplicada.
2. Naturaleza policatinica del quitosano; se cree que esta es la clave de su naturaleza
antifngica ya que la mayora de las paredes celulares de los hongos estn cargadas
negativamente.
3. Longitud de la cadena de este biopolmero, aumentando la superficie catinica en contacto
con el hongo.
4. Efecto inhibitorio en la sntesis de enzimas macerantes producidas en los hongos, como la
poligalacturonasa, pectina metil estarasa, pectato liasa y celulasa.
5. Produccin de compuestos fenlicos como el acido clorognico, acido cafico y ciertas
fitoalexinas como la risitina.
6. Formacin de barreras estructurales (papilas, lignificacin, tilosas) que impiden la
penetracin de los hongos en el hospedero.7,34-39
El quitosano puede inhibir el crecimiento de algunos hongos como Alternaria alternate,
Botrytis cinerea, Colletrotichum gloeosporioides y Rhizoppus stolonifer siendo afectado el
indice de inhibicin por la concentracin de quitosano. El crecimiento de hongos como F.
-
27
oxysporum, R. stololonifer, Penicillium digitatum, and C. gloeosporioides puede ser inhibido
por el quitosano a una concentracin del 3 % m/v. Con respecto a la actividad antifngica del
quitosano muchos estudios se han enfocado a los efectos de la distribucin de tamao
molecular y grado de desacetilacin, as mismo, el uso de derivados del quitosano ante entes
fngicos tambin proporciona mayores actividades, con respecto a quitosano sin modificar.33
En contraste, existen condiciones de concentracin establecidas en las cuales el quitosano sin
modificar inhibe una serie de microorganismos importantes (Ver Tabla 4).5-6,40
Tabla 4. Concentracin mnima inhibitoria de quitosano, para algunos microorganismos. 40
Organismos Sensibles CMI (ppm) Organismos Sensibles CMI (ppm)
Gram Negativas Gram Negativas
Escherichia coli 20, 100, 468, 650 y 1000
Xanthomonas campestris
500
Salmonella enterica 2000 y 3000 Samonella tiphymurium >1000
Pseudomonas aeruginosa >20 y 1700 Aeromonas hydrophila 1000
Gram Positivas Gram Positivas
Bacillus cereus 800, 700 y
>1250
Listeria monocytogenes 150, 250 y
800
Hongos Hongos
Aspergillus fumigatus >2000 Aspergillus parasiticus >2000
Fusarium oxysporum
100 Botrytis cinerea
10
CMI: Concentracin Mnima Inhibitoria
2.4.2 Degradacin Oxidativa de Quitosano
Los estudios realizados sobre algunas bacterias Bacillus cereus, E. coli, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, B. subtilis, Listeria monocytogenes y
Klebsiella pneumoniae, demostraron que para el caso de quitosano de masas molares (MM)
menores, se observa una mayor actividad, reflejada en la disminucin del crecimiento de los
microorganismos y en su multiplicacin. El tamao y conformacin parece ser fundamental para
-
28 entender la efectividad del quitosano ante estos entes. La movilidad, la atraccin y la interaccin
inica de cadenas pequeas resulta ser ms eficiente a la hora de realizar protecciones de
membranas celulares con uniones eficaces en la superficie de los organismos, en comparacin
con cadenas ms largas y de conformaciones ms amplias. De manera similar, en lo que respecta
la accin del quitosano en presencia de hongos, este puede establecerse como un agente
fungisttico y no fungicida, con muchas potencialidades que pueden establecer cambios de
ordenacin, tanto en el hospedero como en el hongo.
Generalmente el quitosano tiende a ser eficaz en la inhibicin de la germinacin de esporas,
la elongacin del tubo germinativo y el crecimiento radial. La mayora de los estudios se han
realizado en levaduras y hongos asociados al deterioro de plantas y de alimentos. Para estos
microorganismos, en presencia de quitosano se activan varios procesos en el tejido vegetal, donde
las quitinasas inducen una intervencin sobre los micoparsitos biotrficos y necrotrficos, en
hongos entomopatgenos y en hongos micorricicos arbusculares. Los estudios realizados en
cultivos de R. solani y S. rolfsii en medios nutridos por agar, han indicado que el porcentaje de
germinacin del hongo disminuy con el aumento de la concentracin de quitosano en el
medio.40
Existen varios mtodos para degradar el quitosano y obtener fracciones de menor masa
molar en los que se incluye la hidrlisis enzimtica, hidrlisis cida, irradiacin de alta energa,
degradacin trmica y por tratamiento ultrasnico, el quitosano es sensible a una amplia variedad
de agentes oxidantes, los cuales ocasionan cambios estructurales significativos. 41
En la bsqueda de agentes oxidantes limpios y eficientes el perxido de hidrgeno surge
como una alternativa apropiada. En medio alcalino puede actuar como una especie nucleoflica
formando el anin hidroperxido (HOO-) y en medio cido el reactivo es estable (pH
-
29 radicales libres de gran alcance por la disociacin del H2O2, lo que efectivamente puede atacar a
los enlaces -(14)-D-glucosdicos y degradan el quitosano obtenindose as quitosano de
masas moleculares bajas. Sin embargo, estos mtodos son ineficientes cuando se utiliza solo
H2O2. Para mejorar la eficacia, se combina la degradacin con H2O2, en presencia de tcnicas
qumicas y fsicas.42-48
En el sistema de despolimerizacin del quitosano con H2O2, los reacciones existentes son
las mostradas en las ecuaciones (5) y (6), y la reaccin total es mostrada en la ecuacin (7).
R-NH2 + H + R-NH3+
H2O2 H + + HOO -
H2O2 + R-NH2 + H + R-NH3 + + H + + HOO -
(5)
(6)
(7)
El anin hidroperxido es muy inestable y fcilmente descompuesto en oxgeno radical y en
el grupo hidroxilo ver ecuacin (8) y (9)
HOO- OH- + O. (8)
H2O2 + HOO- HO.
+ O2.- + H2O (9)
El radical hidroxilo es un oxidante muy potente. La principal accin del HO. con el
polisacrido ha sido la abstraccin de hidrgeno y posterior formacin de agua. Reacciona con
los hidratos de carbono muy rpidamente se muestra en las ecuaciones (10) y (11).
(GlcN)m (GlcN)n + HO. (GlcN)m (GlcN)n + H2O (10)
(GlcN)m (GlcN)n + H2O (GlcN)m + (GlcN)n (11)
Durante el tratamiento, el R-NH2 preferentemente reacciona con H+ para producir R-NH3+,
lo que provoca la disminucin de H+ y el aumento de pH. As mismo, se muestra en la ecuacin
(7). Adems, el H2O2 es descompuesto a HO. , lo que significa que el H2O2 es continuamente
descompuesto como se muestra en la ecuacin (8). Estos radicales al someterse a otras reacciones
de oxidacin da como resultado productos de masas moleculares bajas.44-46,48,49
-
30
La qumica de oxidacin con perxido de hidrgeno en presencia de radiacin ultravioleta es
una tcnica que puede ser aplicada con xito en la oxidacin de muchos procesos. La luz
ultravioleta a (
-
31 cetona en la que ha sido sustituido el grupo carbonilo (C=O) por una imina o grupo azometina.
En los diferentes derivados del quitosano, existen diferentes tipos de grupos aminos como aminas
primarias (R-NH2), iminas (-C=N) en bases de Schiff de quitosano, aminas secundarias (R2-NH)
en quitosano N sustituido y sales amonio cuaternario (R3N+). Generalmente muchos de estos
productos derivados presentan actividades antifungicas o bactericidas para Btrytis cinerea Pers.
(B. cinerea Pers) y Colletotrichum lagenarium (Pass) Ell. et halts (C. lagenarium (Pass) Ell.et
Halts).18 En la Figura 3 se muestra la ruta de la sntesis.50-56
OOH
H2NHO
O
100-GA
124 5
6
3
OOH
N=CHRHO
O
100-GA
124 5
6
3
RCHO
OOH
NHCH2RHO
O
100-GA
124 5
6
3
OOH
NCH2RHO
O
100-GA
124 5
6
3
A
B
CH3I,NaI/NaOH
NaBH4
H3C CH3+
I-
Figura 3. Ruta sinttica para la preparacin de los derivados de quitosano N sustituidos (A) Iminas a partir de quitosanos (B) N-alquil quitosanos.
Estos microorganimos B. cinerea Pers y Colletotrichum lagenarium (Pass) Ell.et halst
representan las mayores enfermedades de vegetales y frutas en el mundo. La sntesis de
antifngicos para el control de estas enfermedades en especfico proporcionaran una gran ventaja
al mundo de los fungicidas y ms an si se lograrn obtener estos de forma ecoamigable.38
Los derivados de quitosano N- bencilados (ver Figura 4) son muy importantes para el control
patgeno de algunos microorganismos en las plantas como Agrobacterium tumefaciens,
Fusarium oxysporum hongo patgeno de la enfermedad Pythium debaryanum.
-
32
OOH
H2NHO
O
100-GA
124 5
6
3
OOH
N=CHHO
O
100-GA
124 5
6
3
ArCHO, AcOH/H2O 1 %1 h, Temperatura ambiente
NaBH4(1.5 moles)
1.5 h,Temperatura ambiente
R
OOH
NHCH2HO
O
100-GA
124 5
6
3
R
Figura 4. Ruta sinttica para quitosanos N-bencil sustituidos.
Algunos estudios muestran que el quitosano como agente antifngico es evaluado en medios
cidos debido a su baja solubilidad sobre pH 6,5. Sin embargo, no se puede ignorar experimentos
en medios bsicos es por esta razn que se han realizado derivados solubles en medios bsicos
fisiolgicos y pueden ser una opcin para pesticidas policationicos. La obtencin de
sulfanilamidas derivados de quitosano y derivados de quitosano O-sustituidos (ver Figura 5) han
mostrado un incremento de la solubilidad de estos compuestos en un medio ligeramente ms
bsico a neutro pH ~ 7,5 adems de actividades antifngicas en hongos patgenos P. asparagi y
Aiternaria solani.36-39
OOR
H2NHO
O
100-GA
124 5
6
3
OOR1
NHHO
O
100-GA
124 5
6
3HN SO2Cl
O
NH
O2S
O
R=H , R1 =HN SO2Cl
O R=R1=SO3- R=R1=CH2COOH
Figura 5. Ruta sinttica de derivados sulfanilamidas de quitosano, quitosano carboximetilado y sulfatos de quitosano.
-
33
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivos
3.1.1 Objetivo General
Obtener derivados de quitosano con posibles propiedades fungicidas y bactericidas; mediante,
hidrlisis alcalina, degradacin oxidativa con perxido de hidrogeno y por reacciones de
iminacin.
3.1.2 Objetivos Especficos
1. Obtener quitosano de diferentes grados de N-desacetilacin por hidrlisis alcalina de la
quitina extrada de los exoesqueletos de crustceos.
2. Obtener derivados de quitosano (fracciones), por medio de reacciones orgnicas de
degradacin oxidativa con perxido de hidrogeno.
3. Sintetizar derivados de quitosano tipo base de Schiff por reacciones de iminacin con
diversos aldehdos.
4. Caracterizar qumica y fisicoqumicamente los derivados de la quitina y del quitosano
(FTIR, anlisis elemental, difraccin de rayos X y viscosidad, entre otras).
5. Evaluar las propiedades fungicidas y bactericidas del quitosano y derivados, a travs del
uso de medios de cultivo lquido definidos.
-
34
4. PARTE EXPERIMENTAL
4.1 Muestras, Reactivos y Materiales
Los desechos industriales de cangrejo fueron obtenidos de la industria cangrejera
Promarca. Para la extraccin de la quitina y obtencin del quitosano se utiliz sulfito de sodio
(Merck, 98 % de pureza) como agente antioxidante, NaOH, HCl y etanol al 99%, cido actico
glacial (Merck), NH4OH (J.T. Baker, 95 %.), p-dimetilamino benzaldehdo (Merck, 98 % de
pureza) y vainillina (Reidel de Haen, 95 %). La degradacin del quitosano se llev a cabo con
HCl (Baker, 85%), H2O2, marca (J.T. Baker, 35 % ). Todo el material de vidrio utilizado fue
marca Pyrex, Kimax o equivalente. Las pruebas microbiolgicas se llevaron a cabo con
Escherichia Coli (E. Coli) CVCM2070, Staphylococcus aureus (S. ureos) CVCM764 de la
coleccin bacteriana de la UCV, Saccharomyces Cerevisiae y Neurospora Crassa, se utilizo
medio de cultivo comercial LB Broth (Lennox L Broth) para las bacterias, YPD para las
levaduras y MPPY para los hongos. Se uso como material de referencia quitosano comercial
marca Aldrich de alta (QAMM), mediana (QMMM) y baja masa molar (QBMM).
4.2 Equipos
Para medir las masas de los desechos industriales de cangrejos y NaOH durante la
extraccin de la quitina y obtencin del quitosano se us una balanza digital (Premier) con
sensibilidad 5 g, para el resto del proceso se utiliz una balanza analtica (Dhaus) con
sensibilidad 0,0001 g, para las reacciones de desproteinizacin, desmineralizacin y
desacetilacin se utiliz un reactor elaborado por la empresa Acerinox en acero inoxidable con
camisa de calentamiento a llama y provisto de agitacin. Las reacciones de degradacin se
llevaron a cabo en planchas de calentamiento (Cimarec) con agitacin magntica.
Espectrmetro IR marca Shimadzu modelo FTIR 8400; Difractmetro de Rayos X marca
Bruker modelo D8 Focus; Analizador Elemental marca Leco Modelo Truspec CHN y un
espectofotrometo Tecan con 96 pozos para multianalisis. DSC TA Instrument.
-
35
Incubadora (VWR, 1217), congelador criognico vertical (Thermo, 5704),
4.3 Obtencin del Quitosano
Se trituraron los desechos de la industria cangrejera y se colocaron en un reactor, con
solucin de NaOH al 10 % m/v en una proporcin 1:1 (m:v) y sulfito de sodio al 1 % como
agente antioxidante para evitar la degradacin del material y se calent a 103C por 60 min, para
la eliminacin de restos de protenas. Luego de lavar repetidas veces con abundante agua, se
agreg solucin 1 M de HCl en proporcin 3:1 (m:v) durante 3 ocasiones hasta desaparicin
completa de la efervescencia tpica de la reaccin del CaCO3 con soluciones cidas. La quitina
obtenida fue lavada con abundante agua para eliminar el cido en exceso y sometida a un
tratamiento termo alcalino con solucin al 30 % y 50 % de NaOH y al 1 % de sulfito de sodio
como agente antioxidante durante distintos periodos de tiempo a 103 C, con el fin de hidrolizar
los grupos acetamido en el C2 de la quitina, este paso fue repetido una o ms veces segn fue
necesario para obtener quitosanos con grados de desacetilacin relativamente altos. Por ltimo, el
quitosano se lavo repetidamente con etanol al 99 % para decolorarlo.
4.3.1 Purificacin del Quitosano
El quitosano se disolvi en solucin de cido actico al 3% m/v, agitando fuertemente
hasta disolucin completa, se filtr en papel Whatman 41 para eliminar materia insoluble y luego
se aadi solucin concentrada de NH4OH para precipitar el gel. El precipitado obtenido se lav
con agua destilada para la eliminacin del NH4OH en exceso y se sec a 40 C en estufa.
4.3.2 Degradacin Oxidativa del Quitosano de distintos grados de desacetilacin
Se disolvi 250 mg de quitosano purificado en 50 ml de solucin de HCl 0,5 % en
agitacin constante y se llev a una temperatura de 50 C se le adicion una solucin de H2O2 al
0.68 M. Esta reaccin se repiti a diferentes tiempos de reaccin (30, 90, 150 y 240 min)
manteniendo las otras variables de reaccin, se centrifug obtenindose una fraccin que se seco
a 40 C por 5 horas.
-
36 4.3.3 Preparacin de Iminas de baja masa molecular
Se disolvi el quitosano obtenido durante el proceso de degradacin oxidativa, en cido
actico al 3% (v/v) utilizando una mezcladora durante 5 min o hasta observar disolucin
completa y se aadi solucin de p-dimetil-aminobenzaldehdo y vainillina al 2 % en etanol y se
dejo reaccionar durante 6 horas, se evaporo solvente en una estufa a 50 C y se lavo el slido
obtenido con etanol, luego las muestras obtenidas fueron liofilizadas.
4.4 Caracterizacin del quitosano
4.4.1 Espectroscopia FT-IR
Para realizar el anlisis por FTIR se prepararon pastillas mezclando 2 mg de quitosano
con 148 mg de KBr seco. Las pastillas fueron medidas con 10 escaneos a una resolucin de 4cm-1
en un rango 750 cm-1 a 3750 cm-1. El grado de desacetilacin GDA se determino utilizando las
ecuaciones 13 y 14:
A1320 / A1420 = 0.3822 + 0.03133 * GA (13)20
GDA = 100 - GA (14)
4.4.2 Difraccin de Rayos X
Se llev a cabo un estudio de difraccin de rayos X a los quitosanos obtenidos y a las
fracciones degradadas resultantes de la reaccin de oxidacin utilizando un difractmetro de
rayos X de radiacin de Cu K (=1,54 A) con promedio de escaneo de 0,05 por paso y en un
rango desde 5 hasta 40, con el fin de observar los cambios en la cristalinidad luego de la
reaccin de desacetilacin y de degradacin oxidativa. El ndice de cristalinidad X (%) se
determino mediante la ecuacin 38:
X (%) = [ ( I110 Iam ) / I110 ] * 100 (15)
-
37 4.4.3 Anlisis Elemental
Se realiz el anlisis de combustin de las muestras de quitosano obtenidas a travs de la
toma de aproximadamente 1,0 -1,5 mg de muestra, estas se introdujeron en un Analizador
Elemental marca Leco Modelo Truspec CHN para determinar los porcentajes de C, N e H, se us
como patrn de referencia EDTA, estos anlisis se realizaron por triplicado. Los resultados
obtenidos en funcin de la relacin C/N permitieron determinar los grados de desacetilacin
(GDB) utilizando la expresin (16):
GDB = [1- (C/N 5,145)/ 1,716] *100 (16)
4.4.4 Masa Molar Viscosimtrica
Los anlisis viscosimtricos se realizaron en un viscosmetro marca Anton Paar Modelo SVM
3000, se prepararon soluciones de quitosano con una rango de concentraciones de (0 10 ) g/L,
con las condiciones y los solventes descritos en la Seccin 2.3. Se tomo como material de
referencia quitosanos comerciales en los rangos de alta, mediana y baja masa molar para
corroborar los resultados obtenidos con los quitosanos extrados durante este trabajo.
4.4.5 Anlisis Calorimtrico Diferencial de Barrido
En un DSC marca TA Instrument se someti 2 mg aproximadamente de quitosano en
capsulas de aluminio a un programa de calentamiento desde 30 a 350 C en un flujo de 10 C/
min, en una atmosfera de N2 obtenindose as las curvas de flujo calorfico caractersticas de cada
muestra de quitosano.
4.5 Pruebas microbiolgicas
Se evaluaron los siguientes derivados de quitosano: quitosano altamente desacetilado,
quitosano degradado oxidativamente e Iminas de baja masa molecular con distintos grados de
desacetilacin.
-
38 4.5.1 Pruebas bactericidas
4.5.1.1 Activacin y aislamiento de las bacterias:
Se inocul, la cepa de E. coli CVCM2070 y S. aureus CVCM764, en 30 mL de medio
nutritivo (LB Broth ) contenido en un Elermeyer de 250mL estril.
Posteriormente se llevaron a incubadora con agitacin a 100 rpm durante 24 h a 37 C. Se
procedi al aislamiento de la bacteria, siguiendo el siguiente procedimiento, se tom 15 L del
cultivo crecido anteriormente, y se sembr por separado dichas bacterias en capsulas de Petri con
Agar nutritivo (Igual al medio nutritivo + Agar al 1.5 %) y, aplicando el mtodo de siembra por
agotamiento, luego stas fueron llevadas a una incubadora durante 24 h a 37 C.
Una vez obtenido el aislamiento, se tomo de las placas una colonia (UFC) e inoculada en
caldo nutritivo, se llevo a cabo con agitacin 100 rpm, a 37 C durante 24 h. Para la
conservacin de las bacterias, se adicionaron 500 L del cultivo de bacterias crecido previamente
y 500 L de glicerol al 60% en tubos eppendorf estriles, se obtuvo como volumen final 1 mL del
cultivo bacteriano, posterior a ello, se llevo a un congelador a 80 C.
4.5.1.2 Cintica de crecimiento de E. coli CVCM2070 y S. aureus CVCM764.
Se activo nuevamente las bacteria E. coli CVCM2070 y S. aureus CVCM764 de acuerdo al
experimento de la seccin anterior, a diferencia de este se tomo como inoculo inicial, el cultivo
conservado y se sembr en 30 mL de LB Broth. Posteriormente, se sembr 3 ml del cultivo de
bacterias crecido y fueron diluidos en 30 mL de LB Broth estril, se llev a incubar con
agitacin a 100rpm durante 1h.
Fueron tomados 100 L del cultivo crecido durante 1h, y se mont por triplicado en tubos de
ensayo de 20ml los siguientes ensayos, para garantizar que los solventes empleados en las
proporciones mostradas en la Tabla 5 permitan la solubilidad del quitosano y a su vez no inhiban
el crecimiento de las bacterias. Posteriormente, se llevaron dichos ensayos a la incubadora con
agitacin 100 rpm, y se realiz un seguimiento durante cada hora, mediante el uso un
espectrofotmetro a 600 nm.
-
39
Tabla 5. Ensayo de crecimiento de las bacterias con los solventes a emplear en la solubilidad
del quitosano.
Cultivo de Bacterias Solventes
100 L 775 L: Agua (Control)
100 L 775L: cido Actico 1 %
4.5.1.3 Efecto del quitosano en el crecimiento bacteriano por difusin en medio lquido definido
(Antibiograma).
Para la construccin del Antibiograma, se realiz la cintica de crecimiento de E. coli y de S.
aureus, en presencia de diferentes concentraciones de quitosano (1,56; 3,12; 6,25; 12,5; 25; 50;
100 y 200 ppm), adems de un control representado por el agua y el acido actico al 1 % luego se
llev incubar con agitacin a 100 rpm durante el tiempo correspondiente a la cintica de
crecimiento de la bacteria estudiada, en este caso E. Coli y para S. aureus especficamente,
posterior a ello se midi la absorbancia a 600 nm.
4.5.2 Pruebas fungicidas
4.5.2.1 Cintica y antibiograma de levaduras.
Se realiz la activacin de la cepa Saccharomyces Cerevisiae en medio de cultivo lquido
de Levadura marca Fleshman a 30 C y 37 C, se observ la activacin de estas levaduras a
partir de las 36 h, debido a una turbidez a 600 nm de 0.8889 para S. Cerevisiae y para C.
Guilliermondii de 0.7769, se procedi a realizar el aislamiento para obtener colonias individuales
para este procedimiento se us el mismo medio de cultivo de levadura de panadera pero con
medio gelificante (Agar) vertido en capsulas de petri.
El proceso de aislamiento consisti en colocar un volumen de 15 L de cultivo crecido
por 12 h y se realiz la tcnica de agotamiento o difusin para aislar las colonias, luego de
realizar la difusin se colocaron a incubar a las temperaturas de 30 C y 37 C por 36 h, para el
-
40 caso de la S. Cerevisiae se obtuvo un aislamiento efectivo en ese medio de cultivo, para el caso
de C. Guilliermondii no hubo ningn resultado.
Se realizaron pruebas de solubilidad de las muestras de quitosano con el medio de cultivo
de levadura de panadera, estas muestras revelaron que ese medio estimula la precipitacin del
quitosano, indicando que este medio no es adecuado para realizar los ensayos de actividad
antimicrobiana. Por esta razn se modific el medio de cultivo ya optimizado, y se utiliz el
medio YPD y YPD2 (doble de concentracin del medio YPD) para la activacin y aislamiento, se
realiz la activacin de la cepas Saccharomyces Cerevisiae y Candida Guilliermondii en el
medio YPD y YPD2 a 30 C y 37 C, se observ la activacin de estas levaduras a partir de las
36 h, debido a una turbidez a 600 nm de 1.2456 para S. Cerevisiae y para C. Guilliermondii de
0.0025 lo que indic para el caso de C. Guilliermondii no hubo activacin en esos medio de
cultivos. As mismo, se procedi a realizar el aislamiento con los medios de cultivo YPD y YPD2
en Agar, para el caso de la S. Cerevisiae se obtuv un aislamiento efectivo en esos medios de
cultivo.
Luego del aislamiento se tomo una colonia individual se incub en los medios de cultivo
por 12 h luego se tomo 1 mL y 2 mL y se preincubaron por 1 hora, se tomaron placas de 96 pozos
y se evaluaron para ambos medios de cultivo los siguiente volmenes de inoculo 5, 10, 20 y 40
L en un volumen final de 200 L, se tomaron mediciones cada hora por 17 horas a 600 nm.
Se estableci entonces que la cintica de crecimiento para S. Cerevisiae presenta en todas su
condiciones una fase de latencia hasta las 10 horas, a partir de all empieza su fase de crecimiento
y a partir de 16 h inicia su fase estacionaria, se estableci como volumen de inoculo optimo 40
L, y volumen de inoculo optimo a preincubar 2 mL. Se realizaron las pruebas antimicrobianas
con quitosano desde (0 400) ppm.
4.5.2.2 Cintica de crecimiento de hongos filamentosos
Para realizar el seguimiento del crecimiento de Neurospora Crassa se cuantific glucosa
no consumidas por el hongo. Se conoce que el consumo de glucosa es inversamente proporcional
al crecimiento en biomasa, razn por la cual se utilizan el consumo de glucosa como parmetro
indirecta que indiquen la fase del metabolismo en la cual se encuentren los hongos analizados en
la cintica. Los hongos crecidos en MPPY Agar, luego de 12 h para N. Crassa, se tomo con un
-
41 sacabocado un fragmento del micelio y se llevo a tubos falcons de 15 mL con 2 mL de MPPY
liquido, y se realizo el estudio de consumo de glucosa durante el tiempo a 26 C por 36 h. Se
utilizo una tcnica enzimtica en la que se detecta glucosa por la glucosa oxidasa.
Se utiliz el mtodo enzimtico para determinacin de glucosa a partir de un kit comercial
marca Qualitest. Para la reaccin enzimtica se tomaron 10 L de la muestra o patrn con 1 mL
de la enzima. Se incuban por 10 minutos a 37C o por 30 minutos a temperatura ambiente. Se
determino la cantidad de glucosa a 510 nm. El color es estable por una hora. Se realizaron
diluciones seriadas 1/100 de cada muestra. Se realiz una curva de calibracin, utilizada como
sistema de referencia, todas las veces que se analizaron las muestras. La concentraciones fueron :
1, 5, 10, 50, 100, 200, 400, 800 g de glucosa/mL. Una vez analizadas las muestras en el
espectrofotmetro, se calcul la concentracin de glucosa y se determino el avance del
crecimiento del hongo durante el tiempo. As mismo, para la determinacin del antibiograma
frente al quitosano se sigui el procedimiento mostrado anteriormente incluyendo en cada
sistemas concentraciones de quitosano de (20 800) ppm.
-
42
5. RESULTADOS Y DISCUSIN
5.1 Obtencin del Quitosano
Se someti a varias hidrolisis alcalinas a una muestra de quitina (Q0) donde se obtuvo
quitosano de diferentes grados de desacetilacin (Q1- Q9), estos GD fueron determinados por
FTIR y CHN mostrando una diferencia entre cada grado de desacetilacin no mayor al 3% como
puede observarse en la Tabla 6 en donde se expresa tambin las condiciones de la reaccin de
desacetilacin de cada quitosano. Para el caso de Q1 a Q3 hubo una aumento de
aproximadamente 3% en el grado de desacetilacin en comparacin con el resto de las muestras
Q4 a Q7, hubo una diferencia en el grado de desacetilacin en promedio de 5%, en ambos caso se
modifico el tiempo de reaccin y concentracin de NaOH, sin embargo, las diferencias marcadas
en los grados de desacetilacin se deben a los altos tiempos de reaccin acompaados con los
diferentes pasos de reaccin.
Tabla 6. Condiciones de reaccin y grados de desacetilacin obtenidos por FTIR y CHN. (Fuente Propia:2013)
GDA = Grado de desacetilacin obtenido por espectroscopia de FTIR a travs de la ecuacin (13) y (14) GDB= Grado de desacetilacin obtenido por anlisis elemental (CHN) a travs de la ecuacin (16).
5.2 Caracterizacin del Quitosano
5.2.1 Espectroscopia FT-IR
El espectro vibracional del quitosano (Q9) se observa en la Figura 6 este muestra
Muestra Tiempos de reaccin, h [NaOH],
% m/v GDA, % GDB, %
Q0 --- --- 32,86 30,03 Q1 6 + 4 (10) 30 70,18 73,07 Q2 4 + 4 + 4 + 4 (16) 30 72,41 75,51 Q3 4 + 4 + 4 (12) 30 74,06 78,02 Q4 6 + 4 (10) 50 81,20 82,56 Q5 6 + 6 + 6 (18) 50 87,01 86,01 Q6 6 + 3 + 3 (12) 50 85,38 88,09 Q7 6 + 4 + 4 (14) 50 88,23 89,22 Q8 4 + 4 + 4 + 4 (16) 50 92, 08 90,12 Q9 4 + 4 + 4 + 5 (17) 50 95,76 97,04
-
43 caractersticas espectrales de quitosano altamente desacetilado, en este pueden distinguirse las
siguientes seales estiramiento OH alrededor de 3450 cm-1, la seal a 1420 cm-1 correspondiente
a la flexin del grupo CH2, el estiramiento CO a 1030 cm-1, el estiramiento CO a 1070 cm-1, la
seal del estiramiento del enlace glucsido CO a 897 cm-1 y el estiramiento CO asimtrico
(puente COC) a 1160 cm-1.9
A
0
20
40
60
80
100
80013001800230028003300
T (%
)
Nmero de Onda (cm -1 )Quitosano (Q9) Quitina
O
H y
NH
C
H d
e CH
y C
H2
B
0
20
40
60
80
100
800900100011001200130014001500160017001800
T (%
)
Nmero de Onda (cm -1 )
Quitosano (Q9) Quitina
C
-O d
e
(1-4
)
-C
-O-C
del
anill
o
gl
ucos
idc
o
-
C-O
Alc
ohol
pr
imar
io
-C
-O A
lcoh
ol
secu
ndar
io
-C
H3
Am
ida
I
-
NH
2
Am
ida
II
C
=Ode
NH
CO
CH
3
Figura 6. Espectros infrarrojos de la Quitina y Quitosano (Q9) (A) Espectro de infrarrojo entre 800 3900 cm-1 (B) Expansin del rea C-O-C. (Fuente Propia:2013)
-
44 5.2.2 Difraccin de rayos X
El anlisis a travs de difraccin de rayos X, mostr seales alrededor de 10, 20 y 26,4
propias de la quitina y quitosano en los planos de reflexin (020) y (110), para el caso de la
quitina se muestran una serie de picos un poco ms agudos y de mayor intensidad tpico de
muestras ms cristalinas, de acuerdo al difractograma mostrado en la Figura 7(A). En la Figura
7(B), se muestra descenso en la cristalinidad debido a que el aumento de los grupos aminos
libres en la cadena polimrica conduce a un aumento a las fuerzas electrostticas intermoleculares
e intramoleculares, y a la formacin de puentes de hidrogeno, disminuyendo la rigidez de las
estructuras esto hace que el quitosano obtenido sea menos cristalino a medida que se tienen
quitosanos de altos grados de desacetilacin.8
Figura 7. (A) Difractogramas de Quitina y Quitosano. (B) ndice de cristalinidad en funcin del Grado de desacetilacin (Fuente Propia:2013)
600
1600
2600
3600
4600
5600
6600
5 10 15 20 25 30 35 40
I
2
Quitosano Quitina
69
74
79
84
89
94
30 40 50 60 70 80 90 100
Indi
ce de
Cris
talin
idad
(%)
Grado de desacetilacin (%)
(110)
(020)
A B
-
45 5.2.3 Determinacin de masas molares promedios viscosimtricas
La viscosidad intrnseca fue determinada a travs del intercepto (B1) derivado del ajuste
polinomial de la curva obtenida al graficar la concentracin de la solucin de los diferentes
quitosanos y la viscosidad relativa como se puede observar en la Figura 8, luego empleando la
ecuacin de MHS se obtuvo la masa molar promedio viscosimtrica en la Tabla 7 se muestran los
valores de Mv de los quitosanos comerciales usados como material de referencia estos
correspondieron a lo establecido, con valores menores de 50 kDa para QBMM, para el caso de
QMMM a valores entre 50 y 150 kDa, y para QAMM valores mayores a 150 kDa, a partir de
estos resultados las muestras obtenidas (Q1-Q9), se sometieron a la determinacin de la Mv,
estableciendo que (Q1-Q3) corresponden a QAMM y para el resto de los quitosanos (Q4-Q9)
quitosanos de MMM. La variacin de masas moleculares durante el proceso de obtencin de
quitosano es debido al uso de condiciones rigurosas de reaccin para dar como resultado
quitosanos de altos grados de desacetilacin, para el caso de (Q1-Q3) la concentracin de
hidrxido fue de 30 % m/v y para el caso de las muestras (Q4-Q9) 50 % m/v, se ha demostrado
que los polisacridos sometidos a altas concentraciones de bases en largos periodos de tiempo,
sufren una degradaciones traducidas en la disminucin de masas molares.27-30
Figura 8. Viscosidad relativa (/1) en funcin de la concentracin de quitosano (CQ) comercial QMMM en una solucin de CH3COOH/NaCl 0,2 M a 25 C. (Fuente Propia:2013)
0 2 4 6 8 100
5
10
15
20
25/1 = 1 + 1,19914 CQ+ 0,14105 CQ2
R2 = 0.99308
CQ (g/L)
/1
-
46 Tabla 7. Masas molares viscosimtricas de quitosanos comerciales y de los obtenidos. (Fuente Propia:2013)
5.3 Pruebas antimicrobianas de quitosanos de distintos grados de desacetilacin frente
a S. aureus y E. coli .
Se realiz el seguimiento por espectrofotometra del crecimiento de las bacterias, en medio
liquido LB Broth y en las diferentes concentraciones de acido actico para evaluar el efecto
antimicrobiano de este, en la Figura 9 se muestran el mximo crecimiento o fase exponencial y la
fase estacionaria, que vara dependiendo del tipo de bacteria; a su vez se ve representada el
porcentaje de transmitancia en funcin del tiempo. Esta informacin permite establecer el
momento oportuno para la evaluacin de la actividad antimicrobiana del quitosano.50-55
As mismo, para S. aureus y E. coli, a las 5 h y 6 h respectivamente entran en la fase de
latencia. La cintica de crecimiento de las bacterias se obtuvo en condiciones controladas, a una
temperatura de 37 C, pH 6,5 y agitaciones constantes de 250 rpm. Las bacterias que no
esporulan, entran a una fase de crecimiento nulo, o fase estacionaria, al agotarse los nutrimentos
en el medio.60-66 En la Figura 9 (A-B) se observa el crecimiento de las cepas en presencia del
solvente acido actico-agua , indicando que tanto la fase exponencial como estacionario de las
mismas, estos presentaron resultados similares a las cinticas en el medio de cultivo LB-Borth ,
pero solo para la concentracin de acido actico de 1 %, concentraciones superiores (2 %, 3 %)
Muestra [], g/L K, L/g Mv ,KDa Q1 0,78265 2,00E-07 2,5461 388,390 Q2 0,56752 2,92E-07 2,5859 270,321 Q3 1,45697 5,06E-07 2,6156 294,801 Q4 0,52343 1,02E-06 2,6564 141,178 Q5 0,46634 1,98E-06 2,6972 98,109 Q6 1,34311 2,74E-06 2,7176 124,151 Q7 1,35064 3,21E-06 2,7278 115,298 Q8 2,24579 3,75E-06 2,7385 128,820 Q9 2,91413 1,07E-05 2,8094 86,024
QBMM 0,10543 5,10E-06 2,5851 46,7017 QMMM 1,19914 5,10E-06 2,5851 119,601 QAMM 3,38723 5,10E-06 2,5851 178,732
-
47 inhibieron el crecimiento de dichas bacterias, por consecuencia de la acidificacin del medio por
parte del solvente.58,59
A
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 110
20
40
60
80
LB
LBAcAc 1 %
LBAcAc 2 %
LBAcAc 3 %
Tiempo (h)
T (%
)
B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 110
20
40
60
80
LB
LBAcAc 1 %
LBAcAc 2 %
LBAcAc 3 %
Tiempo (h)
T (%
)
C
0.0 0.2 0.4 0.6 0.80.5
1.0
1.5
2.0
y = 1.0916x + 1.0346R = 0.9907
Log(t)
Log(
%T)
D
0.0 0.2 0.4 0.6 0.81.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0y = 0.7843x + 1.213
R = 0.9833
Log(t)
Log(
%T)
Figura 9. Curvas de crecimiento de S.aureus (A) y E.coli (B) a 37C en solucin de acido actico-agua 1% a 37 C. Ajuste lineal de la curva de crecimiento de S.aureus (C) y E.coli (D) (Fuente Propia:2013)
En la Figura 9 (C-D) se observa el ajuste de las curvas de crecimiento proporcionando a
partir de la pendiente la velocidad mxima especifica de crecimiento, para S. aureus de 1.09 h-1 y
para E. coli 0.78 h-1 . El quitosano inhibi el crecimiento de E. coli, S. aureus; los resultados de
inhibicin total se muestran en la Figura 10, dicha inhibicin dependi de varios aspectos como:
la especie bacteriana, grado de desacetilacin y concentracin de la solucin de quitosano.
Obtenindose que para E. coli no se presentan diferencia significativas (p< 0,05) entre Q9 y Q8
mientras que si se refleja diferencia (p < 0,0001) para los grados de desacetilacin Q7-Q4,
especficamente a partir de los rangos de concentraciones de 12.5 100 ppm. Por otra parte, el
quitosano reflejo una relacin dosis-dependiente inhibidora de crecimiento, as mismo se conoci
-
48 concentraciones mnima inhibitoria (CIM) con rangos que van desde 25-100 ppm; variando de
igual manera en funcin del los grados de desacetilacin como se observa en la tabla 8. 67-70
0 50 100 150 200 250 300 350 4000
20
40
60
80
Q9 Q8 Q7
Q6 Q5 Q4
Concentracin de quitosano (ppm)
T (%
)
0 25 50 75 100 1250
20
40
60
80
200 300 400
Q9 Q8 Q7
Q6 Q5 Q4
Concentracin de quitosano (ppm)
T (%
)
Figura 10. (A) Efecto del quitosano con diferentes grados de desacetilacin en el crecimiento de Escherichia coli (B) Expansin de la zona de concentraciones mnimas inhibitorias. (Fuente Propia:2013)
A
B
-
49
Se determino la eficiencia del quitosano como antibacteriano, mediante comparaciones de
actividad frente a compuestos comerciales como: ampicilina, estreptomicina y sulfato de cobre;
en la Figura 11 se muestra la ausencia de cambios significativos (p< 0,05) especficamente en los
quitosanos Q9 y Q8, con respecto al efecto de ampicilina y sulfato de cobre. Para el caso de los
quitosanos restantes, los resultados reflejaron que los controles negativos ampicilina y sulfato de
cobre fueron mucho ms inhibitorios en las concentraciones comprendidas en el rango de 12.5-
100 ppm., en el caso de estreptomicina como se puede observar la Figura 12, presento una menor
actividad con respecto a los grados de desacetilacin Q9-Q7; y una mayor inhibicin de
crecimiento en los grados de desacetilacin restante en los rangos de concentraciones de 12.5-50
ppm, aunque en ciertas concentraciones existe diferencia de actividad antibacteriana por parte de
los tratamientos de quitosano y sus controles negativos, de igual manera a partir de
concentraciones de 200 400 ppm todos los tratamientos no presentaron diferencia (p< 0,05) en
cuanto a crecimiento de E. coli los rangos de concentraciones mnimas inhibitorias por parte de
los controles, no superaron los de los compuestos de quitosano con diferentes GD (Tabla 8).40-49
El quitosano present mayor efecto inhibitorio para S.aureus como se puede observar en
la Figura 13. Presentando diferencias significativas (P < 0,001), solo en los Q4 y Q5 en los rangos
de concentraciones de 25-50 ppm. Para el caso de Q6-Q9 se presentaron comportamientos
similares mostrados en la Tabla 9. Asi mismo, se presentaron efectos superiores de actividad
antibacteriana en los compuestos de quitosano, con respecto a los controles negativo (ampicilina,
estreptomicina), presentando una diferencia de P < 0,0001 (Ver Figura 14). Sin embargo, la sal
de sulfato de cobre presento mayor actividad siendo la concentracin mnima inhibitoria de 50
ppm este comportamiento se puede observar en la Figura 15.59
-
50
0 25 50 75 100 1250
20
40
60
80
200 400
Ampicilina Q9
Q8
Q7
Q6 Q5 Q4
Concentracin de quitosano (ppm)
T (%
)
0 25 50 75 100 1250
20
40
60
80
200 300 400
Sulfato de cobre Q9Q8
Q7Q6 Q5 Q4
Concentracin de quitosano (ppm)
T (%
)
Figura 11 .Efecto del quitosano con diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento de Escherichia coli. A) Efecto del control negativo Ampicilina. B) Efecto del control negativo Sulfato de Cobre. (Fuente Propia:2013)
A
B
-
51
0 50 1000
20
40
60
80
200 300 400
Estreptomicina Q9 Q8Q7 Q6 Q5 Q4
Concentracin de quitosano (ppm)
T (%
)
Figura 12. Efecto de quitosano con diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento de Escherichia coli. Efecto del control negativo Estreptomicina. (Fuente Propia:2013)
Tabla 8. Concentracin mnima inhibitoria de los compuestos antibacterianos, en el crecimiento
de Escherichia coli (Fuente Propia:2013)
Muestras Concentracin mnima inhibitoria (CMI)
Q9 25
Q8 25
Q7 50
Q6 50
Q5 100
Q4 100
Estreptomicina 100
Ampicilina 25
Sulfato de Cobre 25
-
52
0
10
20
30
40
50
60
70
1,56 6,25 12,5 25 50 100 200 300 400
T (%
)
Concentracin de quitosano (ppm)
Q9 Q8 Q7 Q6 Q5 Q4
Figura 13. Efecto del quitosano con diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento de Staphylococcus aureus. (Fuente Propia:2013) Tabla 9 Concentracin mnima inhibitoria de los compuestos antibacterianos, en el crecimiento
de Staphylococcus aureus. (Fuente Propia:2013)
Muestras Concentracin mnima inhibitoria (CIM)
Q9; Q8 50 ppm
Q7; Q6 50 ppm
Q5; Q4 100 ppm
Estreptomicina ---
Ampicilina ---
Sulfato de Cobre 50 ppm
-
53
A
0
10
20
30
40
50
60
70
1,56 6,25 12,5 25 50 100 200 300 400
T (%
)
Concentracin de quitosano (ppm)
Ampicilina Q9 Q8 Q7 Q6 Q5 Q4
B
0
10
20
30
40
50
60
70
1,56 6,25 12,5 25 50 100 200 300 400
T (%
)
Concentracin de quitosano (ppm)
Estreptomicina Q9 Q8 Q7 Q6 Q5 Q4
Figura 14. Efecto del quitosano con diferentes grados de desacetilacin en el crecimiento Staphylococcus aureus. A) Efecto del control negativo Ampicilina. B) Efecto del control negativo Estreptomicina. (Fuente Propia:2013)
-
54
0
10
20
30
40
50
60
70
1,56 6,25 12,5 25 50 100 200 300 400
T (%
)
Concentracin de quitosano (ppm)
Sulfato de cobre Q9 Q8 Q7 Q6 Q5 Q4
Figura 15. Efecto de la molcula de quitosano con diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento de Staphylococcus aureus. (Fuente Propia:2013)
Se ha demostrado que la actividad antibacteriana actu en funcin del microorganismo
objetivo, el grado de desacetilacin y la concentracin de solucin de quitosano.70 El efecto del
quitosano como agente antibacteriano aumenta en funcin al grado de desacetilacin, este ltimo
alusivo a la cantidad de grupos aminos libres NH3+; se sugiere que la estructura policatinica que
se forma en el proceso de desacetilacin de la quitina interactuo con los componentes anionicos
predominantes (lipo - polisacridos, protenas) de las bacterias Gram-negativas; as mismo, la
unin de quitosano a los cidos teicoicos presente en Gram-positivas, junto con un potencial de
extraccin de lpidos de membrana (predominantemente cido lipoteicoico), da como
resultado una secuencia de eventos que conduce a la muerte bacteriana. La presencia de grupos
NH3+, es lo que desempea el papel importante. En consecuencia quitosanos con mayor GD
mostraron un fuerte efecto inhibitorio. 76-83
-
55
Para verificar que el quitosano presenta caractersticas bactericidas totales, se someti al
mtodo de resiembra despus de 15 h de incubacin empleando solo las concentraciones mnimas
inhibitorias. Los resultados fueron comparados con los controles positivos en los cuales se
presentaron efectos bactericidas en E.coli y S.aureus (Ver Figura 16 y 17), los resultados de
anlisis de variancia de una va indicaron que la diferencia entre el grupo control, en funcin de
cada uno de los tratamientos con los compuestos de quitosano con diferentes GD, en sus
concentraciones mnimas inhibitorias fueron estadsticamente diferentes (P
-
56
Control + Q9 Q8 Q7 Q6 Q5 Q40
20
40
60
80Control +Q9Q8Q7Q6Q5Q4
*** *** ****** *** ***
Control + Q4Q5Q6Q7Q8Q9Muestras de Quitosano
T (%
)
Figura 17. Comparacin del crecimiento Staphylococcus aureus con quitosanos de diferentes grados de desacetilacin con las concentraciones mnimas inhibitorias respectivas p < 0,0001. (Fuente Propia:2013)
5.4 Pruebas antimicrobianas de quitosanos de distintos grados de desacetilacin frente
a Sacaromyces Cerviciae y Neurospora crassa
Se realiz la curva de crecimiento para S. Cerevisiae en medio de cultivo YPD y medio de
cultivo YPD mas acido actico como se puede observar en la Figura 18 (A), estas muestran una
fase de latencia hasta las 10 horas, a partir de all empieza su fase de crecimiento y a partir de 16
h inicia su fase estacionaria, se estableci como volumen de inculo ptimo 40 L, y volumen de
inculo ptimo a preincubar 2 mL. En la Figura 18 (B) se observa el ajuste de la curva de
crecimiento proporcionando a partir de la pendiente la velocidad mxima especfica de
crecimiento, para S. Cerviciae 2,25 h-1. El quitosano inhibi el crecimiento de S. Cerviciae, los
resultados de inhibicin total se muestran en la Figura 19. Sin embargo, dicha inhibicin se
observ a partir de concentraciones altas 200 ppm para Q9 y Q8 no se presentan diferencias
significativas (p< 0,05) con respecto a la capacidad inhibitoria de los fungicidas comerciales
Benomil y Ketoconazol, mientras que se refleja diferencia significativa (p < 0,0001) para los
grados de desacetilacin Q7-Q4, ya que se necesitaron concentraciones por encima de los 1000
ppm para observar un efecto.
-
57
En la Figura 20 se puede observar que no hay una amplia disminucin del porcentaje de
levaduras con respecto a la variacin del grado de desacetilacin, lo que indic que para ste tipo
de microorganismos es necesario realizar una modificacin estructural del quitosano, para
mejorar su desempeo frente a estos.
0 4 8 12 16 20 240
20
40
60
80
YPD
YPDAcAc 1 %
Tiempo (h)
T (%
)
0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.00.0
0.5
1.0
1.5
2.0
y = 2.2585x + 0.4236R = 0.9885
Log(t)
Log(
%T)
Figura 18 (A). Cintica de crecimiento de S. Cerevisiae a 34 C con un volumen de inoculo inicial de 1 mL en 20 mL en YPD (B). Ajuste lineal de la curva de crecimiento de S. Cerevisiae a 34 C (Fuente Propia:2013)
B
A
-
58
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 6000
20
40
60
80
100
Q9 Q8
BenomilKetoconazol
Concentracin de quitosano (ppm)
T (%
)
Figura 19. Efecto de quitosanos de distintos grados de desacetilacin frente a S. Cerevisiae a 34 C . (Fuente Propia:2013)
Control Q9 Q8 Q7 Q6 Q5 Q40
20
40
60
80
100Control + (Agua)
Q9
Q8
Q7
Q6
Q5
Q4
Muestras de Q uitosano
T (%
)
Figura 20. Comparacin del crecimiento Saccaromyces Cervisiae con quitosanos con diferentes grados de desacetilacin. (Fuente Propia:2013)
Se realiz la curva de crecimiento para N. Crassa a travs de la determinacin de glucosa en
el medio de cultivo, de acuerdo a la curva de calibracin mostrada en la Figura 21, se obtuvieron
-
59 dos curvas en el medio de cultivo MPPY y en medio de cultivo MPPY ms cido actico Ver
Figura 22 (A), se estableci como consumo constate de glucosa a partir de las 24 h, tiempo
propicio para la evaluacin de las propiedades. El quitosano inhibi el crecimiento de N. Crassa,
los resultados de inhibicin total se muestran en la Figura 22 (B), dicha inhibicin se observ a
partir de concentraciones altas 400 ppm para Q9 y Q8, se observarn diferencias altamente
significativas (p < 0,0001) con respecto a la capacidad inhibitoria del fungicida comercial
Benomil, mientras que para los grados de desacetilacin Q7-Q4 hay inhibicin a partir de 400
ppm pero el porcentaje de micelio del hongo muerto es menor, en este caso tampoco se observa
una amplia disminucin del porcentaje micelio del hongo con respecto a la variacin del grado de
desacetilacin. Se verifico la capacidad fungisttica de estos quitosanos ya que luego de realizar
el mtodo de resiembra, el micelio del hongo contino en crecimiento (Ver Figura 22 (C).
400 450 500 550 600 650 7000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Longitud de onda (nm)
Abs
orba
ncia
0 200 400 600 8000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
y = 0.0021x - 0.0221R = 0.9864
g/mL
Abs
orba
ncia
Figura 21. (A) Espectros de las distintas concentraciones del complejo enzimtico de glucosa (B) Curva de calibracin para consumo de glucosa del N. Crassa. (Valbuena,2013)
A B
-
60
0 20 40 60 80 100300
350
400
450
500
MPPY
MPPYAcAc1%
Tiempo (Horas)
Glu
cosa
con
sum
ida
( g/m
L)
50 100 150 250 3500
20
40
60
80
400 450 600 800
Q9 Q8 Q7 Q6
Q5
Q4
Benomil
Concentracion de Q uitosano (mg/L)
Glu
cosa
con
sum
ida
( g/m
L)1E
+01
Figura 22. (A) Curva de crecimiento de N. Crassa a 25 C (B) Efecto de quitosanos con diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento de N. Crassa. (Fuente Propia:2013)
A
B
-
61
Contr
ol + Q9 Q8 Q7 Q6 Q5 Q4
0
20
40
60
80
** ** * ns ns
Control + Q5Q6Q7Q8Q9 Q4
Q uitosano
Glu
cosa
con
sum
ida
( g/m
L)1E
+01
Figura 22. (C) Comparacin del control + con el efecto de la molcula de quitosano con diferentes grados de desacetilacin (GD %) en el crecimiento N. Crassa; para las concentraciones mnimas inhibitorias respectivas.Valor de P: < 0.05 (**).(Fuente Propia:2013)
5.5 Degradacin oxidativa de quitosano
La degradacin oxidativa del quitosano se llev a cabo con Q4, Q6 y Q9 cada una con un
grado de desacetilacin diferente, en este caso se vari solo el tiempo de reaccin como se
explica en la Seccin 4.3.2 . Durante el proceso de oxidacin se obtuvo una fraccin insoluble en
agua, a nivel espectral se muestran similitudes caractersticas de quitosano de alto grado de
desacetilacin, sin embargo se muestra una variacin en el rea C-O-C, atribuido quizs a la
formacin de nuevos grupos durante el proceso de degradacin, as mismo se muestra una seal a
aproximadamente a 1623 cm-1 la cual se puede asignar a la absorcin C=O, probablemente a
nuevos grupos formados durante la oxidacin, a 777,5 cm-1 se muestra una seal para el caso de
las fracciones degradadas a 150 min y 240 min, esta seal es correspondiente a la deformacin
fuera del plano del grupo N=CHCOO- (Ver Figuras 23-25).
C
-
62
50010001500200025003000350040000
20
40
60
80
10090minQ4 150minQ4 240minQ430minQ4
Nmero de onda (cm-1)
T (%
)
6008001000120014001600180020000
20
40
60
80
10090minQ4 150minQ4 240minQ430minQ4
C=O
de
degr
adac
in
fuer
a del
pla
no N
=CH
COO
-
Nmero de onda (cm-1)
T (%
)
Figura 23. (A) Espectros de FTIR de las fracciones de Q4(B) Expansin del rea C-O-C. (Fuente Propia:2013)
A
B
-
63
50010001500200025003000350040000
20
40
60
80
10030minQ6 90minQ6 150minQ6 240minQ6
Nmero de onda (cm-1)
T (%
)
6008001000120014001600180020000
20
40
60
80
10030minQ6 90minQ6 150minQ6 240minQ6
C=O
de
degr
adac
in
fuer
a del
pla
no N
=CH
COO
-
Nmero de onda (cm-1)
T (%
)
Figura 24. (A) Espectros de FTIR de las fracciones de Q6. (B) Expansin del rea C-O-C. (Fuente Propia:2013)
B
A
-
64
50010001500200025003000350040000
20
40
60
80
10030minQ9 90minQ9 150minQ9 240minQ9
Nmero de onda (cm-1)
T (%
)
6008001000120014001600180020000
20
40
60
80
10030minQ9 90minQ9 150minQ9 240minQ9
C=O
de
degr
adac
in
fuer
a del
pla
no N
=CH
COO
-
Nmero de onda (cm-1)
T (%
)
Figura 25. (A) Espectros de FTIR de las fracciones de Q9. (B) Expansin del rea C-O-C de los espectros de FTIR de las fracciones de Q9. (Fuente Propia:2013)
En la Figura 26 se muestra la relacin del rea de las bandas del infrarrojo
A
B
-
65 correspondiente a las vibraciones de los enlaces glicosdicos (14), se observa cmo hay una
disminucin en el rea de esas bandas, lo que es indicativo de una disminucin de esos grupos
dadas las condiciones de degradacin oxidativa a las cuales se sometieron las muestras. Para el
caso de Q9 se puede observar que hay una degradacin ms marcada a medida que el tiempo de
reaccin va en aumento, esto se debe a diferencias en entre ambas muestras la cual es para Q4.
Asi mismo, se pudo corroborar que el proceso de degradacin ocurri ya que hubo una
disminucin marcada en la masa molecular de las fracciones degradadas, para Q4
aproximadamente un 20 %, para Q6 aproximadamente un 55 % y para Q9 mas de 50 %, el
aumento en la degradacin se debe una degradacin marcada a medida que el tiempo de reaccin
va en aumento, esto se debe a diferencias en desacetilacin entre ambas muestras la cual es
mayor para Q4>Q6>Q9 (Ver Tabla 10).
0 100 200 3000
5
10
15
20A895Q9A1153Q9 A895Q4A1153Q4
Tiempo de reaccion (minutos)
Are
a de
la b
anda
(%T.
cm-1
)
Figura 26. reas de las bandas 1153 cm-1 y 895 cm-1 de los espectros FTIR de Q9 y Q4 en funcin del tiempo de oxidacin. (Fuente Propia:2013)
En la Figura 27 se presenta el Termograma de los Quitosanos comerciales QBMM y
-
66 QAMM as como de los quitosanos degradados de Q6 y 240minQ6. Como puede observarse las
curvas de los quitosanos QBMM y QAMM son caractersticas de este material a una temperatura
aproximada de 70 C aparece un pico relacionado a pequeos movimientos inducidos por el agua
enlace (agua que interacta con el quitosano). Luego a una temperatura alrededor de 200 C se
observa una temperatura de transicin vtrea (Tg) del polisacrido. Finalmente a 295 C
experimenta degradacin trmica antes de fundir.
De igual manera, se pueden analizar los quitosanos degradados Q6 y 240minQ6, a una
temperatura de 70 C se observa el pico asignable al agua enlace. La Tg del material se desplaza
a menores temperaturas respecto al quitosano comercial mientras que la degradacin trmica
muestra distintos comportamientos. El Q6 presenta un nico pico a temperaturas cercanas a
295C y el 240minQ6 presenta dos temperaturas de degradacin.
El quitosano Q6 muestra caractersticas al QAMM y el quitosano 240minQ6 se asemeja al
QBMM, debido probablemente a similitudes en la masa molar del polmero. Las dos primeras