Evaluation clinique Evaluation clinique du VITEKdu VITEK ®® MS MS

SystSyst èème de Spectromme de Spectrom éétrie de Masse trie de Masse MALDIMALDI --TOFTOF

CHU ToulouseLaboratoire de Bactériologie-Hygiène

Laboratoire de Parasitologie-Mycologie

Dr Damien DUBOIS

Conflit dConflit d’’ intintéérrêêtt

Comparaison à la base de données spectrale

Dépôt d’une colonie et de la matrice

Génération d’un spectre :liste de pics = masses et intensités

de protéines

Spectrométrie de masse MALDI-TOFMéthode

Spectrométrie de masseMatrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Fli ght

Principe

DETECTEURPLAQUE

Spectrométrie de masse MALDI-TOFAvantages

, filamenteux

VITEK MSVITEK MS

� Base de données MS-ID => 586 espèces– 508 bacteriennes et 78 fungiques

� Algorithme ASC (Advanced Spectra Classifier)– présence et absence de pics spécifiques

� Interprétation des résultats

No ID

Evaluation Evaluation du VITEK MSdu VITEK MS� Essai clinique prospectif=> essai clinique européen multi-centrique (3 sites) =>CE-IVD

ObjectifObjectif

� Evaluer les caractéristiques de performance biologique du VITEK MS pour l’identification de

� bactéries (n=800), levures et filamenteux (n=200)� laboratoires de microbiologie clinique � avec 1 seul dépôt (spot)� en terme de % d’identification (ID) correcte

= proposition de l’ID correcte,

ie faibles discriminations incluses

IsolatsIsolats

� 6 semaines consécutives

� Issus de– différents services cliniques, – différents prélèvements (urines, selles, hémoc, …)

� Duplicats d’isolats écartés

� ≤ 50 isolats/espèce– Éviter une sur-représentation des espèces les plus fréquemment

isolées dans la routine

� Culture– Milieux COS, PVX, BCYE– Temps incubation 18 à 72h

VitekVitek®®MS MS versusversus VitekVitek®®22

Cartes GN, GP, ANC, NH et YST

=> espèces revendiquées

ID selon les recommandations du VITEK2 = incluant les tests complémentaires

proposés en cas de faible discrimination

VitekVitek®®MS MS versusversus biologie molbiologie molééculaireculaire

⇒ espèces non revendiquées par VITEK 2

⇒ discordances, no ID,

faible discrimination Vitek2

Séquençage double-brin– 16S RNA

– sodA (Staph. et Strept./Entero.)

– gyrB (Entérobactéries, Pseudo.)

– ITS (fungi)

Gènes spécifiques– N. meningitidis (crgA),

– Shigella (IpaH)

PrPrééparation des paration des ééchantillonschantillons

0.5µl Ac. Formique (25%)

Séchage

1µl matrice (HCCA)

Séchage / Cristallisation

Bactéries Filamenteux

Levures

Aucun Pré-traitement

Dépôt fin d’un isolat sur un spot => 1 spot par isolat

Formation des opFormation des opéérateursrateurs

� 4 techniciens impliqués dans l’essai

� Formation à la réalisation des dépôtspour l’acquisition des spectres sur VITEK MS => 3*48 spots (2 spots/isolat)

� Etude de maîtrise – 16 isolats (1 spot/isolat)

bactbactéériorio

PraticabilitPraticabilitéé

� « PrepStation » simple et conviviale� Spectres non exploitables peu fréquents (1/50)� Peu sensible à la qualité du dépôt (Raster)� Lames de dépôt à UU – code-barrées� Calibrant/Contrôle qualité

� Spectro volumineux, bruyant, peu ergonomique-

+

bactbactéériorio

RRéésultats globauxsultats globaux

RRéésultats globauxsultats globaux

� Non exploitables� Espèces fréquentes, � Non sur-représentées,� ID correcte par ailleurs⇒ retest avec un spot ⇒ 15 / 17 isolats retestés avec ID correcte

Trop/Pas assez pics =7

Mauvais spectres =10

bactbactéériorio

RRéésultats globauxsultats globaux

� 56 genres� 147 espèces � 962 isolats

1.1%n=11

Discordances

2.6%n=25No ID

ID OK96.3%n=926

ID incorrectes

3.8% n=36

bactbactéério + mycorio + myco

Absence dAbsence d’’ ID n=25, 2.6%ID n=25, 2.6%ID référence génotypique

*result with a second deposit1Acinetobacter without species name in public genomic databases2Genotypic ID only at the genus level - A. versicolor after conventional identification (present in the VITEK MS database)3C. metapsilosis is absent in the Vitek MS database

Reference ID Retest result*Staphylococcus aureus OK

Staphylococcus haemolyticus No IDEnterococcus faecium OK

Enterobacter cloacae OK (E. cloacae/asburiae )

Proteus mirabilis OKAlcaligenes faecalis OK

Haemophilus influenzae OKHelicobacter pylori No IDHelicobacter pylori No IDHelicobacter pylori No IDCandida albicans not done

Geotrichum candidum not done

Aspergillus sp 2 not done

Reference ID Retest result*Acinetobacter sp 1 No ID

Staphylococcus pasteuri No IDStaphylococcus condimenti No ID

Corynebacterium fastidiosum/segmentosum

No ID

Corynebacterium macginley No ID

Clostridium celerecrescens No ID

Prevotella nanceiensis No IDPrevotella nigrescens No ID

Anaerococcus hydrogenalis No ID

Candida parapsilosis/metapsilosis3 not doneCandida nivariensis not done

Candida orthopsilosis not done

Espèces absentes de la base de données

Discordances n=11, 1.1%Discordances n=11, 1.1%

=> Bactéries hors TOP30

Espèces absentes de la base de données

(%, valeurs de confiance)

ID référence génotypique

Shigella flexneri Shigella flexneri

Reference ID VITEK MS (1) VITEK MS (2) VITEK MS (3) Rete st Escherichia coli (99.9) E. coliEscherichia coli(99.9) E. coli

Aggregatibacter segnis Haemophilus influenzae (99.4) not doneCampylobacter jejuni Citrobacter braakii (84.4) OK

Neisseria mucosa Neisseria subflava (99.9) N. subflavaLactobacillus rhamnosus Propionibacterium avidum (99.3) OK

Streptococcus australis Str.parasanguinis (99.9) S. parasanguinisCandida palmioleophila Candida haemulonii (94.7) not done

Haemophilus parainfluenzae Haemophilus haemolyticus(98.8) E. aerogenes (93.5) . OKRalstonia pickettii Prevot. melaninogenica (99.9) St. saprophyticus(99.9) Chryseob. gleum(96.2) OK

Streptococcus canis Str. dys. dysgalactiae (99.9) Str. dys. equisimilis (99.9) Str. equi equi (99.9) No ID

RRéésultats en bactsultats en bact éériologieriologie

RRéésultats globauxsultats globaux

� 50 genres� 124 espèces� 766 isolats

Discordances No ID

ID OK

1.3%

n=10

2.5%

n=19

96.2%n=737

ID incorrectes

3.8% n=29

bactbactéériorio

RRéésultats globauxsultats globaux

Discordances No ID

ID OK

1.3%

n=10

2.5%

n=19

96.2%n=737

ID incorrectes

3.8% n=29

Avant Avant retestretest

ID OK97.2%n=744

1.0%

n=8

Discordances

1.8%

n=14

No ID

ID incorrectes

2.8% n=22

AprApr èès s retest retest ‘‘No IDNo ID’’(1 spot)(1 spot)

bactbactéériorio

RRéésultats globaux : TOP30sultats globaux : TOP30

TOP30 = 76.5% isolats de l’étude≈ 90% isolats en routine

Avant Avant retestretest

ID OK

100%

n=586

AprApr èèss retestretest ‘‘No IDNo ID’’(1 spot)(1 spot)

ID OK

99.1%

n=581

0.9%

n=5

No ID

bactbactéériorio

RRéésultats globaux : sultats globaux : ID OK et faibles discriminationsID OK et faibles discriminations

86.5%86.5%n= 662n= 662

ID espID esp èèceceTOTALTOTAL

Discordances No ID

1.3%

n=10

2.5%

n=19

ID OK

96.2%

n=737

ID incorrectes

3.8% n=29

1.5% n=11Faible discrisous-espèce

85%85%n=651n=651

ID ID espesp èècece

bactbactéériorio

RRéésultats globaux : ID OKsultats globaux : ID OKFaible discrimination Faible discrimination àà la sousla sous--espespèècece

1.5% (n=11)1.5% (n=11)

xx

Faibles discriminationsconstantes ou fréquentes

RRéésultats globaux : sultats globaux : ID OK et faibles discriminationsID OK et faibles discriminations

86.5%86.5%n= 662n= 662

ID espID esp èèceceTOTALTOTAL

Discordances No ID

1.3%

n=10

2.5%

n=19

ID OK

96.2%

n=737

ID incorrectes

3.8% n=29

1.5% n=11Faible discrisous-espèce

85%85%n=651n=651

ID ID espesp èècece

8.7% n=648.7% n=64 Faible discri espèce (1 difficulté)

bactbactéériorio

RRéésultats globauxsultats globaux : ID OK: ID OKFaible discrimination Faible discrimination àà ll’’ espespèèce (8.7%,ce (8.7%, n=64) = ID au genren=64) = ID au genre

=> 1 difficult=> 1 difficultéé

RRéésultats globaux : sultats globaux : ID OK et faibles discriminationsID OK et faibles discriminations

86.5%86.5%n= 662n= 662

ID espID esp èèceceTOTALTOTAL

Discordances No ID

1.3%

n=10

2.5%

n=19

ID OK

96.2%

n=737

ID incorrectes

3.8% n=29

1.5% n=11Faible discrisous-espèce

85%85%n=651n=651

ID ID espesp èècece

1.5% n=11Faible discri

genre

8.7% n=648.7% n=64 Faible discri espèce (1 difficulté)

Tests additionnels(1 difficulté)

bactbactéériorio

RRéésultats globaux : ID OKsultats globaux : ID OKFaible discrimination au genreFaible discrimination au genre

1.5% (n=11) => tests additionels1.5% (n=11) => tests additionels=> 1 difficult=> 1 difficultéé

Mais non applicable en routine, cf Discordances avec faible discriminationRetester l’isolat

RRéésultats sultats par groupe bactpar groupe bact éérienrien

StaphylococcusStaphylococcus

96.8% ID OK

97.6% ID OKaprès retest pour non ID

No ID

No ID

Retest

No ID

OK

Absents de la base de données1Species absent from the VITEK MS database

StreptococcusStreptococcus

98.2% ID OK

Streptococci groupe 'milleri'ID OK(n = 25)

Bonne ID des Streptocoques alpha-hémolytiques

versus Vitek2

S. pneumoniaeID OK

(n = 19)

1Species absent from the VITEK MS database*Low Discrimination discordances

EnterococcusEnterococcus

98.5% ID OK100% ID OK pour non ID

Retest

OK

EntEntéérobactrobactéériesries

98.9% ID OK

99.6% ID OK après retest pour non ID

E cloacae/asburiae LD

Mauvaise ID de Shigella flexneri

⇒Shigella ∈∈∈∈ E. coligénétiquement

Retest

OK

OK

E. coli

BGN non BGN non fermentantsfermentants

96,8% ID OK

Retest

No ID

OK

OK

1Species absent from the VITEK MS database*Low Discrimination discordances

Autres Gram nAutres Gram néégatifgatif

24 isolats de Haemophilus91.6% ID OK

100% ID OK après retest

Discrimination Neisseriacommensales et pathogènes

Retest

OK

OKNo ID

Helicobacter pyloriProblème de base de données?

Diversité ?

OK

N. subflava

*Low Discrimination discordances

AnaAnaéérobiesrobies

30 isolats anaérobies86.6% ID OK

Grande méconnaissancede la flore anaérobie

ID au genre ?

No IDNo ID

No ID

No ID

Retest

1Species absent from the VITEK MS database

Bacilles Gram positifBacilles Gram positif

Diversité des Corynéformes non représentée

Retest

No IDNo ID

OK

1Species absent from the VITEK MS database

RRéésultats en mycologiesultats en mycologie

Extraction Extraction ééchantillonschantillons

Protocole classiquement utilisé en MALDI-TOF :

Durée ≈ 1h00

Matrice (HCCA)

Cristallisation

≈ 1 min

+ Ethanol

2X2 min

Surna-geant

Ac. Formique + Ac cyanhydrique

15 min

2 min

Surna-geant

1 à 2 colonies

Durée ≈ 5 min

Vitek MS :0.5µl Ac.

Formique (25%)Séchage ≈ 1 min

1µl matrice (HCCA)

Cristallisation ≈ 1 min

Levure

Filamenteux Aucun Pré-traitement

LevuresLevures

00000010088C.tropicalis

1,732,240,6195,5170178Levures

00000010044Saccharo.cerevisiae

00000010011Crypto.neoformans

005031713326Autre Candida (C.metapsilosis, nivariensis, orthopsilosis, norvegensis, palmioleophila

Debaryomyces hansenii,)

210000984344C.parapsilosis

14100008667C.lusitaniae

00000010088C.krusei

00000010044C.kefyr

00000010055C.inconspicua, C.inconspicua/C.ernobii

00000010033C.guilliermondii

0000001003131C.glabrata

212100965557C.albicans

%Low discrim.%No ident.%Discordance

Incorrect identification%

Correct ident.

Numberof strainReference ID

� 17 espèces � 178 isolats

– Excellentes performances (95.5%)

– Base de données plutôt riche.

– Mais : émergence de nouvelles espèces pathogènes avec sensibilitédiminuée aux antifongiques

=> Nécessité d’être de plus en plus précis dans l’id entification et de continuer à compléter les bases de données

� 4 genres

10011Aspergillus sp

10011G.candidum

11,1288,81618Filamenteux

10022G.capitatum

10011Asper.niger

1001212Asper.fumigatus

10011Asper.flavus/Asper oryzae

%n

No ID%Correct

IDNumberof strain

Reference ID

FilamenteuxFilamenteux� 2 genres� 6 espèces � 18 isolats

– Performances encourageantes pour filamenteux testés (88.8%)

– Mais : faible échantillonage (18 souches) du fait d’une base de données encore incomplète

=> Nécessité d’enrichir la base en filamenteux pour une utilisation en routine

PerformancesPerformances� Acquisition rapide� Colonies muqueuses� Bactéries de culture lente ou difficile avec peu de matériel

� Stringence de l’algorithme – « No ID »� Un seul spot� Bonne ID des Pneumocoques et Neisseria pathogènes� Dépôt des colonies fongiques sans extraction préalab le

� Colonies sèches� Mauvaise ID des Shigella� Faible discrimination, ex « Enterobacter cloacae/asburiae »

� Stringence de l’algorithme – « No ID » => ID au genre ?� Valeurs de confiance (%) peu informatives� Base de données à étoffer

-

+

RemerciementsRemerciements

�� CHU ToulouseCHU Toulouse– Bactériologie : M Grare, MF Prère, C Segonds, E Oswald– Mycologie : X Iriart, S Cassaing, A Berry– Techniciens : B Gras-Potier, B Rigonnet, V Tudal, E Cartron

�� bioMbioMéérieuxrieux– Affaires cliniques : S Roux, C Gobet-Betoulle– R&D : V Monnin, S Chatellier