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BioinformáticaClustering

RodrigoSantamaría

DándolealvinoDándolealvino

Saccharomyces cerevisiaeLaexpesióngenéticaElcambiodiáuxico

• Dándolealvino• Clustering• Clústering jerárquico• Anotaciones

2

Dándolealvino

• Hayevidenciasdelaelaboracióndevinoporhumanosdesdehace6000años*

*En2011sedescubrieron enunacuevadeArmeniaunaprensadevino, vasijasdefermentaciónycopas**ProducidoporunaflorquefermentanaturalmentegraciasalalevaduraSaccharomyces cerevisiae***Cualquiermamíferoquetomaralasdosis dealcoholquetoma,proporcionalmente, estamusaraña,moriría

musarañaarborícoladecolaemplumada

• Peroojo,unamusaraña ledaalvinodesdehacemillones deaños– Enparticular,al“vinodepalma”**– Handesarrolladounmetabolismodelalcoholqueevitaqueseemborrachen***

Saccharomyces cerevisiae• Estalevadura*fermentaelvino:– Seencuentraenlosviñedosdeformanatural– Sealimentadelaglucosa delafruta– Produceetanol

• Cambiodiaúxico:sisequedasinglucosa,puede,enpresenciadeoxígeno,alimentarsedeletanol– Convirtiendoelvinoenvinagre– Poresolasbarricasdevinohandesellarse

*Laslevadurasformanpartedelreinoanimaldeloshongos, sonorganismoseucariotas unicelulares.Sonmuyinteresantescomoorganismosmodelo alserfáciles decultivarytenerunaestructuracelularsimilaralanuestra

glucosa etanol ácidoacético

cambio

diaúxico

metabolismo

Scerevisiae

O2

Expresióngénica

DNA

mRNA

transcripción

Proteínas

traducción

expresión

Vídeos sobre losprocesos detranscripción ytraducción delaNDSUhttp://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/videos/Transcription_eng.mp4http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/videos/Translation_eng.mp4

Ladescripción deesteflujo deinformaciónbiológica(simplificadoaquí)seconocecomoeldogmacentraldelabiologíamolecular(Crick,1958)

Elcambiodiaúxico

• Estecambioafectaalaexpresión demuchosgenes

• Esunaventajaevolutivamuygrande– Lalevadurapuedematarasuscompetidoresgenerandoetanol(tóxicoparamuchasbacterias)

– Puedeutilizareseetanolcomofuentedeenergía– EnausenciadeO2 lalevadurahiberna

6

Matricesdeexpresión

• UnamatrizEdedimensiónnxm– ngenes (típicamentetodoslosdelgenoma)– m condiciones experimentales• Distintospuntostemporales• Distintascondicionesambientales,tejidos,etc.

– Eij expresióndelgeni bajolacondiciónj• Permitenrealizarmuchosanálisis– Detectargenesquecambiansuexpresión– Detectargenesquevaríandemanerasimilar,etc.

7

Expresión delcambiodiaúxico

• JosephDeRisi (1997)*hizoelprimerexperimentodeexpresión genómicadecambiodiáuxico– Matriz6400x7• TodoslosgenesdelgenomadeScerevisiae• 7puntostemporales:-6,-4,-2,0,2,4,6

– 0eselpuntodondeseproduceelcambiodiaúxico

8*Elpaper completoaquí:http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/papers/DeRisi1997.pdf

Expresión delcambiodiaúxico

9

-6 -4 -2 0 2 4 6YLR258W 1.07 1.35 1.37 3.70 4.00 10.00 5.88YPL012W 1.06 0.83 0.90 0.44 0.33 0.13 0.12YPR055W 1.11 1.11 1.12 1.06 1.05 1.06 1.05

diauxic shift

Expresión delgenYPR055W2hdespués delcambio

¿Cuál deestostresgenescreesqueestaríainvolucradoenelcambiodiaúxico?

Laexpresión enlog2hacequelosvaloresmenoresqueunoseannegativosyproporcionalesalospositivos:• 1seduplica• -1sedivideentre2

Fold change

10

-6 -4 -2 0 2 4 6YLR258W 1.07 1.35 1.37 3.70 4.00 10.00 5.88YPL012W 1.06 0.83 0.90 0.44 0.33 0.13 0.12YPR055W 1.11 1.11 1.12 1.06 1.05 1.06 1.05

diauxic shift

Estosvaloresestánexpresadosenfold changefold change ~variaciónrespectoalareferencia(doble,triple,mitad,etc.)

fc(-6) = expr(-6)/expr(ref)

Amenudosetransformanalog2 fold changehacesimétricalavariaciónevitaquesedisparenlosvaloresmuyaltos

Ejercicio• 1)DescargaelexperimentodeDeRisi aquí:

– http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/expresion/2010diauxic-edited.txt

– Elexperimentoyaseencuentraenlog2fc– ¿Podrías encontrarestamatrizenlared?¿Dónde?

• 2)Cargalamatrizm anteriorconpython– numpy.genfromtxt* ocsv.reader– ¿Quédimensionestiene?**

• 3)Selecciona losgenesconexpresión (log2)envalorabsoluto>2.3paraalgunodelostiempos– Utilizaparaellonumpy.any ynumpy.where– Losllamaremosdgenes yasumatrizdeexpresióndm.¿Cuántosgenesson?

11

*Necesitarás hacerusodelosargumentosdelimiter, names, dtype, skip_header y/ousecolsIMPORTANTE:Tambiénnecesitarásusarfilling_values=0 paralosvaloresperdidos

**Pista:shape

ClusteringCluster yclustering

ErrorcuadráticomedioAlgoritmodeLloyd

• Dándolealvino• Clustering• Clustering jerárquico• Anotaciones

12

Cluster

• Conjunto deelementosconunpatrónsimilar– Ydistinto aldelrestodeelementos– Ennuestrocaso,conjuntosdegenesconnivelesdeactivaciónsimilaresalolargodeltiempo

– Lamayoríadegenestendránseguramenteunpatrónplano,alnoestarinvolucradosenelcambiodiaúxico• Sieliminamostodoslosgenesquetienentodoslosvalores(log2)desuperfilentre-2.3y2.3,nosquedamosconsólounos230de6400genes

13¿porqué2.3comoumbral?

sdev de0.55Sdev*4~2.2

Clustering

• Algoritmoparaencontrarclusters– Caracterizarlosmediantecentroides• puntosenel“medio”decadacluster

– Optimizarladistancia deloscentroides alospuntosqueagrupa• Típicamente,seusaladistanciaeuclídea*

– Seandospuntosm-dimensionalesa=(a1,...,am)yb=(b1,...,bm):

– Definimosladistanciaaunconjuntodecentroides como:

14

𝑑 𝑎,𝑏 = & (𝑎( − 𝑏()+

(,-

�

𝑑 𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜, 𝐶𝑒𝑛𝑡𝑟𝑜𝑖𝑑𝑒𝑠 = min∀>?-@?-ABC(D?E

𝑑(𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜𝑠, 𝑥)

*Enpython podemos calcularlaconnumpy.linalg.norm(a-b)

Máslejanoprimero

• Estrategiadeoptimización:1. Tomarunpuntocualquieracomocentroide2. Añadirnuevoscentroides eligiendodeentrelos

puntosrestantesaquélmáslejanoatodosloscentroides actualeshastaque|centroides|=k

15

MasLejanoPrimero(Puntos, k)Centroides <- un punto aleatorio de Puntos

mientras |Centroides| < k

punto <- punto en Puntos que maximice d(punto,Centroides)

añadir punto a Centroides

retornar Centroides

Ejercicio1• ImplementarlafunciónfarthestFirst:

– entrada:• E matrizdepuntos nxm• k númerodeclusters• init puntoinicial (envezdealeatoriamente, selosuministramos)

– salida:centroides segúnestealgoritmo• Ejemplo:

– E:np.array([[3,20],[4,22],[5,23],[3,18],[4,21],[5,24], [21,10],[22,12],[23,13],[21,8],[20,11],[24,13], [11,2],[12,1],[13,3],[15,4],[11,3],[14,2]])

– k:3– init: [3,20]– salida:[[3,20], [24,13], [14,2]]

• Prueba:– E=dm (lamatrizdeexpresióndedgenes)– k=3– init=[-0.23, -0.09, -0.27, 0.2 , 0.56, 1.52, 2.64]

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farthestFirstk=1 k=2

k=4k=3

farthestFirst

• Estealgoritmoesmuyrápido ypuededarbuenosresultados.• Perotieneproblemasparatratarconoutliers (casosatípicos),muy

comunesenbioinformática

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Errorcuadráticomedio(MSE*)

• Mediadetodaslasdistanciasmínimasacentroides– Másmoderadoquetomarsólolamáxima

19

𝑀𝑆𝐸 =1𝑛 & 𝑑(𝑝𝑢𝑛𝑡𝑜,𝐶𝑒𝑛𝑡𝑟𝑜𝑖𝑑𝑒𝑠)K

�

∀LM-AC?-NM-ACE

*MeanSquared Error

Ejercicio2• Implementarlafunciónmse:

– entrada:• points array depuntosn-dimensionales• centers array decentroides n-dimensionales

– salida:errorcuadráticomedio• Ejemplo:

– points :array([[ 1, 24], [ 4, 2], [23, 20], [24, 22], [25, 23], [23, 18], [24, 21], [25, 24], [31, 10], [32, 12], [33, 13], [31, 8], [30, 11], [34, 13], [21, 2], [22, 1], [23, 3], [25, 4], [21, 3], [24, 2]])

– centers:array([[1,24], [31,8], [4,2]])– salida:104.95

• Prueba:– points= array([[3,20],[4,22],[5,23],[3,18],[4,21],[5,24],

[21,10],[22,12],[23,13],[21,8],[20,11],[24,13], [11,2],[12,1],[13,3],[15,4],[11,3],[14,2]])

– centers=[[3,20], [24,13], [14,2]]

20

AlgoritmodeLloyd

• Centroide:puntocuyascoordenadassonlamediadelascoordenadasdeunconjuntodepuntos

21*Entendidacomoqueloscentroides nocambienocambienmenosqueundeterminadovalorrespectoalaiteración anterior

Lloyd(Puntos, k)Centroides <- k puntos aleatorios en Puntos

Clusters = []

hacerClusters <- asignar cada punto en Puntos al centroide más cercano

Centroides <- recalcular los centroides de cada cluster en Clusters

hasta convergencia*retornar Clusters

it 1it 0

it 0

AlgoritmodeLloydit -

elección aleatoria formar clusters

recalcular centroides formar clusters

it 2

AlgoritmodeLloydit 1

recalcular centroides formar clusters

Enlait.2nohaycambiodecluster paraningún punto,asíque losnuevoscentroides sonigualesqueenlaiteraciónanterior,yelalgoritmotermina

¿ElalgoritmodeLloydconvergeencualquiercaso?¿Cuántas iteracionestardaríacomomáximo?

¿Siempredalamismaagrupación?¿Aseguralamejoragrupaciónposible?

SíKNoNo

AlgoritmodeLloyd

• Lainicialización aleatoriapuededarlugaraproblemasalahoradedetectarclusters

24

inicializacionKmedias(Puntos, k)Centroides <- un punto aleatorio en Puntos

mientras |Centroides|<k

puntoNuevo <- elegir aleatoriamente un punto de Puntos pero con probabilidades asignadas proporcionales a d(punto, Centroides)2

añadir puntoNuevo a Centroides

retornar Centroides

Ejercicio3• Implementarlafunciónlloyd (conlainicializacióndek-medias)*:

– entrada:• points array depuntosn-dimensionales• k númerodeclusters• convergence distanciamediamáximaentreloscentroides dedositeraciones consideradapara

terminarelalgoritmo• iterations númeromáximodeiteracionesencasodequenosellegueaconvergencia

– salida:array conelnúmerodecluster alquepertenececadapunto• Ejemplo:

– Points:array([[3,20],[4,22],[5,23],[3,18],[4,21],[5,24],[21,10],[22,12],[23,13],[21,8],[20,11],[24,13], [11,2],[12,1],[13,3],[15,4],[11,3],[14,2]])

– k:3– convergence:0.1– iterations:100– Salida…hayunaúnicasolución?

• Prueba:– Añadir un tercer parámetro opcionalinitCenters queindiqueunarray depuntosiniciales

ausarenvezdetomarlosaleatoriamente depoints– Utilizar losmismosparámetrosdelejemplomás:– points= centers=array([[3,20], [24,13], [14,2]])

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Clusters enelcambiodiaúxico

• AplicandoelalgoritmodeLloydconk=6 adm,obtenemos 6clusters depatronesdistintosrespectoalcambiodiaúxico

• Estospatronesgenerannuevaspreguntasbiológicas:¿Porquéaumentansuexpresiónlosgenesenelcluster 1,3y4?¿porquédisminuyenenlosclusters 2,5o6?¿Enquémedidaesoscambioscontribuyenalcambiodiaúxico?

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Clustering dek-medias:problemas

• ElalgoritmodeLloydesmuysimilaraotrasaproximacionescomoelclustering dek-medias,ypresentaproblemassimilares:– Problemasdeclasificación– Imposición dekapriori– Noindicalassimilitudesentreclusters– Nodeterminista(aleatorizaciónenelinicio)

27

Clustering jerárquicoMatrizdedistanciasClustering jerárquico

Interpretaciónderesultados


28

Matrizdedistancias

• SeaunamatrizdeexpresiónE nxm– LamatrizdedistanciasDesunamatriznx ndondeDij=d(gi,gj)• Siendod ladistanciaEuclídea (normalmente)• Siendogi ygj losperfilesdeexpresióndelosgenescorrespondientesalasfilasi yj deE

• Enpython lapodemoscalcularcon:distm=scipy.spatial.distance.pdist(e)

distm=scipy.spatial.distance.squareform(distm)*

29*pdist calculalamatrizdedistanciasenformacondensada (yaqueesunamatriztriangulardediagonalcero).squareform permiterecuperarlamatrizredundantecuadradacorrespondiente

Matrizdedistancias

30

1 hr 2 hr 3 hrg1 10.0 8.0 10g2 10.0 0.0 9.0g3 4.0 8.5 3.0g4 9.5 0.5 8.5g5 4.5 8.5 2.5g6 10.5 9.0 12.0g7 5.0 8.5 11.0g8 3.7 8.7 2.0g9 9.7 2.0 9.0g10 10.2 1.0 9.2

g2 g3 g4 g5 g6 g7 g8 g9 g10g1 8.1 9.2 7.7 9.3 2.3 5.1 10.2 6.1 7.0g2 12.0 0.9 12.0 9.5 10.1 12.8 2.0 1.0g3 11.2 0.7 11.1 8.1 1.1 10.5 11.5g4 11.2 9.2 9.5 12.0 1.6 1.1g5 11.2 8.5 1.0 10.6 11.6g6 5.6 12.1 7.7 8.5g7 9.1 8.3 9.3g8 11.4 12.4g9 1.1

MatrizE (izquierda) ymatrizD (abajo)D seharealizadocondistanciaseuclídeas,yesunamatriztriangularydediagonalcero.

Clustering jerárquico

• Estemétodoagrupaloselementosmáscercanositerativamente

• Unaformacomúnesagruparporparessegúnunadistanciamediaentregrupos– UPGMA(Unweighted Paired GroupMethod withArithmetic mean)

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32


g3 g5 g8 g7 g1 g6 g10 g2 g4 g9

g2 g3,5 g4 g6 g7 g8 g9 g10g1 8.1 9.2 7.7 2.3 5.1 10.2 6.1 7.0g2 12.0 0.9 9.5 10.1 12.8 2.0 1.0g3,5 11.2 11.1 8.1 1.0 10.5 11.5g4 9.2 9.5 12.0 1.6 1.1g6 5.6 12.1 7.7 8.5g7 9.1 8.3 9.3g8 11.4 12.4g9 1.1

g3 g5 g8 g7 g1 g6 g10 g2 g4 g9

g2,4 g3,5 g6 g7 g8 g9 g10g1 7.7 9.2 2.3 5.1 10.2 6.1 7.0g2,4 11.2 9.2 9.5 12.0 1.6 1.0g3,5 11.1 8.1 1.0 10.5 11.5g6 5.6 12.1 7.7 8.5g7 9.1 8.3 9.3g8 11.4 12.4g9 1.1

g3 g5 g8 g7 g1 g6 g10 g2 g4 g9


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clusteringJerarquico(D, k)Clusters <- n clusters de un elemento etiquetados de 1 a nconstruir un grafo T con n nodos aislados etiquetados de 1 a ncont <- nmientras |Clusters|>k

Ccont <- fusión de los Clusters más cercanos Ci y Cjañadir un nodo Ccont a Tconectar Ccont a los nodos Ci y Cjeliminar de D las filas y columnas correspondientes a Ci y Cjañadir una fila/columna a D con D(Ccont,C) para todo C en Clusterseliminar Ci y Cj de Clustersañadir Ccont a Clusterscont <- cont +1

raiz <- nodo en T correspondiente al cluster finalretornar |Clusters|

Unposiblemétodo paralaestructuradeárbolesusarundiccionariodonde lasclavesseannodos ylosvaloresseanlistasdedoselementos conlos nodos hijos


• LadistanciaD(C1,C2) entreclusters sepuededefinirdedistintosmodos.

• EnUPGMAseusaladistanciamediaentreloselementosdelosdosclusters:

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𝐷PQR(𝐶1, 𝐶2) =∑ 𝑑(,U�∀LM-AC(?-@VWU?-@K

𝐶1 · |𝐶2|

Ejercicio4

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• ImplementarlafunciónhierarchicalClustering– entrada:

• E matrizoarray depuntosn-dimensionales– salida:diccionarioconlosclusters formados.Lasclavesindicaránel

nododelárbolqueseusaparaelcluster ylosvaloreslalistadenodoshoja(filasdeE)quecontieneelcluster.

• Ejemplo:– E:array([[ 10.,8.,10.], [10.,0.,9. ], [4. ,8.5,3. ],

[9.5,0.5,8.5], [4.5,8.5,2.5], [10.5, 9.,12. ], [5.,8.5,11.], [3.7,8.7,2. ], [9.7,2. , 9. ], [10.2,1.,9.2]])• Secorresponde con lamatriz 10x3deladiap.30

– Resultado intermedio (árbol):{0:[], 1:[], 2:[], 3:[], 4:[], 5:[], 6:[], 7:[], 8:[], 9:[], 10:[2, 4], 11:[1, 3], 12:[7, 10], 13:[9, 11], 14:[8, 13], 15:[0, 5], 16:[6, 15], 17:[14, 16], 18:[12, 17]}

– Salida:{12: [7, 2, 4], 14: [8, 9, 1, 3], 16: [6, 0, 5]}• Prueba:

– E: dm– k:6

Ejercicio4(estructuradedatos)

36


g3 g5 g8 g7 g1 g6 g10 g2 g4 g9

{0:[], 1:[], 2:[], 3:[], 4:[], 5:[], 6:[], 7:[], 8:[], 9:[], 10: [2, 4]

g1 ag10 (nodoshoja) g3,5

Almacenaremoselárbolcomoundiccionario.Cadaclaveindica1)unabifurcacióndelárbolyelvaloresunarray condosnodos, obien2)unnodohoja(esdecirunafiladelamatrizinicial)ysusuvaloresunarray vacíoLosnodoshojadeben identificarseconvaloresi=0aN-1,donde icorresponde alafiladeEenlaqueseencuentraelpunto.Losnodos intermedios debenidentificarseconvaloresi=N,N+1,...porordendedistancia,siendoNelqueindicalabifurcacióndelosdospuntosdeEconmenordistancia.

Clusters enelcambiodiaúxico

• Cortandopor6clusters,obtenemos clusters detamaños1,6,102,34,10y76,respectivamente

• Losresultadossondistintosalosobtenidos conelclustering dek-medias,yaquehayvariasdiferenciasprocedimentales (cálculodedistancias,mododeagrupamiento,etc.)

37

Clustering einterpretación biológica

• Elclustering essólo unprimerpaso enelanálisisdeunexperimento

• Lesiguenmásexperimentosparaconfirmarquelosclusters tienensentidobiológico

• Haytambiénpruebasbioinformáticasparaidentificarsi– Haymotivosenlassecuenciasencontradas

• P.ej.,elmotivoreguladorCSREseencuentraenvariosgenesconactivacióndiaúxica [Schöler ySchüller,1994]

• Comovimosenlasesión3(muestreodeGibbs,p.ej.)– Hayfuncionesbiológicasconocidasrelacionadasconlosgrupos

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AnotacionesAnotacionesgenéticasAnotacionesfuncionalesEnriquecimientofuncional


39

Anotacionesdeungen

• Característicasgenerales(GFF)– Nombreysinónimos– Estructura– Posición

• Locus– Posición(comienzoyfin)enelcromosoma– Cromosomaenelqueseencuentra

• Sentidooantisentido• Secuencia(FASTA)• Funcionesconocidas(OBO,otros)

40

Estructuradeungen

41

https://en.wikipedia.org/wiki/File:Gene_structure_eukaryote_2_annotated.svg

Estructuradeungen

• OpenReadingFrame (ORF):región abiertaparatranscripción porpartedelaDNApolimerasa

• Start/Stop:codonesosecuenciasdeinicio/paradadelatranscripción

• UntranstlatedRegions (UTR):regionesenlosextremos5’o3’queayudanalinicio/findelatranscripciónyqueseincluyen enelmRNA

• Secuenciaregulatoria:secuenciaprevia/posterioraunORFquemodula sutranscripción– Promotor:acumulalasproteínasnecesariasparalatranscripción– Catalizador/Silenciador:mejora/obstaculizalatranscripción

• Exon:sección delORFenelmRNA queterminaráformandolaproteína

• Intron:seccióndelORFenelmRNA queno formalaproteína• SecuenciadeDNAcodificante(CDS):DNAqueformapartedela

proteína.EquivalealosexonessinlosUTR42

GeneralFeature Format (GFF)

Tipodeestructura

Posición

Identificador

Sentido

Otrainformación

https://en.wikipedia.org/wiki/General_feature_format

GeneralFeature Format

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##gff-version 3#date Thu Jun 30 19:50:03 2016...chrV SGDgene 285241 286914 . - .

ID=YER065C;Name=YER065C;gene=ICL1;Alias=ICL1,isocitrate lyase1;Ontology_term=GO:0004451,GO:0005737,GO:0006097;Note=Isocitrate lyase B catalyzes the formation of succinate and glyoxylate from isocitrate-C a key reaction of the glyoxylatecycle B expression of ICL1 is induced by growth on ethanol and repressed by growth on glucose;display=Isocitratelyase;dbxref=SGD:S000000867;orf_classification=VerifiedchrV SGDCDS285241 286914 . - 0

Parent=YER065C_mRNA;Name=YER065C_CDS;orf_classification=VerifiedchrV SGDmRNA 285241 286914 . - .

ID=YER065C_mRNA;Name=YER065C_mRNA;Parent=YER065C...

Cadaentradaestádelimitadaportabuladores

Loscomentarioscomienzanpor# Escomún queloscamposnoseutilicen correctamente,aquíelcampo1(ID)seusaparaindicarelcromosomaElcampo2nosindicalafuentedelainformación, enestecasoSGD(Saccharomyces Genome Database)Loscamposvacíosseidentificancon.aunquenosiempre!

Elcampo9sesuelesobrecargardeinformaciónnoestandarizada

http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/anotaciones/saccharomyces_cerevisiae_R64-2-1_20150113.gff

Ejercicio5• Implementarlafunciónannotations

– Entrada:• ids:array connombresdegenesensegún elexperimentodeDeRisi

– Salida:diccionarioconlosnombresdelosgenescomoclavesycomovaloresundiccionarioconloscamposstart,end,name eid• EsteúltimoseráelnúmeroentreSGD: y;

– UtilizadlaversióndeSGDR64-2-1(30deenerode2016)*• ¿Podríasobtenerunaversiónmásactualizada?

• Ejemplo– [YER065C]– {'YER065C': {'end': '286914', 'id': 'S000000867', 'name':

'ICL1', 'start': '285241'}}

• Prueba:['YPR184W', 'YLR312C', 'YML054C', 'YBR116C', 'YKL187C', 'YLR267W', 'YEL012W', 'YOL084W', 'YJL045W', 'YJR095W']

45*http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/anotaciones/scerevisiae/saccharomyces_cerevisiae_R64-2-1_20150113.gff

Anotacionesfuncionales:ontologías

• Ontología:vocabulariocontrolado– Jerarquizadoenformadegrafodirigidoacíclico (DAG)– Sepuedevercomoun‘árbolcomplejo’

• GeneOntology (GO):ontologíasbiológicas*– ComponentesCelulares(CC)– Funcionesmoleculares(MF)– ProcesosBiológicos(BP)– Eslaontologíamásextendida,peronolaúnica

• KEGG(rutasbiológicas),Reactome (reaccionesquímicas),etc.

46*http://www.geneontology.org/

OpenBiomedical Ontologies (OBO)

• Estándar pararepresentarontologías*• Cadatérminodelvocabularioserepresentaconunpárrafo:

47

[Term]id: GO:0000001name: mitochondrion inheritancenamespace: biological_processdef: "The distribution of mitochondria, including themitochondrial genome, into daughter cells after mitosis ormeiosis, mediated by interactions between mitochondria and the cytoskeleton." [GOC:mcc, PMID:10873824, PMID:11389764]synonym: "mitochondrial inheritance" EXACT []is_a: GO:0048308 ! organelle inheritanceis_a: GO:0048311 ! mitochondrion distribution

*Porejemplo, paraGO:http://www.geneontology.org/page/download-ontology

GeneOntology Annotations (GOA)• Enunorganismo,

cadagenestáanotadocontérminosdelaontología

• GeneAssociationFile(GAF)– Formatocomúnpara

representarlasanotaciones

– Formatotabuladode17campos

– Loscomentariosempiezanpor“!”

48

GeneAnnotation File(GAF)

49

SGD S000000349 ADH5 GO:0043458 SGD_REF:S000076493|PMID:15082781 IMP PAlcohol dehydrogenase isoenzyme V YBR145W|alcohol dehydrogenase ADH5 gene taxon:559292 20061114 SGD

1- Basededatosfuentedelaanotación2- Identificadorúnico delgenoentidadbiológica

3- Símbolo comúndelgen4,8,16,17- Algunos campospuedenestarvacíos

5- Identificadordelelementodelaontologíaconelqueseasociaalgen6- Evidenciasenlasquese apoyalaasociación(sihayvariasseseparanpor|),generalmentesonpublicacionesconPMID 7- Tipodeevidencia*

*Muyimportanteparaelbiólogo,pueshayevidenciasmáscontundentesqueotras.Engeneral,sueleserrecomendabletratarconprecauciónaquellasinferidaselectrónicamente(IEA).Paraconsultartodosloscódigos: http://www.geneontology.org/page/guide-go-evidence-codes

9- Tipodeontología:P(BP),F(MF),oC(CC)

10- Nombrecompletodelgen 11- Sinónimos delgen12- Tipodeentidad(enGOsuelen sergenes)13- Id.Taxonómicodelaentidad

14- Fechadelaanotación15- Responsable delaanotación

Ejercicio6• Implementarlafunciónfunctions

– Entrada:• ids:array connombresdegenessegún elexperimentodeDeRisi

– Salida:diccionarioconlosids degenescomoclavesycomovaloresunconjunto(set)conlosnombres delosprocesosbiológicos (P)conlosqueestáanotadoquenoesténinferidoselectrónicamente(IEA)

– Utilizad lasversiones:• GO:laversióndelSGDR64-2-1,de11defebrerode2016*• GAF:versión34023de25dejuniode2016**

– ¿Podrías obtenerunaversiónmásactualizada?¿Dónde?

• Ejemplo– [YER065C]– {'S000000867': set(['glyoxylate cycle'])}

• Prueba:['YPR184W', 'YLR312C', 'YML054C', 'YBR116C', 'YKL187C', 'YLR267W', 'YEL012W', 'YOL084W', 'YJL045W', 'YJR095W']

50* http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/anotaciones/scerevisiae/go.obo** http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/anotaciones/scerevisiae/gene_association.sgd

Anotaciones:problemas

• Apesardelosesfuerzosdeestandarización– Existenmuchosnombreseidentificadoresdistintosparacadagen

– Losformatoscambianligeramenteentreorganismos

– Hayerroresenelusodelosformatos• Elparseo deestetipodearchivossueleconsumirmuchotiempodeprogramación

51

Enriquecimientoestadístico

• SeandosconjuntosG yF deelementosgi yfitomadosdeununiversodeelementosU– F estáenriquecido porG sicontieneunnúmerodeloselementosdeGquenopuededebersealazar,teniendoencuentalostamañosdeG,F yU

52

FG

U

FG

U

FG

U

F G

U

FG

U

¿Cuál deestosconjuntosG creesqueenriquecemásaF ?

1 2 3 4

5

TestdeFisher• SeandosgruposX eY conelementosquecumplenonounadeterminadacondiciónF

• Seasumatrizdecontingencia:

• Fisherdemostróquelaprobabilidadp deestamatrizes

53

X Y Total

Cumplen F a b a+bNocumplen F c d c+d

Total a+c b+d a+b+d+c=n

𝑝 =𝑎 + 𝑏 ! 𝑐 + 𝑑 ! 𝑎 + 𝑐 ! 𝑏 + 𝑑 !

𝑎!𝑏! 𝑐!𝑑! 𝑛!

TestdeFisher:ejemplo• ConsideremosungrupoGdegenes,yotrogrupoconel

restodegenesdenuestrouniverso(U-G).• RespectoaunaanotaciónF,lamatrizdecontingenciaes:

54

G U-G Total

EnF 10 30 40=|F|

NoenF 20 140 160

Total 30=|G| 170 200=|U|

1. Tenemos40deuntotalde200genesanotadosconlafunción F2. ElgrupoGtiene10desus30genesanotadosconlafunción F3. Asumimos lahipótesisnulaH0 dequetantolosgenesenG comoelresto(U-G)

tienenlamismaprobabilidaddeestarenF4. ¿Sihubiéramoscogido|G|genesalazar,cualeslaprobabilidad detenerestatabla

decontingencia?:𝑝 =

40! 160! 30! 170!10! 30! 20! 140! 200! = 0.01789

Ejercicio7• Implementarlafunciónenrichment

– Entrada:• ids:conjuntocongenesdeinterés• goids:conjuntocongenesanotadosconunafunción• n:númerototaldegeneseneluniverso

– Salida:p-valordeltestdeFisherparaestacomparación*– Utilizad lasversionesdeGOyGAFqueseindicanenelejercicio5

• Ejemplo– ids=set(range(30))– goids=set(range(20,60))– n=200– salida: 0.01789

• Prueba:– ids=dgenes,losgenesrelacionadosconelcambiodiaúxico**– goids=geneseneltérmino alcohol metabolic process (GO:0006066):

• {'S000000056', 'S000000080', 'S000000702', 'S000000826', 'S000004937'}

– n=6034(núm.degenesenlamatrizdeexpresióndeDeRisi)

55

*PISTA:siusaspython, puedes usarlafunción pvalue delalibreríafisher, encuyocasoelvalorautilizareselderight_tail. Investigatambiénelusodeset ysus operaciones paraintersección, unión, diferencia,etc.**http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/expresion/diau/dgenes.txt

5656

FG

U

FG

U

FG

U

F G

U

FG

U

¿Cuál deestosconjuntosG creesqueenriquecemásaF ?1

2

3

4

5

|G|=30|F|=50|G∩F|=5|U|=300

|G|=30|F|=50|G∩F|=20|U|=300

|G|=180|F|=50|G∩F|=40|U|=300

|G|=30|F|=160|G∩F|=20|U|=300

|G|=30|F|=50|G∩F|=5|U|=700

5757

FG

U

FG

U

FG

U

F G

U

FG

U

1

2

3

4

5

0.49

0.92·10-12

1.07·10-10

0.28

0.05

|G|=30|F|=50|G∩F|=5|U|=300

|G|=30|F|=50|G∩F|=20|U|=300

|G|=180|F|=50|G∩F|=40|U|=300

|G|=30|F|=160|G∩F|=20|U|=300

|G|=30|F|=50|G∩F|=5|U|=700

TestdeFisher:interpretación

• Sielp-valoressuficientementebajo,podemosdecirquenosedebealazarelhechodequehayamoscogidovarioselementosdeF enG– Esdecir,F seencuentraenriquecido enG

• ¿Quéessuficientementebajo?– Sesueleestimarunumbralα=0.05,0.01o0.001• Probabilidad<=5%,1%o0.1%dequesedebaalazar

58

TestdeFisher:interpretación• UntestdeenriquecimientopermiterechazaronoH0(unadeterminadacircunstancianopareceosíparecedebidaalazar,respectivamente)

• Limitacionesdelostests deenriquecimiento[Khatri2005,Glass2014]:– NosirvenparaconfirmarquelosdatossedebenalazarencasodequenoserechaceH0• Nosepuedeconfirmartotalmenteelazar

– NopermitenconfirmarlahipótesisalternativaH1• Nosepuedeconfirmartotalmentelafaltadeazar

– Losumbralessonarbitrarios– Algunosgenesestánmásanotadosqueotros,conloquenuestraH0 noestotalmentecorrecta

59

Contrastesmúltiples dehipótesis

• Esnormalrealizareltestdeenriquecimientocontodos lostérminos GOalavez– Objetivo:detectaraquellosmásenriquecidos

• Cuantosmástests realicemos,másposibilidadeshaydequealgunodeelloscaigaporazarpordebajodelumbralfijado

60

Correcciones

• CorreccióndeBonferroni– Sedivideelumbralαentreelnúmerodetests• α=0.05,106 testsà α(corregido)=0.05/106 = 5·10-8

• FalseDiscoveryRate (FDR)*1. Secalculanlosp-valoresdenuestrosN tests2. Seordenan:P1≤P2≤P3…≤PN3. Paraunvalorα,se buscaelvalormásgrandePk tal

que:4. SetomacomoFDR(umbralcorregido)Z=Pk

61

Pk <αkN

*También conocidocomoCorreccióndeBenjamini-Hochberg

Ejercicio8• ImplementarlafunciónenrichmentAll

– Entrada:• uids:array contodoslosnombresdegenes ennuestroexperimento• gids:array cont todoslosgenesdeinterés(p.ej.losdeuncluster)• a:umbralparadeterminarsihayenriquecimiento• min:mínimonúmerodeanotacionesquedebeteneruntérminoparaser

considerado• max:máximo númerodeanotacionesquedebeteneruntérminoparaser

considerado• type:carácter‘P’,‘C’ o‘F’ indicandoeltipodetérminosGOquese

consideran– Salida:listadediccionariosconlossiguientescampos:

• name:nombredeltérmino GOenriquecido• pval:p-valor• ngis:número degenesenids anotadosconeltérmino• ngo:número degenesentotalanotadosconeltérmino

– Utilizad lasmismasversionesdeGAFyGOqueenelejercicio5

62

Ejercicio8• Ejemplo– gids=c3genes.txt*– uids=ugenes.txt**– a=10e-20, min=5, max=500, type=‘P’– Salida:[{'name': 'cytoplasmic translation', 'ngis':

45, 'ngo': 170, 'pval': 8.481635678756666e-44}]• Compara este resultado conlosresultados deDeRisi (enparticular su fig.5F)

• Prueba:– ids=randomGenes.txt***– n=númerototaldegenesenDeRisi– a=0.01, min=5, max=500

63

*Sonlos102genesdelgrupo3obtenidoconelclustering jerárquico (diap.35)eval(urllib.urlopen(http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/expresion/diau/c3genes.txt))

** TodosaquellosdelosquetenemosanotacionesenelGFF:http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/expresion/diau/ugenes.txt***Ungrupode102geneselegidosaleatoriamentehttp://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/expresion/diau/randomGenes.txt

Elpeligrodelosumbrales• Enlapruebadelej.8existentérminos enriquecidospararandomGenes, inclusoconFDR=0.01!– Esunumbralsuficientementebajo?

• Hay145términosGOBPconentre5y500anotacionesquecontenganalgunodelosgenesenrandomGenes– 145*0.01=1.45à hayposibilidadesdequesenoscuelealguno

• Recomendaciones– Mejorpecardefalsosnegativosquedefalsospositivos

• Usaumbrales<<0.01.Demaneragenérica,10-6 puedeestarbienteniendoencuentaquetenemosunos105 términosGO

• Opuedesafinarmásusandocálculoscomoelanterior– Descartatérminosconmuypocasomuchasanotaciones– Vigilasiemprengis yngo ademásdepval

64

Latrampadelinformático

• Correlaciónnoimplicacausalidad– Nosepuedesaltardeunaafirmaciónestadísticaaunaexplicaciónbiológica

– Necesidaddenuevosexperimentosbiológicosalaluzdelosindicadoresestadísticos

65

“The numbers arewhere the scientific discussion should start,not end.”StevenGoodman (ver[Nuzzo2014])

Latrampadelbiólogo

• Laestadísticanosedebecocinar– Losumbralesestadísticosdebenserrigurosos– Nosepuedenmodificarlosumbralesomodeloshastaqueconfirmenunateoríabiológica

• Muyimportante: estasdos“trampas”hanpobladolasbasesdedatosdefalsospositivosyresultadosnoreplicables

66

“P-hackingis trying multiple things until you get the desired result”UriSimonsohn [verNuzzo2014]

Bibliografía• P.Compeau andP.Pevzner (2015).Bioinformatics

Algorithms:An ActiveLearning Approach,2nded.Vol II.Ch8.

• Respetoalcambiodiaúxico– DeRisi,J.L.,Iyer,V.R.,&Brown,P.O.(1997).Exploring the

metabolic andgenetic controlofgeneexpression on agenomicscale.Science,278(5338),680-686.

– http://vis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/papers/DeRisi1997.pdf

• Respectoalaslimitacionesdelp-valor– Nuzzo,R.(2014).Statisticalerrors.Nature,506(7487),150-152.– http://www.nature.com/news/scientific-method-statistical-

errors-1.14700

67

Voronto,unaherramientaparavisualizarelenriquecimiento estadístico http://vis.usal.es/voronto68

Respiratory electron transport chain UPFig 5.DCOXlink torespiration (COX5A, COX6,etc.)Glycogen biosynthetic process UP(GSY1,2,GLG1,2,GLC3)->Fig.3

clustering - visusalvis.usal.es/rodrigo/documentos/bioinfo/muii/sesiones/6-clustering.pdf ·...

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