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Claudia Kohlert
Systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol nach oraler Applikation einer
thymianhaltigen Zubereitung im Menschen
Systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol nach oraler Applikation einer
thymianhaltigen Zubereitung im Menschen
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
CLAUDIA KOHLERT aus Bad Kissingen
Würzburg 2001
Eingereicht am: 28.08.01
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender: Prof. Dr. W. Goebel
Gutachter: PD Dr. M. Veit
Gutachter: Prof. Dr. H. Derendorf
Tag des Promotionskolloquiums:
Doktorurkunde ausgehändigt am:
MEINER FAMILIE
Manchmal sieht unser Schicksal aus
wie ein Fruchtbaum im Winter.
Wer sollte bei diesem traurigen Ansehen desselben
wohl denken, daß diese starren Äste,
diese zackigen Zweige im nächsten Frühjahr
wieder grünen, blühen, sodann
Früchte tragen könnten; doch wir
hoffen`s, wir wissen`s.
Goethe
DANKSAGUNGEN Zum Gelingen dieser Arbeit hat das wissenschaftliche und persönliche Engagement von Herrn Privatdozent Dr. Markus Veit, Herrn Professor Hartmut Derendorf, unseren Kooperationspartnern, Freunden und Kollegen maßgeblich beigetragen. Deshalb möchte ich mich ganz herzlich bedanken bei:
Meinem Doktorvater, Herrn Privatdozent Dr. Markus Veit, für sein
wissenschaftliches Interesse und Engagement und nicht zuletzt für seine Ermutigung, den Weg zu Ende zu gehen. Durch ihn lernte ich selbständig zu arbeiten, Verantwortung zu tragen und konnte mir Durchsetzungsvermögen erwerben. Auch für mein weiteres Leben - nicht nur in Bezug auf Fachliches - hat er mir viel mit auf den Weg gegeben.
Meiner Co-Betreuerin, Frau Privatdozentin Dr. Gudrun Abel für ihre
wissenschaftliche Unterstützung, die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes und ihren persönlichen Einsatz, der maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beitrug. Durch den Aufenthalt in der Abteilung "Forschung und Entwicklung" der Bionorica AG konnte ich wertvolle Erfahrungen für mein weiteres Berufsleben sammeln.
Meinem Co-Betreuer Herrn Prof. Dr. Hartmut Derendorf für seine
wissenschaftliche Unterstützung in Fragen der pharmakokinetischen Auswertung und für die Weiterbildung, die er mir während meines Aufenthaltes in seinem Arbeitskreis an der University of Florida ermöglichte.
Herrn Dr. Volker Christoffel für die Bereitstellung eines Arbeitsplatzes in seiner
Abteilung während meines Aufenthaltes bei der Bionorica AG. Herrn Prof. Dr. Franz-Christian Czygan für die Bereitstellung eines
Arbeitsplatzes an seinem Institut, seine Diskussionsbereitschaft und seine Anregungen, sich auch über die Wissenschaft hinaus zu bilden.
Meinen Kollegen Frau Dr. Ulrike Gräfe und Herrn Jörg Wittig, ohne deren
fachlichen und persönlichen Beistand das Anfertigen dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Sie haben mich während der Zeit am Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie in "guten und schlechten" Zeiten begleitet. Durch ihre Bereitschaft, Kritik zu üben und kompromißlos für den Anderen einzustehen, haben sie diese Zeit unvergeßlich gemacht.
Frau Dr. Irmgard van Rensen für die wissenschaftliche Unterstützung und
Diskussionsbereitschaft und allen anderen Mitarbeitern des Lehrstuhls für
Pharmazeutische Biologie, die durch ihre Hilfe einen wertvollen Beitrag zu einem sehr angenehmen Arbeitsklima leisteten.
Meinen Kollegen der Abteilung "Forschung und Entwicklung" der Bionorica AG,
insbesondere Frau Eleonora Schmid und Frau Susanna Heidmann für ihr Interesse und für ihre stete Hilfsbereitschaft.
Herrn Dr. med. Benno Brinkhaus und Herrn Dr. med. Gernot Schindler von der
Medizinischen Klinik I mit Poliklinik, Abteilung Naturheilverfahren, der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg für ihr Engagement bei der Durchführung der klinischen Studien, das maßgeblich zum Gelingen dieses Projektes beigetragen hat.
Herrn Dr. Reinhard März von der Bionorica AG, dessen großem Engagement
und Interesse wir die großzügige finanzielle Unterstützung durch die Firma Bionorica verdanken. Er stand stets mit Rat und Tat zur Seite, die Kooperation mit ihm in diesem Projekt hat mich sehr bereichert.
Herrn Holger Pforte vom Deutschen Institut für Ernährungsforschung in
Potsdam für die Durchführung der LC-Messungen im Rahmen der Plasmaanalytik. Herrn Dr. Feigl von Bayern Innovativ, ohne dessen umfangreiche finanzielle
Unterstützung unseres Projektes die Durchführung dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
A&M (Labor für Analytik und Metabolismusforschung, Bergheim) für die
Durchführung der LC-MS/MS Messungen. Frau Dr. Ulrike Gräfe, Herrn Jörg Wittig, Frau Ingrid Leipolz-Wittig und
besonders Dr. Peter Schupp für die persönliche Betreuung, Toleranz und Unterstützung, und nicht zuletzt für die Korrektur dieser Arbeit.
Meiner Familie für den persönlichen Beistand und die aufopfernde
Unterstützung während dieser Arbeit in "Krisenzeiten".
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung.......................................................................................................... 1
1.1 Ätherische Öle ............................................................................................... 3
1.2 Die Gattung Thymus in Pharmazie und Medizin............................................ 4
1.2.1 Botanik und Inhaltsstoffe ....................................................................... 4
1.2.2 Pharmakologische Aktivität ................................................................... 5
1.2.2.1 Antiphlogistische Wirkung ............................................................. 5
1.2.2.2 Sekretolytische Wirkung................................................................ 6
1.2.2.3 Antibakterielle Wirkung ................................................................. 6
1.2.2.4 Antivirale Wirkung ......................................................................... 7
1.2.2.5 Antioxidative Wirkung.................................................................... 7
1.2.2.6 Toxikologie.................................................................................... 8
1.2.3 Klinische Wirksamkeit............................................................................ 8
1.3 Kenntnisstand zu Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik von Ätherisch-Öl-
Komponenten ................................................................................................ 9
1.3.1 Resorption ............................................................................................. 9
1.3.2 Verteilung ............................................................................................ 13
1.3.3 Pharmakokinetik.................................................................................. 16
1.3.4 Elimination........................................................................................... 18
1.4 Methoden und Analytik ................................................................................ 26
1.5 Zielsetzung .................................................................................................. 28
2 Material und Methoden .................................................................................. 29
2.1 Chemikalien ................................................................................................. 29
2.2 Materialien und Geräte ................................................................................ 30
2.3 Studiendesign der Pilotstudien zur systemischen Verfügbarkeit und
Pharmakokinetik von Thymol....................................................................... 36
2.4 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Plasmaanalytik
der Pilotstudien ............................................................................................ 36
2.4.1 Methodenentwicklung der Pilotstudien ................................................ 40
2.4.2 Validierung der Methode für die Pilotstudien ....................................... 42
2.4.3 Strukturabsicherung von Thymol im Plasma nach enzymatischer
Spaltung mittels GC-MS...................................................................... 45
Inhaltsverzeichnis II
2.5 Studiendesign der Hauptstudie zur systemischen Verfügbarkeit und
Pharmakokinetik von Thymol....................................................................... 46
2.5.1 Probanden........................................................................................... 46
2.5.2 Ein- und Ausschlußkriterien................................................................. 46
2.5.3 Prüfpräparat ........................................................................................ 48
2.5.4 Dosierung ............................................................................................ 48
2.5.5 Studienablauf ...................................................................................... 49
2.5.6 Unerwünschte Ereignisse.................................................................... 50
2.6 Prüfpräparat der Hauptstudie....................................................................... 51
2.6.1 Extraktion von Thymol aus BronchipretTP Filmtabletten ................... 51
2.6.2 Trennung und Detektion ...................................................................... 51
2.6.3 Kalibrierung und Quantifizierung ......................................................... 52
2.7 Analytik der Plasma- und Urinproben vor enzymatischer Hydrolyse............ 53
2.7.1 Detektion von Thymolsulfat und Thymolglucuronid in Plasma und
Urin mittels LC-MS/MS........................................................................ 53
2.7.1.1 Probenaufarbeitung .................................................................... 53
2.7.1.2 Trennung und Detektion.............................................................. 54
2.7.2 Detektion von freiem Thymol im Plasma ............................................. 55
2.7.2.1 Probenaufarbeitung .................................................................... 55
2.7.2.2 Trennung und Detektion.............................................................. 55
2.7.3 Detektion von freiem Thymol im Urin................................................... 56
2.7.3.1 Probenaufarbeitung .................................................................... 56
2.7.3.2 Trennung und Detektion.............................................................. 56
2.8 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Plasma-
analytik für die Hauptstudie.......................................................................... 58
2.8.1 Validierung der Analytik zur Auswertung der Hauptstudie................... 61
2.8.1.1 Identifizierung und Quantifizierung der Referenzsubstanz
Thymol; Interkalibrierung des Arbeitsstandards .......................... 61
2.8.1.2 Lebensdauer der Fasern............................................................. 63
2.8.1.3 Spezifität ..................................................................................... 63
2.8.1.4 Einstellung des Gleichgewichtszustandes .................................. 65
2.8.1.5 Kalibrierfunktion: Linearität und Bestimmungsgrenze ................. 65
2.8.1.6 Richtigkeit und Wiederholpräzision ............................................. 67
Inhaltsverzeichnis III
2.8.1.7 Stabilität ...................................................................................... 69
2.8.1.8 Qualitätssicherung während der Probenmessung ...................... 70
2.8.1.9 Wiederfindung............................................................................. 71
2.8.1.10 Strukturabsicherung von Thymol im Plasma nach enzymatischer
Spaltung mittels GC-MS.............................................................. 71
2.9 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Urinanalytik .. 72
2.9.1 Methodenentwicklung.......................................................................... 72
2.9.2 Validierung .......................................................................................... 73
2.9.2.1 Spezifität ..................................................................................... 73
2.9.2.2 Einstellung des Gleichgewichtszustandes .................................. 75
2.9.2.3 Kalibrierfunktion: Linearität und Bestimmungsgrenze ................. 75
2.9.2.4 Richtigkeit und Wiederholpräzision ............................................. 77
2.9.2.5 Stabilität ...................................................................................... 78
2.9.2.6 Qualitätssicherung während der Probenmessung ...................... 79
2.9.2.7 Wiederfindung............................................................................. 80
2.9.2.8 Strukturabsicherung von Thymol im Urin nach enzymatischer
Spaltung mittels GC-MS.............................................................. 80
2.10 Synthese von Thymolglucuronid als Referenzsubstanz............................... 81
2.11 Pharmakokinetische Analysen..................................................................... 85
2.11.1 Nichtkompartiment Analyse................................................................. 85
2.11.2 Kompartiment Analyse ........................................................................ 86
3 Ergebnisse...................................................................................................... 87
3.1 Analytik der Plasma- und Urinproben vor enzymatischer Spaltung der
Konjugate .................................................................................................... 87
3.2 Ergebnisse der Pilotstudien ......................................................................... 92
3.2.1 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der
Konjugate nach Applikation einer Tablette BronchipretTP ................ 92
3.2.2 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der
Konjugate nach therapeutischer Dosierung......................................... 94
3.2.3 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der Konjugate -
Einzeldosis BronchipretTP – verlängerter Meßzeitraum.................... 95
Inhaltsverzeichnis IV
3.3 Ergebnisse der Hauptstudie......................................................................... 96
3.3.1 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der Konjugate
nach Applikation einer Tablette BronchipretTP.................................. 96
3.3.2 Renale Elimination von Thymol in Form seiner Phase-II-Metabolite ... 98
3.3.3 Pharmakokinetik in Nichtkompartiment-Modellen.............................. 100
3.3.4 Pharmakokinetik in Kompartiment-Modellen ..................................... 101
3.4 Pharmakokinetische Auswertung der Thymolkonzentrationen im Urin nach
enzymatischer Spaltung der Konjugate ..................................................... 104
4 Diskussion.................................................................................................... 106
4.1 Analytische Methoden................................................................................ 106
4.2 Metabolismus und Pharmakokinetik von Thymol....................................... 109
4.2.1 Metabolismus .................................................................................... 109
4.2.2 Pharmakokinetik................................................................................ 112
4.2.3 Beurteilung der potentiellen Wirksamkeit .......................................... 116
5 Zusammenfassung ...................................................................................... 118
6 Summary....................................................................................................... 121
7 Literaturverzeichnis ..................................................................................... 123
8 Anhang.......................................................................................................... 132
9 Abbildungsverzeichnis................................................................................ 158
10 Tabellenverzeichnis ..................................................................................... 162
11 Abkürzungsverzeichnis............................................................................... 165
1 Einleitung 1
1 Einleitung
Pflanzen, die Ätherische Öle enthalten, werden seit Jahrhunderten in der
Volksmedizin zur Behandlung und Linderung verschiedenster Krankheiten, wie z.B.
von gastrointestinalen Beschwerden, Schmerzen, Erkältungskrankheiten und
Bronchitis eingesetzt.
Die Wirksamkeit von Ätherischen Ölen und daraus hergestellten Zubereitungen hat
sich in langer Tradition - sprich empirisch - erwiesen und konnte in klinischen Studien
bestätigt werden. Zusätzlich wurden in In-vitro-Assays diverse pharmakologische
Eigenschaften Ätherischer Öle oder daraus isolierter Einzelkomponenten festgestellt.
Es ist allerdings häufig nicht klar, welche Substanzen im Körper für die beobachteten
Effekte verantwortlich sind. Untersuchungen zur systemischen Verfügbarkeit liefern
erste Anhaltspunkte, ob die in vitro getesteten Verbindungen auch für die in vivo
beobachteten Effekte bzw. die klinische Wirksamkeit einer Verbindung oder daraus
hergestellten Zubereitungen verantwortlich sind. Darüber hinaus sind
Untersuchungen zu Resorption, Verteilung und Metabolismus wünschenswert. Zum
einen, um die systemische Verfügbarkeit der betreffenden Verbindung am Zielorgan
abzuklären und zum anderen, um die Arzneimittelsicherheit und –unbedenklichkeit
im Rahmen von Zulassungs- und Nachzulassungsverfahren auch bei pflanzlichen
Arzneimitteln zu gewährleisten.
Trotz der großen Anzahl pflanzlicher Arzneimittel, die Ätherische Öle oder natürlich
vorkommende Verbindungen aus Ätherischen Ölen enthalten, existieren nur einige
wenige Studien zur systemischen Verfügbarkeit und Pharmakokinetik. Dies zeigt, wie
groß der Bedarf an weiteren Untersuchungen zur Pharmakokinetik und
Bioverfügbarkeit ist.
Verläßliche Daten zur Pharmakokinetik am Menschen könnten helfen zu klären, ob
eine Substanz oder deren Metabolite zur Therapie bestimmter Krankheiten beitragen
kann, und würden somit auch einen Beitrag zur größeren Sicherheit in der
Anwendung pflanzlicher Arzneimittel leisten.
Das im Rahmen des im folgenden beschriebenen Projektes verwendete
Fertigarzneimittel BronchipretTP, eine Kombination aus Thymiantrockenextrakt und
Primelwurzeltrockenextrakt, wird zur Therapie der akuten Bronchitis eingesetzt.
Untersuchungen zur systemischen Verfügbarkeit sollen jedoch zunächst klären, ob
1 Einleitung 2
Thymol, das den Hauptbestandteil des ätherischen Thymianlös darstellt, für die
Wirksamkeit (mit)verantwortlich sein kann.
Derartige Untersuchungen liefern nicht nur Daten, die ein rationales Konzept in der
Phytotherapie untermauern können, sondern sind auch national und international
richtungsweisend für Wirksamkeitsprüfungen von Phytopharmaka, die bei
Atemwegserkrankungen eingesetzt werden.
1 Einleitung 3
1.1 Ätherische Öle
Ätherische Öle sind Gemische lipophiler, bei Raumtemperatur meist flüssiger,
flüchtiger, sehr intensiv riechender Verbindungen, die von Pflanzen produziert
werden. Ein natürliches Ätherisches Öl setzt sich aus einer Vielzahl lipophiler
Einzelsubstanzen zusammen. Bisher sind ca. 3000 Verbindungen beschrieben, die
hauptsächlich aus dem Terpen- und auch dem Phenylpropanstoffwechsel stammen.
Aufgrund der chemischen Struktur der Verbindungen neigen Ätherische Öle zur
Autoxidation und sollten daher vor Licht und Sauerstoff geschützt aufbewahrt werden
(TEUSCHER, 1997).
Ätherische Öle bzw. daraus isolierte Verbindungen werden vielfältig in der
Lebensmittelindustrie verwendet, beispielsweise als Aromastoffe zur Herstellung von
Zahnpasten, Bonbons, Kaugummis oder Getränken. Darüber hinaus sind sie in
Bohnerwachs, Schuhcremes und Raumsprays zu finden.
In der Medizin werden die Ätherischen Öle in langer Tradition verwendet
(GILDEMEISTER und HOFFMANN, 1956). Ätherische Öle bzw. einzelne isolierte
Verbindungen werden auf Grund ihrer sekretolytischen, expektorierenden,
spasmolytischen, antitussiven und antibakteriellen Eigenschaften zur Therapie von
Erkältungskrankheiten eingesetzt. Zur Wirksamkeit von 1,8-Cineol (GRIMM, 1987;
DOROW, 1989; MAHLO et al., 1990), Thymianextrakt (KNOLS et al., 1994; ERNST et al.,
1997) und Myrtol (FEDERSPIL et al., 1997) liegen Studien zur klinischen Wirksamkeit
vor. Einige Ätherische Öle bzw. Ätherisch-Öl-Komponenten, wie beispielsweise
Terpentinöl oder Campher zeigen bei äußerlicher Anwendung hyperämisierende
Eigenschaften (SCHILCHER, 1986), Pfefferminzöl wirkt schmerzlindernd bei
Kopfschmerzen vom Spannungstyp (GÖBEL et al., 1996) und nach oraler Applikation
bei Reizdarmsyndrom (LIU et al., 1997; PITTLER und ERNST, 1998) und Dyspepsie
(MAY et al., 1996).
Zum Wirkmechanismus Ätherischer Öle ist jedoch noch wenig bekannt. Es wird
postuliert, daß die Einzelkomponenten auf Grund ihrer geringen Molekülgröße und
Lipophilie mit Zellmembranen in Wechselwirkungen treten können. Die Reizwirkung
könnte, ähnlich wie bei Lokalanästhetika, bei hohen Konzentrationen durch
Membranschädigung entstehen, während mittlere Konzentrationen membran-
1 Einleitung 4
stabilisierend wirken (TEUSCHER et al., 1990). Bei geringeren Konzentrationen treten
Effekte durch spezifische Wechselwirkungen mit Enzymen, Carriern, Ionenkanälen
oder Rezeptoren, die in der Zellmembran lokalisiert sind, auf (SCHILCHER, 1986;
TEUSCHER et al., 1990). Ätherisch-Öl-Komponenten können auf Grund ihrer
strukturellen Eigenschaften die Blut-Hirn-Schranke überwinden. Diese Tatsache
macht sich auch die Aromatherapie zunutze, bei der man nach Applikation
Ätherischer Öle einen Einfluß auf die Gehirnaktivität feststellen kann (BUCHBAUER,
1998).
1.2 Die Gattung Thymus in Pharmazie und Medizin
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden mit einem
Fertigpräparat vorgenommen. Dabei handelt es sich um Bronchipret®TP
Filmtabletten, die Thymian- und Primelwurzeltrockenextrakt enthalten.
1.2.1 Botanik und Inhaltsstoffe
Thymus vulgaris (Abb. 1.1) L. gehört zur Familie der Lamiaceae. Der bis zu 50 cm
hoch werdende Strauch mit lanzettlich eingerollten Blättern und rötlich-violetten
Blüten wächst auf den Macchien der Berge in Italien, Südfrankreich und Spanien
(HÄNSEL et al., 1994; CZYGAN, 1997; HÄNSEL et al., 1999).
Abb. 1.1 Thymus vulgaris, L.
1 Einleitung 5
Thymiankraut (Thymi herba), bestehend aus den getrockneten Laubblättern und
Blüten, ist schon in den alten „Arzneibüchern“ als probates Mittel bei Infektionen der
Atemwege bekannt. Bereits im Jahre 1543 beschreibt Leonhart Fuchs in seinem
„New Kreüterbuch“ die heute noch genutzte Wirksamkeit gegen Husten (CZYGAN und
HÄNSEL, 1993). Volksmedizinisch wird Thymian unter anderem bei Asthma, Laryngitis
und Tonsillitis verwendet.
Im Europäischen Arzneibuch sind sowohl Thymus vulgaris als auch Thymus zygis als
offizinelle Drogen geführt (EUROPÄISCHES ARZNEIBUCH, 1997). Thymus vulgaris führt
1-2,5 % Ätherisches Öl, dessen Hauptbestandteil mit 30-70 % das Thymol darstellt.
Neben Thymol sind das isomere Carvacrol mit 3-15 % und 1,8-Cineol mit 2-14 % zu
finden. Neben dem Ätherischen Öl finden sich Flavonoide, Gerbstoffe, Bitterstoffe
und Triterpene (HÄNSEL et al., 1994; CZYGAN, 1997).
1.2.2 Pharmakologische Aktivität
Thymian in einer Dosis von 1-2 g Droge auf eine Tasse als Aufguß mehrmals täglich
oder in Form von Fluidextrakt (1-3 mal täglich 1-2 g) wird zur Therapie von
Bronchitis, Keuchhusten und Katarrhen der oberen Luftwege eingesetzt. Es sind
bronchospasmolytische, expektorierende und antibakterielle Wirkungen beschrieben
(BUNDESANZEIGER, 1992).
Die im folgenden aufgeführten pharmakologischen Aktivitäten wurden z.T. nach
Applikation verschiedener Zubereitungen (Thymianextrakt, Ätherisches Thymianöl
oder einzelne Ätherisch-Öl-Komponenten des Thymianöls) beobachtet. Es muß
deshalb jeweils die unterschiedliche stoffliche Zusammensetzung der verwendeten
Zubereitungen berücksichtigt werden.
1.2.2.1 Antiphlogistische Wirkung
Im Carrageenin-induzierten Rattenpfotenödemmodell wurde eine dosisabhängige,
antiphlogistische Wirkung für Thymianextrakt nach oraler Applikation (162 mg/kg
Körpergewicht) gezeigt. Da das Maximum der Hemmung vor allem in der frühen
Phase beobachtet wurde (0,5 – 2 h nach Applikation), nahm man an, daß die
entzündungshemmende Wirkung vor allem auf die Hemmwirkung gegenüber
1 Einleitung 6
Histamin und Serotonin zurückzuführen war (MORGENSTERN, 1998). Primel-
wurzelextrakt, der neben Thymianextrakt Bestandteil der BronchipretTP
Filmtabletten ist, zeigte in demselben Modell zwar ebenso antiphlogistische Wirkung,
jedoch leistete Thymian den hauptsächlichen Beitrag (MORGENSTERN, 1998).
1.2.2.2 Sekretolytische Wirkung
Thymianöl zeigt eine sekretolytische, sekretomotorische und broncholytische
Wirkung (WEIß, 1991). Durch die vermehrte Bildung seröser Interziliarflüssigkeit,
sowie die gleichzeitige Steigerung der Ziliartätigkeit an den Bronchien, wird das
Abhusten erleichtert (HÄNSEL et al., 1994; CZYGAN, 1997). Die dosisabhängige,
sekretolytische Wirkung des Thymianextraktes wurde außerdem in verschiedenen
Sekretolysemodellen am Kaninchen bzw. an der Ratte belegt (LESLIE, 1978; Curle et
al., 1991).
1.2.2.3 Antibakterielle Wirkung
Die bakteriostatische Wirkung verschiedener Thymianöle bzw. einzelner
Komponenten, unter anderem auch gegen Erreger, die bei akuten und chronischen
Atemwegserkrankungen am häufigsten nachgewiesen wurden, ist zahlreich in der
Literatur beschrieben (CRESPO et al., 1990; DIDRY et al., 1993; PANIZZI et al., 1993;
SHAPIRO et al., 1994; PATTNAIK et al., 1996; MARINO et al., 1999).
In einer Untersuchung von Panizzi et al. zeigte ein Thymianöl mit 31,4 % Thymol,
12,4 % Carvacrol sowie gamma-Terpinen (11,1 %) und p-Cymen (17,0 %) eine
minimale Hemmkonzentration (MHK) gegenüber Staphylococcus aureus von
5 µg⋅mL-1 Flüssigmedium. Gegenüber Escherichia coli, Bacillus subtilis und
Saccharomyces cerevisiae betrug die MHK jeweils 2 µg⋅mL-1, gegenüber Candida
albicans nur 1 µg⋅mL-1 (PANIZZI et al., 1993).
Die Wirkung der Ätherisch-Öl-Fraktion der phenolreichen spanischen Thymus-Art
Thymus serpylloides ssp. gadorensis wurde an sechs grampositiven und
gramnegativen Bakterienstämmen mit der Methode der Filterplättchendiffusion
getestet (CRESPO et al., 1990). Neben der Ätherisch-Öl-Fraktion wurden auch
1 Einleitung 7
synthetische Mischungen der in dem Öl enthaltenen Kohlenwasserstoffe, Alkohole,
Acetate und Phenole untersucht. Am stärksten wirksam war die Mischung der
Phenole und der Alkohole.
Im Test gegen 9 gramnegative und 6 grampositive Bakterien zeigte sich
Thymianöl vor allem gegen grampositive Bakterien als biostatisch wirksam
(MARINO et al., 1999). Im Vergleich zu anderen Entwicklungsstadien erwies sich das
zur Blütezeit gewonnene Öl als das wirksamste.
1.2.2.4 Antivirale Wirkung
Eine antivirale Wirkung konnte für Thymianextrakt im Plaque-Reduktions-Test
gegenüber Influenza-A-Viren und dem Respiratory-Syncytical-Virus (RS-Virus)
gezeigt werden. Für die Hemmung von Influenza-A-Viren wurde eine IC50 von 15 µg
Trockenmasse⋅mL-1 ermittelt. Die IC50 für Amantadin als Referenzsubstanz lag bei
1 µg Trockenmasse⋅mL-1 (SCHWENK, 1998).
1.2.2.5 Antioxidative Wirkung
Neben dem Einsatz als alt bewährtes Hustenmittel interessiert sich die Wissenschaft
in jüngster Zeit auch auf anderen Ebenen für den Thymian bzw. das Ätherische
Thymianöl.
Der antioxidative Effekt des Thymianöls bzw. von Thymol alleine konnte in Ratten
nachgewiesen werden. Nach Applikation von Thymianöl bzw. Thymol war die
Aktivität antioxidativ wirksamer Enzyme (Superoxiddismutase und Glutathion-
peroxidase) gegenüber den Kontrolltieren signifikant erhöht. Der Gehalt mehrfach
ungesättigter Fettsäuren in cerebralen Phospholipiden sowie anderen Geweben, die
für eine normale Hirntätigkeit, vor allem im Alter notwendig sind, blieb auf einem
deutlich höheren Niveau als bei den Kontrolltieren. Der Hauptbeitrag zu dem
beobachteten antioxidativen Effekt wurde offenbar durch Thymol geleistet (YOUDIM
und DEANS, 1999; YOUDIM und DEANS, 2000).
1 Einleitung 8
1.2.2.6 Toxikologie
Weder Thymianextrakt noch Thymianöl zeigten in Tierversuchen mit Ratten und
Mäusen akute Toxizität nach oraler Gabe (LESLIE und SALMON, 1979; QURESHI et al.,
1991). Für die Applikation von Thymianöl (Thymus Kotschyanus) lag die LD50 für
kleinere Labortiere bei 1000-1200 mg⋅kg-1 Körpergewicht. Für Kaninchen gelang die
Bestimmung der LD50 auf Grund der offensichtlich fehlenden Toxizität nicht
(GUSEINOW et al., 1987).
1.2.3 Klinische Wirksamkeit
In einer randomisierten Doppelblindstudie an 60 Patienten mit produktivem Husten
wurde die vergleichbare sekretolytische Wirksamkeit von Thymianextrakt und
Bromhexin gezeigt (KNOLS et al., 1994).
Der Vergleich von Bronchipret Filmtabletten mit anderen Sekretolytika in einer
Multicenter Studie im Hinblick auf die klinische Wirksamkeit bei akuter Bronchitis
belegte, daß Bronchipret Filmtabletten sowohl gegenüber anderen pflanzlichen als
auch synthetischen Sekretolytika relevante therapeutische Vorteile, vor allem bei der
Behandlung Erwachsener, aufwies (ERNST et al., 1997). So wurde durch die
Bronchipret Therapie die Menge, Viskosität und Eigenschaften des Sputums positiv
beeinflußt. Die Hustenhäufigkeit tagsüber sowie nachts und der Schmerz während
des Hustens nahmen unter der Therapie ab. Ebenso verringerte sich die Auskultation
auch während des Hustens. Bei den Nebenwirkungen wurden lediglich
gastrointestinale Störungen beobachtet, die aber gegenüber synthetischen
Sekretolytika eine geringere Rate aufwiesen. Somit erwies sich Bronchipret in der
symptomatischen Behandlung akuter Bronchitis als sichere und effektive
Formulierung.
1 Einleitung 9
1.3 Kenntnisstand zu Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik von Ätherisch-Öl-Komponenten
Die Pharmakokinetik natürlicher, terpenoider Verbindungen ist noch nicht
ausreichend untersucht. Für einige Monoterpene liegen sehr detaillierte Daten vor,
aber vor allem zu Untersuchungen am Menschen fehlen zufriedenstellende
pharmakokinetische Daten. Ergebnisse aus Tierexperimenten sind zwar nicht ohne
weiteres auf den Menschen übertragbar, jedoch sind sie angesichts der spärlichen
Datenlage zu dieser Thematik ein wertvoller Anhaltspunkt.
Leider wurden in den vorliegenden Arbeiten meistens keine oder nur sehr wenige
Angaben zu den jeweils verwendeten analytischen Methoden gemacht. Deshalb
mußte die Bewertung der Ergebnisse der Studien vorsichtig vorgenommen werden,
da die verwendeten analytischen Methoden den Anforderungen einer
entsprechenden Validierung nicht genügen könnten.
1.3.1 Resorption
Dermale Applikation
Zubereitungen aus Eukalyptusöl und Latschenkiefernöl, die α- und β-Pinen,
Campher, 3-Caren, und Limonen enthielten, wurden für die meisten Studien zur
Untersuchung der dermalen Resorption Ätherischer-Öl-Komponenten herangezogen.
(Strukturformeln der im folgenden beschriebenen Verbindungen siehe Abb. 1.2).
Diese Monoterpene wurden nach dermaler Applikation auf Grund ihrer lipophilen
Eigenschaften und der geringen Molekülgröße ohne weiteres resorbiert (RÖMMELT et
al., 1974; SCHÄFER und SCHÄFER, 1982; SCHUSTER et al., 1986).
Die Haut stellte keine Barriere für die Resorption der betrachteten Verbindungen dar
(RÖMMELT et al., 1974; SCHÄFER und SCHÄFER, 1982). Die Applikation Ätherischer-Öl-
Verbindungen in Form einer Salbe bei Menschen (SCHUSTER et al., 1986;
LANGENECKERT, 1998) als auch in Form eines Bades bei Mäusen (SCHÄFER und
SCHÄFER, 1982) führte zu einem raschen Anstieg der Plasmakonzentrationen der
untersuchten Verbindungen.
Die ebenfalls mögliche pulmonale Resorption flüchtiger Verbindungen wurde in allen
Studien mit externer Luftzufuhr der Probanden während der Versuche vermieden.
1 Einleitung 10
Dieses Verfahren schien sinnvoll, denn in den von Langeneckert durchgeführten
Untersuchungen zeigte sich, daß ein erheblicher Teil der Verbindungen bei dermaler
Applikation auch pulmonal resorbiert wurde (LANGENECKERT, 1998). Maximale
Plasmakonzentrationen wurden innerhalb von 10 min für α-Pinen (SCHUSTER, 1986)
bzw. nach 1 h für 1,8-Cineol (LANGENECKERT, 1998) beobachtet. Es konnte gezeigt
werden, daß das Ausmaß der Resorption von der Größe des behandelten
Hautareals (SCHÄFER und SCHÄFER, 1982), den Hauteigenschaften, den
verabreichten Konzentrationen, sowie der Expositionszeit abhing (RÖMMELT et al.,
1974). Die zuletzt genannten Ergebnisse wurden in einer Studie mit nur einem
Probanden erhalten und erlauben deshalb nur begrenzte Schlußfolgerungen (Details
siehe Tab. 1.1 und Tab. 1.2).
Orale Applikation
Nur wenige Studien beschäftigten sich mit der Resorption flüchtiger Verbindungen
nach oraler Applikation. In drei Studien mit Ratten wurde mit Hilfe von radioaktiv
markiertem 14C-Citral und [1-14C]-trans-Anethol die aufgenommene Menge über die
in Urin, Faeces und Ausatemluft wiedergefundene Menge an Radioaktivität
abgeschätzt (SANGSTER et al., 1984b; DILIBERTO et al., 1988; BOUNDS und CALDWELL,
1996). Es wurden 80-95 % der ursprünglich verabreichten Radioaktivität
wiedergefunden.
In einer pharmakokinetischen Studie wurden Probanden Weichgelatinekapseln
verabreicht, die ein definiertes Gemisch aus Limonen, 1,8-Cineol und α-Pinen
enthielten (ZIMMERMANN et al., 1995). Es wurden zerkleinerte Kapseln (entsprach der
Verabreichung in flüssiger Form) mit intakten Kapseln verglichen. Bei beiden
Probandengruppen, konnten annähernd gleiche AUC-Werte beobachtet werden. Die
Differenz der AUC-Werte betrug weniger als 7 %. Die Cmax-Werte der Probanden, die
die zerkleinerten Kapseln erhalten hatten, waren mehr als 25 % höher und tmax war
0,75 h verglichen mit 2,5 h in der Gruppe der ganzen Kapseln. Diese Daten deuteten
darauf hin, daß der obere Teil des Gastrointestinaltraktes keinen signifikanten Einfluß
auf die Resorption von 1,8-Cineol hatte.
1 Einleitung 11
Abb. 1.2 Strukturformeln von Ätherisch-ÖL-Komponenten (SCHNEIDER, 1998).
OH
OH
p-Cymen Thymol Carvacrol
OMe OH
OMe
t-Anethol Eugenol (+)-α-Pinen
OH (-)-α-Pinen (-)-ß-Pinen (-)-Borneol
O
O
OH
L(-)-Campher 1,8-Cineol (-)-Menthol
OH
O
H
(+)-Limonen Linalool t-Citral (=Geranial)
1 Einleitung 12
OH
CO2H
OH
(+)-3-Caren (-)-Isobornylacetat (-)-Myrtenal
CH2OH
OH
O
(-)-Myrtenol Pinocarveol (-)-Verbenon
Pulmonale Resorption
Flüchtige Monoterpene sind ganz besonders zur Inhalation geeignet, beispielsweise
zur Therapie von Infektionen des Respirationstraktes. Nach Inhalation können die
Substanzen durch die Lunge resorbiert werden und somit systemisch verfügbar sein.
54-76 % der mit dem Inhalat verabreichten Dosis von α-Pinen, Campher und
Menthol wurden durch die Lunge aufgenommen (RÖMMELT et al., 1978; RÖMMELT et
al., 1988; LEVIN et al., 1992). Die Berechnung der absorbierten Menge erfolgte
jedoch durch die Bildung der Differenz von eingeatmeter und ausgeatmeter Menge.
Diese Methode brachte jedoch einige Unsicherheiten mit sich, wie beispielsweise
Ablagerungen der Verbindungen auf der Schleimhaut sowie Metabolismus vor der
Resorption; auch die Verteilung in andere Kompartimente wurde somit nicht
berücksichtigt. Diese Bedenken wurden durch eine Studie bestätigt, bei der nur 4-
6 % der durch Inhalation verabreichten Menge im Blut wiedergefunden wurden
(RÖMMELT et al., 1978).
Vielfältige Faktoren schienen das Ausmaß der inhalativen Resorption zu
beeinflussen. Römmelt et al. (1988) zeigten, daß die pulmonale Resorption von der
Art der Verbindung und der Atemmechanik der Probanden abhing (RÖMMELT et al.,
1988). Außerdem konnte gezeigt werden, daß der Übergang der Verbindungen aus
dem Wasser in die Gasphase Temperatur abhängig war. Bei 80°C konnten nach
1 Einleitung 13
15 min zwar 12 % Campher aber nur 5 % Menthol in der Gasphase detektiert
werden. Offensichtlich korrelierte der Anteil der pulmonalen Resorption mit der
Flüchtigkeit der Verbindungen (LANGENECKERT, 1998) (Details siehe Tab. 1.2).
1.3.2 Verteilung
Der Metabolismus von Ätherisch-Öl-Komponenten ist durch ihre individuelle
chemische Struktur bedingt, weshalb keine generellen Aussagen getroffen werden
können. Metaboliten entstehen sowohl durch Phase-I- als auch durch Phase-II-
Reaktionen.
Bereits 1979 wurden von Takada et al. Untersuchungen zum Metabolismus von
Thymol in Kaninchen und am Menschen durchgeführt (TAKADA et al., 1979). Im Urin
von 3 Kaninchen wurde nach oraler Applikation von Thymol in einer Dosis von
0,5 g⋅kg-1 Körpergewicht der Anteil an Glucuronsäure und Schwefelsäure vor
Applikation des Thymols mit dem Gehalt nach der Applikation verglichen. Aus
diesem Vergleich folgerten die Autoren, daß Thymol bzw. Oxidationsprodukte des
Thymols hauptsächlich an Glucuronsäure konjugiert wurden. Ob der Urin vor der
Bestimmung mit Glucuronidase bzw. Sulfatase behandelt wurde, war nicht
ersichtlich.
Aus Urin von 2 Probanden wurde nach oraler Applikation von 0,6 g Thymol
Thymohydrochinon und Thymolglucuronid isoliert und durch den Vergleich mit
synthetisierten Referenzsubstanzen die Identität bestätigt. Die Existenz von
Thymolsulfat wurde auf Grund von Experimenten mit Flüssig-Flüssig-Extraktion
postuliert. Die Strukturabsicherung der Komponenten mittels Massenspektrometrie
fehlte jedoch.
Austgulen et al. (1987) konnten nach Applikation von 1 mmol⋅kg-1 Thymol per
Magensonde im Rattenurin 6 Phase-I-Metabolite detektieren (Abb. 1.3) (AUSTGULEN
et al., 1987). Hierbei handelte es sich um Oxidationsprodukte. Die Oxidation fand
sowohl am Aromaten als auch an der aliphatischen Seitenkette statt. Die massen-
spektrometrische Strukturaufklärung der Thymolmetabolite erfolgte jedoch nicht an
Hand von Referenzsubstanzen, sondern im Vergleich mit Fragmentierungsmustern
des strukturell ähnlichen p-Cymens, dessen Metabolite in einer früher durchgeführten
Studie bestimmt wurden.
1 Einleitung 14
OH
OH
OH
OH
OHO
OH
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
ThymolThymohydrochinon
Abb. 1.3 Phase-I-Metaboliten von Thymol im Rattenurin (AUSTGULEN et al., 1987).
Der Metabolismus von trans-Anethol wurde sowohl bei Nagern als auch bei
Menschen untersucht (SANGSTER et al., 1984a; SANGSTER et al., 1984b; SANGSTER et
al., 1987). Die Bestimmung renaler Metabolite deutete darauf hin, daß 14C-trans-
Anethol im Menschen vollständig über den Weg der oxidativen O-Demethylierung
und Oxidation der Seitenkette an unterschiedlichen Stellen abgebaut wurde
(SANGSTER et al., 1987). Es wurde kein freies trans-Anethol im Urin detektiert. Das
Metabolitenmuster renaler Metabolite beim Menschen unterschied sich nur
quantitativ von dem der Ratten. Eine Dosisabhängigkeit in der Bildung renaler
Metabolite war sowohl für t-Anethol in Nagern als auch für 14C-Eugenol in Ratten zu
beobachten (SUTTON et al., 1985). Für trans-Anethol war die Bildung der Phase-I-
1 Einleitung 15
Metabolite dosisabhängig (SANGSTER et al., 1984a), wohingegen 14C-Eugenol eine
Dosisabhängigkeit bei der Bildung von Phase-II-Metaboliten zeigte.
Metaboliten von Menthol wurden in einigen Humanstudien untersucht (BELL et al.,
1981; SOMERVILLE et al., 1984; KAFFENBERGER und DOYLE, 1990; LANGENECKERT,
1998). Nach oraler Applikation von L-(-)-Menthol bzw. Pfefferminzöl wurden 35-80 %
des ursprünglichen Mentholgehaltes renal als Glucuronid eliminiert. Nur in der von
Bell et al. (1981) durchgeführten Studie wurde die Menge an freiem Menthol und
Mentholglucuronid separat untersucht (BELL et al., 1981). Es konnte kein freies
Menthol detektiert werden und Mentholsulfat wurde nur in Spuren nachgewiesen.
Die großen interindividuellen Schwankungen bezüglich der ausgeschiedenen Menge
an Menthol könnten auf Unterschiede in der Resorption und die unterschiedlichen
Eßgewohnheiten zurückzuführen sein (KAFFENBERGER und DOYLE, 1990). Nach
Verabreichung von Pfefferminzölkapseln an Ileostomiepatienten war die Elimination
von Mentholglucuronid um 6 % geringer als nach Verabreichung an gesunde
Probanden. Dies ließ vermuten, daß der Großteil der Mentholresorption in oberen
Darmabschnitten stattfand (SOMERVILLE et al., 1984).
Andere Bestandteile des Ätherischen Pfefferminzöls wie Menthon oder
Menthylacetat wurden in diesen Studien jedoch nicht untersucht. Diese
Verbindungen könnten aber zu Menthol metabolisiert werden und als
Mentholglucuronid ausgeschieden werden.
Der Metabolismus von Menthol wurde detailliert in Ratten nach oraler Applikation
untersucht (MANS und PENTZ, 1987; YAMAGUCHI et al., 1994). Das Oxidationsmuster
war dem des Thymols ähnlich. Mentholglucuronid stellte mit einem Anteil von 60 %
im Rattenurin ebenfalls den Hauptmetaboliten dar (MANS und PENTZ, 1987).
Untersuchungen zu Citral (Isomerengemisch aus Neral und Geranial) in Ratten
zeigten einen vollständigen und stereoselektiven Metabolismus (DILIBERTO et al.,
1990). Zusätzlich zur Leber waren noch andere Organe am Metabolismus beteiligt.
Der Vergleich der Eliminationswege nach oraler, intravenöser und dermaler
Applikation ließen einen cutanen first-pass Effekt vermuten (DILIBERTO et al., 1988)
(Details siehe Tab. 1.3).
1 Einleitung 16
1.3.3 Pharmakokinetik
Aus der zur Verfügung stehenden Literatur zur Pharmakokinetik Ätherischer-Öl-
Komponenten ging hervor, daß die meisten Ätherischen Öle bzw. einzelne
Verbindungen daraus durch ein mindestens biphasisches Plasmakonzentrationsprofil
gekennzeichnet waren (KLEINSCHMIDT et al., 1985; KOVAR et al., 1987; FALK und
HAGBERG, 1990; JAGER et al., 1996). Dies deutete darauf hin, daß die Verbindungen
zunächst in andere Gewebe verteilt wurden. Eine hohe Clearance und kurze
Eliminationshalbwertszeiten ließen jedoch eine Kumulation unwahrscheinlich
erscheinen.
Der beste Ansatz, grundlegende pharmakokinetische Parameter einer Verbindung
(Halbwertszeit, Verteilungsvolumen und Clearance) zu erhalten, ist die Beobachtung
der Plasmakonzentrationen nach intravenöser Injektion. Es wurde jedoch nur eine
Studie nach intravenöser Applikation von Kleinschmidt et al. (1985) durchgeführt, bei
der den Probanden ein bronchosekretolytisches Gemisch von Terpenen (Ozothin®:
Myrtenal, Myrtenol, Pinocarveol, Verbenon, Terbinhydrat) injiziert wurde und
anschließend Plasmakonzentrationen als Gesamtterpenkonzentration bestimmt
wurden. Die kurze Halbwertszeit in der α-Phase von 3 bis 4 min deutete auf eine
rasche Verteilung der Terpene in Gewebe hin. Die Eliminationshalbwertszeit in der β-
Phase von 60-65 min wurde auf Metabolismus und Ausscheidung zurückgeführt
(KLEINSCHMIDT et al., 1985).
Pharmakokinetische Kenndaten von α-Pinen wurden nach oraler, dermaler und
pulmomaler Applikation bestimmt (SCHUSTER et al., 1986; FALK und HAGBERG, 1990;
LANGENECKERT, 1998). Nach oraler Applikation ergab sich eine Halbwertszeit von
202 min. Nach dermaler Applikation hingegen wurde eine mit ca. 5 min sehr kurze
Halbwertszeit in der α-Phase, gefolgt von einer längeren Halbwertszeit in der β-
Phase (26 bis 38 min) beobachtet. In der Studie von Falk und Hagberg (1990) wurde
eine dritte γ-Phase mit einer Eliminationshalbwertszeit von 695 min bestimmt (FALK
und HAGBERG, 1990). Hierbei wurde die Wichtigkeit langer Blutabnahmezeiten und
die Notwendigkeit sensitiver Methoden zur Bestimmung pharmakokinetischer
Parameter deutlich. Das hohe Verteilungsvolumen von α-Pinen deutete auf
1 Einleitung 17
Verteilung der Verbindung in Kompartimente hin, was wiederum auf die Affinität zu
lipophilen Geweben zurückzuführen sein könnte.
Trotz des hohen Verteilungsvolumens sprach die hohe Clearance für eine schnelle
Elimination von α-Pinen, weshalb es auch bei Langzeitapplikation nicht zu einer
Kumulation kommen dürfte. In dieser Studie wurden hohe Standardabweichungen
beobachtet, was durch das gemischte Probandenkollektiv (weibliche und männliche
Probanden) bedingt gewesen sein könnte (SCHUSTER et al., 1986).
Nach Inhalation von 1,8-Cineol konnte ein erheblicher Unterschied in der
Eliminatioshalbwertszeit zwischen weiblichen und männlichen Probanden beobachtet
werden (JAGER et al., 1996). Obwohl pulmonale Resorption und tmax annähernd
gleich waren, zeigte sich für die weiblichen Probanden eine doppelt so lange
Eliminationshalbwertszeit von 18 h. Auf Grund dessen nahm man an, daß das
subcutane Fettgewebe einen wichtigen Einfluß auf die Elimination von 1,8-Cineol
ausübte. Nach oraler Applikation von 1,8-Cineol wurde eine Halbwertszeit von 5,86 h
ermittelt (LANGENECKERT, 1998).
Die relative Bioverfügbarkeit von 1,8-Cineol und pharmakokinetische Kenndaten von
Myrtol (Gemisch aus 30 mg 1,8-Cineol, 30 mg Limonen und 8 mg α-Pinen) wurden
nach oraler Applikation intakter und zerkleinerter Kapseln bestimmt (ZIMMERMANN et
al., 1995). Vergleiche der 1,8-Cineol Plasmakonzentrationen zeigten eine relative
Bioverfügbarkeit von ca. 100 % für die intakten Kapseln. Wie erwartet, blieben die
1,8-Cineol Plasmakonzentrationen nach Applikation der intakten Kapseln länger auf
einem höheren Niveau. Die Komponenten Limonen und 1,8-Cineol konnten nur in
einigen wenigen Probanden detektiert werden.
Daten zur Elimination von Menthol und Campher nach Inhalation wurden in ein
Zweikompartiment-Modell eingepaßt (RÖMMELT et al., 1988). Die Eliminations-
halbwertszeit betrug für Menthol 35,5 und für Campher 39,9 min. Dies deutete darauf
hin, daß selbst nach Dauermedikation nicht mit einer Kumulation zu rechnen sein
würde (Details siehe Tab. 1.1).
1 Einleitung 18
1.3.4 Elimination
Die Elimination Ätherischer-Öl-Komponenten wurde im Urin, Faeces und in der
Ausatemluft untersucht. Die Verbindungen bzw. deren Metabolite wurden
hauptsächlich renal und pulmonal eliminiert. Geringe Mengen wurden über die
Faeces ausgeschieden. Unmetabolisiert konnten jedoch nur Spuren in Urin und
Faeces nachgewiesen werden. Für Menthol und Linalool wurde ein
enterohepatischer Kreislauf angenommen, der die Exkretion der Substanzen
verzögerte (PARKE et al., 1974; YAMAGUCHI et al., 1994).
Auf Grund ihrer Flüchtigkeit war anzunehmen, daß Ätherisch-Öl-Komponenten oder
deren Metabolite abgeatmet werden können. Es konnten jedoch nur 1,5 bis 5 % der
intravenös verabreichten Monoterpene unmetabolisiert in der Atemluft wieder
gefunden werden. 75-95 % dieser Fraktion wurden in den ersten 40 min abgeatmet
(RÖMMELT et al., 1974; KLEINSCHMIDT et al., 1985). Die abgeatmete Menge nahm mit
zunehmendem Siedepunkt der Terpene ab (RÖMMELT et al., 1974). Der
hauptsächliche Teil der Verbindungen wurde offenbar metabolisiert und als CO2
abgegeben, oder renal als Konjugate eliminiert (Römmelt et al., 1974; KLEINSCHMIDT
et al., 1985; LEVIN et al., 1992) (Details siehe Tab. 1.5).
Die vollständige Elimination der verabreichten Dosis wurde nur für radioaktiv
markiertes Citral und t-Anethol untersucht (SANGSTER et al., 1984b; DILIBERTO et al.,
1988; BOUNDS und CALDWELL, 1996). Die renale Ausscheidung stellte mit mehr als
50 % der applizierten Dosis den Hauptausscheidungsweg dieser Verbindungen dar,
gefolgt von pulmonaler Elimination (SANGSTER et al., 1984b; DILIBERTO et al., 1988).
Der Ausscheidung über die Faeces kam die geringste Bedeutung zu.
Nach oraler Applikation von 14C-t-Anethol an Menschen wurden ca. 60 % der
Metabolite renal eliminiert (SANGSTER et al., 1987; CALDWELL und SUTTON, 1988). Ein
geringerer Anteil wurde metabolisiert und über die Lunge als 14CO2 abgegeben.
Kumulative Ausscheidungskurven zeigten die komplette Elimination nach 24 h an.
Höhere Dosen hatten keinen Einfluß auf die Eliminationswege von t-Anethol
(CALDWELL und SUTTON, 1988).
Im Gegensatz dazu wurden eine Dosisabhängigkeit der Eliminationswege für 14C-t-
Anethol in Ratten und für α-Pinen im Menschen beobachtet (SANGSTER et al., 1987;
1 Einleitung 19
LEVIN et al., 1992). Bei niedrigen Dosen wurde ein Großteil der applizierten
radioaktiven Dosis als 14CO2 wiedergefunden, was darauf hindeutete, daß bei Ratten
oxidative O-Demethylierung vorherrschte. Im Gegensatz dazu nahm der prozentuale
Anteil an renal eliminiertem α-Pinen (Hauptmetabolit: Verbenol) mit abnehmender
Dosis zu (LEVIN et al., 1992). Diese Ergebnisse könnten auf Sättigung der für die
entsprechenden Reaktionen verantwortlichen Enzyme zurückzuführen gewesen sein.
Veränderung im Exkretionsprofil in Bezug auf die Art der Applikation wurden für Citral
beobachtet. Die Unterschiede nach oraler und intravenöser Applikation wurden als
Folge des Abbaus durch die Darmflora oder einen first-pass Effekt gesehen. Für
Citral wurde keine Verschiebung des Eliminationsprofils bei veränderter Dosis
beobachtet (DILIBERTO et al., 1988) (Details siehe Tab. 1.4 und Tab. 1.5).
1 Einleitung 20
Tab. 1.1 Pharmakokinetik Ätherischer-Öl-Verbindungen (Fortsetzung s. Seite 21).
Verbindung Ozothin1 (+)-α-Pinen, (-)-α-Pinen Menthol Campher Probanden Probanden Probanden Probanden Probanden Probanden n 9 und 27 8 ♂ 6♂, 6♀ 8♂ 10♂
oral Inhalation Applikation intravenös
2 h Inhalation, leichte körperliche Betätigung in einem Expositionsraum
dermal Salbe, Fläche: 400 cm2
10 min Inhalation aus einer Salbe aus
Wasser (500 mL; 80°C)
Dosis 10 mL 450 mg⋅m-3; 225 mg⋅m-3
450 mg⋅m-3 (-)-α-Pinen 2 g 83 mg 61 mg 5 g Salbe
α-Phase n=9
β-Phase n=27
α-Phase
β-Phase
γ-Phase
450 mg⋅m-3 ; 225 mg⋅m-3
4,8
38 695
450 mg⋅m-3 (-)-α-Pinen
Verteilungs- und Eliminations- halbwertszeit (min)
3-4 60-65
5,6 40 555
26 202 121 35,5 39,9
Verteilungs- volumen (L⋅kg-1)
8425
t max (min) 120
6,3 105 12
c max
(ng⋅mL-1) 7,4 48,5 50,0
Cl4h (l⋅h-1⋅ kg-1)
1,4 1,3
1,4
Clearance
Cl21h (l⋅h-1⋅kg-1)
14186 (L⋅h-1)
1,1 1,1 1,2 Erstautor(en) KLEINSCHMIDT et al.,
1985 FALK und HAGBERG, 1990 SCHUSTER
et al., 1986 LANGENECKERT, 1998 RÖMMELT et al., 1988
1 Ozothin: Myrtenal, Myrtenol, Pinocarveol, Verbenon, Terpinhydrat
1 Einleitung 21
Tab. 1.1 Pharmakokinetik Ätherischer-Öl-Verbindungen (Fortsetzung von Seite 20). Verbindung 1,8-Cineol Probanden Mäuse Probanden Probanden Probanden
n 5 20♂, 19-42 Jahre 2♀ 2♂ 8 ♂ 1 h Inhalation
oral Applikation
Rosmarinöl Kapsel zerkleinerte Kapsel
20 min Inhalation dermal Inhalation oral
cross over Dosis 0,5 mL 120
mg2 300 mg3
120 mg2
300 mg3
4 g 1165 mg 219 mg 292 mg
α- β- Phase
α-Phase
β-Phase
α-Phase
β-Phase
Verteilungs-
und Eliminations- halbwertszeit
(min)
6 45 92 221 100 206 2,0 4,8 31 33 6,9 13 73 282 157 106 351
Verteilungs- volumen (L⋅kg-1)
t max (min) 138 154 42 65 19 14 14 15 60 10 75 c max
(ng⋅mL-1) 72 168 108 205 868 1135 701 459 22 296 601
Erstautor(en) KOVAR et al.,
1987 ZIMMERMANN et al., 1995 JAGER et al., 1996 LANGENECKERT, 1998
2 Myrtol: 8 mg α-Pinen, 30 mg Limonen, 30 mg 1,8-Cineol 3 Myrtol: 20 mg α-Pinen, 75 mg Limonen, 75 mg 1,8-Cineol
1 Einleitung 22
Tab. 1.2 Resorption in Tier und Mensch. Verbindung(en) Campher, Menthol, α-Pinen,
Isobornylacetat, Limonen radioaktiv markiert, Haupt-
komponenten von Pinimenthol-Bad
α-Pinen, Campher, β-Pinen, Limonen
14C-Citral 14C- t-Anethol radioaktiv markiert
α-Pinen Limonen Campher Borneol Menthol Campher (+)-α-Pinen
(-)-α-Pinen
Probanden/Tiere Mäuse Probanden Ratten Ratten, Mäuse Probanden, Alter 20-30 Probanden Alter: 20-45 Probanden Alter: durchschn. 31 n 3 ♂ 3 ♂ 1 > 3 6♂, 6♀
6 ♂ und ♀
10 ♂ 2 ♂
Lösung/Bad Rasierte Haut
Darreichungsform
3 cm2 1,5, 3, 6 cm2
Lösung/Bad intravenös
oral und intravenös
oral Inhalation 10 min Inhalation aus Wasser
(500 mL; 80°C)
Inhalation während leichter körperlicher Betätigung
2 h Exposition
450 225 10 450
Dosis 20 mL Badekonzentrat mit einer radioaktiv markierten
Verbindung, in 100 L Wasser
450 L Wasser, 30 min, 150 mL Latschenkiefernöl i.v.:0,6 µg⋅kg-1
oral: 5, 50, 500 mg⋅kg-1
i.v.:50 mg⋅kg-1
250 mg⋅kg-1 10 %ige wäßrige Lösung der betreffenden Verbindungen
5 g Salbe
mg⋅m-3
61 % 66 % 54 % 58 % 58 % 60 % 40 % 58 %
Prozentsatz unmetabolisiert im Blut
Resorption keine Verbindung bevorzugt resorbiert
absorbierte Menge von
behandeltem Hautareal abhängig
abhängig von Expositionszeit,
Größe des Hautareals,
Konzentration
80-95 % Resorption
>95 % Wiederfindung
der Radioaktivität im 24 h Urin 5,6 % 4,6 % 7,5 % 6,5 %
76 % 67 %
Erstautor(en) SCHÄFER und SCHÄFER, 1982 RÖMMELT et al.,
1974 DILIBERTO et
al., 1988 BOUNDS und CALDWELL,
1996
RÖMMELT et al., 1978 RÖMMELT et al., 1988 LEVIN et al., 1992
1 Einleitung 23
Tab. 1.3 Metabolismus in Tier und Mensch. Verbindung Thymol Carva-
crol Citral t-Anethol Eugenol Menthol
Probanden/ Tiere
Probanden Kanin-chen
Ratten Ratten Ratten Probanden Ratten Mäuse Ratten/Mäuse Ratten Probanden Probanden
Ileostomie Patienten
Probanden Ratten Probanden
n 2 3 ♂ ♂ >3 2 ♂ ♀ ♂ ♀ ♂ ♀ 20 4♂, 2♀ 3♂, 3♀ 4♂ ♂ 8 ♂ oral Darreich-
ungsform oral oral Magen-
sonde Magen-sonde
oral, intravenös,
dermal
oral oral/ intraperitoneal
oral/intra-venös
Magen-sonde
oral
Kap- seln
besch. Kap.
Kap- seln
besch. Kap.
oral magensaft-resistente Kapseln
oral der-mal
Inha-la-tion
oral
Menthol Menthol Dosis 0,6 g
0,5 g⋅kg -1
1 mmol⋅
kg-1
1 mmol⋅ kg-1
500 mg⋅kg-1, 5, 50 mg⋅kg-1
1 mg 50 mg⋅kg-1 0,05 5, 50, 1500
mg⋅kg-1
0,05- 1000
mg⋅kg-1
500 mg Menthol
0,4 mL Pfefferminzöl 95 mg Menthol
180 mg Pfeffer-minzöl
0,1-1,0; 0,5 mg⋅kg-1
297 mg
56 mg
73 mg
Phase-I-Metabolismus Urin Thymo-
hydro-quinone
Siehe Abb. 1.3
4-MBA2 3%
ω-Oxidation: Zimtsäure-Derivate;
Dosisabhän-gigkeit
Reduktion der
Doppelbin-dung
Oxidation der Methin- und
Methylstruktur
Oxidations-produkt
Reduktion und
Hydroxylie-rung der 2,3- Doppelbindung;
Oxidation der Aldehyd-
funktion; stereoselek-
tiv an C8
Oxidation der olefinischen
Doppelbindung
Spuren unmetabolisierte
n Menthols
Phase-II-Metabolismus Berechnet als Prozentsatz des ursprünglichen Mentholgehaltes nach GS-Spaltung4:
nach GS-Spaltung4:
nach GS-Spaltung4:
Glucuro-nid
+ + 1 + + + + hohe Dosen
vor und nach
GS-Spal-tung4: 50 %
in 24 h
35 % in 24 h
40 % in 24 h
17 % in 24 h
29 % in 24 h
40 % in 14 h
nach GS-Spaltung4:
60 % 1 % 5 % 80 %
Sulfat + +1 + geringe Dosen
Spuren
weitere Konjugate
cutaner first-pass
Metabolismus
Glycin- Konjugate 4-MHA3
56%
Glycin- Konjugate,
Gluthathion- Konjugate
Anzahl der Metaboliten
6 7 7 11 10 14
Erst-autor(en)
TAKADA et al., 1979
AUSTGULEN et al., 1987
DILIBERTO et al., 1988;
DILIBERTO et al., 1990
SANGSTER et al., 1987
SANGSTER et al., 1984a
SANGSTER et al., 1984b
SUTTON et al., 1985
BELL et al., 1981
SOMERVILLE et al., 1984 KAFFEN-BERGER
und DOYLE, 1990
MANS und PENTZ, 1987; YAMAGUCHI et
al., 1994
LANGENECKERT, 1998
1indirekte Bestimmung 24-MBA: 4-Methoxybenzoe Säure 34-MHA: 4-Methoxyhippur Säure4GS-Spaltung: Glucuronidase und Sulfatase Spaltung
1 Einleitung 24
Tab. 1.4 Elimination bei Nagern. Verbindung Menthol Linalool Citral t-Anethol Eugenol Proband/ Tier
Ratten Ratten
Ratten Ratten Ratten Mäuse Ratten
n 3♂ 2♂ > 3 ♂ ♀ ♂ ♀ Darreich-ungsform
oral Magen-sonde
oral intra-venös
dermal oral/intavenös Magensonde
Dosis 500 mg⋅kg-1 500 mg⋅kg-1 5, 50, 500 mg⋅kg-1
5 mg⋅kg-1
5-50 mg⋅kg-1
0,05 mg⋅kg-1
1500 mg⋅kg-1
0,05 mg⋅kg-1
1500 mg⋅kg-1
0,05- 1000 mg⋅kg-1
Elimina-tionsweg
renal 19% bevorzugt an Tag 2
7% 51% 58% 8,5% 56% 32% 72% 35% 75-80%
pulmonal 23% CO2 17% CO2 8% CO2 3,3% CO2 28% 57% 20% 67% unmetabolisiert 0,48% 0,33% 2,84% faecal 26%
bevorzugt an Tag 1
67% biliär 12% 7% 3,48% 1% 1% 10%
enterohe-patischer Kreislauf
+ +
Ende der Detektion
48 h 72 h 72 h 72 h 24 h
Erst-autor(en)
MANS und PENTZ, 1987; YAMAGUCHI et al., 1994
PARKE et al., 1974
DILIBERTO et al., 1988 SANGSTER et al., 1984b SUTTON et al., 1985
1 Einleitung 25
Tab. 1.5 Elimination beim Menschen. Verbindung α-Pinen Campher β-Pinen Limonen Ozothin 14C-t-Anethol (+)-α Pinen (-)-α Pinen Proband/Tier Probanden Probanden Proban-
den Probanden Probanden
n 1♂
27 und 9♂ 3♂ 5♂ 2♂
oral oral Darreichungs-form
intravenös oder Bad
intra-venös
Inhalation 2 h Exposition
Dosis intravenös: 0,6 µg⋅kg-1; Bad: 150 mL Latschenkiefernöl in 450 L Wasser
10 mL 1 mg 1 mg 50 mg 250 mg 450 mg⋅m-3 225 mg⋅m-3 10 mg⋅m-3 450 mg⋅m-3
1,7%
Verbenol 2%
Verbenol 3,8%
Verbenol 1,5%
Verbenol Eliminations-weg
renal 60 % 60,1 % 68,6 % 53,9 %
0,001% unmetabolisiert im Urin
intravenös: 5-7% 20 % 13,5 % 17 % 13,8 %
5 % unmet.1 3 % unmet. 1 3,6 % unmet. 1 1,4 % unmet. 1 unmet. 1 als CO2 als CO2 75% eliminiert nach:
10-15 min 10-15 min 10-15 min 20-30 min Bad
pulmonal
2 h nach Bad: % des max. detektierten Wertes:
7,7 % nicht bestimmt
nicht bestimmt
7,7%
60 % 60 % 60 % 40 % Ende der Detektion
nach 45 min: 90 % eliminiert
60 min 8 h 48 h 2 h
Erstautor(en) RÖMMELT et al., 1974 KLEIN-SCHMIDT et al., 1985
SANG-STER et
al., 1987
CALDWELL und SUTTON, 1988
LEVIN et al., 1992
1unmetabolisiert
1 Einleitung 26
1.4 Methoden und Analytik
Für die Analytik flüchtiger, terpenoider Verbindungen bzw. deren Metabolite in
biologischen Matrices sind entsprechend sensitive und selektive Detektions-
methoden unabdingbare Voraussetzung. Auf Grund ihrer Flüchtigkeit sind die
Ätherisch-Öl-Komponenten für die GC-Analytik geeignet. In Kombination mit
entsprechender Detektion stellt die GC ein sehr sensitives Verfahren dar, mit dem im
unteren ng⋅mL-1 Bereich gearbeitet werden kann.
Die Bestimmung von Ätherisch-Öl-Komponenten in Plasma bzw. Blut, Urin oder in
der Atemluft wurde in den meisten der vorliegenden Arbeiten per GC in Kombination
mit der sehr sensitiven Flammenionisationsdetektion (RÖMMELT et al., 1974;
RÖMMELT et al., 1978; KLEINSCHMIDT et al., 1985; RÖMMELT et al., 1988; FALK und
HAGBERG, 1990; ZIMMERMANN et al., 1995; JAGER et al., 1996) bzw. Detektion per MS
(SCHUSTER et al., 1986) durchgeführt. Dabei wurden je nach Extraktionsverfahren
Nachweisgrenzen von 0,1 ng⋅mL-1 (RÖMMELT et al., 1988) bis 10 ng⋅mL-1 (FALK und
HAGBERG., 1990) erzielt. Die Bestimmung von Phase-I-Metaboliten radioaktiv
markierter Ätherischer-ÖL-Komponenten, die durch die Metabolisierung ihre
Flüchtigkeit verloren haben, wurde häufig per HPLC in Kombination mit
Flüssigszintillationsdetektion vorgenommen (SANGSTER et al., 1984b; SUTTON et al.,
1985; DILIBERTO et al., 1988). Die Verwendung radioaktiv markierter Verbindungen
bot zwar den Vorteil hoher Empfindlichkeit, jedoch lieferte sie keine Informationen zur
Identität der Verbindungen.
Weitere Angaben zur Validierung der jeweils verwendeten analytischen Methode
(Richtigkeit, Präzision) fanden sich nur bei Kleinschmidt et al. (1985) und
Zimmermann et al. (1995) (KLEINSCHMIDT et al., 1985; ZIMMERMANN et al., 1995).
Angaben zur Selektivität fehlten jedoch bei den meisten der oben aufgeführten
Studien.
Als selektivstes und gleichzeitig äußerst sensitives Detektionssytem gilt heute GC-
MS oder GC-MS/MS in Verbindung mit SIM- oder SRM-Experimenten. Diese
Techniken standen jedoch für die o.g. Arbeiten z.T. noch nicht zur Verfügung und
sind heute auf Grund ihrer Kostenintensität nicht für die Routineanalytik einsetzbar.
1 Einleitung 27
In den veröffentlichten Arbeiten wurden bereits mehrere Methoden zur Extraktion
Ätherischer-Öl-Komponenten bzw. deren Phase-I-Metaboliten aus biologischen
Matrices beschrieben. Bei der konventionellen Probenaufarbeitung mittels Flüssig-
Flüssig- (BELL et al. 1981; KLEINSCHMIDT et al., 1985; KAFFENBERGER et al., 1990;
ZIMMERMANN et al., 1995) und Festphasenextraktion (LEVIN et al., 1992) bzw. beim
Einengen der Proben durch Verdampfen könnte ein undefinierbarer Anteil der
flüchtigen Analyten verloren gehen. Gerade bei erwartungsgemäß geringen
Konzentrationen des Analyten waren Methoden ohne vorzeitige Verluste erforderlich.
Die Bestimmung im gewünschten Konzentrationsbereich konnte somit z.T. erst durch
zeit- und materialintensive Anreicherungsverfahren erreicht werden. Hierbei wurden
die Ätherisch-Öl-Komponenten auf Adsorbentien angereichert, um die Nachweis-
grenze abzusenken (RÖMMELT et al., 1974; KLEINSCHMIDT et al., 1985; SCHUSTER et
al., 1986; RÖMMELT et al., 1988). Idealerweise wurden die Verbindungen direkt aus
dem Gasraum über der Probe analysiert, wobei der Verlust flüchtiger Analyten
minimiert bzw. ausgeschlossen wurde (LEVIN et al., 1992).
Zur Bestimmung der Ätherisch-Öl-Komponenten in der Atemluft wurden die
Verbindungen an Adsorbentien gebunden (RÖMMELT et al., 1974; RÖMMELT et al.,
1988) oder direkt in der Atemluft bestimmt (FALK und HAGBERG, 1990). Mit der von
Falk und Hagberg entwickelten Methode konnte sowohl die Konzentration im Inhalat
als auch in der Ausatemluft mit Infrarotspektrometrie gemessen werden (FALK und
HAGBERG, 1990). Abgeatmetes radioaktiv markiertes CO2 wurde in alkalischen
Lösungen gefällt oder an Kohle gebunden, wodurch unter Umständen zu geringe
Gehalte erzielt worden sein könnten (CALDWELL und SUTTON, 1988; SANGSTER et al.,
1984b).
Da in den meisten Fällen keine näheren Angaben zur Validierung der verwendeten
Methoden gemacht wurden, könnten die in vergleichbaren Studien zum Teil
divergierenden Ergebnisse auf die Anwendung unterschiedlicher analytischer
Methoden zurückzuführen sein.
1 Einleitung 28
1.5 Zielsetzung
Die in den pharmakokinetischen Studien eingesetzten BronchipretTP Filmtabletten
sind indiziert zur Behandlung akuter Bronchitis. Die Wirkstoffe sollten also letztlich im
Respirationstrakt ihre Wirkung über die systemische Verfügbarkeit entfalten.
Zur Bioverfügbarkeit und Pharmakokinetik dieser Präparation nach oraler Applikation
am Menschen fehlten jedoch bislang verläßliche Untersuchungen an Hand
pharmakokinetischer Studien. Erst diese Untersuchungen zur systemischen
Verfügbarkeit lieferten Hinweise, ob die im Thymianextrakt enthaltenen Ätherisch-Öl-
Komponenten - insbesondere Thymol - auch für die klinische Wirksamkeit
(mit)verantwortlich sein könnten.
Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren somit, die systemische Verfügbarkeit und
Pharmakokinetik sowie den Metabolismus von Thymol im Menschen zu
untersuchen.
Für diese Untersuchungen war zunächst die Erarbeitung einer Probenauf-arbeitungsmethode zur Bestimmung des Thymols in den biologischen Matrices
Plasma und Urin notwendig. Zur Quantifizierung mußte eine entsprechend selektive
und sensitive analytische Meßmethode entwickelt werden. Um einen hohen
Probendurchsatz zu erzielen, wurde die Methode automatisiert. Somit war es
möglich, die Methode internationalen Anforderungen entsprechend validieren zu
können.
Da zur routinemäßigen Bestimmung des Thymolgehaltes die Spaltung der Phase-II-
Konjugate erfolgen mußte, war eine separate Methode zur Identifizierung der Phase-II-Metabolite erforderlich.
2 Material und Methoden 29
2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien
Thymol „GC“ Fluka, 89330
Thymol (1H-NMR, Lot 377452/1) Zentralinstitut Arzneimittel-
forschung GmbH, Sinzig
o-Cresol Merck, 809692
t-Anethol HWI Analytik, 2974
Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-Transferase, Sigma, U4502
Type III from bovine liver
β-Glucuronidase/Sulfatase, Type B-1 Sigma, G0251
β-Glucuronidase, Type HP2 from Helix pomatia Sigma, G7017
>7500 Units/mL Sulfatase Aktivität;
100000 Units/mL Glucuronidase Aktivität
Sulfatase, Type H1 from Helix pomatia Sigma, S9626
10 Units/mg Sulfatase Aktivität
300 Units/mg Glucuronidase Aktivität
Ethanol unvergällt Chemikalienausgabe
L(+)-Ascorbinsäure p.a. Merck, 127
Natriumacetat p.a., wasserfrei Merck, 106268
Methanol, LIChroSolv für die Chromatographie Merck, 106007
Natriumchlorid suprapur Merck, 106406
Natriumchlorid Merck, 106404
ortho-Phosphorsäure 85% Merck, 159382
Wasser deionisiert „Milli Q“ aus Millipore Anlage
Tris HCl Puffer Sigma, T 3253
Mercaptoethanol Merck, 115433
Eisessig 100% Merck, 100058
Magnesiumchlorid Grüssing, 12088
Aceton LiChroSolv Merck, 100020
NaOH Plätzchen Merck, 106482
2 Material und Methoden 30
Ammoniumacetat Merck, 159039
Heptan p.a. Merck, 104379
Acetonitril Merck, 100030
Ammoniumacetat Merck, 101116
Ethylacetat Riedel de Haen, 34858
Ameisensäure Riedel de Haen, 33015
Water LIChrosolv Merck, 115333
Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat Merck, 106345
Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat Merck, 106579
2.2 Materialien und Geräte
für die Durchführung der Messungen während der Pilotstudien
pH-Meter Knick, Typ 646
Wasserbad Hartenstein, HWR
Ultraschallbad Bransonic, 221
Waagen Mettler AT200
Mettler P1600
Sartorius Micro MC 5
Zentrifugen Minifuge GL; Heraeus Christ
Du Pont Sorvall, RC-5B;
Laborzentrifuge Sigma, 2-15
Metallblockthermostat Liebisch, Typ 2099-DA
für die Durchführung der Messungen während der Hauptstudie
Ultraschallbad Branson 5210
Waagen Mettler AE163,
Mettler 6000
Laborheizblock Thermomix comfort Eppendorf
Zentrifuge Minifuge GL; Heraeus Christ
Schüttler Heidolph REAX 2000
Eppendorf Microdistiller Eppendorf, 5325 V1.20
2 Material und Methoden 31
GC-Apparatur für die Messungen während der Pilotstudien
Gaschromatograph Carlo Erba Strumentazione HRGC 5300
Mega Series
Gase Messer, Griesheim
Säule HP Innowax (Crosslinked Polyethylenglycol)
Innendurchmesser 0,2 mm x 50 m, Filmdicke
0,2 µm
Combi-PAL Autosampler CTC Analytics
Trägergas Helium
Flow 1 mL⋅min-1
Wasserstoff 30 ml⋅min-1
Luft 400 mL⋅min-1
Injektor Split/Splitless-Injektor, 220°C
Detektor Flammenionisationsdetektor, 250°C
Injektion manuell nach Festphasenmikroextraktion,
automatisiert durch Combi-PAL
Liner 0,75 mm I.D., Supelco
Septen Thermogreen LB-2-Septen, Supelco
GC-MS Kopplung für die Messungen während der Pilotstudien
Gaschromatograph GC 8000 CE Instruments
Detektor MD1000; Anregung 70 eV
Injektor Split-Splitless, 220°C
Säule HP Innowax (Crosslinked Polyethylenglycol)
Innendurchmesser 0,2 mm x 50 m, Filmdicke
0,2 µm
Trägergas Helium
Flow 1,0 mL⋅min-1
Septen Thermogreen LB-2-Septen, Supelco
2 Material und Methoden 32
GC Apparatur für die Messungen während der Hauptstudie (SPME, Wiederfindung,
Interkalibrierung)
Gaschromatograph Hewlett Packard 5890 Series II
Gase Linde, Nürnberg
Säule HP Innowax (Crosslinked Polyethylenglycol)
Innendurchmesser 0,2 mm x 50 m, Filmdicke
0,2 µm
Combi-PAL Autosampler CTC Analytics
Single Magnet Mixer und Heater Chromtech
Trägergas Helium
Flow 1 mL⋅min-1
Wasserstoff 33 ml⋅min-1
Luft 397 mL⋅min-1
Make up gas (Stickstoff) 32 mL⋅min-1
Injektor Split/Splitless-Injektor, Temperatur 220°C
Detektor Flammenionisationsdetektor, 250°C
Injektion manuell nach Festphasenmikroextraktion,
automatisiert durch CTC Combi-PAL
Autosampler
Septen Thermogreen LB-2-Septen, Supelco
Liner 0,75 mm I.D., Supelco
Liner Art.-Nr.: 5183-4647, Agilent
GC-MS-Kopplung für die Messungen während der Hauptstudie und Bestimmung des
freien Thymols im Urin, GC-FID Bestimmung des Thymolgehaltes im Prüfpräparat
Gaschromatograph Hewlett Packard HP 6890 Series
Gase Linde, Nürnberg
Trägergas Helium
Flow 1 mL⋅min-1
Wasserstoff 40 ml⋅min-1
Luft 450 mL⋅min-1
2 Material und Methoden 33
Make up Gas (Stickstoff) 45 mL⋅min-1
Injektor Split/Splitless-Injektor, Temperatur 220°C
Detektor Flammenionisationsdetektor 250 °C
Detektor Hewlett Packard 5973 MSD; Anregung 70 eV
Injektion manuell nach Festphasenmikroextraktion
Septen Thermogreen LB-2-Septen, Supelco
Liner 0,75 mm I.D., Supelco
Liner Art.-Nr.: 5183-4647, Agilent
HPLC-UV/VIS Apparatur zur Überprüfung der Thymolglucuronid-Synthese
Pumpen Beckman Pumpenmodul 126, 116
Säulenofen Gynkotek Säulenthermostat, 20°C
Injektion Beckman Autosampler 502;
20 µL-Probenschleife
Steuerung Hochdruckseitige Gradientensteuerung
(Beckman Gold Software Supports Version
7.0)
Detektor Beckman Photodiodenarraydetektor 168
Trennsäule Knauer Eurospher 100 C18, 250x4 mm
Flow 1 mL⋅min-1
HPLC-UV/VIS Apparatur zur Interkalibrierung
Gerät HPLC 1100 von Hewlett Packard mit PDA
Trennsäule Knauer Eurospher 100 C18, 250x3 mm
Säulentemperatur 40°C
Flow 0,8 mL⋅min-1
2 Material und Methoden 34
HPLC-MS/MS Apparatur (durchgeführt von A+M, Labor für Analytik, Bergheim)
HPLC Pumpe 1100 Series Binary Pump, Agilent
Technologies
Autosampler 1100 Series Autosampler, Agilent
Technologies
UV-Detektor SPD-10A, Shimadzu
Degaser Dagasys DG-1210, uniflow,
Vorsäule Lichrospher RP 18 ADS (Merck) mit 6-port
switching valve
Fluß 0,3 mL⋅min-1, 0% Fließmittel B für 10 min,
Elution: backflush
Säule BDS-Hypersil RP18, 100x2,1 mm
Massenspektrometrie Massenspektrometer LCQ classic, ThermoQuest
Probenaufgabe HPLC (0,3 mL⋅min-1)
Post-column-split 1:3 (MS:Abfall); Abfall:
0-5 min
Ionisationsinterface Electrospray Ionisation (ESI)
Analysator Ion trap (LCQ Classic, ThermoQuest)
Ionisations-Modus negativ
Massenbereich 150-600amu
Kapillarspannung -4,0 V
Kapillartemp. 220°C
Spray Spannung 4,2 kV
Tube Lens 0 V
2 Material und Methoden 35
HPLC coulometrische Array Detektion zur Bestimmung freien Thymols im Plasma
Pumpen Merck Hitachi L6200A
Steuerung Hochdruckseitige Gradientensteuerung,
(Interface Modul D 6000)
Detektor ESA Inc. Elektrochemischer 12 Kanal
CoulArray Detektor
Degaser Merck Hitachi ERC 3114
Injektion Merck Hitachi, AS 2000A, 100 µL
Injektionsvolumen 100 µL
Säule Macherey-Nagel Nucleosil RP 18,
250x4,6 mm
Festphasenmikroextraktion
SPME-Fasern 100 µm Polydimethylsiloxan, Supelco
57300-U
85 µm Polyacrylat, Supelco 57304
65 µm Polydimethylsiloxan-Divinylbenzen,
Supelco 57311
Fiber Holder Supelco, 57330-U
Stirrer/Hot Plate Corning
SPME Sampling Stand/Vial Puck Supelco
SPME Stativ Supelco, 57357-U
Plasma
Aufbewahrung von Plasma- und Urinproben
9 mL S-Monovetten KE Sarstedt, 02.1066.001
Zentrifugenröhrchen, steril, 50 mL Nunc
Eppendorfcaps 1,5 mL Eppendorf
2 Material und Methoden 36
2.3 Studiendesign der Pilotstudien zur systemischen Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol
Um eine Vorstellung davon zu bekommen, mit welchen Thymol-
Plasmakonzentrationen nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP zu rechnen
sein würde bzw. über welchen Zeitraum nach Applikation Thymol im Plasma
detektierbar sein würde, wurden zunächst 3 Pilotstudien durchgeführt. Die aus den
Pilotstudien resultierenden Ergebnisse waren notwendig, um die Hauptstudie
hinsichtlich des Messzeitraumes und der Messintervalle entsprechend planen zu
können.
Die erste Pilotstudie erfolgte mit 4 männlichen, gesunden Probanden. Nach
Applikation einer Tablette Bronchipret®TP wurden über 4 Stunden Blutproben zu
folgenden Zeitpunkten genommen: t= 0´, 10´, 20´, 30´, 40´, 50´, 60´, 70´, 80´, 90´,
100´, 120´, 130´, 2,5 h, 3 h, 3,5 h.
In der zweiten Pilotstudie wurden Messungen im Steady State vorgenommen, d.h. 2
männliche, gesunde Probanden nahmen 1 Woche lang 3 mal täglich eine Tablette
BronchipretTP ein. Nach Einnahme einer weiteren Tablette wurden wiederum, wie
oben aufgeführt, Blutproben gewonnen.
In der dritten Pilotstudie wurde die Verweildauer des Thymols im Plasma nach
Einnahme einer Tablette BronchipretTP untersucht. Es wurden solange
Plasmaproben genommen, bis kaum noch Thymol im Plasma detektierbar war.
Für die oben aufgeführten Pilotstudien gelten die unter Absatz 2.5.1 bis 2.5.6
aufgeführten Bedingungen mit Abweichungen bezüglich der Blutentnahmezeitpunkte.
2.4 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Plasmaanalytik der Pilotstudien
Zur Bestimmung der systemischen Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol
war die Entwicklung einer sehr sensitiven Methode notwendig, die die Detektion von
Thymol in humanem Plasma im unteren ng⋅mL-1 Bereich ermöglichte. Aus der
Literatur war bekannt, daß Thymol sowohl im menschlichen Urin als auch im Urin
von Kaninchen zu einem Großteil nicht in freier Form, sondern in Form seiner Phase-
2 Material und Methoden 37
II-Konjugate vorlag (TAKADA et al., 1979; AUSTGULEN et al., 1987). Um Thymol aber
für die sehr sensitive Detektion per Flammenionisation zugänglich zu machen, war
die enzymatische Spaltung notwendig, die Thymol aus seinen Phase-II-Konjugaten
freisetzte, um es somit in der Gasphase detektieren zu können.
Nach enzymatischer Spaltung des Phase-II-Konjugates Thymolsulfat (siehe Absatz
3.1) und anschließender Festphasenmikroextraktion erfolgte die gaschromato-
graphische Trennung mit nachfolgender Flammenionisationsdetektion.
Thymol gehört in die Stoffklasse aromatischer Monoterpene und liegt in reiner Form
im Gegensatz zu den meisten Ätherisch-Öl-Komponenten in fester Form vor. Der
Siedepunkt liegt bei 233,4°C. Bedingt durch die für Ätherisch-Öl-Komponenten eher
ungewöhnliche Phenolpartialstruktur weist Thymol zwar auch lipophile Eigenschaften
auf, löst sich aber im Verhältnis 1:1100 in Wasser (HUNNIUS, 1986).
Die Flüchtigkeit des Thymols gab zwar die Möglichkeit zur gaschromatographischen
Bestimmung, jedoch waren dadurch die Möglichkeiten der Probenaufarbeitung
eingeschränkt (siehe Absatz 1.4). In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb die
Headspace-Festphasenmikroextraktion (headspace solid-phase microextraction; HS-
SPME) zur Probenaufarbeitung gewählt. Sie ermöglichte Extraktion, Anreicherung
und Probenaufgabe in einem einzigen Arbeitsschritt und es konnte dadurch auf den
Einsatz oftmals teurer, giftiger oder carcinogener Lösungsmittel verzichtet werden.
Die HS-SPME ist ein noch wenig etabliertes, schnelles und einfaches Verfahren zur
Aufarbeitung vorwiegend wässeriger Proben, die flüchtige Verbindungen enthalten.
Mit Hilfe beschichteter Quarzfasern werden Analyten aus der Gasphase über der
Probenmatrix extrahiert (PAWLISZYN, 1997). Im Gegensatz zu anderen
konventionellen Extraktionsmethoden basiert die SPME nicht auf einer
erschöpfenden Extraktion der Probe, sondern auf einer Gleichgewichtseinstellung
des Analyten in der Probe, der Gasphase über der Probe und der Faserbeschichtung
(Abb. 2.1). Da die Gesamtmenge des Analyten während der Extraktion konstant
bleibt, gilt folgende Beziehung:
2 Material und Methoden 38
C0*V2 = C1∞*V1 + C2
∞*V2 + C3∞*V3
Dabei gilt:
C0 : Anfangskonzentration des Analyten in der Probe
C1∞: Gleichgewichtskonzentration des Analyten in der Faser
C2∞: Gleichgewichtskonzentration des Analyten in der Probe
C3∞: Gleichgewichtskonzentration des Analyten in der Gasphase
V1, V2 und V3: Volumen der Faserbeschichtung, der Probe und der Gasphase
(ZHANG und PAWLISZYN, 1993).
Demnach war eine konstante Gleichgewichtslage des gesamten Systems Vor-
bedingung für eine reproduzierbar durchzuführende Analytik. Diese Aspekte mußten
bei der Methodenerstellung sorgfältig berücksichtigt werden, um eine gute
Methodenleistung bei möglichst kurzen Analysenzeiten zu erhalten. Die Zeitspannen
bis zum Erreichen der stabilen Gleichgewichtslage waren dabei von dem jeweils
gewählten Fasermaterial, den chemisch-physikalischen Eigenschaften des Analyten,
sowie von der Probenmatrix- und temperatur abhängig.
Die beschichtete Faser wurde dem Gasraum über der Probe solange ausgesetzt, bis
sich das Gleichgewicht eingestellt hatte. Danach wurde die Faser in den
Injektorblock des Gaschromatographen eingebracht und die Analyten thermisch
desorbiert.
2 Material und Methoden 39
PlasmaRührfisch
FaserProbengefäß
NadelNadelführung
Septum
Heizung
Abb. 2.1 Schematische Darstellung der Headspace-Festphasenmikroextraktions-methode.
Gerade in letzter Zeit wurde die SPME bzw. HS-SPME neben der Anwendung im
Bereich der Umweltanalytik, Nahrungsmittelanalytik und Biologie (ALPENDURADA,
2000) zunehmend zur Analytik von Arznei- und Suchtstoffen aus biologischen
Matrices, wie beispielsweise Plasma, Urin und Speichel sowie zur Haaranalytik
eingesetzt (KROGH et al., 1995; ISHII et al., 1996; KUMAZAWA et al., 1996; ULRICH und
MARTENS, 1997; HALL et al., 1998; KROLL und BORCHERT, 1998; LEE et al., 1999;
ULRICH et al., 1999; NAMERA et al., 2000; THEODORIDIS et al., 2000; MILLS und
WALKER, 2001).
Für die Bestimmung von Phenolen, wie beispielsweise Thymol, wirkten sich Erhitzen,
niedriger pH-Wert und der Zusatz von Salz positiv auf die Geschwindigkeit der
Gleichgewichtseinstellung aus, da dadurch die Löslichkeit des Thymols in der Matrix
herabgesetzt und der Analyt somit in die Gasphase gezwungen wurde (BUCHHOLZ
und PAWLISZYN, 1993; BUCHHOLZ und PAWLISZYN, 1994). Rühren bewirkte eine
gleichmäßige Durchmischung der Probe und beeinflußte ebenfalls die
2 Material und Methoden 40
Gleichgewichtseinstellung positiv, so daß die Analysenzeiten verkürzt werden
konnten.
2.4.1 Methodenentwicklung der Pilotstudien
Behandlung der Blutproben
Das den Probanden mit Hilfe von S-Monovetten abgenommene Blut wurde 10 min
bei ca. 3900 g zentrifugiert, das Plasma in Eppendorf-Caps zu 500 µL aliquotiert und
zur Stabilisierung mit jeweils 20 µL Essigsäure 0,58 M versetzt. Danach wurden die
Proben tiefgefroren bei –20°C aufbewahrt.
Konditionierung der PDMS-Fasern
Für die Untersuchungen im Rahmen der Pilotstudien wurde zunächst die 100 µm
Polydimethylsiloxan-Faser (PDMS) verwendet. Vor der Verwendung der SPME-
Fasern mußten diese gereinigt werden, um zu gewährleisten, daß sich vor Beginn
der Verwendung keine Kleberbestandteile oder andere unerwünschte Substanzen
auf der Faser befanden. Dazu wurden die PDMS-Fasern 60 min bei 250°C im
Injektor bei geöffnetem Splitventil konditioniert. Diese Vorgehensweise erwies sich
bei allen getesteten Fasern verschiedener Chargen als ausreichende
Konditionierung.
Probenaufarbeitung
Nach dem Auftauen der Plasmaproben wurden zu 520 µL Plasma nochmals 40 µL
Essigsäure 0,58 M gegeben. Somit wies das Plasma einen pH-Wert von 5 auf, was
dem pH-Optimum der β-Glucuronidase entsprach. 50 µL β-Glucuronidase (Sigma
G7017) wurden hinzupipettiert und das Plasma 30 min bei 37°C inkubiert. Weder die
Verwendung einer β-Glucuronidase anderer Herkunft, einer Sulfatase, der Zusatz
weiterer Enzymeinheiten noch eine Verlängerung der Inkubationszeit konnten die
Menge des freigesetzten Thymols erhöhen. Nach Durchführung des Enzymassays
wurden 50 µL Interne Standardlösung (o-Cresol 4 µg⋅mL-1, s.u.) hinzupipettiert und
die Probe in ein 4 mL SPME-Probengefäß überführt. Bei der Überführung wurden
2 Material und Methoden 41
keine Verluste beobachtet. Die SPME-Probengefäße wurden zuvor mit 0,5 g NaCl,
jeweils 50 µL Phosphorsäure 85 % sowie einem Rührfisch versehen. Nach dem
luftdichten Verschließen der SPME-Probengefäße wurden die Proben für 5
Sekunden auf den Vortex-Rührer homogen durchmischt.
Nach 10minütigem Inkubieren bei 80°C auf dem Wasserbad wurde die Probe auf
dem Rührer (750 rpm) für 20 min auf 68°C erhitzt und dabei die Faser dem Gasraum
ausgesetzt. Anschließend wurde die Faser in den Injektorblock überführt. Die Faser
blieb bei geschlossenem Splitventil für 5 min im Injektor. Um Carryover-Effekte auf
der Faser zu vermeiden, wurde diese nach der Desorption für 2 min im Injektorblock
bei geöffnetem Splitventil gereinigt.
Analytische Säule
Zur chromatographischen Trennung der interessierenden Analyten neben
zahlreichen anderen flüchtigen Plasmabestandteilen wurde eine Kapillartrennsäule
verwendet. Die für Ätherisch-Öl-Komponenten und Phenole geeignete, 50 m lange
HP Innowax Säule (0,2 mm I.D., 0,2 µm Filmdicke; quervernetztes Polyethylenglykol)
bot eine ausreichende Trennleistung.
Interner Standard
Um den interessierenden Analyten aus einer komplexen biologischen Matrix mit
entsprechender Reproduzierbarkeit und Präzision quantifizieren zu können, war der
Zusatz eines Internen Standards notwendig. Ein idealer Interner Standard zeichnet
sich durch Ähnlichkeit zum Analyten bezüglich chemischer und physikalischer
Eigenschaften aus. Deshalb greift man bei der Suche nach einem geeigneten
Internen Standard auf strukturell ähnliche Substanzen mit ausreichender chemischer
Stabilität zurück. Für die Quantifizierung von Thymol erwies sich o-Cresol als
geeignet. Der Gleichgewichtszustand des o-Cresols war bei allen Methoden
innerhalb der Expositionszeit erreicht. Dies ist die Grundvoraussetzung für die
Verwendung einer Substanz als Internen Standard in der SPME.
2 Material und Methoden 42
Standardlösungen
Zur Herstellung der Standardlösungen des Analyten als auch des Internen Standards
wurden die Substanzen jeweils in Methanol (2 % des späteren Endvolumens)
vorgelöst und dann mit Wasser auf das Endvolumen aufgefüllt. Durch die
Verdünnung mit Wasser wurde gewährleistet, daß die so entstandene Matrix im
wesentlichen dem Plasma ähnlich blieb und damit eine Beeinflussung des
Gleichgewichtes minimiert wurde. Die Lösungen wurden bei Nichtgebrauch im
Kühlschrank bei 2-8°C aufbewahrt.
Temperaturprogramm
Optimale Trennbedingungen zeigten sich bei folgendem Temperaturprogramm: die
Starttemperatur von 80°C wurde für 5 min gehalten, danach wurde mit 4°C pro min
auf 220°C aufgeheizt und diese Temperatur für 10 min konstant gehalten. Danach
kühlte das System wieder auf 80°C ab. Unter diesen Bedingungen eluierte o-Cresol
nach ca. 35 min und Thymol nach ca. 40 min. Eine wesentliche Verkürzung des
Temperaturprogrammes durch steileres Aufheizen konnte keine ausreichende
Trennung der Peaks von Plasmapeaks mehr gewährleisten.
2.4.2 Validierung der Methode für die Pilotstudien
Auf Grund der Tatsache, daß die Probenaufgabe während des Vermessens der
Proben der Pilotstudien manuell erfolgen mußte, konnte eine Validierung in dem
nach dem Entwurf der FDA Guideline zur Validierung bioanalytischer Methoden
(BIOANALYTICAL METHODS VALIDATION, 1998) gefordertem Umfang, wie sie später bei
der automatisierten Probenaufgabe vorgenommen wurde, nicht durchgeführt werden.
Es wurden die im folgenden aufgeführten Parameter überprüft.
2 Material und Methoden 43
Spezifität
Die Spezifität der Methode wurde anhand von 3 Plasmaproben unterschiedlicher
Probanden, jeweils im 0-Wert und mit Thymol versetzt, belegt. Mit der unter 2.4.1
beschriebenen Methode konnten weder für den Internen Standard noch für Thymol
störende Interferenzen detektiert werden.
Einstellung des Gleichgewichtszustandes
Der erste Schritt der Methodenvalidierung war die Ermittlung des Peakflächen-
Zeitprofils, also die Bestimmung des Zeitpunktes, zu dem sich das Gleichgewicht
zwischen Probe, Gasraum und der Faserbeschichtung eingestellt hatte. Das
Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei einer Temperatur von 68°C ist in Abb. 2.2
dargestellt. Als Expositionszeit wurden 20 min gewählt.
02000400060008000
1000012000140001600018000
0 10 20 30 40 50 60 70
Zeit [min]
Peak
fläch
e
Abb. 2.2 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 68°C, MW aus Doppelbestimmung.
Kalibrierfunktion: Linearität und Bestimmungsgrenze
Die Linearität wurde anhand von 7 Konzentrationen im Bereich von 14,6 bis
470 ng⋅mL-1 gezeigt. Es wurde anhand von mit Thymol versetzten Plasmaproben
jeweils eine 6fach Bestimmung jeder Konzentration durchgeführt. Aus den
Peakflächenverhältnissen Analyt zu Internem Standard wurde mittels linearer
2 Material und Methoden 44
Regression eine Kalibriergerade erstellt. Die Parameter der Kalibrierfunktion sind in
Tab. 2.1 aufgeführt.
Tab. 2.1 Kalibrierfunktion für Thymol im Plasma. Konzentrationen: 14,6; 24,0; 48,0; 52,4; 69,2; 99,0; 192,0; 570,0 ng⋅mL-1
Steigung Achsenabschnitt R2
0,00584 -0,00674 0,9896
Die Bestimmungsgrenze einer Methode ist diejenige Konzentration, die noch mit
akzeptabler Präzision und Richtigkeit bestimmt werden kann (SHAH et al., 1992). Für
Thymol lag die Bestimmungsgrenze (LOQ) mit der unter Absatz 2.4.1 beschriebenen
Methode bei 14 ng⋅mL-1. Detektierbar (Signal-Rausch-Verhältnis 3:1) waren ca.
5 ng⋅mL-1. Dies entsprach der Nachweisgrenze der Methode.
Wiederholpräzision und Richtigkeit
Die Daten zu Präzision und Richtigkeit wurden mit den Werten aus der
Kalibrierfunktion gewonnen. Die Präzision der Methode wurde durch den
Variationskoeffizienten (CV(%)) angegeben. Die Richtigkeit wurde durch den
relativen Fehler (RE), also der prozentualen Abweichung des Mittelwertes vom
Sollwert beschrieben (SHAH et al., 1992).
Tab. 2.2 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol in humanem Plasma. Variationskoeffizient und Relativer Fehler wurden jeweils aus den Meßpunkten einer Konzentration bestimmt.
Konzentration „soll“ [ng⋅mL-1]
Konzentration „ist“, Mittelwert [ng⋅mL-1]
Variationskoeffizient [%]
Relativer Fehler [%]
n
14,6 14,79 17,52 1,33 5 24 35,50 28,98 47,90 6 48 52,19 22,40 8,74 5
52,4 62,13 12,03 18,56 6 69,2 72,59 23,36 4,90 6 99 109,64 6,92 10,75 6 192 147,20 7,16 -23,33 5 570 581,90 12,06 2,09 5
2 Material und Methoden 45
Die in Tab. 2.2 gezeigten Daten zu Präzision und Richtigkeit machten deutlich, daß
diese nur z.T. den geforderten Kriterien (CV und RE am LOQ ≤ 20 %, bei höheren
Konzentrationen ≤ 15 %; siehe auch Absatz 2.8.1.6) entsprachen. Damit war die
manuelle HS-SPME Methode für die Durchführung der Hauptstudie insuffizient. Dies
dürfte hauptsächlich auf den manuellen Betrieb der HS-SPME Methode
zurückzuführen gewesen sein, wodurch die Expositionszeit, Temperatur, Rühr-
geschwindigkeit und Eintauchtiefe der Faser ins Probengefäß nicht exakt genug
eingehalten werden konnten. Dies wurde beim Vergleich mit den Validierungs-
parametern, die mit der automatisierten Methode erhalten wurden, um so deutlicher
(siehe Absatz 2.8.1). Die Automatisierung der Methode war also alleine im Hinblick
auf die Einhaltung der Validierunsparameter unerläßlich.
2.4.3 Strukturabsicherung von Thymol im Plasma nach enzymatischer Spaltung mittels GC-MS
Um sicher zu gehen, daß es sich bei dem per GC-FID detektierten Peak auch
tatsächlich um Thymol handelte, wurde die Struktur per GC-MS abgesichert. Der
Flammenionisationsdetektor (FID), der zur Quantifizierung von Ätherischen-Öl-
Komponenten eingesetzt wird, weist eine sehr hohe Empfindlichkeit auf und zeichnet
sich durch Linearität über einen großen Bereich aus. Er ist aber insofern sehr
unselektiv, als er alle kohlenwasserstoffhaltigen Verbindungen verbrennt und damit
detektiert. Man hat zwar die Möglichkeit, die Identität einer Verbindung über
Vergleich der Retentionszeiten mit Referenzsubstanzen abzuklären, aber mit der
massenspektrometrischen Analyse steht ein wesentlich selektiveres Instrument zur
Verfügung.
Die Strukturabsicherung des Thymols nach enzymatischer Spaltung im Plasma
erfolgte im Rahmen der Pilotstudien jeweils durch den Vergleich der Massenspektren
von mit Thymol versetzten Plasmaproben und Proben, die nach Applikation einer
BronchipretTP Tablette gewonnen wurden. Die Massenspektren von Thymol
wurden wie unter Absatz 2.4.1 beschrieben, jeweils nach manueller
Festphasenmikroextraktion und gaschromatographischer Trennung aufgenommen.
Die Ionisierung wurde mit Elektronenstoßionisation (EI, 70 eV) durchgeführt, die
Spektren wurden im Totalionenstrom aufgenommen. In den Massenspektren von
2 Material und Methoden 46
Thymol waren als charakteristische Massenpeaks m/z 150, 135, 115 und 91
detektierbar.
2.5 Studiendesign der Hauptstudie zur systemischen Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol
Die klinischen Prüfungen der Pilotstudien sowie der Hauptstudie wurden an der
Medizinischen Klinik I mit Poliklinik der Friedrich-Alexander–Universität Erlangen-
Nürnberg, Abteilung für Naturheilverfahren und Komplementärmedizin, unter der
Leitung von Prof. Dr. med. G. Hahn durchgeführt. Als Prüfärzte waren
Dr. med. Benno Brinkhaus und Dr. med Gernot Schindler an den Studien beteiligt.
Die Studie wurde bei der Ethikkomission der Universität Erlangen-Nürnberg
eingereicht und positiv beurteilt (Nr. 2142; akzeptiert am 02.02.2000). Die Probanden
wurden über Nutzen und Risiken der Studie informiert. Zu Beginn der
Voruntersuchung erklärte jeder der Probanden schriftlich sein Einverständnis zur
Teilnahme und den damit verknüpften Bedingungen der Studie. Die Durchführung
der Untersuchungen erfolgte in Anlehnung an GCP (Good Clinical Practice).
2.5.1 Probanden
Die Hauptstudie wurde mit 12 männlichen, gesunden Probanden im Alter zwischen
25 und 48 Jahren durchgeführt. Das Gewicht der Probanden variierte zwischen 72 kg
und 92 kg, die Körpergröße zwischen 178 cm und 192 cm. Weitere demographische
Daten finden sich im Anhang in Tab. 8.1.
2.5.2 Ein- und Ausschlußkriterien
Einschlußkriterien
• Alter: 20 bis 50 Jahre
• Männliches Geschlecht
• Klinische Untersuchung ohne relevante path. Befunde:
2 Material und Methoden 47
Kopf/Hals, Schilddrüse, Lunge, Herz, Abdomen, Nieren, Wirbelsäule, Haut
• Laboruntersuchungen ohne relevante path. Befunde:
Hämoglobin, Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten, Hämatokrit, MCV,
Blutzucker, Natrium, Kalium, Calcium, Chlorid, Kreatinin, Harnstoff, GOT, GPT,
Gamma-GT, AP, Cholinesterase, LDH, CK, Alpha-Amylase, Bilirubin,
Gesamteiweiß, Albumin, Harnsäure, Triglyceride und Gesamtcholesterin, CRP,
Quickwert, PTT, TSH, U-Stix
• Körpergewicht im Bereich von (Körpergröße (cm)-100) [kg] ± 15 %
• Durchführungsbedingungen beachtet
• Einverständniserklärung
Ausschlußkriterien
• Atemwegs- und Lungenerkrankungen
• Magen- und Darmerkrankungen
• Gallenwegs- und Lebererkrankungen
• Nierenerkrankungen
• Kardiale Erkrankungen
• Stoffwechsel- und endokrinologische Erkrankungen
• Symptomat. allergische Erkrankungen (z.B. Allerg. Rhinitis)
• Infektionserkrankungen
• Tumorerkrankungen
• Psychiatrische Erkrankungen
• Suchterkrankungen einschl. Alkoholerkrankung
• Intelligenzminderung (F70- F73 nach ICD-10)
• Betreuung
• Sonstige schwere Erkrankungen
• Regelmäßiges Rauchen (mehr als 10 Zigaretten täglich)
• Teilnahme an einer anderen klinischen Studie innerhalb der
letzten 8 Wochen oder im Prüfungszeitraum
• Prüfungsstreß (z.B. Staatsexamen innerhalb von 4 Wochen)
• Andere schwerwiegende Ereignisse (sog. “life events”)
• Bekannte Überempfindlichkeit gegen Inhaltsstoffe des Prüfpräparats
2 Material und Methoden 48
2.5.3 Prüfpräparat
Präparat: BronchipretTP Filmtabletten
Chargennummer: 2143801
Zusammensetzung:
60 mg Primelwurzeltrockenextrakt (6,0-7,0:1), Auszugsmittel Ethanol 47 %(V/V),
160 mg Thymiantrockenextrakt (5,9-10,0:1), Auszugsmittel Ethanol 70 % (V/V).
Sonstige Bestandteile:
Dimeticon, Magnesiumstearat, Methylhydroxypropylcellulose, Pfefferminzaroma,
Poly(1-vinyl-2-pyrrolidon) ringöffnend vernetzt, lösliches Polyvinylpyrrolidon,
Poly(ethylacrylat-methylmethacrylat), Propylenglycol, Saccharin-Natrium 2 H2O,
Talkum, Farbstoffe: E101, E141, E171
Hersteller: Bionorica AG
Verfall: 01/2003
Gehalt an Thymol im Prüfpräparat: 1,08 mg (siehe Absatz 2.6)
2.5.4 Dosierung
Wie es die therapeutische Einmaldosierung vorsah, wurde eine BronchipretTP
Tablette morgens eingenommen. Um zu gewährleisten, daß keine anderen
Ätherisch-Öl-Komponenten die Analytik beeinträchtigten, verzichteten die Probanden
für die Zeit der Studiendauer auf den Verzehr bzw. die Verwendung aller Ätherisch-
Öl-haltigen Produkte, wie z.B. Kaugummis, Zahnpasten, Rasierwasser, Badezusätze
und Gewürze, insbesondere aus der Familie der Lamiaceae. Um den Einfluß auf die
Resorption durch Nahrungsmittel zu standardisieren, waren die Probanden bei
Einnahme der Tablette nüchtern. Die Tabletten wurden jeweils mit 250 mL Wasser
eingenommen.
2 Material und Methoden 49
2.5.5 Studienablauf
Die Probanden erschienen am jeweiligen Studientag morgens nüchtern in der Klinik.
Medikamenteneinnahme innerhalb der letzten Woche, extreme sportliche Betätigung
(ab 3 Tage vor Studienbeginn), größere Mengen Alkohol in den letzten 3 Tagen vor
Studienbeginn, Rauchen (an den Studientagen), xanthinhaltige Nahrungsmittel (z.B.
Kaffee, Tee, Schokolade), Ätherische Öle (z.B. Hustenbonbon, Zahnpaste,
24 Stunden vor Studienbeginn) waren untersagt. Die Probanden brachten am
1. Studientag ihren Morgenurin in den bei der Voruntersuchung ausgehändigten
Behältern mit.
Vor Beginn der Applikation der Studienmedikation wurde jeder Proband nach
unerwünschten Ereignissen gefragt, die gegebenenfalls zu Protokoll genommen
wurden. Für den Rest des jeweils ersten Studientages waren die Probanden in der
Klinik untergebracht und wurden dort auch mit Nahrungsmitteln versorgt. In den
beiden folgenden Studientagen gingen die Probanden ihrer alltäglichen
Beschäftigung nach und kamen lediglich zur Blutabnahme und zur Abgabe des in
Fraktionen gesammelten Urins in die Klinik. Bei jeder Blutabnahme wurden die
Probanden zu unerwünschten Ereignissen sowie zu der von ihnen aufgenommen
Nahrung befragt.
Blutentnahmen
Die Blutproben von jeweils 9 mL wurden mit Hilfe eines Abbocath zum Zeitpunkt t=0;
0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 14; 24; 31; 38; 48; 55;
62 und 72 Stunden nach Applikation der Studienmedikation in S-Monovetten®
abgenommen. Somit wurden den Probanden innerhalb von 26 Blutentnahmen
insgesamt jeweils 234 mL Blut abgenommen.
Urinsammlung
Die Gefäße zur Urinsammlung wurden vor Beginn eines jeden Sammelintervalls
gereinigt und zur Stabilisierung mit 800 mg Ascorbinsäure versehen. Zur Gewinnung
der Urinproben wurde der Urin vor Applikation, sowie in den Zeitintervallen 0 bis 3,
2 Material und Methoden 50
3 bis 6, 6 bis 9, 9 bis 14, 14 bis 24, 24 bis 31, 38 bis 48, 48 bis 55, 55 bis 62 und 62
bis 72 Stunden gesammelt.
Nach Beendigung des Sammelintervalls wurde die Urinmenge notiert und jeweils zu
50 mL in sterilen Zentrifugenröhrchen aliquotiert. Die Proben wurden zunächst sofort
auf Trockeneis eingefroren und später bei –20°C gelagert.
Probenkodierung
Die in der Hauptstudie anfallenden Plasmaproben wurden wie folgt kodiert:
- Probandenbezeichnung: A bis L
- Blutentnahmezeitpunkte 1 = Nullwert; 2 = 0,25 h; 3= 0,5 h; 4 = 0,75 h; 5 = 1 h;
6 = 1,5 h; 7 =2 h; 8 = 2,5 h; 9 = 3 h; 10 = 3,5 h; 11 = 4 h; 12 = 5 h; 13 = 6h;
14 = 7 h; 15 = 8 h; 16 = 9 h; 17 = 10 h; 18 = 12 h; 19 = 14 h; 20 = 24 h;
21 = 31 h; 22 = 38 h; 23 = 48 h; 24 = 55 h; 25 = 62 h; 26 = 72h.
Bei den Urinproben folgte auf Probandenbezeichnung das Zeitintervall, numeriert in
der Reihenfolge der Sammelperioden (0h = 1, 0 bis 3 h = 2, 3 bis 6 h = 3, 6 bis 9 h =
4, 9 bis 14 h = 5, 14 bis 24 h = 6, 24 bis 31 h = 7, 38 bis 48 h = 8, 48 bis 55 h = 9, 55
bis 62 h = 10 und 62 bis 72 h = 11).
2.5.6 Unerwünschte Ereignisse
Unter unerwünschten Ereignissen versteht man alle im Verlauf einer klinischen
Prüfung beobachteten Befindlichkeitsstörungen, subjektiven und objektiven
Krankheitssymptome, Krankheiten und Unfälle, unabhängig von möglichen
ursächlichen Zusammenhängen mit der verabreichten Studienmedikation.
Im Rahmen dieser Studie traten bei 2 Probanden unerwünschte Ereignisse auf. Die
Probanden klagten bereits zu Beginn der Studie über geringe Kopfschmerzen, die
sich aber im Verlauf des 2. Studientages besserten. Die Studie wurde von allen
Probanden bis zum Ende durchgeführt, und es traten keine schwerwiegenden
unerwünschten Ereignisse auf.
2 Material und Methoden 51
2.6 Prüfpräparat der Hauptstudie
Für die Berechnung pharmakokinetischer Kenndaten mußte die verabreichte Dosis
genau bekannt sein. Die Bestimmung des Thymolgehaltes im Prüfpräparat wurde
mittels Mikrodestillation und anschließender gaschromatographischer Bestimmung
vorgenommen. Die hierzu verwendete Methode wurde nach den folgenden ICH
Guidelines CPMP/ICH/381/95 und CPMP/ICH/281/95 validiert. Die Daten zur
Validierung liegen bei der Firma Bionorica AG vor (Prüfvorschrift Nr. FE03805,
Version 1.1).
2.6.1 Extraktion von Thymol aus BronchipretTP Filmtabletten
Ca. 0,4 g gepulverte Probe (genau gewogen) wurden in ein 20 ml Probengefäß
eingewogen, mit 10,0 mL destilliertem Wasser und mit einer Universal-Glasfritte für
kontrollierte Destillation versetzt und mit dem zugehörigen Septum verschlossen. In
den Auffangkolben wurden 0,5 g NaCl eingewogen, mit 4,0 mL t-Anethol Interner
Standardlösung und Siliconentschäumer versetzt und mit dem Schraubverschluß
inklusive geschlitztem Septum verschlossen.
Die beiden Gefäße wurden mit der Universal-Destillationskapillare miteinander
verbunden, in den Eppendorf Microdistiller eingesetzt und das Programm (mit
20°C⋅min-1 wurde auf 110°C aufgeheizt, diese Temperatur für 10 min gehalten,
danach wiederum mit 20°C⋅min-1 auf 112°C aufgeheizt, diese Temperatur für 65 min
gehalten und anschließend mit 2°C min-1 auf 20°C abgekühlt) gestartet. Nach Ablauf
der Prozeßzeit wurden die Phasen kräftig geschüttelt. Die Heptanphase diente nach
erfolgter Phasentrennung als Untersuchungslösung.
2.6.2 Trennung und Detektion
Für die gaschromatographische Trennung und Detektion per FID von Thymol aus
BronchipretTP Filmtabletten wurde folgende GC-Methode herangezogen: Nach der
Aufgabe von 1,0 µL Untersuchungslösung (Split 90:1) wurde ausgehend von 80°C
mit 20°C⋅min-1 auf 220°C aufgeheizt und diese Temperatur für 12 min konstant
gehalten.
2 Material und Methoden 52
2.6.3 Kalibrierung und Quantifizierung
Die verwendete Kalibrierfunktion zur Quantifizierung des Thymolgehaltes des
Prüfpräparates ist in Tab. 2.3 dargestellt. Der Thymolgehalt von 1,08 mg pro Tablette
wurde an Hand des Durchschnittsgewichtes einer Tablette (427,90 mg = MW aus 10
Tabletten) und einer Doppelbestimmung (2 Tabletten) vorgenommen.
Tab. 2.3 Kalibrierfunktion für Thymol, als Interner Standard wurde t-Anethol verwendet.
Steigung Achsenabschnitt R2
1,024336 0,010605 1,00000
2 Material und Methoden 53
2.7 Analytik der Plasma- und Urinproben vor enzymatischer Hydrolyse
2.7.1 Detektion von Thymolsulfat und Thymolglucuronid in Plasma und Urin mittels LC-MS/MS
Die unter Absatz 2.7.1 aufgeführten Arbeiten wurden von A&M, Labor für Analytik
und Metabolismusforschung Service GmbH, Kopernikusstraße 25, 50126 Bergheim
durchgeführt.
Die Identifizierung der nicht flüchtigen Phase-II-Metabolite Thymolglucuronid und
Thymolsulfat wurde mit der sehr empfindlichen und äußerst selektiven Tandem-
Massenspektrometrie nach Trennung per HPLC vorgenommen. Mit diesem
Verfahren bietet sich die Möglichkeit, durch eine zweite Ionisierung Tochterspektren
zu erhalten, die charakteristisch für die jeweilige Verbindung sind. Somit kann die
Identität einer Verbindung exakt abgeklärt werden, ohne daß notwendigerweise
Referenzsubstanzen zur Verfügung stehen.
2.7.1.1 Probenaufarbeitung
Plasma
Zu 550 µL Plasma wurde 550 µL Acetonitril pipettiert, für ca. 20 Sekunden stark
geschüttelt und anschließend für 4 min bei 7825 g zentrifugiert. Bei 40°C wurde das
Lösungsmittel unter Stickstoff eingeengt. Der Rückstand wurde in 5 µL Acetonitril
und 45 µL 2 mM NH4OAc mit Hilfe eines Ultraschallbades aufgenommen. Nach
Zentrifugieren für 4 min bei 7825 g wurde der Überstand (20 µL) zur HPLC-Analyse
verwendet.
Urin
Direkteinspritzung (nach Einnahme von 10 Tabletten):
1,4 mL Urin wurden bei 7825 g für 4 min zentrifugiert und der Überstand zur HPLC
Analytik verwendet (100 µL).
2 Material und Methoden 54
Ethylacetatextraktion (nach Einnahme einer Tablette):
4 mL Urin wurden mit 8 µL Ameisensäure versetzt. Nach Zusatz von 14 mL
Ethylacetat wurde die Lösung für 2 min stark geschüttelt. Um die organische Phase
abzutrennen, wurde die Lösung für 3 min bei 7825 g zentrifugiert und der Überstand
wurde bei 40°C unter Stickstoff eingeengt. Der Rückstand wurde in 12 µL Acetonitril
und 108 µL 2 mM NH4OAc mit Hilfe eines Ultraschallbades gelöst. 20 µL davon
wurden zur HPLC-Analyse verwendet. Von den Referenzlösungen wurden jeweils 5 -
30 µL zur Analyse verwendet.
2.7.1.2 Trennung und Detektion
Für die Trennung und Detektion der Phase-II-Metabolite wurde folgender Gradient
verwendet: Zeit [h] % Fließmittel B
0 0
2 0
2,01 10
15 42
15,01 50
25 80
25,01 0
Fließmittel A: 2 mM NH4OAc, MeCN 95+5 (V+V)
Fließmittel B: MeCN+1mM NH4OAc+H2O, 95+4,8+0,2 (V+V+V)
Die Detektion in der UV-Spur erfolgte bei 212 nm.
Die Detektion erfolgte per LC-ESI-MS zunächst mit den entsprechenden
Ionenspuren und anschließend an Hand der MS/MS-Spektren der betreffenden
Signale (siehe auch Absatz 3.1 sowie Abb. 8.6, Abb. 8.7, Abb. 8.8 und Abb. 8.9). Die
Quantifizierung von Thymolsulfat im Plasma bzw. von Thymolsulfat und
Thymolglucuronid im Urin erfolgte im SIM Modus.
2 Material und Methoden 55
2.7.2 Detektion von freiem Thymol im Plasma
2.7.2.1 Probenaufarbeitung
400 µL Plasma (pH 5) wurden mit 50 µL Interner Standardlösung o-Cresol
(4 µg⋅mL-1), 50 µL Wasser und 500 µL Methanol versetzt. Nach 10minütigem
Schütteln wurde bei 7825 g für 10 min zentrifugiert und der Überstand für die
Trennung per HPLC mit anschließender coulometrischer Arraydetektion verwendet.
2.7.2.2 Trennung und Detektion
Die aufgearbeiteten Plasmaproben wurden am Deutschen Institut für
Ernährungsforschung, Bergholz-Rehbrücke, analysiert.
Die chromatographischen Bedingungen zur Detektion vom Thymol in humanem
Plasma waren wie folgt:
Fließmittel A: 0,1 M Natrium-Dihydrogenphosphatlösung: Wasser im Volumen-
verhältnis 1:4 angesetzt, mit o-Phosphorsäure auf pH 3,4 eingestellt, steril filtriert.
Fließmittel B: 0,1 M Dihydrogenphosphatlösung mit o-Phosphorsäure auf pH 1,4
eingestellt, mit 4 Teilen Methanol aufgefüllt, steril filtriert.
Die Detektion von Thymol im Plasma erfolgte mit coulometrischer Arraydetektion bei
825 mV. Zur Trennung per HPLC wurde folgender Gradient verwendet: t [h] Fließmittel A
0,0 70,0 linear bis
40,0 20,0 linear bis
45,0 0,0 isokratisch bis
50,0 0,0 linear bis
52,0 70,0 isokratisch bis
65,0 70,0 Ende
Mit dieser Methode ergaben sich die in Abb. 2.3 dargestellten Chromatogramme.
Unterhalb der Bestimmungsgrenze von 1,4 ng⋅mL-1 war weder nach Einnahme einer
noch nach 10 Tabletten BronchipretTP freies Thymol detektierbar. Die zu Grunde
liegende Kalibrierfunktion ist in Tab. 2.4 dargestellt.
2 Material und Methoden 56
Tab. 2.4 Kalibrierfunktion (Konzentrationen: 1,4; 14,0; 28,0; 140,0 ng⋅mL-1) für die Bestimmung von Thymol im Plasma.
Steigung Achsenabschnitt R2
0,0136 0,0206 0,9991
Abb. 2.3 0-Wert Plasma mit Thymol versetzt (1,4 ng⋅mL-1) (blau), Plasma nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP (grün).
2.7.3 Detektion von freiem Thymol im Urin
2.7.3.1 Probenaufarbeitung
Jeweils 500 µL Urin (pH 5) wurden mit 250 µL n-Heptan versetzt und für 20 min bei
350 rpm geschüttelt. Der Überstand wurde abgenommen und für die GC-MS Analytik
verwendet.
2.7.3.2 Trennung und Detektion
Für die Trennung und Quantifizierung von Thymol aus Urin wurde folgende GC-
Methode herangezogen: nach der Aufgabe von 3,0 µL Untersuchungslösung im
Splitless Modus wurde die Ausgangstemperatur von 80°C für 1 min gehalten und
anschließend mit 20°C⋅min-1 auf 220°C aufgeheizt. Diese Temperatur wurde für
48.0 49.0 50.0 51.0 52.0
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
Retention time (minutes)
Res
pons
e (n
A)
211 12 Claudi2.008
2 12 Claudi2.012# Ch File [825 mV]
[825 mV]
Thymol ↓
2 Material und Methoden 57
5 min konstant gehalten und dann erneut mit 20°C⋅min-1 auf 260°C aufgeheizt. Die
Endtemperatur wurde für 5 min konstant gehalten. Mit dieser Methode ergaben sich
die in Abb. 2.4 und Abb. 2.5 dargestellten Chromatogramme. Die Quantifizierung
erfolgte im SIM Modus. Unterhalb der Bestimmungsgrenze von 2,1 ng⋅mL-1 ließ sich
im Urin nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP kein freies Thymol nach-
weisen. Die zu Grunde liegende Kalibrierfunktion ist in Tab. 2.5 dargestellt.
Tab. 2.5 Kalibrierfunktion (Konzentrationen: 2,12; 5,3; 10,6; 21,2; 53,0; 106,0; 212,0 ng⋅mL-1) zur Bestimmung von Thymol im Urin.
Steigung Achsenabschnitt R2
12998 1474,1 0,9998
Abb. 2.Bronchip
Abb. 2.4
↓ Thymol
5 IonenspurchromatograretTP.
Ionenspurchromatogramm von 0-Wert Urin mit Thymol (2,1 ng⋅mL-1) versetzt.
min
min
mm von Urin nach Einnahme einer Tablette
2 Material und Methoden 58
2.8 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Plasmaanalytik für die Hauptstudie
Um die bei der Hauptstudie anfallende große Probenanzahl bewältigen zu können
und eine den internationalen Anforderungen gerechte Validierung der HS-SPME
Methode durchführen zu können (BIOANALYTICAL METHODS VALIDATION, 1998), war die
Anschaffung eines Autosamplers, der die automatisierte Probenaufgabe
gewährleistete, unerläßlich (Abb. 2.6). Im Zuge der Anpassung der manuellen HS-
SPME an die automatisierte HS-SPME, mußten jedoch einige Parameter der unter
2.4.1 beschriebenen manuellen HS-SPME Methode wie folgt abgeändert werden.
Abb. 2.6 Combi-Pal Autosampler.
Änderung der Probengefäßgröße
Durch die durch den Combi-PAL Autosampler vorgegebene bzw. eingeschränkte
Probengefäßgröße (2, 10 oder 20 mL), konnte nicht mit den 4 mL Probengefäßen,
die während der manuellen Methode verwendet wurden, weiter gearbeitet werden.
Da die 2 mL Probengefäße ein zu kleines Volumen aufwiesen, um zu verhindern,
daß beim Exponieren der Faser Probenmaterial auf die Faser gelangte und sie damit
beschädigte, wurde im folgenden mit 10 mL Probengefäßen gearbeitet. Daraus
Bakeout
Tray
Injektor
SPME Faser
Single Magnet Mixer/Heater
2 Material und Methoden 59
resultierten größere Headspacevolumina, die wiederum einen Verlust an
Empfindlichkeit bedeuteten.
Einsatz einer speziellen Heiz- und Rührvorrichtung
Bei manueller HS-SPME wurde die Probe geheizt und gleichzeitig mit einem
Rührfisch gerührt. Das Rühren stellte einen wichtigen Einflußfaktor auf die
Einstellung des Gleichgewichtszustandes dar. Dieses intensive Rühren war jedoch
mit dem Combi-PAL Autosampler nicht möglich. Hier fand lediglich ein Schütteln - mit
variabler Umdrehungszahl, bevor die Faser exponiert wurde – und mit definierter,
langsamer Umdrehung, während der Exposition, statt.
Hierdurch kam es zu einer inakzeptablen Verlängerung der Analysenzeit. Zusätzlich
spritzte durch die Schüttelbewegung Probenmaterial auf die Faser, was die
Lebensdauer der Faser erheblich reduzierte und die Reproduzierbarkeit des
Verfahrens einschränkte. Durch die Entwicklung einer Vorrichtung, die das
gleichzeitige Heizen und Rühren der Probe mit einem Rührfisch ermöglichte (Single
Magnet Mixer/Heater, Fa. Chromtech), konnten diese Probleme behoben werden.
Änderung der Faserbeschichtung
Um den durch Einsatz der 10 mL Probengefäße entstandenen Verlust an
Empfindlichkeit auszugleichen, wurde statt der bisher verwendeten 100 µm
Polydimethylsiloxan-Faser eine 85 µm Polyacrylat-Faser eingesetzt. Diese war
empfindlicher für polarere Verbindungen und zeigte gegenüber der
Polydimethylsiloxan-Faser eine höhere Affinität zu Thymol. Die Polyacrylat-Faser
jedoch tolerierte die bei der Probenaufarbeitung zugesetzte Säure, insbesondere
Essigsäure nicht, so daß nach einigen Injektionen die Faserbeschichtung zerstört
wurde.
Deshalb wurde im folgenden mit einer zu diesem Zeitpunkt neu entwickelten 65 µm
Polydimethylsiloxan-Divinylbenzen-Faser (PDMS-DVB) gearbeitet. Sie zeichnete
sich durch eine wesentlich bessere Verträglichkeit niedriger pH-Werte aus und wies
dabei die notwendige Empfindlichkeit für den Analyten auf. Der hohe
Konzentrationsfaktor (Peakfläche durch SPME-Faser resultierend / Peakfläche durch
Headspace resultierend) von Thymol zur 65 µm PDMS-DVB-Faser wurde auch von
2 Material und Methoden 60
Bicchi et al. bestätigt (BICCHI et al., 2000). Die für die Methodenentwicklung
verwendeten 65 µm PDMS-DVB-Fasern waren, ebenso wie die zuvor verwendeten
Fasertypen mit einem angeklebten Septum versehen, das die Verflüchtigung der
Analyten verhinderte. Im Zuge dessen, daß der Hersteller die Zusammensetzung des
Klebers, mit dem die Septen fixiert wurden, veränderte, lösten sich die Septen
während des Gebrauches ab. Als Alternative wurden nun sog. ‚crimped fibers‘
entwickelt. Hier wurde das Septum nicht mehr geklebt, sondern mit einem
Metallmantel befestigt.
Konditionierung der SPME-Fasern
Zur Konditionierung der PDMS-DVB-Fasern wurden die Fasern zunächst 60 min bei
270°C in der Bakeout-Vorrichtung konditioniert, danach für 1 min in Methanol
gereinigt und anschließend für weitere 30 min bei 220°C im Injektor des GC
(geöffnetes Splitventil) belassen. Diese Vorgehensweise erwies sich bei allen
getesteten Fasern verschiedener Chargen als ausreichende Konditionierung.
Probenaufarbeitung
Die Probenaufarbeitung wurde gegenüber der manuellen SPME-Methode
folgendermaßen modifiziert: die eingesetzten Reagenzien wurden an die größeren
Probengefäße (10 mL) angepaßt. Demnach wurden 1040 µL Plasma mit 40 µL
Essigsäure 0,58 M und 100 µL β-Glucuronidaselösung (Sigma G7017) versetzt und
wie unter 2.4.1 beschrieben inkubiert. Anschließend wurden jeweils 50 µL Interne
Standardlösung (o-Cresol: 4 µg⋅mL-1) und Wasser hinzupipettiert. In ein 10 mL
Probengefäß wurden 1,0 g NaCl eingewogen, 100 µL Phosphorsäure 85 %
hinzupipettiert und mit einem Rührfisch versehen. Danach wurde das enzymatisch
behandelte Plasma hinzugefügt und das Probengefäß luftdicht (mit magnetischer
Kappe und PTFE Septum) verschlossen. Verluste des Analyten durch die
Pipettierschritte wurden nicht beobachtet.
Die folgenden Schritte wurden vom Combi-PAL Autosampler durchgeführt: jede
Probe wurde für 35 min bei 80°C unter Rühren bei 750 rpm im Magnet Mixer/Heater
geheizt. Während dieser Zeit wurde eine crimped 65 µm PDMS-DVB-Faser dem
Gasraum über der Probe ausgesetzt. Anschließend wurde die Faser in den
2 Material und Methoden 61
Injektorblock überführt und dort für 5 min desorbiert. Um carryover auszuschließen,
wurde die PDMS-DVB-Faser zu Beginn jeder weiteren Exposition bei 270°C für
10 min in der Bakeout-Vorrichtung gereinigt.
Die Herstellung der Standardlösungen, sowie die Kapillarsäule des GC wurden wie in
Absatz 2.4.1 aufgeführt, beibehalten. Das Temperaturprogramm wurde dahingehend
modifiziert, daß mit 4°C⋅min-1 auf 240°C aufgeheizt wurde und diese Temperatur für
10 min beibehalten wurde.
2.8.1 Validierung der Analytik zur Auswertung der Hauptstudie
Die Validierung der Analytik zur Hauptstudie wurde in Anlehnung an einen
Richtlinienentwurf „Bioanalytical Methods Validation for Human Studies – Draft
Guidance“ des U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug
Administration, Center for Drug Evaluation and Research, vorgenommen
(BIOANALYTICAL METHODS VALIDATION, 1998).
2.8.1.1 Identifizierung und Quantifizierung der Referenzsubstanz Thymol; Interkalibrierung des Arbeitsstandards
Die Identität der Referenzsubstanz Thymol (Lot 377452/1) wurde im Zentralinstitut
Arzneimittelforschung GmbH im Rahmen einer Zertifizierung der Substanz als
Primärstandard mittels 1H-NMR-, 13C-NMR-, Massen-, Infrarot- und
Ultraviolettspektren, sowie an Hand des Schmelzpunktes und per
Dünnschichtchromatographie bestimmt. Die Reinheit wurde mit quantitativer 1H-NMR-Spektroskopie (Wasser- und Lösungsmittelrückstände), Gaschromato-
graphie (100 % Peakflächenmethode) und Titration nach USP24/NF19 bestimmt.
Dabei ergab sich ein Thymolgehalt von 97,3 %, wobei als Verunreinigung
hauptsächlich Wasser auftrat. Lösungsmittelrückstände wurden nicht detektiert.
Zusätzlich wurde die Anwesenheit nicht flüchtiger Bestandteile mit 0,07 % ermittelt.
Die vollständige Dokumentation des Primärstandards Thymol liegt im Zentralinstitut
Arzneimittelforschung GmbH, Sinzig, vor.
2 Material und Methoden 62
Interkalibrierung des Arbeitsstandards
Das als Arbeitsstandard verwendete Thymol (Fluka, 89330) wurde per HPLC und GC
mit dem Primärstandard interkalibriert.
Für die per GC vorgenommene Quantifizierung wurden die unter Absatz 2.8
verwendeten chromatographischen Parameter verwendet. Die Aufgabemenge im
Splitless Modus betrug 1 µL.
Der zur Quantifizierung mittels HPLC verwendete Gradient war folgender: t [h] Fließmittel B [%]
0 30
20 70
22 100
25 100
27 30
Lösungsmittel A: Phosphorsäure 0,085 %; Lösungsmittel B: Acetonitril.
Injektionsvolumen: 5 µL, Detektionswellenlänge 274 nm.
Für den Arbeitsstandard bezogen auf den Primärstandard ergaben sich die in Tab.
2.6 angegeben Gehalte.
Tab. 2.6 Interkalibrierung des Arbeitstandards mit dem Primärstandard.
Konzentrations- Testkonzentration Steigung Achsen- R2 Gehaltbereich abschnitt
HPLC 20,76 bis 415,2 µg.mL-1 107 µg.mL-1 5333,3 11,53 0,99995 96,90%n=5 n=2
GC 7,74 bis 154,8 ng.mL-1 61,5 ng.mL-1 4383,72 -1618,58 0,99984 98,86%n=4 n=2
2 Material und Methoden 63
2.8.1.2 Lebensdauer der Fasern
Aufgrund der Azidität der Probenlösung ergab sich im Vergleich zu anderen HS-
SPME Methoden eine relativ kurze Lebensdauer (40 Injektionen) der Fasern. Die
Fasern verfärbten sich mit zunehmender Anzahl an Extraktionen und die
Chromatographie verschlechterte sich. Zusätzlich wurde eine abnehmende
Wiederfindung beobachtet, das Peakflächenverhältnis blieb jedoch relativ konstant.
2.8.1.3 Spezifität
Die Spezifität der Methode wurde an Hand von Plasmen sechs verschiedener
Probanden belegt. Im Plasma dieser Probanden befand sich jeweils genau zur
Retentionszeit des Thymols ein Peak, je nach Proband im Bereich von 1927 bis 2602
Flächeneinheiten. Verschiedene Säulenmaterialien sowie zahlreiche Änderungen in
Bezug auf das chromatographische System, konnten jedoch nicht dazu beitragen,
diesen Peak abzutrennen. Deshalb wurde die Bestimmungsgrenze auf 8,1 ng⋅mL-1
festgesetzt. Dies entsprach durchschnittlich 3990 Flächeneinheiten und lag damit
deutlich über dem durch den Störpeak hervorgerufenen Signal. Die Existenz des
interferierenden Peaks beeinflußte jedoch in keiner Weise die Gesamtaussagekraft
der Daten. Unter den oben beschriebenen Bedingungen erhielt man die in Abb. 2.7
und Abb. 2.8 gezeigten Chromatogramme.
2 Material und Methoden 64
Abb. 2.7 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben) und einer mit Thymol versetzten Probe (unten).
Abb. 2.8 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP (oben) und einer 0-Wert Probe (unten).
o-Cresol
↓
Thymol
↓
o-Cresol
↓
Thymol
↓
o-Cresol
↓
Thymol
↓
2 Material und Methoden 65
2.8.1.4 Einstellung des Gleichgewichtszustandes
Das Peakflächen-Zeitprofil für Thymol (Konzentration: 61,5 ng⋅mL-1) bei einer
Temperatur von 80°C ist in Abb. 2.9 dargestellt. Die ermittelte optimale
Expositionsdauer lag damit bei 35 min.
0
5000
10000
15000
20000
25000
0 10 20 30 40 50 60 70
Zeit [min]
Pekf
läch
e
Abb. 2.9 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 80°C, MW aus 2 Messungen.
2.8.1.5 Kalibrierfunktion: Linearität und Bestimmungsgrenze
Die Linearität wurde an 3 Tagen mit 3 verschiedenen Fasern anhand von 9
Konzentrationen im Bereich von 8,14 bis 40,07 ng⋅mL-1 und 30,54; bis 203,5 ng.mL-1
gezeigt (Tab. 2.7). Da bei der Verwendung einer Kalibrierfunktion, die den gesamten
Konzentrationsbereich abdeckte, im unteren Konzentrationsbereich keine den
Anforderungen genügenden Werte bezüglich Richtigkeit und Wiederholpräzision
erzielt werden konnten, wurden diese beiden Konzentrationsbereiche separat
kalibriert. Aus den Verhältnissen der Peakflächen von Analyt zu Internem Standard
wurde jeweils mittels linearer Regression die Kalibriergerade erstellt. In Abb. 2.10
und Abb. 2.11 sind exemplarisch die beiden den Arbeitsbereich abdeckenden
Kalibriergeraden dargestellt. Tab. 2.7 zeigt die Ergebnisse der Kalibrierfunktionen
2 Material und Methoden 66
bezüglich Steigung, Achsenabschnitt und Korrelationskoeffizienten. Die
Bestimmungsgrenze für Thymol lag bei 8,1 ng⋅mL1.
0
1
2
0 10 20 30 40 50Konzentration [ng.mL-1]
Peak
fläch
enve
rhäl
tnis
Abb. 2.10 Kalibriergerade für den unteren Konzentrationsbereich des Arbeitsbereiches.
01234567
0 50 100 150 200 250
Konzentration [ng.mL-1]
Peak
fläch
enve
rhäl
tnis
Abb. 2.11 Kalibriergerade für den oberen Bereich des Arbeitsbereiches.
2 Material und Methoden 67
Tab. 2.7 Parameter der Kalibrierfunktionen für Thymol. Konzentrationen: 8,14; 10,18; 20,36; 30,54; 40,07; 50,9; 101,8; 152,7; 203,5 ng.mL-1
Lauf Steigung Achsenabschnitt R2
8,14 bis 40,07 ng.mL-1 1 0,01700 0,49720 0,99854 30,54 bis 203,5 ng.mL-1 0,03280 -0,10450 0,99730
8,14 bis 40,07 ng.mL-1 2 0,03293 0,2556 0,97138 30,54 bis 203,5 ng.mL-1 0,02718 0,33653 0,99319
8,14 bis 40,07 ng.mL-1 3 0,02635 0,21208 0,97794 30,54 bis 203,5 ng.mL-1 0,02227 0,43056 0,99036
2.8.1.6 Richtigkeit und Wiederholpräzision
Die Daten zu Präzision und Richtigkeit wurden an 3 Tagen bestimmt. Dazu wurden
jeweils 5 Plasmaproben 3 verschiedener Thymolkonzentrationen bestimmt. Die
Konzentrationen wurden so gewählt, daß sie sich über den gesamten
Konzentrationsbereich verteilten (Tab. 2.8 und Tab. 2.9).
Die „intra-day precision“ drückt die Präzision aus, die man durch
Mehrfachbestimmung einheitlicher Proben innerhalb eines kurzen Zeitraumes erhält.
Die „between-day precision“ dagegen beschreibt die Präzision bei der Bestimmung
einheitlicher Proben u.a. an verschiedenen Tagen. Die „between-day precision“
wurde aus den Mittelwerten der „intra-day precision“ der jeweiligen Konzentration
berechnet. Sowohl „intra-day“- als auch „between-day precision“ wurden durch den
Variationskoeffizienten (CV(%)) beschrieben. Die prozentuale Abweichung des
Mittelwertes vom wahren Wert gab die Richtigkeit der Methode an (SHAH et al., 1992;
BIOANALYTICAL METHODS VALIDATION, 1998).
Bedingt durch die begrenzte Lebensdauer der SPME Fasern, wurden die
Untersuchungen zu Richtigkeit und Wiederholpräzision jeweils mit verschiedenen
Fasern durchgeführt. Da die Peakflächen der einzelnen Fasern sogar innerhalb einer
Charge z.T. erheblich variierten, wurde jede Faser zunächst separat kalibriert.
2 Material und Methoden 68
Tab. 2.8 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der Validierung („intra-day precision“). Konzentration Tag MW CV RE n
[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]
8,14 1 9,26 18,26 13,72 5 2 6,66 12,23 -18,15 5 3 9,66 9,72 18,70 5
61,5 1 59,69 3,87 -2,94 5 2 55,55 9,30 -9,68 5 3 61,78 11,98 0,45 5
203,5 1 174,57 8,01 -14,22 5 2 192,97 6,32 -5,17 5 3 192,49 13,48 -5,41 5
Tab. 2.9 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der Validierung („between-day precision“), berechnet aus den Mittelwerten der „intra-day precision“.
Konzentration MW CV RE
[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]
8,14 8,53 19,10 4,76
61,5 59,01 5,37 -4,06
203,5 186,68 5,62 -8,27
Der Variationskoeffizient (CV) sowie der relative Fehler (RE) waren sowohl für die
„intra-day precision”, als auch für die „between-day precision“, für die mittlere und
hohe Konzentration kleiner als 15 %, für die Bestimmungsgrenze kleiner als 20 %
(Tab. 2.8 und Tab. 2.9).
2 Material und Methoden 69
2.8.1.7 Stabilität
Stabilität der Plasmaproben
Die Stabilität der bei –20°C tief gefrorenen Plasmaproben wurde nach 2, 4, 6, und 12
Wochen überprüft. Es zeigte sich während des beobachteten Zeitraumes keine
Abnahme der ursprünglich vorhandenen Konzentration (Tab. 2.10). Auf die
Überprüfung der Stabilität in Einfrier- und Auftauzyklen wurde verzichtet, da die
Proben direkt nach Blutentnahme zu jeweils 500 µL aliquotiert wurden.
Tab. 2.10 Stabilität von Thymolsulfat im Plasma bei Lagerung bei -20°C. Die Werte entsprechen jeweils den Mittelwerten aus 2 Messungen, Gehalt in [%].
Woche 0 Woche 2 Woche 4 Woche 6 Woche 12
100 103,3 101,9 99,5 101,1
Stabilität der Plasmaproben im Autosampler
Um zu überprüfen, ob die zur Analytik vorbereiteten Plasmaproben nach längerem
Stehen (maximal 24 Stunden) im Autosampler noch die notwendige Stabilität
aufwiesen, wurden jeweils 4 Proben mit einer mittleren Thymol Konzentration
(41 ng⋅mL-1) sofort und nach 24stündigem Warten im Autosampler vermessen (Tab.
2.11). Es zeigte sich, daß der Thymolgehalt während der Zeit im Autosampler nicht
abnahm (Tab. 8.2 im Anhang).
2 Material und Methoden 70
Tab. 2.11 Stabilität der Plasmaproben im Autosampler (n=4).
Zeit [h] MW SD[ng.mL-1] [ng.mL-1]
0 37,36 0,49
24 39,59 2,29
2.8.1.8 Qualitätssicherung während der Probenmessung
Es wurden Plasmaproben von 12 Probanden in 12 Analysenserien analysiert. Die
Ergebnisse der Messungen (Kalibrierfunktionen und Qualitätskontrollproben) sind im
Anhang (Tab. 8.3 und Tab. 8.4) aufgeführt.
Kalibrierfunktionen
Durch die begrenzte Lebensdauer der SPME-Fasern wurde jede Analysenserie mit
einer neuen Faser durchgeführt. Mit jeder Analysenserie wurden 9 Kalibrierproben
(Plasmaproben mit Thymol versetzt) zur Erstellung zweier Kalibriergeraden (siehe
Absatz 2.8.1.5) analysiert. Die Kalibrierfunktionen für Thymol waren im jeweiligen
Konzentrationsbereich alle linear. Die Korrelationskoeffizienten lagen für den unteren
Konzentrationsbereich zwischen 0,95873 und 0,99715, für den oberen
Konzentrationsbereich zwischen 0,97750 und 0,99907 (Tab. 8.3).
Qualitätskontrollproben
Um den jeweiligen Ablauf einer Analysenserie zu überprüfen, wurden als
Qualitätskontrollproben (QCs) ebenfalls Plasmaproben (mit Thymol versetzt),
eingesetzt. Mit jeder Analysenserie wurden 6 über die gesamte Sequenz verteilte
Qualitätskontrollproben ausgewertet. Davon befanden sich je 2 im unteren (≤ 3
LOQ), im mittleren (ca. 50 % der größten Standardkonzentration) und oberen (75-
90 % der größten Standardkonzentration) Konzentrationsbereich des
Arbeitsbereiches. Mindestens 4 dieser QCs sollten nicht mehr als 20 % vom
2 Material und Methoden 71
tatsächlichen Wert abweichen. 2 dieser QCs konnten außerhalb dieses Bereiches
liegen, sofern sie nicht beide derselben Konzentration angehörten. Diese Kriterien
wurden ebenfalls erfüllt. Die jeweiligen Ergebnisse der QCs finden sich im Anhang
(Tab. 8.4).
2.8.1.9 Wiederfindung
Um festzustellen, welcher Anteil des Analyten (Thymol) durch die SPME Fasern aus
der Probe extrahiert wurde, wurde die Wiederfindung bestimmt. Dabei wurden die
Peakflächen, die durch direktes Einspritzen des Analyten (Thymol in Methanol)
erhalten wurden, mit den Peakflächen, die nach Festphasenmikroextraktion erhalten
wurden, verglichen. Dabei entsprach die Menge des Analyten in der Plasmaprobe
der Menge, die auf die Säule per Flüssigaufgabe aufgegeben wurde. Die
Wiederfindung bei 3 Konzentrationen sind in Tab. 2.12 dargestellt.
Tab. 2.12 Wiederfindung für verschiedene Konzentrationen von Thymol aus humanem Plasma für Headspace-Festphasenmikroextraktion.
aufgegebene Menge bzw. Menge pro mL Plasma [ng]
8.1 61.5 203.5
Wiederfindung [%] 4,9 ± 0,7 5,3 ± 0,7 4,5 ± 0,3
Variationskoeffizient [%] 14,1 12,5 5,9
2.8.1.10 Strukturabsicherung von Thymol im Plasma nach enzymatischer Spaltung mittels GC-MS
Die Strukturabsicherung für Thymol nach enzymatischer Spaltung im Plasma im
Rahmen der Hauptstudie, erfolgte mit der manuellen Festphasenmikroextrak-
tionsmethode (80°C, 750 rpm, 35 min Expositionszeit), da die Umrüstung des GC-
MS mit dem Combi-PAL Autosampler nicht durchführbar war. Die anderen
Parameter wurden wie in Absatz 2.8 beschrieben beibehalten. Die Ionisierung
erfolgte mit 70 eV. Die Spektren wurden sowohl im TIC (Totalionenstrom), als auch
2 Material und Methoden 72
im SIM Modus aufgenommen, woraus eine wesentlich höhere Empfindlichkeit
resultierte.
Bei der Analyse der Plasmaproben der Hauptstudie ergab sich jeweils eine
Übereinstimmung des im SIM Modus aufgenommenen Spektrums mit dem der
Referenzsubstanz bei m/z 150, 135 ,115 und 91. In Abb. 8.1 und Abb. 8.2 im Anhang
sind im Vergleich die typischen Fragmentierungsmuster von einer mit Thymol
versetzten Plasmaprobe und von Plasma nach Einnahme einer Tablette
BronchipretTP dargestellt. Die prozentualen Verhältnisse der entsprechenden
Fragmente wichen kaum von denen der Referenzsubstanz ab (Tab. 8.15).
2.9 Entwicklung und Validierung der analytischen Methoden zur Urinanalytik
2.9.1 Methodenentwicklung
Die Methodenentwicklung zur Bestimmung von Thymol in humanem Urin nach
enzymatischer Spaltung der Phase-II-Metabolite Thymolsulfat und Thymolglucuronid
(siehe Absatz 3.1) basierte auf der unter 2.8 beschriebenen Methode zur
Bestimmung von Thymol in humanem Plasma. Sie unterscheidet sich lediglich in der
Probenaufarbeitung; alle anderen unter 2.8 aufgeführten Parameter wurden
beibehalten. Auf den Zusatz eines Internen Standards wurde verzichtet, die
Validierungskriterien, wie in Absatz 2.9.2 dargestellt, konnten dennoch erfüllt werden.
Probenaufarbeitung
1000 µL Urin wurden mit 20 µL Essigsäure 0,58 M auf pH 5 eingestellt, mit 100 µL β-
Glucuronidase (Sigma G7017) versetzt und wie unter Absatz 2.4.1 beschrieben
inkubiert. Eine größere Menge Enzym und/oder längere Inkubationszeiten führten zu
keiner vermehrten Freisetzung. Nach der Inkubation wurden dem Urin 50 µL Wasser
zugesetzt. In ein 10 mL Probengefäß wurden 1,0 g NaCl eingewogen, 100 µL
Phosphorsäure 85 % und ein Rührfisch hinzugefügt. Der behandelte Urin wurde
hinzugegeben und das Probengefäß wurde luftdicht verschlossen. Verluste beim
Transferieren des Urins wurden nicht beobachtet. Nach 25minütigem Inkubieren bei
2 Material und Methoden 73
80°C und gleichzeitigem Rühren mit 750 rpm, wurde die Faser in den Injektorblock
überführt und dort ebenfalls für 5 min desorbiert.
2.9.2 Validierung
Die Validierung der Methode wurde ebenfalls nach den unter Absatz 2.8
beschriebenen Kriterien vorgenommen.
2.9.2.1 Spezifität
Die Spezifität der Methode wurde an Hand von zu unterschiedlichen Zeitpunkten
gesammelten Urinproben von 6 Probanden, sowie am Tagesprofil des Urins von 3
Probanden belegt. Im Urin aller Probanden befand sich zu jedem Zeitpunkt zur
Retentionszeit des Thymols ein Peak, der aber keiner nennenswerten tageszeitlichen
Schwankung unterlag. Je nach Proband und Sammelzeitpunkt lag die Peakfläche im
Bereich von 2777 bis 6331 Flächeneinheiten.
Die Bestimmungsgrenze wurde somit auf 10,2 ng⋅mL-1 festgesetzt. Dies entsprach
durchschnittlich 15500 Flächeneinheiten und lag damit deutlich über dem durch den
Störpeak hervorgerufenen Signal. Unter den o.g. Bedingungen ergaben sich die in
Abb. 2.12 und Abb. 2.13 dargestellten Chromatogramme.
2 Material und Methoden 74
Abb. 2.12 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben) und einer mit Thymol versetzten Urinprobe (unten).
Abb. 2.13 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben) und einer 0-Wert Urinprobe (unten).
← Thymol
← Thymol
← Thymol
2 Material und Methoden 75
2.9.2.2 Einstellung des Gleichgewichtszustandes
Das Peakflächen-Zeitprofil für Thymol (101,8 ng⋅mL-1) bei einer Temperatur von 80°C
ist in Abb. 2.14 dargestellt. Die ermittelte optimale Expositionsdauer lag damit bei
25 min.
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 10 20 30 40 50 60 70
Zeit [min]
Peak
fläch
e
Abb. 2.14 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 80°C, MW aus 2 Messungen.
2.9.2.3 Kalibrierfunktion: Linearität und Bestimmungsgrenze
Linearität und Bestimmungsgrenze wurden, wie unter Absatz 2.8.1.5 beschrieben, im
Bereich von 10,2 bis 219,0 und von 164,25 bis 755,0 ng⋅mL-1 bestimmt (Tab. 2.13).
Im Gegensatz zur Plasmaanalytik wurde hier auf den Zusatz eines Internen
Standards verzichtet, da Reproduzierbarkeit und Richtigkeit der Methode auch ohne
Internen Standard zufriedenstellende Ergebnisse lieferten. In Abb. 2.15 und Abb.
2.16 sind exemplarisch die beiden den Arbeitsbereich abdeckenden Kalibriergeraden
dargestellt. Tab. 2.13 zeigt die Ergebnisse der ermittelten Kalibrierfunktionen. Die
Bestimmungsgrenze lag bei 10,2 ng⋅mL-1.
Im Zuge der Urinprobenauswertung zeigte sich, daß ein kleinerer Arbeitsbereich von
10,2 bis 328,5 ng.mL-1 ausreichend war. Im folgenden wurde mit nur einer
Kalibrierfunktion im genannten Bereich gearbeitet .
2 Material und Methoden 76
0
50000
100000
150000
200000
250000
0 50 100 150 200 250
Konzentration Thymol [ng.mL-1]
Peak
fläch
e
Abb. 2.15 Kalibriergerade für den unteren Konzentrationsbereich des Arbeitsbereiches.
0100000200000300000400000500000600000700000
0 200 400 600 800
Konzentration Thymol [ng.mL-1]
Peak
fläch
e
Abb. 2.16 Kalibriergerade für den oberen Konzentrationsbereich des Arbeitsbereiches.
Tab. 2.13 Parameter der Kalibrierfunktionen für die Bestimmung von Thymol im Urin.
Lauf Steigung Achsenabschnitt R2
10,95 bis 219,0 ng.mL-1 1 857,82 5755,51 0,99795164,25 bis 755,0 ng.mL-1 736,37 22965,79 0,99304
10,95 bis 219,0 ng.mL-1 2 701,02 9845,12 0,99443164,25 bis 755,0 ng.mL-1 636,94 19511,77 0,99044
10,95 bis 219,0 ng.mL-1 3 635,011 8638,99 0,99233164,25 bis 755,0 ng.mL-1 641,37 11964,06 0,99001
Konzentrationen: 10,95; 54,75; 109,5; 164,25; 219; 328,5; 438; 547,5; 755 ng.mL-1
2 Material und Methoden 77
2.9.2.4 Richtigkeit und Wiederholpräzision
Die Bestimmung von Präzision und Richtigkeit wurde analog zu Absatz 2.8.1.6
durchgeführt. Die erzielten Werte sind in Tab. 2.14 und Tab. 2.15 dargestellt. Der
Variationskoeffizient, sowie der relative Fehler waren für die mittlere und hohe
Konzentration < 15 %, für die Bestimmungsgrenze < 20 %.
Tab. 2.14 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der Validierung („intra-day precision“).
Konzentration Tag MW CV RE n[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]
10,95 1 10,89 10,70 -0,52 52 8,83 7,21 -19,353 8,83 19,38 -19,33
219,0 1 215,61 2,93 -1,55 52 226,67 7,03 3,503 202,74 3,64 -7,42
547,5 1 510,35 2,41 -6,79 52 485,53 10,80 -11,323 559,82 5,95 2,25
Tab. 2.15 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der Validierung („between-day precision“), ermittelt aus den Mittelwerten der „intra-day precision“.
Konzentration MW CV RE[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]
10,95 9,52 12,50 -13,07
219,0 215,01 5,57 -1,82
547,50 518,57 7,29 -5,28
2 Material und Methoden 78
2.9.2.5 Stabilität
Stabilität der Urinproben
Wie in Absatz 2.8.1.7 für die Plasmaproben beschrieben, wurde ebenfalls die
Stabilität der Urinproben überprüft. Auch hier war über den Zeitraum von 12 Wochen
keine Abnahme der Ausgangskonzentration zu verzeichnen .
Tab. 2.16 Stabilität der Thymol-Konjugate im Urin bei Lagerung bei -20°C. Die Werte entsprechen jeweils den Mittelwerten aus 2 Messungen, Gehalt in [%].
Woche 0 Woche 2 Woche 4 Woche 6 Woche 12
100 101,43 100,56 99,08 100,3
Stabilität der Urinproben im Autosampler
Nach 24stündiger Wartezeit der Urinproben im Autosampler mit einer Konzentration
von 109 ng⋅mL-1 zeigte sich, daß der Thymolgehalt während der Zeit im Autosampler
nicht abnahm (Tab. 2.17). Die genauen Daten sind in Tab. 8.5 im Anhang aufgeführt.
Tab. 2.17 Stabilität der Urinproben im Autosampler (n=4).
Zeit [h] MW SD
[ng.mL-1] [ng.mL-1]
0 119,96 12,99
24 122,54 5,39
2 Material und Methoden 79
2.9.2.6 Qualitätssicherung während der Probenmessung
Es wurden Urinproben von 12 Probanden in 5 Analysenserien analysiert. Die
Ergebnisse der Messungen sind im Anhang (Tab. 8.6 und Tab. 8.7) aufgeführt.
Kalibrierfunktionen
Durch die begrenzte Lebensdauer der SPME-Fasern wurde für jede Analysenserie
(Urinproben von 2-3 Probanden) eine neue Faser eingesetzt und mit jeder
Analysenserie 9 bzw. 6 Kalibrierproben (Urinproben mit Thymol versetzt) zur
Erstellung der Kalibriergeraden analysiert (SHAH et al., 1992; BIOANALYTICAL METHODS
VALIDATION, 1998). Wie in Absatz 2.9.2.3 erwähnt, wurde im Laufe der
Probenauswertung der Arbeitsbereich verkleinert und mit einer Kalibrierfunktion von
10,2 bis 328,5 ng.mL-1 gearbeitet. Die Kalibrierfunktionen für Thymol waren alle linear
im jeweiligen Konzentrationsbereich. Die Korrelationskoeffizienten lagen für den
unteren Konzentrationsbereich zwischen 0,99476 und 0,99850, für den oberen
Konzentrationsbereich zwischen 0,97537 und 98155 und für die Kalibrierung im
verkleinerten Arbeitsbereich zwischen 0,98724 und 0,99301. Die Angaben zu den
Kalibrierfunktionen befinden sich im Anhang (Tab. 8.6).
Qualitätskontrollproben
Zur Kontrolle des Ablaufes jeder Analysenserie wurden als Qualitätskontrollproben
(QCs) mit Thymol versetzte Urinproben eingesetzt. Anzahl und Thymolkonzentration
der Proben wurden wie unter 2.8.1.8 beschrieben festgelegt. Da jedoch die Anzahl
der Proben pro Sequenz z.T. erheblich geringer waren als die der Plasmaproben,
wurde die Anzahl der QCs bei geringerem Probenumfang der Sequenz auf 3
reduziert. Im Zuge der Verkleinerung des Arbeitsbereiches wurden die
Konzentrationen der QCs entsprechend angepaßt. Die entsprechenden
Akzeptanzkriterien wurden, wie unter 2.8.1.8 aufgeführt, beibehalten und erfüllt. Die
jeweiligen Ergebnisse der QCs finden sich im Anhang, Tab. 8.7.
2 Material und Methoden 80
2.9.2.7 Wiederfindung
Um festzustellen, welcher Anteil des Analyten (Thymol) durch die SPME-Fasern aus
der Urinprobe extrahiert wurde, bestimmte man die Wiederfindung. Dabei wurde wie
unter Absatz 2.8.1.9 beschrieben vorgegangen. Die Wiederfindung bei 3
Konzentrationen sind in Tab. 2.18 dargestellt.
Tab. 2.18 Wiederfindung für verschiedene Konzentrationen von Thymol aus humanem Urin für Headspace-Festphasenmikroextraktion. aufgegebene Menge bzw. Menge pro mL Urin [ng]
10,95 219 547,5
Wiederfindung [%] 24,9 ± 0,67 16,9 ± 1,3 15,24 ± 0,5
Variationskoeffizient [%] 10,9 7,9 3,3
2.9.2.8 Strukturabsicherung von Thymol im Urin nach enzymatischer Spaltung mittels GC-MS
Die Strukturabsicherung für Thymol nach enzymatischer Spaltung im Urin im
Rahmen der Hauptstudie erfolgte mit der manuellen Festphasenmikroextrak-
tionsmethode (80°C, 750 rpm, 25 min Expositionszeit), da die Umrüstung des GC mit
dem Combi-PAL Autosampler nicht durchführbar war. Die anderen Parameter
wurden wie in Absatz 2.9 beschrieben beibehalten.
Die Ionisierung erfolgte mit 70 eV. Die Spektren wurden sowohl im TIC
(Totalionenstrom) als auch im SIM Modus aufgenommen (Abb. 8.3 und Abb. 8.4 im
Anhang). Die prozentualen Verhältnisse der entsprechenden Fragmente wichen
kaum von denen der Referenzsubstanz ab (Tab. 8.16).
2 Material und Methoden 81
2.10 Synthese von Thymolglucuronid als Referenzsubstanz
Die Synthese des Thymolglucuronides (Abb. 2.17) erfolgte durch die Übertragung
von Glucuronsäure auf Thymol mit Hilfe des Enzyms Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-
Transferase.
OHO
OHOH
HOOCO
Abb. 2.17 Thymolglucuronid.
Zunächst wurden folgende Lösungen hergestellt:
A. 1000 mM Tris HCl Puffer, pH 8, 37°C
B. 30 mM Uridin-5`-Diphosphoglucuronsäure (UDPGA)
C. Thymol, 21,9 mg in EtOH zu 10 mL gelöst
D. 1000 mM Magnesiumchlorid
E. 10 % (m/V) Bovines Serum Albumin
F. 200 mM 2-Mercaptoethanollösung
G. Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-Transferase, Enzymlösung, 100-200 mg/mL
H. EtOH unvergällt
Die Lösungen (Ausnahme Lsg.C) wurden alle mit Nanopur-Wasser hergestellt.
2 Material und Methoden 82
Durchführung
Folgende Reagenzien wurden in einem geeigneten Reaktionsgefäß vereinigt:
Nanopur-Wasser: 17,00 mL
Reagenz A: 20,00 mL
Reagenz C: 2,0 mL
Reagenz D: 3,0 mL
Reagenz E: 20,00 mL
Reagenz F: 1,00 mL
Das Reaktionsgemisch wurde auf 37°C gebracht und auf pH 8 eingestellt (HCl 0,1 M
oder NaOH 0,1M).
6,3 mL des o.g. Reaktionsgemisches wurden mit 88 µL der Enzymlösung versetzt
und ebenfalls auf 37°C gebracht, anschließend wurden 211 µL Reagenz B zugesetzt
und für 60 min. bei 37°C inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen, wurden jeweils
500 µL des Reaktionsansatzes zu 1 mL EtOH gegeben. Nach Abzentrifugieren der
gefällten Proteine befand sich die glucuronidierte Substanz im Überstand.
Das Reaktionsgemisch wurde vor Zugabe der Enzymlösung in 2 Aliquots geteilt, um
1 Aliquot ohne Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-Transferase als Vergleich zu
untersuchen. Der Überstand wurde per HPLC-PDA analysiert, um den Ablauf bzw.
das Ergebnis der enzymatischen Reaktion zu überwachen.
Als Fließmittel dienten A: Phosphorsäure, pH 2 und B: Methanol. Der Gradient, der
bei einem Fluß von 1 mL⋅min-1 die Trennung des Thymolglucuronides von Thymol
ermöglichte, ist in Tab. 2.19 abgebildet.
2 Material und Methoden 83
Tab. 2.19 Gradient zur Trennung von Thymol und Thymolglucuronid. t [h] Fließmittel A [%]
0 100 Isokratisch bis
3,6 65 linear bis
5,6 65 isokratisch bis
10 50 linear bis
12 50 isokratisch bis
20 40 linear bis
21,2 40 isokratisch bis
30 15 linear bis
35 15 isokratisch bis
38 0 linear bis
39,2 0 isokratisch bis
55 100 linear bis
56,2 100 isokratisch bis
65 Ende
Da Thymol ein Absorptionsmaximum λmax=274 nm besitzt, wurde bei 274 nm
detektiert. Es zeigte sich, daß sich nach einer Stunde Inkubationsdauer die
Peakfläche des Thymols wesentlich verringert hatte, während ein neuer Peak mit
kürzerer Retentionszeit entstand (Abb. 2.18).
Abb. 2.18 Chromatogramme des Reaktionsgemisches ohne (schwarz) und mit Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-Transferase (rot) nach 60minütigem Inkubieren bei 37°C.
23.571 31.368Time (min)
2 Material und Methoden 84
Der neu entstandene Peak zeigte ein dem Thymol sehr ähnliches UV-
Absorptionsspektrum. Das Absorptionsmaximum für Thymol lag bei λmax=274 nm,
das des neu entstandenen Peaks bei λmax=270 nm (1. Ableitung der UV-
Absorptionsspektren im Anhang, (Abb. 8.5)). Diese hypsochrome Verschiebung
könnte dem Verlust der freien OH-Funktion zuzuschreiben sein. Zudem eluierte die
neu entstandene Verbindung früher, d.h. sie war hydrophiler als Thymol, was durch
das Anfügen der Glucuronsäure erreicht wurde.
Die Struktur des Thymolglucuronides wurde per LC-MS/MS abgesichert. Das Molion
[M – H]¯ = 325 amu wurde mittels SRM zu folgenden Tochterionen fragmentiert: 307
(Wasserverlust), 175 (Glucuronsäure), 149 (Thymol) und 113. Das MS bzw. MS/MS-
Spektrum findet sich im Anhang, Abb. 8.6.
2 Material und Methoden 85
2.11 Pharmakokinetische Analysen
2.11.1 Nichtkompartiment Analyse
Die nichtkompartimentelle Analyse wurde mit Hilfe von Microsoft Excel 97
durchgeführt. Die Berechnung der pharmakokinetischen Kenndaten wurde wie folgt
vorgenommen (DERENDORF und GARRETT, 1987):
Die terminale Eliminationskonstante ke wurde jeweils aus einem semi-
logarithmischen Graphen der Thymol-Plasmakonzentrationen gegen die Zeit
ermittelt. Mittels linearer Regression durch die letzten 4 Datenpunkte (siehe
individuelle Graphen, Abb. 8.10) ergab sich ke als ke= - Steigung⋅2,303.
t ½ (Eliminationshalbwertszeit) = ln 2/ke
AUC cum (area under the curve) wurde aus dem Konzentrations-Zeitverlauf mit Hilfe der
sog. Trapezregel von t=0 bis t=t last berechnet
AUC last (terminaler Flächenabschnitt) wurde berechnet als Clast/ke
AUC tot Summe aus AUC cum und AUC last
% AUC last prozentualer Anteil des terminalen Flächenabschnittes an der Gesamtfläche:
% AUC last= (AUC last * 100)/(AUC cum + AUC last)
AUMC cum (area under the first moment curve) wurde aus dem Produkt von
Plasmakonzentration und Zeit gegen die Zeit von t=0 bis t=t last mit Hilfe der
Trapezregel berechnet: (c1 * t1 + c2 * t2) * (t2 – t1)/2
AUMC last berechnet als:(clast * tlast)/ke + (c last/ke2)
AUMC tot ist die Summe aus AUMC cum und AUMC last
MRTabs (mean residence time after extravascular administration) wurde berechnet als:
MRT abs=AUMC tot/AUC tot
ka wurde erhalten aus der Beziehung tmax=ln(ka/ke)/ka-ke) unter Verwendung der
Excel Solver Funktion
MAT (mean absorption time) wurde berechnet nach: MAT=1/ka
Cl/f (Clearance/bioverfügbarer Anteil) berechnet nach: Cl/f=D/AUC tot
Vdss/f (Verteilungsvolumen im Steady-State-Zustand/bioverfügbarer Anteil berechnet
nach: Vdss/f =[(f * D * AUMC tot)/AUC tot2] – (f * D)/(AUC tot * ka)
Vdarea/f (Verteilungsvolumen im Pseudo-Steady-State-Zustand/bioverfügbarer Anteil
berechnet nach: Vdarea/f = CL/f / ke
2 Material und Methoden 86
2.11.2 Kompartiment Analyse
Die kompartimentelle Analyse wurde mit Hilfe von Kinetika 2000 Version 3.0
(InnaPhase Corporation, Philadelphia, USA) durchgeführt. Die durch die Software
vorgegebenen pharmakokinetischen Parameter sind im folgenden definiert. Für die
zugrunde liegenden Berechnungen siehe Tab. 8.8 im Anhang.
Ccalc berechnete Konzentration
Residuals Residuale
Weight Wichtung
Weighted Res. gewichtete Residuale
ka Absorptionskonstante
Tlag Resorptionsverzögerungszeit
Vc Volumen im zentralen Kompartiment
ke Eliminationskonstante vom zentralen Kompartiment
k12 Transferkonstante vom zentralen ins periphere Kompartiment
k21 Transferkonstante vom peripheren ins zentrale Kompartiment
AUC partielle Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve
AUMC partielle Fläche unter der Moment Kurve
MRT mittlere Verweildauer
Lz kleinste (langsamste) Eliminationskonstante
Cmax calc berechnete maximale Plasmakonzentration
tmax calc Zeitpunkt der berechneten maximalen Plasmakonzentration
A Koeffizient
Alpha Exponent
B Koeffizient
Beta Exponent
Tabs Resorptionsdauer
t ½ ka Resorptionshalbwertszeit
t ½ alpha Eliminationshalbwertszeit von Alpha
t ½ beta Eliminationshalbwertszeit von Beta
t ½ Lz Eliminationshalbwertszeit assoziiert mit der terminalen Steigung
t ½ ke Eliminationshalbwertszeit von ke
Vss apparentes Verteilungsvolumen im Steady State
Vz apparentes Verteilungsvolumen während der terminalen Phase (Lz)
Cl Gesamtclearance
3 Ergebnisse 87
3 Ergebnisse
3.1 Analytik der Plasma- und Urinproben vor enzymatischer Spaltung der Konjugate
Wie in Absatz 1.4 ausgeführt, wurde aus analytischen Gründen der
Gesamtthymolgehalt nach enzymatischer Spaltung der Konjugate bestimmt. Die
pharmakokinetische Auswertung auf dieser Basis war jedoch nur dann zulässig,
wenn der Zusammenhang zwischen den im Plasma bzw. im Urin vorliegenden
Konjugaten und dem per HS-SPME bestimmten Gesamtthymolgehalt bekannt war.
Deshalb wurde die Beziehung der detektierten Thymolkonjugate zum
Gesamtthymolgehalt nach enzymatischer Hydrolyse untersucht. Für die LC-MS/MS
Analysen wurden exemplarisch Plasma- (tmax bzw. t=0 bis t=5 h) und Urinproben
(cmax bzw. t=0 bis t=24 h) von zwei verschiedenen Probanden herangezogen.
Zusätzlich zu Proben nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP wurden jeweils
auch Proben nach Einnahme von 10 Tabletten untersucht, um zu gewährleisten, daß
die Nachweisgrenze nicht den limitierenden Faktor bei den Messungen darstellen
würde.
Plasma
Im Plasma konnte sowohl nach Einnahme einer als auch nach 10 Tabletten
Bronchipret®TP nur Thymolsulfat detektiert werden (Abb. 3.1). In der Ionenspur
wurde Thymolsulfat mit einer Masse von 229 ([M - H]¯) detektiert. Das Molion
[M - H]¯ = 229 amu (ESI negativ) wurde mittels SRM fragmentiert und im MS/MS-
Spektrum sind die typischen Tochterionen 211 (Wasserverlust), 201, 165 (Verlust
von SO2), 149 (Thymol) und 80 (SO3-) zu finden, Abb. 8.7.
Der Frage, ob neben Thymolsulfat auch unkonjugiertes Thymol im Plasma vorlag,
wurde ebenfalls nachgegangen. Oberhalb einer Bestimmungsgrenze von 1,4 ng⋅mL-1
wurde mit der in Absatz 2.7.2 beschriebenen Methode kein freies Thymol detektiert.
3 Ergebnisse 88
R T : 0 . 0 0 - 3 5 . 0 0 S M : 1 5 B
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5T i m e ( m i n )
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
3 3 . 1 2 N L :1 . 3 7 E 6B a s e P e a k m / z = 1 4 8 . 0 0 - 1 5 0 . 0 0 +2 2 8 . 0 0 - 2 3 0 . 0 0 +3 2 4 . 0 0 - 3 2 6 . 0 0 M S P l a s m a G 0
R T : 0 . 0 0 - 3 5 . 0 0 S M : 1 5 B
0 5 1 0 1 5T i m
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
T h y m o l - s u l p h a t e
1 5 . 0 1
3 3 . 0 5
N L : 9 . 2 2 E 5B a s e P e a k m / z = 1 4 8 . 0 0 - 1 5 0 . 0 0 +2 2 8 . 0 0 - 2 3 0 . 0 0 +3 2 4 . 0 0 - 3 2 6 . 0 0 M S I C I S P l a s m a G 1 a
R T : 0 . 0 0 - 3 5 . 0 0 S M : 1 5 B
0 5 1 0 1 5T i m
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
T h y m o l - g l u c u r o n i d e
1 3 . 0 0
1 5 . 2 1
Abb. 3.1 IonenspurchromatogrammEinnahme einer Tablette BronchiprTablette Bronchipret®TP mit Thymo
Thymolglucuronid →
← Thymolsulfat2 0 2 5 3 0 3 5e ( m i n )
2 0 2 5 3 0 3 5e ( m i n )
T h y m o l - s u l p h a t e
3 2 . 9 5
N L : 1 . 0 3 E 6B a s e P e a k m / z = 1 4 8 . 0 0 - 1 5 0 . 0 0 +2 2 8 . 0 0 - 2 3 0 . 0 0 +3 2 4 . 0 0 - 3 2 6 . 0 0 M S I C I S P l a s m a G 1 B s p i k e
e (neg. LC-ESI) von 0-Wert Plasma (oben), nach et®TP (mitte) und Plasma nach Einnahme einer lglucuronid versetzt (unten).
← Thymolsulfat
3 Ergebnisse 89
Der Konzentrations-Zeitverlauf des Thymolsulfates entsprach dem Verlauf des
Gesamtthymolgehaltes, der nach enzymatischer Behandlung der Plasmaproben per
HS-SPME ermittelt wurde (Abb. 3.2) (siehe Absatz 3.3.1). Die Abwesenheit freien
Thymols, die Ergebnisse der LC-MS Messungen, sowie der parallele Verlauf des
enzymatisch freigesetzten Thymols mit dem des Thymolsulfates deuteten darauf hin,
daß Thymol nur in Form einer Verbindung – nämlich als Thymolsulfat bioverfügbar
war.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6
Zeit [h]
Abb. 3.2 Konzentrations-Zeit-Verlauf des Gesamtthymolgehaltes nach enzymatischer Spaltung mittels HS-SPME ( ) und des per LC-MS ermittelten Thymolsulfates (�). Beschriftung der Y-Achse: : cp [ng⋅mL-1]; �: Thymolsulfat [Peakfläche/250000], 1 Proband.
Urin
Im Urin konnten sowohl nach Einnahme einer als auch nach 10 Tabletten
Bronchipret®TP beide Phase-II-Metabolite - Thymolsulfat und Thymolglucuronid -
detektiert werden (Abb. 3.3). Thymolglucuronid wurde in der Ionenspur mit 325 amu
([M - H]¯) detektiert (ESI negativ). Das MS/MS-Spektrum des Molions [M - H]¯ = 325
amu zeigt die typischen Tochterionen 307 (Wasserverlust), 175 (Glucuronsäure), 149
(Thymol) und 113, Abb. 8.8. Diese sind auch im Vergleich mit dem Spektrum der
Referenzsubstanz, Abb. 8.6 zu erkennen. Die Zuordnung des Thymolsulfatpeaks
erfolgte wie für das Plasma beschrieben, Abb. 8.9. Das Verhältnis der Peakflächen
3 Ergebnisse 90
der beiden Verbindungen blieb in den verschiedenen Sammelintervallen konstant
(Abb. 3.4) und glich dem Verlauf des mit SPME bestimmten Ausscheidungsmusters
an Gesamtthymol nach enzymatischer Spaltung (siehe Abb. 3.11). Freies Thymol
konnte im Urin oberhalb einer Bestimmungsgrenze von 2,1 ng⋅mL-1 mit der in Absatz
2.7.3 beschriebenen Methode ebenfalls nicht detektiert werden.
R T : 0 . 0 0 - 3 5 . 0 0 S M : 1 5 B
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5T i m e ( m i n )
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
1 3 . 0 9
1 2 . 8 21 5 . 3 3
1 1 . 7 91 1 . 6 8
N L : 1 . 3 6 E 5B a s e P e a k m / z = 1 4 8 . 0 0 - 1 5 0 . 0 0 +2 2 8 . 0 0 - 2 3 0 . 0 0 +3 2 4 . 0 0 - 3 2 6 . 0 0 M S I C I S U r i n E R I I I 1 . 0
R T : 0 . 0 0 - 3 5 . 0 0 S M : 1 5 B
0 5 1 0 1 5T i m
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
T h y m o l - s u l p h a t e
T h y m o l - g l u c u r o n i d e
1 5 . 2 7
1 2 . 7 4
N L : 2 . 2 3 E 6B a s e P e a k m / z = 1 4 8 . 0 0 - 1 5 0 . 0 0 +2 2 8 . 0 0 - 2 3 0 . 0 0 +3 2 4 . 0 0 - 3 2 6 . 0 0 M S I C I S U r i n E R I I I 1 . 1
Abb. 3.3 Ionenspurenchromatogramnach Einnahme von 10 Tabletten Br
← Thymolsulfat
Thymolglucuronid →
2 0 2 5 3 0 3 5e ( m i n )
me (neg. LC-ESI) von 0-Wert Urin (oben) und onchipretTP (unten).
3 Ergebnisse 91
0
50
100
150
200
250
300
350
3 6 9 14Zeit [h]
Peak
fläch
e/15
0000
00
ThymolsulfatThymolglucuronid
Abb. 3.4 Kumulative renale Ausscheidung von Thymolsulfat und Thymolglucuronid, 1 Proband.
3 Ergebnisse 92
3.2 Ergebnisse der Pilotstudien
3.2.1 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der Konjugate
nach Applikation einer Tablette BronchipretTP
Die Plasmaproben der Pilotstudien wurden mit der unter Absatz 2.4 beschriebenen
Methode analysiert. Zunächst stand die Ermittlung des notwendigen Meßzeitraums
für die geplante Hauptstudie im Vordergrund.
Die Resorption von Thymol fand offenbar in den oberen Darmabschnitten statt, denn
schon nach 10 bis 20 min war Thymolsulfat im Plasma detektierbar. Nach 0,6 bis 3 h
wurden mit 64 bis 109 ng⋅mL-1 maximale Plasmaspiegel erreicht. Wie in Abb. 3.5 und
Abb. 3.6 erkennbar, fand kein rascher Anstieg der Plasmakonzentrationen statt.
Vielmehr stiegen sie langsam an und gingen in eine Plateauphase über, die erst
gegen Ende des Meßzeitraumes langsam abfiel. Die Eliminationsphase des Thymols
bzw. seiner Metabolite wurde offensichtlich in diesem Zeitraum der Probennahme
noch nicht erfaßt. Berechnungen pharmakokinetischer Kenndaten waren auf Grund
des zu kurzen Meßzeitraumes von 3,5 h zu diesem Zeitpunkt deshalb nicht möglich.
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4
Zeit [h]
Cp
[ng. m
L-1]
Proband 1Proband 2Proband 3Proband 4
Abb. 3.5 Individuelle Plasmakonzentrations-Zeitprofile für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP.
3 Ergebnisse 93
01020304050607080
0 1 2 3 4Zeit [h]
Cp
[ng. m
L-1]
Abb. 3.6 Plasmakonzentrations-Zeitprofil (Median, n=4) für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP.
3 Ergebnisse 94
3.2.2 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der Konjugate nach therapeutischer Dosierung
Um festzustellen, wie die therapeutische Dosierung (3 x 1 Tablette
BronchipretTP / Tag, 1 Woche lang) die Plasmaspiegel beeinflußte, wurden hier die
Plasmakonzentrations-Zeitprofile im Steady State aufgenommen. 12 Stunden nach
der letzten Tabletteneinnahme konnte Thymol im „0-Wert“ noch mit 35 bzw.
70 ng⋅mL-1 detektiert werden (Abb. 3.7). Nach Einnahme einer weiteren Tablette war
innerhalb der ersten Stunde ein Anstieg der Plasmakonzentrationen zu verzeichnen.
Danach stellten sich Plasmakonzentrationen auf die – wie auch nach Einnahme einer
Tablette beobachtete - Plateauphase ein. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, daß
Thymolsulfat über einen wesentlich längeren, als den bislang beobachteten Zeitraum
im Plasma detektierbar war.
0
2040
6080
100120
140160
0 1 2 3 4Zeit [h]
Cp
[ng. m
L-1]
Proband 1
Proband 2
Abb. 3.7State na
↑Individuelle Plasmakonzentrations-Zeitprofile für Thymolsulfat im Steady ch Einnahme einer Tablette BronchipretTP. ↑ : erneute Tabletteneinnahme.
3 Ergebnisse 95
3.2.3 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der Konjugate -
Einzeldosis BronchipretTP – verlängerter Meßzeitraum
Die Hinweise auf eine lange Eliminationsphase aus den beiden vorhergehenden
Pilotstudien, konnten mit dieser Studie bestätigt werden. Nach 1,8 h wurden mit
58 ng⋅mL-1 maximale Plasmaspiegel erreicht. Es zeigte sich die schon vorher
beobachtete Plateauphase, danach fielen die Plasmaspiegel zunächst rasch ab, um
dann nur noch langsam zu sinken (Abb. 3.8). Die sich aus den letzten 4
Datenpunkten des terminalen, linearen Abschnittes der Kurve ergebende
Halbwertszeit betrug 22,4 h. Thymolsulfat war nach Einnahme einer Tablette bis zu
52 h im Plasma detektierbar. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde der
Beobachtungszeitraum für die Hauptstudie angepaßt und bis t = 72 h ausgedehnt.
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 30 40 50 60
Zeit [h]
Cp
[ng. m
L-1]
Abb. 3.8 Plasmakonzentrations-Zeitprofil für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP, 1 Proband.
3 Ergebnisse 96
3.3 Ergebnisse der Hauptstudie
3.3.1 Plasmakonzentrationen nach enzymatischer Spaltung der Konjugate
nach Applikation einer Tablette BronchipretTP
Die Plasmaproben der Hauptstudie wurden mit der hierfür entwickelten,
automatisierten und validierten HS-SPME Methode analysiert (s. Absatz 2.8). Von
den ursprünglich 12 Probanden konnten nur 11 zur Auswertung herangezogen
werden. Bei einem Probanden (Proband E) wurden bereits im 0-Wert (Plasma und
Urin) sehr hohe Thymolkonzentrationen festgestellt, so daß dieser bei der
Berechnung von Mittelwerten und Median nicht mit einbezogen wurde.
Nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP wurde Thymol frühzeitig resorbiert.
Bereits nach 20 min war bei 4 Probanden Thymolsulfat detektierbar. Bei 6
Probanden war Thymolsulfat innerhalb von 30 min detektierbar, bei einem
Probanden waren Plasmaspiegel erst 1,5 h nach Tabletteneinnahme detektierbar
(Abb. 3.9). Die Plasmakonzentrations-Zeitprofile waren sehr homogen, was sich
auch in den geringen Standardabweichungen der einzelnen Abnahmezeitpunkte
ausdrückte (Abb. 3.10). Maximale Plasmaspiegel (cmax = 93,1±24,5 ng⋅mL-1) wurden
frühestens nach 50 min erreicht (tmax= 1,97±0,77 h). Danach blieben die
Plasmaspiegel - wie bereits in den Pilotstudien beobachtet - für ca. 2 h auf einer
Plateauphase, um dann zunächst rasch und gegen Ende sehr langsam abzufallen.
Eine Übersicht über die mittleren Plasmakonzentrationen zum jeweiligen
Abnahmezeitpunkt ist in Tab. 3.1 gegeben. Die individuellen Daten jedes Probanden
finden sich im Anhang in Tab. 8.9, Tab. 8.10 und Tab. 8.11. Der kinetische Verlauf
der Plasmakonzentrationen war biphasisch, unterteilt in eine schnellere Verteilungs-
und eine langsamere Eliminationsphase (Abb. 3.10).
3 Ergebnisse 97
0
20
40
60
80
100
120
140
0 5 10 15 20 25 30 35 40Zeit [h]
cp [n
g. mL-1
]
Proband AProband BProband CProband DProband FProband GProband HProband IProband JProband KProband L
Abb. 3.9 Graphische Darstellung der individuellen Plasmakonzentrationen für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40Zeit [h]
Cp
[ng. m
L-1]
MWMedian
Abb. 3.10 Graphische Darstellung der mittleren und medianen Plasma-konzentrationen für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar, n=11.
3 Ergebnisse 98
Tab. 3.1 Thymolsulfat-Plasmakonzentrationen der Probanden A-D, F-L, MW=arithmetischer Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geometrisches Mittel.
T [h] MW SD Min Median Max GEO nCp [ng.mL-1] Cp [ng.mL-1] Cp [ng.mL-1] Cp [ng.mL-1] Cp [ng.mL-1] Cp [ng.mL-1]
0 0 0 0 0 0 _ _
0,25 11,85 15,21 0 0 38,72 24,39 50,5 34,52 23,25 0 32,29 76,11 32,29 100,75 53,40 34,62 0 43,97 122,41 51,78 10
1 61,13 38,37 0 55,90 125,82 58,34 101,5 69,41 33,92 6,04 62,42 125,39 56,78 112 82,81 19,82 52,73 90,04 110,87 80,50 11
2,5 82,06 18,98 53,31 79,19 113,87 80,04 113 77,93 17,93 51,76 80,39 104,33 75,95 11
3,5 71,20 19,10 45,26 67,87 107,66 68,95 114 66,41 17,01 43,62 62,06 94,37 64,45 115 55,69 18,23 28,79 55,25 98,16 53,20 116 45,08 14,04 24,17 45,87 66,57 42,91 117 37,67 13,16 24,46 37,01 67,32 35,82 118 34,06 11,83 20,04 30,34 54,51 32,30 119 29,92 10,06 17,20 28,50 48,33 28,42 11
10 27,10 9,25 16,30 23,30 39,67 25,66 1112 22,11 5,35 15,12 22,05 30,65 21,51 1114 20,44 6,14 13,40 18,34 34,54 19,72 1124 11,08 4,07 6,82 10,55 19,13 10,47 1131 4,12 4,14 0 4,96 10,18 7,99 638 2,08 3,70 0 0 10,11 7,41 3
3.3.2 Renale Elimination von Thymol in Form seiner Phase-II-Metabolite
Die Bestimmung des Thymols in Form seiner Phase-II-Metabolite mit intaktem
Thymolgrundgerüst erfolgte nach enzymatischer Spaltung wie in Absatz 2.9
beschrieben.
Bereits nach 24 h konnte Thymolsulfat bzw. Thymolglucuronid nicht mehr im Urin
nachgewiesen werden. Ein Großteil der renal eliminierten Menge wurde bereits
3 Ergebnisse 99
innerhalb der ersten 6 Stunden nach Applikation ausgeschieden (Abb. 3.11).
Individuelle Daten siehe Tab. 8.12 im Anhang.
0
5
10
15
20
25
3 6 9 14 24 31 38
Zeit [h]
% d
er D
osis
Abb. 3.11 Kumulative Urinausscheidung in % der verabreichten Dosis (MW+SD) von Thymol nach enzymatischer Spaltung der Konjugate (n=11).
Da die renale Elimination von Thymol bzw. seiner Konjugate bei allen Probanden
innerhalb der Urinsammelperiode von 31 h abgeschlossen war, konnte somit der
renal eliminierte prozentuale Anteil der verabreichten Dosis bestimmt werden. Der
mittlere, renal eliminierte prozentuale Anteil der Dosis mit intaktem
Thymolgrundgerüst betrug durchschnittlich 16,2 %. Die individuellen prozentualen,
renal eliminierten Anteile sind in Tab. 3.2 dargestellt.
Tab. 3.2 Renale Elimination von Thymol (in Form seiner Phase-II-Konjugate) in Prozent der applizierten Dosis (1,08 mg Thymol). MW=arithmetischer Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geo-metrisches Mittel.
A B C D E F G H I J K L MW SD Min Median Max GEO n
20,24 23,83 14,97 13,33 30,64 12,28 24,06 12,38 17,24 13,02 13,45 13,45 16,20 4,50 12,28 13,45 24,06 15,70 11
Proband
3 Ergebnisse 100
Pharmakokinetische Auswertung der Thymolkonzentrationen im Plasma nach
enzymatischer Spaltung der Konjugate
Basierend auf dem Ergebnis, daß Thymol im systemischen Kreislauf nur in Form
seines Phase-II-Metaboliten Thymolsulfat zirkulierte, wurde der nach enzymatischer
Hydrolyse des Plasma erhaltene Thymolgehalt zur pharmakokinetischen Auswertung
herangezogen.
Thymolsulfat-Plasmakonzentrationen konnten bei allen Probanden über einen
Zeitraum von mindestens 24 h bestimmt werden. Um die Eliminationsphase so exakt
wie möglich bestimmen zu können, wurden Peaks, die zwar unterhalb der
Bestimmungsgrenze von 8,1 ng⋅mL-1 lagen, aber dennoch detektiert werden konnten,
mit einbezogen. Jeweils der Wert, der zum ersten Mal unter dem LOQ von
8,1 ng⋅mL-1 lag, wurde als letzter Meßwert berücksichtigt.
3.3.3 Pharmakokinetik in Nichtkompartiment-Modellen
Die pharmakokinetischen Parameter der Nichtkompartiment-Analyse sind in Tab. 3.3
dargestellt. Die jeweiligen individuellen Plasmakonzentrations-Zeitprofile sind im
Anhang in Abb. 8.10 dargestellt, die entsprechenden Daten dazu in Tab. 8.13.
3 Ergebnisse 101
Tab. 3.3 Pharmakokinetische Parameter der Nichtkompartiment-Analyse (Definition der Parameter in Absatz 2.11.1); MW=Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geometrisches Mittel.
MW SD Min Median Max GEO n
cmax [ng/mL] 93,11 24,47 55,90 99,01 125,82 90,04 11
tmax [h] 1,97 0,77 0,80 2,03 3,13 1,81 11
ke [1/h] 0,069 0,009 0,054 0,070 0,084 0,069 11
t1/2 [h] 10,2 1,4 8,3 9,9 12,9 10,1 11
AUCcum [ng*h/mL] 837,3 278,5 456,7 835,8 1281,6 793,6 11
AUClast [ng*h/mL] 96,4 19,2 46,2 98,1 118,1 94,1 11
AUCtot [ng*h/mL] 963,5 274,1 608,6 943,8 1341,3 928,1 11
%AUClast 10,6 3,2 5,8 9,9 15,9 10,1 11
AUMCcum [h2*ng/mL] 7478,0 4246,1 2694,4 6626,9 15797,8 6435,0 11
AUMClast [h2*ng/mL] 4300,0 1125,3 2012,4 4294,6 6491,9 4146,0 11
AUMCtot [h2*ng/mL] 12062,0 3831,3 7965,7 10850,1 19808,9 11553,5 11
MRTabs [h] 12,6 2,1 8,1 12,5 15,2 12,4 11
solver tmax [h] 1,83 0,07 1,71 1,84 1,91 1,82 11
ka [1/h] 1,89 0,14 1,70 1,85 2,17 1,88 11
MAT [h] 0,53 0,04 0,46 0,54 0,59 0,53 11
MRTiv [h] 12,1 2,1 7,5 12,0 14,7 11,9 11
Dose [mg] 1,08
CLtot/f [L/h] 1,21 0,35 0,81 1,14 1,77 1,16 11
Vdss/f [L] 14,72 5,09 6,05 13,85 23,29 13,85 11
Vd area/f [L] 17,70 5,64 10,81 17,16 29,51 16,95 11
3.3.4 Pharmakokinetik in Kompartiment-Modellen
Die individuellen Plasmakonzentrations-Zeitkurven von Thymol wurden an ein
Zweikompartiment-Modell angepaßt. Nur die Plasmakonzentrations-Zeitkurve von
Proband L ließ sich besser mit einem Einkompartiment-Modell beschreiben. Die
Mittelwerte und Mediane der Plasmakonzentrationen wurden ebenfalls an ein
Zweikompartiment-Modell angepasst (Abb. 3.12 und Abb. 3.13). Die entsprechenden
3 Ergebnisse 102
Fits mit den dazugehörigen Ergebnissen finden sich im Anhang in Abb. 8.11 bzw.
Tab. 8.14.
Abb. 3.12 Graphische Darstellung des Fittings des Mittelwertes der Thymolsulfat- Plasmakonzentrationen.
Abb. 3.13 Graphische Darstellung des Fittings des Medians der Thymolsulfat- Plasmakonzentrationen .
3 Ergebnisse 103
Tab. 3.4 Pharmakokinetische Parameter der Kompartiment-Analyse (Definition der Parameter siehe Absatz 2.11.2) nach Anpassung des Mittelwertes und des Medianes an ein Zweikompartiment-Modell.
Mean Median
dose mg 1,08 1,08
ka [1/h] 0,69 0,62Tlag [h] 0,15 0,23Vc [L] 6,21 5,90ke [1/h] 0,21 0,22k12 [1/h] 0,27 0,24k21 [1/h] 0,28 0,17AUC [ng*h/mL] 813,19 824,95
AUMC [h2*ng/mL] 8628,61 10322,90MRT [h] 9,02 10,66
Lz [1/h] 0,09 0,07Cmax calc [ng/mL] 79,81 79,84tmax calc [h] 2,08 2,25
A [ng/mL] 117,21 145,41Alpha [1/h] 0,67 0,56
B [ng/mL] 56,58 37,47Beta [1/h] 0,09 0,07t ½ ka [h] 1,00 1,13
tabs [h] 4,99 5,63t ½ alpha [h] 1,04 1,24t ½ beta [h] 7,82 10,45t ½ Lz [h] 7,82 10,45t ½ ke [h] 3,24 3,13
Vz [L] 14,98 19,74
Cl [L/h] 1,33 1,31
Conc. Unit [ng/mL]
3 Ergebnisse 104
3.4 Pharmakokinetische Auswertung der Thymolkonzentrationen im Urin nach enzymatischer Spaltung der Konjugate
Wie in Absatz 3.3.2 gezeigt, wurde der Urin solange gesammelt, bis keine Thymol-
Konjugate mehr im Urin nachgewiesen werden konnte. Dies ermöglichte die
Berechnung verschiedener pharmakokinetischer Parameter an Hand der Urindaten.
Da U∞ bekannt war, ergab sich aus der Gleichung U U (1 e )tket= ⋅ −∞
− ⋅ durch
Umformen die folgende Gleichung (DERENDORF und GARRETT, 1987):
log(U Ut) logUk
2,303t
e∞ ∞− = −
Die graphische Darstellung dieser Gleichung bezeichnet man als Sigma-Minus-Plot.
In Abb. 8.12 sind die Sigma-Minus-Plots für die renale Elimination von Thymol
dargestellt. Die Eliminationshalbwertszeit wurde analog zu den Plasma-
konzentrations-Zeitkurven aus der jeweiligen Steigung der Geraden während der
terminalen Eliminationsphase ermittelt (Tab. 3.5).
Zur Bestimmung der renalen Clearance wurde die kumulative Thymolmenge (nach
enzymatischer Spaltung der Konjugate) im Urin (Ut cum) gegen die jeweilige
kumulative Fläche unter der Plasmaspiegelkurve (AUCt cum) aufgetragen. Die renale
Clearance wurde aus der Steigung der resultierenden Geraden ermittelt. Die
jeweiligen Plots finden sich im Anhang (Abb. 8.13). Die Ergebnisse sind in Tab. 3.6
dargestellt.
3 Ergebnisse 105
Tab. 3.5 Bestimmung der Eliminationshalbwertszeit aus den
jeweiligen Sigma-Minus-Plots. MW=Mittelwert (n=11),
SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert,
GEO=Geometrisches Mittel.
Tab. 3.6 Bestimmung der renalen Clearance aus den jeweiligen Clearance-
Plots. MW=Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung,
Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geometrisches Mittel.
Proband t1/2 [h]
A 5,83B 4,15C 3,89D 4,85E 5,54F 6,83G 5,33H 4,36I 3,80J 2,50K 3,78L 2,85
MW 4,38SD 1,27Min 2,50
Median 4,15Max 6,83GEO 4,21
n 11
Proband Cl ren [L/h]
A 0,321B 0,633C 0,148E 0,115D 0,209F 0,246G 0,493H 0,144I 0,200J 0,240K 0,181L 0,160
MW 0,271SD 0,156Min 0,144
Median 0,209Max 0,633GEO 0,240
n 11
4 Diskussion 106
4 Diskussion
4.1 Analytische Methoden
Da bei einer verabreichten Dosis von ca. 1 mg Thymol mit Plasmakonzentrationen im
unteren Nanogramm-Bereich zu rechnen war, waren entsprechend empfindliche und
selektive Verfahren notwendig, um Thymol nach internationalen Anforderungen an
die Validierung pharmakokinetischer Studien in biologischen Matrices quantifizieren
zu können.
Bei den in der Literatur beschriebenen analytischen Methoden zur Quantifizierung
von Komponenten Ätherischer Öle aus biologischen Matrices, wurde eine
Bestimmungsgrenze im unteren Nanogrammbereich nur durch aufwendige
Probenaufarbeitung erreicht, die aber für den Einsatz in der Routineanalytik
ungeeignet war. Die Headspace-Festphasenmikroextraktion stellte das Verfahren der
Wahl dar, da sie Probenaufarbeitung, Anreicherung und Probenaufgabe in einem
einzigen Schritt ermöglichte. Gekoppelt mit anschließender gaschromatographischer
Trennung und Detektion mittels FID, stand so ein ausreichend sensitives Meßsystem
zur Verfügung.
Auch im Hinblick auf die Entwicklung weiterer Methoden zur Durchführung von
Bioverfügbarkeits- bzw. pharmakokinetischen Studien wäre ein selektiveres
Meßsystem wie beispielsweise GC-MS bzw. LC-MS/MS wünschenswert gewesen.
Dadurch könnten vorhandene Metabolite bzw. im „Vielstoffgemisch Phyto-
pharmakon“ vorhandene Verbindungen untergeordneter Bedeutung ebenfalls
detektiert werden. Jedoch sind derartige Geräte auf Grund ihrer Kostenintensität
bislang nicht für die Routineanalytik zugänglich. Die durch den FID eingeschränkte
Selektivität bei der Durchführung der Routinemessungen wurde sowohl für Plasma
als auch für Urin durch die Strukturabsicherung per GC-MS ausgeglichen. Die
Identifizierung der Phase-II-Metabolite erfolgte ebenfalls exemplarisch per LC-
MS/MS.
Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Methoden zur Bestimmung von Thymol in
Plasma und Urin konnten nur durch die Automatisierung des Verfahrens nach
Entwürfen für internationale Richtlinien zur Validierung bioanalytischer Methoden
validiert werden (BIOANALYTICAL METHODS VALIDATION, 1998). Dies zeigte der
4 Diskussion 107
Vergleich mit der für die Pilotstudien entwickelten manuellen HS-SPME Methode, die
in Bezug auf die Parameter Präzision und Richtigkeit insuffizient war. Durch die
Automatisierung war eine bessere Einhaltung der Methodenparameter wie
Expositionszeit, Temperatur und Rühren gegeben, außerdem wurde so ein hoher
Durchsatz für die im Rahmen der Studie anfallenden Proben ermöglicht. Mit den
bislang kommerziell erhältlichen HS-SPME Geräten war jedoch nur das Schütteln
der Probe und nicht das Rühren möglich. Schütteln der Probe mit hoher Frequenz
war nur vor der Faserexposition möglich, wohingegen während der Exposition nur
mit geringer Frequenz geschüttelt werden konnte. Dies bedeutete jedoch eine
inakzeptable Verlängerung der Expositionszeit. Außerdem spritzte während des
Schüttelns Probenmaterial auf die Faser, was wiederum die Wiederfindung und die
Lebensdauer der Fasern erheblich beeinträchtigte. Insofern war also nur eine
ungenügende Anpassung der HS-SPME Parameter möglich, weshalb ein
zusätzliches Gerät (Magnet Mixer/Heater) entwickelt wurde, welches gleichzeitiges
Heizen und Rühren der Probe ermöglichte.
Daß die zur Routineanalytik entwickelte, automatisierte Methode schließlich zur
Durchführung der pharmakokinetischen Studie geeignet war, wurde durch das
Erfüllen der Validierungskriterien deutlich. Die Linearität der Methoden konnte sowohl
für die Plasma- als auch für die Urinanalytik im jeweiligen Arbeitsbereich gezeigt
werden. Die Expositionszeit der Fasern von 25 bzw. 35 min bis zum Erreichen des
Gleichgewichtszustandes lag in einem vernünftigen zeitlichen Rahmen, wenn man
berücksichtigt, daß die chromatographische Trennung ohnehin 55 min in Anspruch
nahm. Zur Bestimmung der Richtigkeit und Präzision wurde an jedem Tag jeweils
eine neue Faser eingesetzt, so daß man von einer inter-Faser Präzision sprechen
kann, wobei die „between-day precision“ trotzdem noch < 20 % bei der geringsten
getesteten Konzentration war. Die Peakflächen variierten z.T. erheblich zwischen
den einzelnen Fasern, obwohl diese derselben Charge entstammten. Deshalb wurde
jede neu verwendete Faser separat kalibriert. Die „between-day precision“ von knapp
20 % bei der geringsten Konzentration des Arbeitsbereiches konnte somit als
Hinweis auf die Bestimmungsgrenze bei dieser Konzentration angesehen werden.
Die geringe Wiederfindung von nur 5 % für die Bestimmung aus Plasma war evtl.
zum Teil auf den Zusatz des Enzyms zurückzuführen, welches für die Spaltung der
4 Diskussion 108
Phase-II-Konjugate unabdingbar war. Nach Zusatz des Enzyms war – während der
Validierung in mit Thymol versetzten Plasmaproben - eine erhebliche Abnahme der
Thymolpeakflächen zu beobachten, im Vergleich zu Proben ohne Enzymzusatz.
Dieser Effekt hätte unter Umständen ohne Ansäuern und Erhitzen gravierender
ausfallen können. Für Lidocain, das bei pH 9,5 zu 74 % an Plasmaproteine
gebunden war, wurde gezeigt, daß die Wiederfindung durch Ansäuern bedeutend
verbessert werden konnte (KOSTER et al., 2000). Auch in früheren Untersuchungen
konnte festgestellt werden, daß die hohe Proteinbindung von Antidepressiva und
Clozapin der limitierende Faktor für die Geschwindigkeit der Gleichgewichts-
einstellung und die Wiederfindung darstellte (ULRICH und MARTENS, 1997; ULRICH et
al., 1999). Durch Ansäuern < pH 1 und gleichzeitiges Erhitzen dürfte die
Plasmaproteinbindung zu einem erheblichen Teil reduziert worden sein.
Daß eine geringe Wiederfindung nicht notwendigerweise eine schlechte Präzision
zur Folge hat, zeigte der Vergleich der Validierungsparameter zu Präzision und
Richtigkeit von Plasma- und Urinanalytik. Obwohl sich der Einfluß der Matrix in
Bezug auf die Anwesenheit von Fetten und Proteinen im Plasma deutlich auf die
Wiederfindung auswirkte, (Wiederfindung aus Urin 16 %, aus Plasma 5 %)
unterschieden sich die Werte für Präzision und Richtigkeit nicht wesentlich.
Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit validierten automatisierten HS-SPME
Methoden erwiesen sich somit als geeignet zur routinemäßigen Analytik von Thymol
aus Plasma und Urin.
4 Diskussion 109
4.2 Metabolismus und Pharmakokinetik von Thymol
4.2.1 Metabolismus
Plasma
Im Plasma konnte nach Verabreichung einer Tablette Bronchipret®TP nur
Thymolsulfat detektiert werden. Selbst nach einmaliger Einnahme von 10 Tabletten
konnte kein Thymolglucuronid nachgewiesen werden. Auch die Untersuchung der
Meßzeitpunkte t=0 bis t=5 h auf Thymolglucuronid waren negativ. Ähnliches wurde
auch für das Phenol Creosol beobachtet. Nach oraler Verabreichung einer Mischung
aus Phenol, Guaiacol, p-Cresol und Creosol (je 15-32 mg) an Menschen, wurde für
Creosol ebenfalls die Bildung nur eines Phase-II-Metaboliten, nämlich des
Glucuronides beobachtet, während die anderen Verbindungen sowohl das Sulfat als
auch das Glucuronid bildeten (OGATA et al., 1995).
In Plasma, das mit enzymatisch synthetisiertem Thymolglucuronid versetzt und mit
derselben Methode aufgerbeitet wurde, war Thymolglucuronid jedoch detektierbar,
was darauf hindeutete, daß die verwendete Methode zur Bestimmung von
Thymolglucuronid im Plasma ausreichend selektiv war. Sollte das Plasma tatsächlich
Thymolglucuronid enthalten haben, das einer Bestimmung entgangen war, wäre
zumindest nach Einnahme von 10 Tabletten mit der Detektion des Glucuronides mit
der sehr sensitiven LC-MS/MS Methodik zu rechnen gewesen.
Die Abwesenheit des Thymolglucuronides könnte durch eine wesentlich höhere
Enzymaktivität hepatischer Sulfotransferase im Vergleich zu UDP-
Glucuronyltransferase zu erklären sein. In diesem Fall würden Sulfatierung und
Glucuronidierung konkurrieren und nur nach Verabreichung extrem höherer Dosen
würde Glucuronid gebildet werden (OGATA et al., 1995).
Freies Thymol wurde im Plasma nicht detektiert. Dies steht im Einklang mit den
Untersuchungen von Ogata et al., die trotz der erheblich höheren verabreichten
Dosen nur sehr geringe Mengen unkonjugierter Phenole im Plasma nachweisen
konnten (< 4 % von Cmax) (OGATA et al., 1995). Die vorliegenden Ergebnisse
belegen, daß nach Einnahme von BronchipretTP nicht Thymol, sondern
ausschließlich dessen Phase-II-Metabolit Thymolsulfat bioverfügbar war.
4 Diskussion 110
Urin
Im Urin konnte sowohl Thymolglucuronid als auch -sulfat bestimmt werden. Dies
bestätigte die Ergebnisse einer anderen Arbeitsgruppe. Nach oraler Applikation von
Thymol wurden sowohl im Urin von Menschen als auch im Urin von Ratten beide
Metabolite detektiert (TAKADA et al., 1979). Jedoch wurden diese Untersuchungen
ohne Strukturabsicherung per MS durchgeführt.
Für Phenol, i.v. an Mäuse verabreicht, wurden im Urin ebenfalls beide Phase-II-
Metabolite detektiert, mit Phenolsulfat als Hauptmetabolit. Mit steigender Dosis
verschob sich das Verhältnis von Sulfat zu Gunsten des Glucuronides (KENYON et al.,
1995). Auch für Phenol, Guaiacol, p-Cresol und Creosol wurde die Existenz beider
Phase-II-Metabolite im Urin bestätigt. Für alle Verbindungen wurde das Glucuronid
und mit Ausnahme des Creosols, das Sulfat detektiert (OGATA et al., 1995). Das
Verhältnis der Peakintensität von Thymolglucuronid zu -sulfat blieb zwischen den
verschiedenen Sammelintervallen konstant.
Freies Thymol wurde auch im Urin nicht detektiert. Nach oraler Applikation einer
wesentlich höheren Dosis des strukturell ähnlichen Menthols (500 mg), konnte
ebenfalls kein freies Menthol nachgewiesen werden (BELL et al., 1981). Weitere, mit
Menthol durchgeführte Studien konzentrierten sich auf die gesamte, mit
unverändertem Mentholgrundgerüst renal eliminierte Menge nach enzymatischer
Spaltung, so daß in diesem Punkt keine Vergleiche angestellt werden konnten
(SOMERVILLE et al., 1984; KAFFENBERGER und DOYLE, 1990). Unkonjugiertes Phenol,
Guaiacol, p-Cresol und Creosol wurden im Urin nur in geringen Mengen gefunden,
obwohl die verabreichten Dosen z.T. das 30fache der verabreichten Thymoldosis
betrugen (OGATA et al., 1995).
Die vorliegenden Daten zeigen, daß Thymolglucuronid trotz seiner Abwesenheit im
Plasma renal eliminiert wurde. Auch für andere Verbindungen (z.B. Probenecid)
konnte die Präsenz eines Metaboliten im Urin belegt werden, obwohl dieser im
Plasma nicht nachgewiesen werden konnte (VREE et al., 1992; VREE et al., 1993).
Im Falle des Thymols könnte Thymolsulfat im Nierengewebe durch die Aktivität von
Arylsulfatasen, die u.a. für menschliches Nierengewebe beschrieben wurde (MUNROE
und CHANG, 1987), gespalten werden. Darüber hinaus könnte Thymolsulfat
glomerulär filtriert, durch im Urin aktive Arylsulfatasen (CAVALLINI et al., 1980)
4 Diskussion 111
gespalten und im proximalen Tubulus rückresorbiert werden. Somit könnte durch
UDP-Glucuronyltransferasen die Glucuronidierung im Nierengewebe bzw. -epithel
erfolgen und Thymolglucuronid könnte durch die vielfältigen zur Verfügung
stehenden Transportmechanismen erneut in den proximalen Tubulus sezerniert
werden (DEKANT, 2001).
Obwohl die Leber als wichtigstes Organ bei der Biotransformation angesehen wird,
konnte an Hand von Modellsubstanzen gezeigt werden, daß Nierenmikrosomen
Glucuronyltransferaseaktivität besitzen (BRUNELLE und VERBEECK, 1996), bzw. sogar
einen wesentlich effizienteren Beitrag zur Glucuronidierung leisten als beispielsweise
Lebermikrosomen oder Mikrosomen der Darmschleimhaut (BRUNELLE und VERBEECK,
1996; SHIPKOVA et al., 2001). Die Glucuronidierung in der Niere wurde auch für
Morphin (MAZOIT et al., 1990) und für das dem Thymol strukturell sehr ähnliche
Propofol beobachtet (RAOOF et al., 1996). Außerdem konnte die Glucuronidierung
von Paracetamol (HART et al., 1980), 1-Naphtol (REDEGELD et al., 1988) und 4-
Dimethylaminophenol (ELBERS et al., 1980) mit Hilfe der perfundierten Rattenniere
nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnte auch eine unterschiedliche Aktivität
von UDP-Glucuronyltransferasen verschiedener Gewebe gezeigt werden (SHIPKOVA
et al., 2001). Für den o.g. Mechanismus würde auch das in der vorliegenden Arbeit
beobachtete, über die Zeit hinweg konstant bleibende Verhältnis von renal
eliminiertem Glucuronid und Sulfat sprechen.
4 Diskussion 112
4.2.2 Pharmakokinetik
Da im Plasma nur Thymolsulfat nachweisbar war, war die Berechnung der
pharmakokinetischen Parameter an Hand der sich nach enzymatischer Hydrolyse
der Plasmaproben ergebenden Plasmakonzentrations-Zeitverläufe gerechtfertigt.
Pilotstudien
Die Pilotstudien dienten in erster Linie der Bestimmung des Meßzeitraumes und der
Meßabstände für die Hauptstudie sowie der Entwicklung der Plasmaanalytik. Die
entwickelte Probenaufarbeitung erlaubte die Bestimmung von Thymol nach oraler
Applikation einer Tablette Bronchipret®TP nach enzymatischer Spaltung von
Thymolsulfat. Im Rahmen der Validierung dieser Methode stellte sich jedoch auf
Grund der Unzulänglichkeit der Parameter für Präzision und Richtigkeit heraus, daß
die Hauptstudie nur durch die Übertragung der Methode auf einen Autosampler
durchführbar war.
Bereits in den ersten beiden Pilotstudien zeichnete sich ab, daß Thymol (nach
enzymatischer Spaltung) wesentlich länger im Plasma detektierbar war als andere
Ätherisch-Öl-Verbindungen nach oraler Applikation (ZIMMERMANN et al., 1995;
LANGENECKERT, 1998). Im Zuge der dritten Pilotstudie wurden schließlich solange
Plasmaproben genommen, bis nach 48 h kaum noch Thymol detektierbar war.
Die exakte Erfassung der Eliminationsphase war für die Berechnung
pharmakokinetischer Parameter von großer Bedeutung. Um die Eliminationsphase
aller Probanden vollständig erfassen zu können, wurde auf Grund der Datenlage der
Pilotstudien für die Hauptstudie ein Meßzeitraum von 72 h festgelegt.
Hauptstudie
Die Plasmakonzentrations-Zeitverläufe waren sehr konsistent. Thymol wurde
offensichtlich frühzeitig resorbiert, was auch in der MAT von 0,5 h zum Ausdruck
kam. Dies deutete darauf hin, daß die Verbindungen hauptsächlich in den oberen
Darmabschnitten aufgenommen wurden. Dies wurde auch durch Versuche mit
Ileostomiepatienten bestätigt. Im Vergleich zu gesunden Probanden war die mit dem
Urin ausgeschiedene Mentholmenge bei den Ileostomiepatienten nur um 11 %
4 Diskussion 113
geringer (SOMERVILLE et al., 1984). Nach oraler Gabe von 1,8-Cineol und α-Pinen
waren die Verbindungen ebenfalls nach 10-30 min im Plasma detektierbar
(ZIMMERMANN et al., 1995; LANGENECKERT, 1998). Die geringe Molekülgröße, sowie
die lipophilen Eigenschaften der Ätherisch-Öl-Komponenten, dürften die Resorption
begünstigt haben.
Maximale mittlere Plasmakonzentrationen von 93,1 ng⋅mL-1 wurden nach 1,97 h
erreicht. Diese Werte waren vergleichbar mit denen anderer Ätherisch-Öl-
Komponenten nach oraler Applikation. 1,8-Cineol erreichte Cmax nach 1,25
(LANGENECKERT, 1998) bzw. 0,7 h und α-Pinen nach 1,75 h (ZIMMERMANN et al., 1995;
LANGENECKERT, 1998). Thymol konnte im Plasma über einen Zeitraum von 24 bis
38 h nach Applikation nachgewiesen werden. Andere Ätherisch-Öl-Komponenten,
oral appliziert, waren nach wesentlich kürzerer Zeit im Plasma nicht mehr
detektierbar (ZIMMERMANN et al., 1995; LANGENECKERT, 1998). Die lange
Verweildauer des Thymolsulfates drückte sich auch in der Eliminationshalbwertszeit
von 10,2 h aus. Hierfür fanden sich in der Literatur keine vergleichbaren Werte.
Andere Ätherisch-Öl-Komponenten wie α-Pinen und 1,8-Cineol sowie die von Ogata
et al. untersuchten Phase-II-Metabolite der verabreichten Phenole zeigten wesentlich
kürzere Eliminationhalbwertszeiten von 0,8 bis 5,8 h (OGATA et al., 1995;
ZIMMERMANN et al., 1995; LANGENECKERT, 1998).
Die langsame Ausscheidung des Thymols spiegelte sich ebenfalls in der geringen
Gesamtkörperclearance unter Berücksichtigung des bioverfügbaren Anteils (Cltot/f)
von nur 1,21 l⋅h-1 wider. Sie konnte je nach Bioverfügbarkeit zwischen 0,19
(mindestens 16 % des applizierten Thymols wurden resorbiert) und 1,21 l⋅h-1 (100 %
Bioverfügbarkeit) betragen. Das Verteilungsvolumen unter Berücksichtigung des
bioverfügbaren Anteils im Steady State (Vdss/f) bzw. im Pseudo Steady State
(Vdarea/f) war mit 14,7 bzw. 17,7 L ebenfalls klein und deutete darauf hin, daß die
Verbindungen bevorzugt im Extrazellulärraum vorlagen. Je nach bioverfügbarem
Anteil (16 % bzw. 100 %) resultierten Werte zwischen 2,2 und 14,7 bzw. 2,65 und
17,7 L. Ein Verteilungsvolumen von 2 L war jedoch extrem unwahrscheinlich, da das
bedeuten würde, daß die Substanz ausschließlich im Plasma vorlag, was aber durch
das biphasische Eliminationsprofil nicht bestätigt werden konnte. Deshalb war eine
Resorption von weit mehr als 16 % anzunehmen.
4 Diskussion 114
Für α-Pinen wurde nach dermaler Applikation eine Clearance von 14186 l⋅h-1
berechnet. Das Verteilungsvolumen/bioverfügbarer Anteil betrug 8425 L (SCHUSTER
et al., 1986). Damit schien sich α-Pinen - im Gegensatz zu Thymolsulfat - bevorzugt
im Gewebe aufzuhalten. Für die strukturell sehr ähnlichen Phase-II-Metabolite
(Glucuronid/Sulfat) von Phenol, Guaiacol und p-Cresol wurden Verteilungs-
volumina/bioverfügbarem Anteil (Vdarea/f) von 185/130, 100/396 und 58/74 L
bestimmt. Die Gesamtkörperclearance betrug 47/45, 33/108 und 33/61 L⋅h-1. Diese
Parameter deuteten darauf hin, daß sich diese Verbindungen ebenfalls bevorzugt im
Extrazellulärraum aufhielten und rasch eliminiert wurden. Die Verbindungen konnten
bis maximal 8 h nach Applikation im Plasma nachgewiesen werden.
Die individuellen Plasmakonzentrations-Zeitkurven wurden an ein Zweikom-
partiment-Modell angepaßt. Nur die Plasmakonzentrations-Zeitkurve eines
Probanden ließ sich besser mit einem Einkompartiment-Modell beschreiben. Ein
biphasischer Verlauf, unterteilt in eine Verteilungs- und Eliminationsphase, ließ sich
auch für die meisten anderen Ätherisch-Öl-Komponenten beobachten (KLEINSCHMIDT
et al., 1985; SCHUSTER et al., 1986; FALK und HAGBERG, 1990; JAGER et al., 1996).
Die Bestimmung des Anteils an renal eliminiertem Thymol erfolgte nach
enzymatischer Spaltung der Phase-II-Konjugate. Bereits nach 24 h konnten keine
Phase-II-Metabolite mehr im Urin nachgewiesen werden. Ein Großteil der renal
eliminierten Menge wurde bereits innerhalb der ersten 6 Stunden nach Applikation
ausgeschieden. Da die renale Elimination der Thymolkonjugate bei allen Probanden
innerhalb der Urinsammelperiode von 31 h abgeschlossen war, konnte somit der
renal eliminierte prozentuale Anteil der verabreichten Dosis bestimmt werden. Der
mittlere, renal eliminierte prozentuale Anteil der Dosis mit intaktem
Thymolgrundgerüst betrug 16,2 ± 4,5 % (MW±SD). Für die strukturell ähnlichen
Verbindungen Phenol, Guaiacol, p-Cresol und Creosol lag der mit unverändertem
Grundgerüst renal ausgeschiedene Anteil bei 45 bis 100 % der verabreichten Dosis,
wovon der Hauptanteil bereits 2 h nach Applikation eliminiert wurde (OGATA et al.,
1995). Für Menthol lag der renal eliminierte Anteil mit 35 bis 80 % ebenfalls
wesentlich höher, jedoch wurde der Großteil der renal eliminierten Menge ebenfalls
bereits nach 6 h ausgeschieden (BELL et al., 1981; SOMERVILLE et al., 1984;
KAFFENBERGER und DOYLE, 1990; LANGENECKERT, 1998).
4 Diskussion 115
Untersuchungen von Austgulen et al. zum Phase-I-Metabolismus von Thymol in
Rattenurin zeigten die Bildung von 6 verschiedenen Phase-I-Metaboliten (AUSTGULEN
et al., 1987). Sollten ähnliche Verbindungen im Menschen gebildet werden, könnte
dadurch die vergleichsweise geringe Ausscheidungsrate an Thymol mit intaktem
Grundgerüst von 16 % erklärt werden. Ein anderer Grund für die wesentlich größeren
Ausscheidungsraten der strukturell ähnlichen Verbindungen könnte in der Dosis
begründet sein. Da Menthol und die anderen Phenole in erheblich höheren Dosen
verabreicht wurden, waren evtl. die Phase-I-Enzyme gesättigt, so daß die
Metabolisierung bei höherer Dosierung durch Konjugation übernommen wurde.
Die aus den Urindaten mit Hilfe des Sigma-Minus-Plots berechnete mittlere
Halbwertszeit von 4,38 h stimmte nicht mit der aus den Plasmakonzentrationen
ermittelten terminalen Halbwertszeit von 10,2 h überein. Dies könnte eventuell darauf
zurückzuführen sein, daß geringe, nach 24 h noch ausgeschiedene Mengen
Thymolsulfat bzw. Thymolglucuronid durch die Analytik nicht mehr erfaßt wurden und
somit aus den Sigma-Minus-Plots zu große Eliminationskonstanten ermittelt wurden.
Diese Annahme wurde durch den flachen Plasmakonzentrationsverlauf im hinteren
Bereich unterstützt.
Die mittlere renale Clearance betrug 0,271 L⋅h-1. Diese geringe renale
Ausscheidungsrate könnte auf eine hohe Proteinbindung oder durch die
Rückresorption der Verbindung in der Niere zurückzuführen sein. Aufgrund der
Verweildauer und einem schwach sauren pH-Wert könnten vor allem in der Blase
Konjugate gespalten werden und resorbierbare Verbindungen freigesetzt werden
(FORTH et al., 1993). Durch einen Konzentrationsgradienten würde die Verbindung im
proximalen Tubulus wieder rückresorbiert. Die biliäre Exkretion und ein damit
verbundener enterohepatischer Kreislauf schien für die Phase-II-Metabolite des
Thymols unwahrscheinlich, da erst Moleküle > 500-700 g/mol über die Galle
ausgeschieden werden (FORTH et al., 1993).
4 Diskussion 116
4.2.3 Beurteilung der potentiellen Wirksamkeit
Da Thymol in humanem Plasma nur in Form seines Phase-II-Metaboliten
Thymolsulfat nachzuweisen war, würde also nach dem bisherigen Kenntnisstand
eine pharmakologische Wirkung in vivo nach Einnahme von Thymianextrakt u.a.
durch die o.g. Verbindung hervorgerufen werden. Die Eliminationshalbwertszeit des
Thymolsulfates von 10 h würde bei therapeutischer Dosierung von BronchipretTP
(3x1/d) zunächst zu einer Akkumulation und dann zu Steady-State-Konzentrationen
führen, die eine Wirksamkeit erklären könnten. Unter Berücksichtigung der langen
Eliminationsphase sollte das Dosierungsschema überdacht werden, um die Dosis
bzw. die Dosierintervalle den Plasmaspiegeln entsprechend anzupassen.
Die pharmakodynamische Wirkung des Thymolsulfates ist bislang noch nicht
untersucht worden. Anhand des vorliegenden Datenmaterials können also die in vitro
mit Thymianöl bzw. Thymianextrakt beobachteten Wirkungen nicht ohne weiteres auf
die in den klinischen Studien beobachtete Wirksamkeit übertragen werden (KNOLS et
al., 1994, ERNST et al., 1997). Möglicherweise wirken einzelne Komponenten des
„Vielstoffgemisches Phytopharmakon“ synergistisch, wie es vielfach in der
Phytotherapie beobachtet wird. Besonderes Augenmerk gilt dabei den ebenfalls im
Thymianextrakt enthaltenen Flavonoiden.
Um die klinische Wirksamkeit auf Basis der antiphlogistischen, sekretolytsischen,
antibakteriellen und antiviralen Wirkung von Thymianextrakt bzw. Thymol, das ja mit
bis zu 70 % den Hauptbestandteil des Ätherischen Thymianöls darstellt (CZYGAN und
HÄNSEL, 1993), zu erklären, wäre auch die enzymatische Freisetzung des Thymols
aus Thymolsulfat durch Sulfatasen denkbar. Die Aktivität von Sulfatasen im
menschlichen Lungengewebe wurde an Hand von Modellsubstanzen gezeigt
(TOUSSAINT et al., 1993) und könnte damit erklären, daß Thymol trotz der
Abwesenheit unkonjugierten Thymols im Plasma zu einem gewissen Teil auch
pulmonal eliminiert wurde (BISCHOFF, 2000). Darüber hinaus wäre auch die Spaltung
des Thymolsulfates durch Sulfatasen in anderen Geweben denkbar, so daß das frei
werdende Thymol in die Zellen aufgenommen würde. Somit wäre unkonjugiertes
Thymol zwar im Plasma nicht nachweisbar, jedoch könnte es auf diesem Wege
trotzdem am jeweiligen Zielorgan pharmakodynamische Wirkungen zeigen.
4 Diskussion 117
Die Elimination von Thymol erfolgte einerseits renal in Form seiner Phase-II-
Konjugate, andererseits konnte auch die pulmonale Elimination geringer Mengen
Thymols nachgewiesen werden (BISCHOFF, 2000). Die dermale Elimination erschien
auf Grund der Lipophilie und der Molekülgröße des Thymols ebenfalls wahrscheinlich
und ein gewisser Anteil könnte auch mit der Faeces ausgeschieden worden sein. Da
der mit unverändertem Thymolgrundgerüst renal eliminierte Anteil nur 16 % betrug,
könnte - neben den erwähnten anderen Eliminationswegen - ein erheblicher Teil der
verabreichten Dosis bereits in Phase-I-Reaktionen zu eventuell wirksamen
Verbindungen metabolisiert worden sein. Somit dürfte die Bioverfügbarkeit nach
oraler Applikation erheblich mehr als 16 % betragen. Um jedoch die absolute
Bioverfügbarkeit nach oraler Applikation exakt bestimmen zu können, müßte
zunächst die Bioverfügbarkeit nach intravenöser Applikation bestimmt werden.
Da im Rahmen der Untersuchungen von Austgulen et al. verschiedene Phase-I-
Metabolite des Thymols im Rattenurin detektiert wurden, wären weiterführende
Untersuchungen diesbezüglich im Menschen interessant (AUSTGULEN et al., 1987).
Die Identifizierung der potentiellen humanen Phase-I-Metabolite sowie deren
Quantifizierung würden zur umfassenden Klärung des Metabolismus von Thymol
beitragen. Weiterhin würden pharmakodynamische Untersuchungen mit diesen
Phase-I-Metaboliten einen weiteren Beitrag zum Verständnis des Wirkmechanismus
leisten.
Außerdem wäre der Vergleich der Pharmakokinetik von kranken und gesunden
Probanden, vor allem im Hinblick auf die pulmonale Elimination von Interesse. Durch
eine Verschiebung des pH-Wertes im Zuge einer Entzündung, wie sie bei einer
Bronchitis vorliegt, könnten Sulfatasen im Lungengewebe eine höhere Aktivität
aufweisen und somit eine größere Menge Thymol im Lungengewebe von kranken
Probanden freigesetzt werden. Der Nachweis der Spaltung von Thymolsulfat zu
Thymol durch Sulfatasen würde einen wichtigen Beitrag zur Übertragbarkeit von In-
vitro-Ergebnissen auf In-vivo-Resultate leisten.
5 Zusammenfassung 118
5 Zusammenfassung
Um abzuklären, ob Thymol, der Hauptbestandteil des Ätherischen Thymianöls nach
oraler Applikation einer thymianhaltigen Zubereitung zur Wirksamkeit beitragen kann,
wurde eine pharmakokinetische Studie nach Applikation einer Einzeldosis von
Bronchipret®TP Tabletten durchgeführt.
Die Voraussetzung hierfür war die Entwicklung einer Extraktionsmethode, mit der
Thymol nach enzymatischer Spaltung seiner Phase-II-Konjugate Thymolsulfat aus
Plasma sowie nach Spaltung von Thymolsulfat und Thymolglucuronid aus Urin
extrahiert werden konnte. Das hierzu verwendete neuartige automatisierte Verfahren
der Headspace-Festphasenmikroextraktion ermöglichte Extraktion, Anreicherung und
Probenaufgabe in einem einzigen Arbeitsschritt. Nur durch die Automatisierung der
Methode konnte eine internationalen Anforderungen genügende Validierung der
Methode vorgenommen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal
das Verfahren der Festphasenmikroextraktion für die Auswertung einer
Bioverfügbarkeits- bzw. pharmakokinetischen Studie angewendet.
Zur Analytik des Thymols wurde eine GC-Methode mit Flammenionisatiosdetektion
entwickelt. Dieses sensitive Detektionsverfahren ermöglichte die Quantifizierung des
Thymols nach enzymatischer Spaltung im unteren ng⋅mL-1 Bereich. Bei dem
systemisch verfügbaren Phase-II-Konjugat des Thymols handelte es sich um
Thymolsulfat. Per HPLC-MS/MS konnte der Phase-II-Metabolit Thymolsulfat in
Plasma und Urin sowie zusätzlich Thymolglucuronid im Urin identifiziert werden.
Thymol selbst war systemisch nicht verfügbar. Im Plasma konnte freies Thymol
oberhalb der Bestimmungsgrenze von 1,4 ng⋅mL-1 nicht nachgewiesen werden. Im
Urin war freies Thymol oberhalb einer Bestimmungsgrenze von 2,1 ng⋅mL-1 ebenfalls
nicht detektierbar. Somit war alleine Thymolsulfat im Plasma detektierbar und die
pharmakokinetische Auswertung wurde an Hand der sich nach enzymatischer
Hydrolyse ergebenden Thymolkonzentrationen vorgenommen.
Die systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol wurde im
Rahmen von 4 klinischen Studien an gesunden Probanden untersucht. In 2
Pilotstudien wurde eine Einmaldosierung (1 Tablette Bronchipret®TP) verabreicht, um
5 Zusammenfassung 119
den Meßzeitraum für die Hauptstudie festlegen zu können. In einer dritten Pilotstudie
erhielten die Probanden die therapeutische Dosierung von 3x1 Tablette pro Tag. Aus
den Pilotstudien ging eindeutig hervor, daß Thymolsulfat über einen Zeitraum von ca.
40 Stunden nach Applikation im Plasma detektierbar war. Die Hauptstudie wurde mit
12 gesunden Probanden nach Einmaldosierung durchgeführt. (Dosis: 1 Tablette
BronchipretTP entsprechend 1,08 mg Thymol).
Nach Applikation einer Einzeldosis Bronchipret®TP erfolgte die Resorption frühzeitig.
So war Thymol bereits bei einigen Probanden schon nach 20 min im enzymatisch
behandelten Plasma detektierbar. Maximale Plasmaspiegel (cmax ) von
93,1±24,5 ng⋅mL-1 (MW±SD) wurden nach 1,97±0,77 h (tmax) (MW±SD) erreicht.
Die Plasmakonzentrationen, über die Zeit hinweg beobachtet, zeigten einen
biphasischen Verlauf, wobei die terminale Eliminationsphase erst nach ca. 10
Stunden einsetzte und bis zu 38 h andauerte. Die terminale Halbwertszeit betrug somit 10,2 h. Hieraus wurde ersichtlich, daß entsprechend lange Meßzeiträume in
Kombination mit einer hochempfindlichen Analytik zur vollständigen Erfassung der
Daten benötigt werden.
Bezogen auf die verabreichte Thymoldosis (1,08 mg) betrug die renal eliminierte
Thymolmenge mit unverändertem Thymolgrundgerüst 16,2±4,5 % (MW±SD). Die
renale Clearance betrug 271±156 mL⋅h-1 (MW±SD), was auf eine hohe
Plasmaeiweißbindung bzw. eine tubuläre Rückresorption hindeutete.
Nach dem bisherigen Kenntnisstand würde also eine pharmakologische Wirkung in
vivo nach Einnahme von Thymianextrakt u.a. durch Thymolsulfat bzw. potentielle
Phase-I-Metabolite hervorgerufen. Die pharmakodynamischen Wirkungen dieser
Verbindungen sind jedoch bislang noch nicht untersucht. Anhand des vorliegenden
Datenmaterials kann die in den klinischen Studien beobachtete Wirksamkeit einer
thymianextrakthaltigen Formulierung nicht auf eine einzelne Substanz zurückgeführt
werden. Möglicherweise wirken die einzelnen Komponenten synergistisch, wie es
vielfach in der Phytotherapie beobachtet wird.
Denkbar wäre auch die enzymatische Freisetzung des Thymols aus Thymolsulfat
durch Sulfataseaktivität im Zielgewebe. Die Aktivität dieses Enzyms wurde u.a. im
menschlichen Lungengewebe an Hand von Modellsubstanzen gezeigt und könnte
5 Zusammenfassung 120
damit erklären, daß Thymol trotz der Abwesenheit freien Thymols im Plasma zu
einem gewissen Teil auch pulmonal eliminiert wird. Somit wäre unkonjugiertes
Thymol zwar im Plasma nicht nachweisbar, jedoch könnte es auf diesem Wege
trotzdem am Zielorgan Respirationstrakt wirken.
Der Nachweis der Spaltung von Sulfat zum Aglykon würde einen wichtigen Beitrag
zur Übertragbarkeit von den in-vitro mit Thymianextrakt und Thymianöl beobachteten
Wirkungen auf die klinische Wirksamkeit bei akuter Bronchitis leisten. Ebenso wäre
die pharmakodynamische Aktivität möglicher Phase-I-Metabolite von großem
Interesse für das Verständnis des Wirkmechanismus.
6 Summary 121
6 Summary
A pharmacokinetic study following a single dose of BronchipretTP tablets was
performed to determine whether thymol, which is the main compound in the essential
oil of thyme, contributes to the efficacy of this formulation containing thyme extract.
The major prerequisite for this study was the development of an extraction method
for the analysis of thymol after enzymatic cleavage of the phase-II-conjugates thymol
sulfate in human plasma as well as thymol sulfate and thymol glucuronide in urine. A
novel automated headspace solid-phase microextraction method was developed,
which provided extraction, concentration and sampling in a single step.
Automation of the method was necessary to test the method according to
international guidelines for validation of bioanalytical procedures. This is the first time
that solid-phase microextraction has been used for a bioavailability or
pharmacokinetic study.
A sensitive method for quantification of thymol was developed by using gas
chromatography combined with flame ionization detection. Quantification of thymol at
the lower ng⋅mL-1 level was consequently achieved.
Thymol itself was not systemically available because no free thymol could be
detected in plasma above 1.4 ng⋅mL-1. The systemically available phase-II-
metabolite was identified as thymol sulfate by HPLC-MS/MS. Thymol sulfate was
identified in plasma whereas both thymol sulfate and thymol glucuronide were
detected in urine. No free thymol was detected in urine above a limit of quantification
of 2.1 ng⋅mL-1. As thymol sulfate was the only compound systemically available in
plasma, pharmacokinetic analysis of the data was carried out based on the data
obtained after enzymatic cleavage of thymol sulfate.
The systemic availability and pharmacokinetics of thymol was investigated in 4
clinical studies of healthy male volunteers. A single dose (1 tablet Bronchipret®TP)
was administered in 2 pilot studies to determine blood sampling periods. The
therapeutic dosage of 3 tablets per day was administered in the third pilot study.
These pilot studies indicated that thymol sulfate was detectable in plasma up to 40 h
6 Summary 122
after application. The main study comprised a single-dose study with 12 healthy
volunteers (dose: 1 tablet BronchipretTP equivalent to 1.08 mg thymol).
Absorption of thymol was rapid after administration of a single dose of
Bronchipret®TP tablets. Thymol could be detected in hydrolyzed plasma 20 min after
application. Maximum plasma levels (cmax) of 93.1±24.5 ng⋅mL-1 (mean±SD) were
reached after 1.97±0.77 h (tmax) (mean±SD). Plasma concentrations showed a
biphasic profile and the terminal elimination phase set in after about 10 h and
continued up to 38 h. The terminal elimination half life was calculated to be 10.2 h.
This stresses the importance of long sampling periods in combination with highly
sensitive analytical tools to adequately follow the elimination profile.
With regard to the applied thymol dose (1.08 mg) the renally eliminated amount of
thymol with unchanged thymol base structure was 16.2±4.5 % (mean±SD). The renal
clearance of 271±156 mL⋅h-1 (mean±SD) indicates high protein binding and/or tubular
reabsorption.
The data indicate that the pharmacological effect observed in-vivo after application of
preparations containing thyme extract could be due to thymol sulfate or putative
phase-I-metabolites.
However, the pharmacodynamic effects of these compounds have not been
investigated yet. The clinical efficacy of a formulation containing thyme extract can
therefore not be reduced to one single compound. A synergism of several
compounds is frequently observed in phytomedicine.
Another concept for explanation of the data obtained bases on cleavage of the
phase-II-metabolite by sulfatases. The activities of these enzymes have been
demonstrated with model compounds in human lung tissue. This activity is consistent
with the observed pulmonary elimination of thymol. Free thymol could therefore be
effective at the respiratory system, although it was not detected in plasma.
Evidence of cleavage of thymol sulfate to thymol also has implications for the transfer
of the results obtained in-vitro with thyme extract and thyme oil and the clinical
efficacy against acute bronchitis. Finally this study has highlighted the need to study
the pharmacodynamic activity of putative phase-I-metabolites of thymol in order to
understand the mechanisms of actions.
7 Literaturverzeichnis 123
7 Literaturverzeichnis
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8 Anhang 132
8 Anhang
Tab. 8.1 Demographische Daten der Probanden. Probanden-
kürzel
Alter
[Jahre]
Körpergröße
[cm]
Gewicht
[kg]
Körperfett-
anteil [%]
A 25 181 72 15
B 27 192 92 16
C 26 185 77 13
D 26 189 92 21
E 28 185 83 20
F 25 178 88 26
G 25 175 86 27
H 48 180 74 18
I 36 192 83 15
J 27 180 84 21
K 28 179 79 19
L 33 178 78 19
MW 29,50 182,83 82,33 19,17
SD 6,74 5,70 6,54 4,26
Min 25 175 72 13
Median 27 180,5 83 19
Max 48 192 92 27
8 Anhang 133
Tab. 8.2 Stabilität der Plasmaproben nach 24 h im Autosampler.
Zeit [h] gemessene Konzentration MW CV RE [ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]
0 37,2736,92 37,36 1,32 -8,8838,0637,20
24 42,6938,21 39,59 5,77 -3,4337,5739,91
Tab. 8.3 Kalibrierfunktionen während der Vermessung der Plasmaproben.
Proband
Steigung Achsenabschnitt R2 Steigung Achsenabschnitt R2
A 0,0273 0,12616 0,97799 0,03194 -0,13181 0,9924
B 0,0252 0,36312 0,98178 0,0241 0,2994 0,993360,0218 0,1672 0,9784
C 0,01715 0,43911 0,98544 0,02354 0,33222 0,99462
D 0,02193 0,59287 0,95873 0,01841 0,54031 0,9775
E 0,02561 -0,02167 0,97513 0,02305 0,01963 0,99907
F 0,02125 0,37117 0,99405 0,02467 0,19811 0,99104
G 0,02669 -0,03389 0,97935 0,01877 0,20114 0,99752
H 0,0231 0,05612 0,99417 0,01943 0,18039 0,99669
I 0,02785 0,0257 0,99715 0,02653 0,04407 0,99951
J 0,02437 0,07396 0,95649 0,02576 0,01164 0,99099
K 0,02703 -0,03621 0,98236 0,02404 -0,01168 0,99088
L 0,03033 0,00999 0,96345 0,0281 0,11108 0,99309
8,14 bis 40,07 ng.mL-1 30,54 bis 203,5 ng.mL-1
8 Anhang 134
Tab. 8.4 Ergebnisse der Qualitätskontrollproben (Plasma).
Konzentration MW CV RE n[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]
21,5 20,85 13,28 -2,28 24
101,8 99,73 8,89 -2,04 24
169,2 163,26 7,57 -3,51 24
Tab. 8.5 Stabilität der Urinproben im Autosampler nach 24 h.
Zeit [h] gemessene Konzentration MW CV RE [ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]
0 104,21135,12 119,96 10,84 9,55116,45124,04
24 115,31121,61 122,54 4,40 11,91127,21126,02
8 Anhang 135
Tab. 8.6 Kalibrierfunktionen während der Vermessung der Urinproben.
Proband10,95 bis 328,5 ng.mL-1
Steigung Achsenabschnitt R2 Steigung Achsenabschnitt R2
A/B 978,16 13074,17 0,99850 942,91 31458,91 0,98155
C/D/E 993,5 4572,55 0,99476 948,77 24083,88 0,97537
F/G 704,84 26874,67 0,98724
H/I 805,03 25948,97 0,99301
J/K/L 847,98 30885,29 0,99156
10,95 bis 219,0 ng.mL-1 bzw. 164,25 bis 755,0 ng.mL-1
Tab. 8.7 Ergebnisse der Qualitätskontrollproben (Urin).
Konzentration MW CV RE n[ng.mL-1] [ng.mL-1] [%] [%]
30,54 30,95 17,12 1,64 9
164,25 164,56 9,81 0,19 4
273,75 280,33 8,88 2,40 3
328,5 313,22 6,70 -4,65 4
657,0 640,51 8,29 -2,51 4
8 Anhang 136
Tab. 8.8 Berechnungsgrundlagen der in Kinetica 2000 verwendeten pharmakokinetischen Parameter für extravaskuläre Applikation. parameter 1 Komp. Modell 2 Komp. Modell
Vc Vc
Dose
A= Vc
Dose
A +B=
AUC
−
−=
ka1
alpha1
alphakakaAAUC
−
−+
−
−=
ka1
beta1
betakakaB
ka1
alpha1
alphakakaAAUC
AUMC
−
−= 22 ka
1alpha
1alphaka
kaAAUC
−
−+
−
−= 2222 ka
1beta
1betaka
kaBka1
alpha1
alphakakaAAUC
T1/2 Tln2
alpha12alpha = T
ln2
beta12 beta=
MRT
+−=
ka1lag
AUCAUMCMRT
Cl, Vss, Vz Cl
Dose
AUC=
Vss Cl M RT= ⋅ VzCl
Lz=
kel kel Lz alpha= = kel
alpha beta
k21= ⋅
C0 C0=A C0=A+B
K21 k
A beta B alpha
C21
0= ⋅ + ⋅
K12 ( )kelkbetaalphak 2112 +−+=
8 Anhang 137
Tab. 8.9 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden A-D.
Zeit soll [h]
t [h] Cp t [h] Cp t [h] Cp t [h] Cp
0 0 0 0 0 0 0 0 00,25 0,37 38,7 0,27 0 0,32 0 0,23 0
0,5 0,62 42,3 0,52 11,6 0,55 51,0 0,48 00,75 0,83 42,6 0,77 17,7 0,80 67,4 0,73 0
1,00 1,12 51,8 1,03 13,8 1,07 55,1 0,98 01,5 1,62 62,4 1,55 36,8 1,58 54,6 1,50 6,0
2 2,10 76,5 2,03 73,9 2,07 58,6 2,00 110,92,5 2,63 79,2 2,57 61,3 2,60 66,5 2,53 88,5
3 3,13 80,4 3,03 51,8 3,08 59,1 3,00 99,43,5 3,58 72,8 3,53 50,2 3,67 61,9 3,50 91,6
4 4,12 62,1 4,00 50,2 4,17 59,7 3,97 88,25 5,10 55,2 5,03 42,8 5,07 44,3 5,00 74,0
6 6,13 45,9 6,07 24,2 6,10 36,7 6,03 54,27 7,10 41,7 7,50 25,7 7,07 27,9 7,03 32,1
8 8,10 36,7 8,03 22,4 8,07 23,7 8,00 30,39 8,97 28,0 9,08 17,2 9,03 21,2 9,00 24,5
10 10,03 21,9 10,07 17,3 10,08 18,9 10,00 18,812 11,97 15,2 12,00 16,6 12,07 22,0 12,03 19,2
14 14,08 18,6 14,00 16,3 14,07 16,8 13,92 15,824 24,20 8,5 24,08 6,8 24,25 7,8 24,17 7,8
31 30,93 3,7 31,00 0 31,03 0 30,92 038 37,92 - 38,17 0 38,08 0 38,00 0
48 48,50 - 48,42 - 2,38 - 48,12 055 55,33 - 55,67 - 55,08 - 55,00 -
62 61,92 - 62,33 - 62,00 - 62,00 -72 72,25 - 72,42 - 72,00 - 72,00 -
ProbandA B C D
8 Anhang 138
Tab. 8.10 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden E-H.
Zeit soll [h]
t [h] Cp t [h] Cp t [h] Cp t [h] Cp
0 0 181,2 0 0 0 0 0 00,25 0,25 221,5 0,33 17,0 0,37 20,9 0,30 36,6
0,5 0,50 173,1 0,57 32,3 0,62 36,8 0,60 76,10,75 0,75 192,8 0,83 39,0 0,87 40,8 0,85 122,4
1,00 1,00 207,9 1,10 55,9 1,17 43,4 1,13 125,81,5 1,52 315,7 1,50 50,9 1,53 56,7 2,52 125,4
2 2,00 275,0 2,02 52,7 2,08 59,5 2,05 90,02,5 2,50 226,9 2,72 53,3 2,62 70,0 2,60 90,8
3 3,00 284,7 3,05 52,8 3,08 69,1 3,07 86,53,5 3,50 229,1 3,55 45,3 3,62 59,6 3,50 76,6
4 4,00 172,7 4,05 43,6 4,07 47,0 4,00 78,45 5,00 170,2 5,05 43,4 5,08 28,8 5,08 53,2
6 6,03 169,8 6,00 35,8 6,03 25,0 6,02 66,67 7,05 163,6 7,03 24,5 7,08 24,7 7,07 67,3
8 8,03 147,5 8,08 25,2 8,10 20,0 8,05 52,59 9,00 153,9 9,08 29,4 9,03 17,7 9,02 43,9
10 10,02 126,5 10,05 23,3 10,08 16,3 10,02 37,012 12,00 114,0 12,08 22,5 12,12 15,1 12,05 27,8
14 14,00 99,7 13,98 18,2 14,03 13,4 14,08 26,524 23,83 38,0 24,42 7,4 23,87 10,5 24,00 19,1
31 30,83 28,5 31,30 0 31,03 5,0 30,93 10,238 37,75 15,1 37,42 0 37,95 0 37,88 6,9
48 47,83 9,2 48,22 - 48,20 0 48,05 055 55,42 0 54,92 - 55,00 - 54,80 0
62 62,33 - 61,92 - 62,00 - 61,83 072 72,25 - 72,08 - 72,00 - 71,88 0
ProbandF G HE
8 Anhang 139
Tab. 8.11 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden I-L.
Zeit soll [h]
t [h] Cp t [h] Cp t [h] Cp t [h] Cp
0 0 0 0 0 0 0 0 00,25 0,25 0 0,25 0 0,25 17,1 0,25 0
0,5 0,50 24,9 0,50 12,6 0,50 65,7 0,50 26,30,75 0,75 52,3 0,83 59,8 0,75 101,3 0,75 44,0
1,00 1,00 60,5 1,05 73,9 1,00 123,4 1,00 68,91,5 1,52 80,7 1,50 99,0 1,52 86,6 1,52 104,4
2 2,00 91,9 2,00 96,2 2,00 95,2 2,00 105,62,5 2,50 103,7 2,50 75,7 2,50 99,8 2,50 113,9
3 3,00 92,2 3,02 81,4 3,00 80,3 3,00 104,33,5 3,50 90,6 3,53 59,1 3,50 67,9 3,50 107,7
4 4,00 81,8 4,00 64,1 4,00 61,2 4,00 94,45 5,00 56,9 5,00 58,1 5,00 57,6 5,00 98,2
6 3,03 49,6 6,03 41,1 6,03 54,6 6,03 62,47 7,02 43,3 7,03 38,6 7,00 37,0 7,05 51,5
8 8,02 42,7 8,05 37,1 8,00 29,6 8,03 54,59 9,05 35,8 9,03 34,6 9,02 28,5 9,00 48,3
10 10,08 38,8 10,03 31,9 10,03 34,2 10,02 39,712 12,03 21,3 12,00 24,3 12,00 28,4 12,00 30,7
14 14,00 25,6 14,02 18,3 14,03 20,8 14,00 34,524 24,00 16,8 23,88 11,6 24,00 11,4 23,83 14,0
31 30,75 8,7 31,05 6,7 31,00 7,0 30,83 7,738 38,00 5,8 38,22 0 37,92 0 37,75 0
48 48,00 0 48,08 0 47,75 0 47,83 -55 54,67 0 55,33 0 54,92 - 55,42 -
62 61,83 0 62,17 0 62,00 - 62,33 -72 71,83 - 72,42 0 72,00 - 72,25 -
J K LProband
I
8 Anhang 140
Tab. 8.12 Kumulative Urinausscheidung Ut [µg] von Thymol nach enzymatischer Spaltung der Thymol-Konjugate.
Zeit [h] A B C D E F G H I J K LUt [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg] Ut [µg]
0 0 0 0 0 63,6 0 0 0 0 0 0 03 85,7 104,9 76,4 39,7 181,6 58,8 102,8 69,1 62,6 50,5 29,6 63,1
6 123,1 160,2 102,2 68,9 231,9 72,3 158,1 88,3 103,3 96,5 80,4 95,79 151,2 203,3 124,0 93,2 243,7 98,6 191,2 102,2 138,8 123,5 113,4 134,9
14 182,5 232,5 149,5 122,1 277,4 106,9 220,7 122,5 169,1 140,6 129,4 138,524 218,5 257,4 161,7 143,9 314,4 132,6 250,1 133,7 186,2 140,6 145,2 145,3
31 218,5 257,4 161,7 143,9 325,5 132,6 259,9 133,7 186,2 140,6 145,2 145,338 218,5 257,4 161,7 143,9 330,9 132,6 259,9 133,7 186,2 140,6 145,2 145,3
48 - - - - 330,9 - 259,9 133,7 186,2 - - 145,355 - - - - 330,9 - - - - - - -
Proband
8 Anhang 141
Tab. 8.13 Individuelle Pharmakokinetische Parameter der Nichtkompartiment-Analyse.
Proband A B C D E F G H I J K L
cmax [ng/mL] 80,39 73,87 67,39 110,87 315,68 55,90 70,04 125,82 103,68 99,01 123,36 113,87tmax [h] 3,13 2,03 0,80 2,00 1,52 1,10 2,62 2,52 2,50 1,50 1,00 2,50
ke [1/h] 0,0791 0,0704 0,0708 0,0702 0,0655 0,0837 0,0536 0,0585 0,0640 0,0625 0,0698 0,0789t1/2 [h] 8,8 9,9 9,8 9,9 10,6 8,3 12,9 11,8 10,8 11,1 9,9 8,8
AUCcum [ng*h/mL] 708,4 511,7 980,3 733,6 3604,1 456,7 534,4 1281,6 1040,4 835,8 915,3 1212,2AUClast [ng*h/mL] 46,18 96,95 110,07 111,77 81,30 88,29 92,41 118,11 91,07 107,95 100,07 98,05AUCtot [ng*h/mL] 795,5 608,6 1341,3 794,4 3685,4 678,5 682,3 1340,7 1131,5 943,8 1015,4 1266,8
%AUClast 5,8 15,9 8,2 14,1 2,2 13,0 13,5 8,8 8,2 11,4 9,9 7,7AUMCcum [h2*ng/mL] 5438,6 4253,0 2968,0 6626,9 44356,9 2694,4 4336,0 15797,8 11717,7 7855,0 8185,7 12384,4AUMClast [h2*ng/mL] 2012,4 3712,7 4223,1 4294,6 5746,9 3210,5 4590,8 6491,9 4883,7 5078,8 4535,4 4266,3AUMCtot [h2*ng/mL] 8524,7 7965,7 10850,1 9524,3 50103,8 8174,5 10379,8 19808,9 16601,4 12933,8 12721,0 15197,5MRTabs [h] 10,7 13,1 8,1 12,0 13,6 12,0 15,2 14,8 14,7 13,7 12,5 12,0
solver tmax [h] 1,71 1,88 1,91 1,84 1,78 1,86 1,85 1,71 1,91 1,79 1,79 1,82ka [1/h] 2,0 1,8 1,8 1,8 2,0 1,7 2,0 2,2 1,8 2,0 1,9 1,8
MAT [h] 0,51 0,56 0,57 0,54 0,50 0,59 0,50 0,46 0,55 0,50 0,52 0,56MRTiv [h] 10,2 12,5 7,5 11,4 13,1 11,5 14,7 14,3 14,1 13,2 12,0 11,4
Dose [mg] 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08CLtot/f [L/h] 1,36 1,77 0,81 1,36 1,59 0,29 1,58 0,81 0,95 1,14 1,06 0,85
Vdss/f [L] 13,85 22,23 6,05 15,56 18,24 3,84 23,29 11,53 13,47 15,11 12,77 9,75Vd area/f [L] 17,16 25,22 11,37 19,38 19,01 4,48 29,51 13,76 14,91 18,31 15,23 10,81
8 Anhang 142
Tab. 8.14 Tabellarische Darstellung des Fittings der Thymol-Plasmakonzentrationen für ein Zweikompartiment-Modell (Proband A-K) bzw. Einkompartiment-Modell (Proband L).
A B C D E F G H I J K L
dose mg 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08 1,08ka [1/h] 0,48 0,63 0,62 0,40 0,52 0,65 0,57 1,31 0,49 2,05 0,69 0,10
Tlag [h] 0,67 0,32 1,48 0,54Vc [L] 6,10 7,72 5,57 1,26 0,78 9,66 7,62 6,90 5,63 7,93 4,55 1,28ke [1/h] 0,23 0,19 0,28 1,05 0,39 0,17 0,20 0,12 0,16 0,15 0,23 0,68
k12 [1/h] 0,16 0,33 0,32 1,05 1,79 0,27 0,28 0,12 0,19 0,22 0,35k21 [1/h] 0,14 0,11 0,17 0,11 0,48 0,29 0,11 0,17 0,10 0,32 0,20AUC [ng*h/mL] 758,79 747,39 698,73 822,08 3579,11 672,92 716,84 1326,14 1197,64 893,54 1016,22 1238,25
AUMC [h2*ng/mL] 8467,51 16571,30 8236,68 10506,70 50593,10 8894,38 13735,80 20015,70 23714,00 10299,40 13397,70 14509,30MRT [h] 9,09 19,92 9,84 8,78 12,21 11,68 17,41 14,33 17,75 10,50 11,74 1,46Lz [1/h] 0,09 0,08 0,07 0,07 0,07 0,08 0,05 0,06 0,06 0,06 0,06 0,09
Cmax calc [ng/mL] 74,00 58,35 74,94 112,81 243,02 52,56 58,37 108,74 84,62 95,12 98,77 87,33tmax calc [h] 2,44 2,53 2,10 2,51 1,32 2,15 2,04 1,66 2,56 1,62 1,72 3,32
A [ng/mL] 145,60 120,18 161,39 837,09 1152,89 70,17 121,28 95,45 159,15 74,65 188,14 846,15Alpha [1/h] 0,46 0,59 0,70 2,15 2,58 0,66 0,55 0,35 0,41 0,61 0,71 0,68
B [ng/mL] 31,39 19,71 32,39 22,61 225,38 41,64 20,37 61,02 32,53 61,51 48,99Beta [1/h] 0,07 0,04 0,07 0,05 0,07 0,07 0,04 0,06 0,04 0,08 0,07t ½ ka [h] 1,44 1,10 1,13 1,74 1,33 1,06 1,22 0,53 1,42 0,34 1,00 7,11tabs [h] 7,18 5,48 5,63 8,72 6,66 5,32 6,08 2,64 7,10 1,69 5,01 35,54
t ½ alpha [h] 1,51 1,17 0,99 0,32 0,27 1,05 1,26 1,97 1,67 1,14 0,97 1,01t ½ beta [h] 9,74 19,15 10,02 13,24 9,63 9,42 16,88 11,98 17,33 8,69 10,65t ½ Lz [h] 9,74 19,15 10,02 13,24 9,63 9,42 16,88 11,98 17,33 8,69 10,65 1,01t ½ ke [h] 2,97 3,70 2,50 0,66 1,80 4,17 3,51 5,87 4,33 4,55 2,97 1,01
Vz [L] 20,01 39,92 22,35 25,10 4,19 21,82 36,68 14,08 22,55 15,15 16,32 1,28Cl [L/h] 1,42 1,45 1,55 1,31 0,30 1,60 1,51 0,81 0,90 1,21 1,06 0,87
Conc. Unit [ng/mL]
8 Anhang 143
Abb. 8.1 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks einer mit Thymol versetzten Plasmaprobe (SIM Modus).
Abb. 8.2 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks aus Plasma nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP (SIM Modus).
Tab. 8.15 Prozentuale Verhältnisse der Fragmente von Thymol (Plasma).
m/z 91 115 135 150
Referenz 15,7 14,3 100 30,6 1 Tablette 15,31 13,98 100 31,03
8 Anhang 144
Abb. 8.3 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks einer mit Thymol versetzten Urinprobe (SIM Modus).
Abb. 8.4 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks aus Urin nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP (SIM Modus).
Tab. 8.16 Prozentuale Verhältnisse der Fragmente von Thymol (Urin).
m/z 91 115 135 150
Referenz 16,79 14,38 100 32,08 1 Tablette 14,6 14,34 100 32,99
8 Anhang 145
Abb. 8.5 1. Ableitung der UV-Absorptionsspektren von Thymol (—) λmax = 274 nm (0-Durchgang) und dem neu entstandenen Peak, Thymolglucuronid (- -) λmax = 270 nm (0-Durchgang).
240
250
270
260
280
290
300
Wavelenght [nm]
Der
ivat
ive
of A
bsor
banc
e x
10-3
-2.0
00-1
.000
0.00
01.
000
-2.0
00-1
.000
0.00
01.
000
Line Type Time Range______ 30.16 - 30.29
- - - - - - 25.58 - 25.61
8 Anhang 146
Abb. 8.6 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolglucuronid-Standard, enzymatisch synthetisiert ([M – H]¯ = 325 amu) (oben). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 307 (Wasserverlust), 175 (Glucuronsäure), 149 (Thymol; nur schwach erkennbar) und 113 sind im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). T h y m o l g l u k u r o n i d # 1 0 5 5 - 1 0 8 0 R T : 1 3 . 0 1 - 1 3 . 4 4 A V : 1 4 S B : 3 5 1 8 . 9 1 - 1 2 . 8 7 , 1 3 . 8 4 - 1 5 . 5 2 N L : 1 . 6 3 E 5T : - c E S I F u l l m s [ 1 1 5 . 0 0 - 6 0 0 . 0 0 ]
1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
1 4 3 . 1 3
2 8 5 . 1 9
3 2 5 . 0 1
3 8 2 . 8 9
2 0 0 . 0 7
3 0 1 . 0 82 3 8 . 9 2
2 8 1 . 9 23 4 2 . 1 9 3 8 4 . 9 5
3 6 6 . 9 12 2 4 . 8 9 3 0 6 . 9 53 5 7 . 9 62 0 2 . 9 4 3 8 9 . 9 32 4 0 . 7 7
1 3 6 . 0 4 2 8 0 . 9 31 5 6 . 9 4 1 8 1 . 9 0 2 2 1 . 1 1 2 4 4 . 0 71 2 4 . 0 5
T h y m o l g l u k u r o n i d # 1 0 6 9 R T : 1 3 . 2 3 A V : 1 N L : 7 . 7 9 E 4T : - c d F u l l m s 2 3 2 4 . 9 8 @ 4 0 . 0 0 [ 7 5 . 0 0 - 6 6 0 . 0 0 ]
1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
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ve
Ab
un
da
nc
e
1 1 2 . 9 0
1 7 4 . 8 2
3 0 7 . 1 51 7 3 . 9 19 8 . 7 5 1 2 9 . 1 2 2 5 0 . 0 8 2 6 2 . 0 5 2 8 9 . 3 8
8 Anhang 147
Abb. 8.7 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolsulfat ([M – H]¯ = 229 amu) im Plasma nach Einnahme einer Tablette Bronchipret® TP (oben). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 211 (Wasserverlust), 201, 165 (SO2 Verlust), 149 (Thymol) und 80 (SO3¯) sind im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). P l a s m a G 1 B s p i k e # 1 1 0 0 - 1 1 3 0 R T : 1 4 . 8 7 - 1 5 . 3 9 A V : 1 6 S B : 7 8 1 3 . 5 8 - 1 4 . 8 3 , 1 5 . 8 3 - 1 7 . 3 0 N L : 5 . 9 4 E 5T : - c E S I F u l l m s [ 1 1 5 . 0 0 - 6 0 0 . 0 0 ]
1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
2 2 9 . 0 6
3 5 2 . 0 1
3 6 9 . 2 9
3 0 4 . 1 42 4 9 . 0 2
1 6 6 . 2 0 3 0 5 . 1 2 3 2 3 . 0 61 8 7 . 1 3 3 8 0 . 8 82 9 7 . 0 01 4 0 . 9 6 2 7 0 . 5 92 1 3 . 9 9
P l a s m a G 1 B s p i k e # 1 1 1 3 - 1 1 2 7 R T : 1 5 . 1 1 - 1 5 . 3 3 A V : 8 S B : 7 8 1 3 . 5 8 - 1 4 . 8 3 , 1 5 . 8 3 - 1 7 . 3 0 N L : 4 . 2 2 E 5T : - c d F u l l m s 2 2 2 9 . 0 3 @ 4 0 . 0 0 [ 5 0 . 0 0 - 4 7 0 . 0 0 ]
5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
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Ab
un
da
nc
e
1 4 9 . 1 1
8 0 . 0 0
1 6 5 . 1 3
8 0 . 9 1 2 0 0 . 8 9 2 2 9 . 1 61 2 3 . 2 27 9 . 4 0 2 4 2 . 5 1 3 7 5 . 9 61 8 6 . 1 3
8 Anhang 148
Abb. 8.8 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolglucuronid ([M – H]¯ = 325 amu) in Urin (10 Tabletten) (oben). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 307 (Wasserverlust), 175 (Glucuronsäure), 149 (Thymol) und 113 sind im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). U r i n E R I I I 1 . 2 # 8 4 4 - 8 7 7 R T : 1 2 . 5 5 - 1 3 . 0 9 A V : 1 7 S B : 7 9 1 0 . 9 7 - 1 2 . 5 0 , 1 3 . 4 0 - 1 4 . 6 3 N L : 8 . 8 0 E 5T : - c E S I F u l l m s [ 1 1 5 . 0 0 - 6 0 0 . 0 0 ]
1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
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Ab
un
da
nc
e
3 2 5 . 0 2
3 8 5 . 1 8
3 8 7 . 2 12 2 9 . 0 6
3 2 5 . 9 4
3 9 3 . 1 13 5 6 . 4 53 6 7 . 2 5
3 0 5 . 1 1 3 3 8 . 9 12 8 8 . 9 32 0 7 . 8 81 7 8 . 0 21 2 4 . 0 9 2 3 6 . 5 5 2 7 2 . 9 6
1 6 3 . 8 0
U r i n E R I I I 1 . 2 # 8 5 9 R T : 1 2 . 8 1 A V : 1 N L : 2 . 8 8 E 5T : - c d F u l l m s 2 3 2 5 . 0 2 @ 4 0 . 0 0 [ 7 5 . 0 0 - 6 6 5 . 0 0 ]
1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
1 1 2 . 9 4
1 7 4 . 8 4
3 0 7 . 0 02 4 4 . 0 21 7 4 . 2 01 4 9 . 0 9
1 5 6 . 8 11 1 0 . 9 8 2 1 4 . 1 6 2 6 8 . 0 5 3 0 6 . 2 31 3 9 . 1 5 3 2 2 . 2 11 9 7 . 9 3
8 Anhang 149
Abb. 8.9 LC-ESI-MS-Spektrum (oben) von Thymolsulfat ([M – H]¯ = 229 amu) in Urin (10 Tabletten). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 211 (Wasserverlust), 201, 165 (SO2 Verlust), 149 (Thymol) und 80 (SO3¯) sind im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). U r i n E R I I I 1 . 2 # 9 9 1 - 1 0 1 8 R T : 1 5 . 1 5 - 1 5 . 5 3 A V : 1 4 S B : 1 1 6 1 2 . 5 5 - 1 4 . 9 7 , 1 5 . 9 2 - 1 7 . 5 7 N L : 2 . 5 7 E 6T : - c E S I F u l l m s [ 1 1 5 . 0 0 - 6 0 0 . 0 0 ]
1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
2 2 9 . 0 4
3 5 2 . 0 6
3 5 3 . 0 82 3 0 . 1 43 5 6 . 1 8
3 0 4 . 0 0 3 3 8 . 4 5 3 6 9 . 9 21 4 9 . 2 0 2 7 6 . 0 31 4 0 . 8 8 2 1 6 . 0 6 2 6 2 . 8 81 6 8 . 9 1 1 9 4 . 5 6
U r i n E R I I I 1 . 2 # 9 9 7 - 1 0 2 1 R T : 1 5 . 2 3 - 1 5 . 5 8 A V : 1 2 S B : 1 1 6 1 2 . 5 5 - 1 4 . 9 7 , 1 5 . 9 2 - 1 7 . 5 7 N L : 1 . 1 4 E 6T : - c d F u l l m s 2 2 2 9 . 0 5 @ 4 0 . 0 0 [ 5 0 . 0 0 - 4 7 0 . 0 0 ]
5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 3 0 0 3 5 0 4 0 0m / z
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nc
e
1 4 9 . 1 2
8 0 . 0 1
1 6 5 . 1 7
1 4 8 . 2 68 1 . 0 3 1 1 3 . 3 0 2 0 1 . 9 87 8 . 1 5 1 8 6 . 9 2 2 4 0 . 4 6 3 7 7 . 9 32 7 0 . 9 0
8 Anhang 150
Abb. 8.10 Graphische Darstellung der individuellen Thymolsulfat-Plasmakonzentrations-Zeitverläufe. Zur Bestimmung von ke wurden jeweils die letzten 4 Wertepaare herangezogen.
Proband A
1
10
100
0 5 10 15 20 25 30 35
Zeit [h]
cp [n
g*m
L-1]
Proband D
1
10
100
1000
0 5 10 15 20 25 30
Ze it [h]
cp [n
g*m
L-1]
Proband B
1
10
100
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [h]
cp [n
g*m
L-1]
Proband E
1
10
100
1000
0 10 20 30 40 50 60
Zeit [h]
cp [n
g*m
L-1]
Proband C
1
10
100
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [h]
cp [n
g*m
L-1]
Proband F
1
10
100
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [h]
cp [n
g*m
L-1]
8 Anhang 151
Proband G
1
10
100
0 5 10 15 20 25 30 35
Zeit [h]
cp [n
g*m
L-1]
Proband J
1
10
100
1000
0 10 20 30 40
Zeit [h]
cp [n
g*m
L-1]
Proband H
1
10
100
1000
0 10 20 30 40
Zeit [h]
cp [n
g*m
L-1]
Proband K
1
10
100
1000
0 5 10 15 20 25 30 35
Ze it [h]
cp [n
g*m
L-1
]
Proband I
1
10
100
1000
0 10 20 30 40
Zeit [h]
cp [n
g*m
L-1]
Proband L
1
10
100
1000
0 5 10 15 20 25 30 35
Ze it [h]
cp [n
g*m
L-1]
8 Anhang 152
Abb. 8.11 Graphische Darstellung des Fittings der Thymol-Plasmakonzentrationen für ein Zweikompartiment- (Proband A-K) bzw. Einkompartiment-Modell (Proband L).
8 Anhang 153
8 Anhang 154
Abb. 8.12 Sigma-Minus-Plots zur Ermittlung der Eliminationskonstante ke.
Proband A
y = 192,68e-0,1188x
1
10
100
1000
0 5 10 15
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
Proband D
y = 170,37e-0,143x
1
10
100
1000
0 5 10 15
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
Proband B
y = 253,9e-0,1668x
1
10
100
1000
0 5 10 15
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
Proband E
y = 291,93e-0,1251x
1
10
100
1000
0 10 20 30 40
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
Proband C
y = 162,68e-0,1783x
1
10
100
1000
0 5 10 15
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
Proband F
y = 99,91e-0,1014x
1
10
100
1000
0 5 10 15
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
8 Anhang 155
Proband G
y = 225,87e-0,1299x
1
10
100
1000
0 5 10 15 20 25 30
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
Proband J
y = 215,15e-0,2772x
1
10
100
1000
0 2 4 6 8 10
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
Proband H
y = 113,97e-0,1589x
1
10
100
1000
0 5 10 15
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
Proband K
y = 190,39e-0,1831x
1
10
100
1000
0 5 10 15
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
Proband I
y = 230,79e-0,1824x
1
10
100
1000
0 5 10 15
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
Proband L
y = 161,78e-0,2434x
1
10
100
1000
0 5 10 15
Zeit [h]
Uin
f-Ut [
µg]
8 Anhang 156
Abb. 8.13 Renale Clearance-Plots (Ut gegen AUCt).
Proband A
y = 321,05x
0
50
100
150
200
250
0 0,2 0,4 0,6 0,8
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
Proband D
y = 209,03x0
50
100
150
200
0 0,2 0,4 0,6 0,8
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
Proband B
y = 633,35x
0
50100
150
200
250300
350
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
Proband E
y = 114,53x
050
100150200250300350400
0 1 2 3 4
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
Proband C
y = 148,44x
0
50
100
150
200
0 0,5 1 1,5
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
Proband F
y = 246,34x0
50
100
150
200
0 0,2 0,4 0,6 0,8
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
8 Anhang 157
Proband G
y = 492,77x
0
50
100
150
200
250
300
350
0 0,2 0,4 0,6 0,8
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
Proband J
y = 240,32x0
50
100
150
200
0 0,2 0,4 0,6 0,8
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
Proband H
y = 144,41x0
50
100
150
200
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
Proband K
y = 180,83x
0
50
100
150
200
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
Proband I
y = 199,83x0
50
100
150
200
250
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
Proband L
y = 160,16x
0
50
100
150
200
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
AUCt cum [h*µg/mL]
Ut c
um [µ
g]
9 Abbildungsverzeichnis 158
9 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1 Thymus vulgaris, L....................................................................................... 4
Abb. 1.2 Strukturformeln von Ätherisch-ÖL-Komponenten (SCHNEIDER, 1998)........ 11
Abb. 1.3 Phase-I-Metaboliten von Thymol im Rattenurin (AUSTGULEN et al., 1987). 14
Abb. 2.1 Schematische Darstellung der Headspace-Festphasenmikroextraktions-
methode. ........................................................................................................... 39
Abb. 2.2 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 68°C, MW aus Doppelbestimmung. 43
Abb. 2.3 0-Wert Plasma mit Thymol versetzt (1,4 ng⋅mL-1) (blau), Plasma nach
Einnahme einer Tablette BronchipretTP (grün). .............................................. 56
Abb. 2.4 Ionenspurchromatogramm von 0-Wert Urin mit Thymol (2,1 ng⋅mL-1)
versetzt................................................................................................................57
Abb. 2.5 Ionenspurchromatogramm von Urin nach Einnahme einer Tablette
BronchipretTP.................................................................................................. 57
Abb. 2.6 Combi-Pal Autosampler............................................................................. 58
Abb. 2.7 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben) und
einer mit Thymol versetzten Probe (unten)........................................................ 64
Abb. 2.8 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP (oben) und
einer 0-Wert Probe (unten)................................................................................ 64
Abb. 2.9 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 80°C, MW aus 2 Messungen.......... 65
Abb. 2.10 Kalibriergerade für den unteren Konzentrationsbereich des
Arbeitsbereiches................................................................................................ 66
Abb. 2.11 Kalibriergerade für den oberen Bereich des Arbeitsbereiches................. 66
Abb. 2.12 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben)
und einer mit Thymol versetzten Urinprobe (unten). ......................................... 74
Abb. 2.13 Chromatogramm nach Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (oben)
und einer 0-Wert Urinprobe (unten)................................................................... 74
Abb. 2.14 Peakflächen-Zeitprofil für Thymol bei 80°C, MW aus 2 Messungen........ 75
Abb. 2.15 Kalibriergerade für den unteren Konzentrationsbereich des
Arbeitsbereiches................................................................................................ 76
Abb. 2.16 Kalibriergerade für den oberen Konzentrationsbereich des
Arbeitsbereiches................................................................................................ 76
9 Abbildungsverzeichnis 159
Abb. 2.17 Thymolglucuronid. ................................................................................... 81
Abb. 2.18 Chromatogramme des Reaktionsgemisches ohne (schwarz) und mit
Uridin-5`-Diphosphoglucuronyl-Transferase (rot) nach 60minütigem Inkubieren
bei 37°C............................................................................................................. 83
Abb. 3.1 Ionenspurchromatogramme (neg. LC-ESI) von 0-Wert Plasma (oben), nach
Einnahme einer Tablette Bronchipret®TP (mitte) und Plasma nach Einnahme
einer Tablette Bronchipret®TP mit Thymolglucuronid versetzt (unten). ............. 88
Abb. 3.2 Konzentrations-Zeit-Verlauf des Gesamtthymolgehaltes nach
enzymatischer Spaltung mittels HS-SPME ( ) und des per LC-MS ermittelten
Thymolsulfates (�). Beschriftung der Y-Achse: : cp [ng⋅mL-1]; �: Thymolsulfat
[Peakfläche/250000], 1 Proband. ...................................................................... 89
Abb. 3.3 Ionenspurenchromatogramme (neg. LC-ESI) von 0-Wert Urin (oben) und
nach Einnahme von 10 Tabletten BronchipretTP (unten)................................ 90
Abb. 3.4 Kumulative renale Ausscheidung von Thymolsulfat und Thymolglucuronid,
1 Proband.......................................................................................................... 91
Abb. 3.5 Individuelle Plasmakonzentrations-Zeitprofile für Thymolsulfat nach
Einnahme einer Tablette BronchipretTP.......................................................... 92
Abb. 3.6 Plasmakonzentrations-Zeitprofil (Median, n=4) für Thymolsulfat nach
Einnahme einer Tablette BronchipretTP.......................................................... 93
Abb. 3.7 Individuelle Plasmakonzentrations-Zeitprofile für Thymolsulfat im Steady
State nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP. ↑ : erneute
Tabletteneinnahme............................................................................................ 94
Abb. 3.8 Plasmakonzentrations-Zeitprofil für Thymolsulfat nach Einnahme einer
Tablette BronchipretTP, 1 Proband. ................................................................ 95
Abb. 3.9 Graphische Darstellung der individuellen Plasmakonzentrationen für
Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP............................ 97
Abb. 3.10 Graphische Darstellung der mittleren und medianen Plasma-
konzentrationen für Thymolsulfat nach Einnahme einer Tablette BronchipretTP.
Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar, n=11. .. 97
Abb. 3.11 Kumulative Urinausscheidung in % der verabreichten Dosis (MW+SD) von
Thymol nach enzymatischer Spaltung der Konjugate (n=11). ........................... 99
9 Abbildungsverzeichnis 160
Abb. 3.12 Graphische Darstellung des Fittings des Mittelwertes der Thymolsulfat-
Plasmakonzentrationen. .................................................................................. 102
Abb. 3.13 Graphische Darstellung des Fittings des Medians der Thymolsulfat-
Plasmakonzentrationen . ................................................................................. 102
Abb. 8.1 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks einer mit Thymol versetzten
Plasmaprobe (SIM Modus).............................................................................. 143
Abb. 8.2 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks aus Plasma nach Einnahme einer
Tablette BronchipretTP (SIM Modus). ........................................................... 143
Abb. 8.3 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks einer mit Thymol versetzten Urinprobe
(SIM Modus).................................................................................................... 144
Abb. 8.4 GC-EI-Spektrum des Thymolpeaks aus Urin nach Einnahme einer Tablette
BronchipretTP (SIM Modus). ......................................................................... 144
Abb. 8.5 1. Ableitung der UV-Absorptionsspektren von Thymol (—) λmax = 274 nm (0-
Durchgang) und dem neu entstandenen Peak, Thymolglucuronid (- -) λmax = 270
nm (0-Durchgang). .......................................................................................... 145
Abb. 8.6 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolglucuronid-Standard, enzymatisch
synthetisiert ([M – H]¯ = 325 amu) (oben). Das Molion wurde per SRM
fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 307 (Wasserverlust), 175
(Glucuronsäure), 149 (Thymol; nur schwach erkennbar) und 113 sind im
MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). .......................................................... 146
Abb. 8.7 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolsulfat ([M – H]¯ = 229 amu) im Plasma
nach Einnahme einer Tablette Bronchipret® TP (oben). Das Molion wurde per
SRM fragmentiert, die Tochterionen [M – H]¯ 211 (Wasserverlust), 201, 165
(SO2 Verlust), 149 (Thymol) und 80 (SO3¯) sind im MS/MS-Spektrum zu
erkennen (unten). ............................................................................................ 147
Abb. 8.8 LC-ESI-MS-Spektrum von Thymolglucuronid ([M – H]¯ = 325 amu) in Urin
(10 Tabletten) (oben). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen
[M – H]¯ 307 (Wasserverlust), 175 (Glucuronsäure), 149 (Thymol) und 113 sind
im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten). ..................................................... 148
Abb. 8.9 LC-ESI-MS-Spektrum (oben) von Thymolsulfat ([M – H]¯ = 229 amu) in Urin
(10 Tabletten). Das Molion wurde per SRM fragmentiert, die Tochterionen [M –
H]¯ 211 (Wasserverlust), 201, 165 (SO2 Verlust), 149 (Thymol) und 80 (SO3¯)
sind im MS/MS-Spektrum zu erkennen (unten)............................................... 149
9 Abbildungsverzeichnis 161
Abb. 8.10 Graphische Darstellung der individuellen Thymolsulfat-
Plasmakonzentrations-Zeitverläufe. Zur Bestimmung von ke wurden jeweils die
letzten 4 Wertepaare herangezogen. .............................................................. 150
Abb. 8.11 Graphische Darstellung des Fittings der Thymol-Plasmakonzentrationen
für ein Zweikompartiment- (Proband A-K) bzw. Einkompartiment-Modell
(Proband L). .................................................................................................... 152
Abb. 8.12 Sigma-Minus-Plots zur Ermittlung der Eliminationskonstante ke. .......... 154
Abb. 8.13 Renale Clearance-Plots (Ut gegen AUCt). ............................................. 156
10 Tabellenverzeichnis 162
10 Tabellenverzeichnis
Tab. 1.1 Pharmakokinetik Ätherischer-Öl-Verbindungen (Fortsetzung s. Seite 21). 20
Tab. 1.2 Resorption in Tier und Mensch .................................................................. 22
Tab. 1.3 Metabolismus in Tier und Mensch.............................................................. 23
Tab. 1.4 Elimination bei Nagern ............................................................................... 24
Tab. 1.5 Elimination beim Menschen ....................................................................... 25
Tab. 2.1 Kalibrierfunktion für Thymol im Plasma. ......................................................44
Tab. 2.2 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol in humanem
Plasma. Variationskoeffizient und Relativer Fehler wurden jeweils aus den
Meßpunkten einer Konzentration bestimmt. ...................................................... 44
Tab. 2.3 Kalibrierfunktion für Thymol, als Interner Standard wurde t-Anethol
verwendet.......................................................................................................... 52
Tab. 2.4 Kalibrierfunktion (Konzentrationen: 1,4; 14,0; 28,0; 140,0 ng⋅mL-1) für die
Bestimmung von Thymol im Plasma. ................................................................ 56
Tab. 2.5 Kalibrierfunktion (Konzentrationen: 2,12; 5,3; 10,6; 21,2; 53,0; 106,0;
212,0 ng⋅mL-1) zur Bestimmung von Thymol im Urin......................................... 57
Tab. 2.6 Interkalibrierung des Arbeitstandards mit dem Primärstandard.................. 62
Tab. 2.7 Parameter der Kalibrierfunktionen für Thymol............................................ 67
Tab. 2.8 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der
Validierung („intra-day precision“). .................................................................... 68
Tab. 2.9 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der
Validierung („between-day precision“), berechnet aus den Mittelwerten der „intra-
day precision“. ................................................................................................... 68
Tab. 2.10 Stabilität von Thymolsulfat im Plasma bei Lagerung bei -20°C. Die Werte
entsprechen jeweils den Mittelwerten aus 2 Messungen, Gehalt in [%]. ........... 69
Tab. 2.11 Stabilität der Plasmaproben im Autosampler (n=4). ................................. 70
Tab. 2.12 Wiederfindung für verschiedene Konzentrationen von Thymol aus
humanem Plasma für Headspace-Festphasenmikroextraktion. ........................ 71
Tab. 2.13 Parameter der Kalibrierfunktionen für die Bestimmung von Thymol im
Urin.................................................................................................................... 76
Tab. 2.14 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der
Validierung („intra-day precision“). .................................................................... 77
10 Tabellenverzeichnis 163
Tab. 2.15 Präzision und Richtigkeit für die Bestimmung von Thymol während der
Validierung („between-day precision“), ermittelt aus den Mittelwerten der „intra-
day precision“. ................................................................................................... 77
Tab. 2.16 Stabilität der Thymol-Konjugate im Urin bei Lagerung bei -20°C. Die Werte
entsprechen jeweils den Mittelwerten aus 2 Messungen, Gehalt in [%]. ........... 78
Tab. 2.17 Stabilität der Urinproben im Autosampler (n=4). ...................................... 78
Tab. 2.18 Wiederfindung für verschiedene Konzentrationen von Thymol aus
humanem Urin für Headspace-Festphasenmikroextraktion............................... 80
Tab. 2.19 Gradient zur Trennung von Thymol und Thymolglucuronid...................... 83
Tab. 3.1 Thymolsulfat-Plasmakonzentrationen der Probanden A-D, F-L,
MW=arithmetischer Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung,
Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geometrisches Mittel. .........98
Tab. 3.2 Renale Elimination von Thymol (in Form seiner Phase-II-Konjugate) in
Prozent der applizierten Dosis (1,08 mg Thymol). MW=arithmetischer Mittelwert
(n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert,
GEO=Geo-metrisches Mittel.............................................................................. 99
Tab. 3.3 Pharmakokinetische Parameter der Nichtkompartiment-Analyse (Definition
der Parameter in Absatz 2.11.1); MW=Mittelwert (n=11),
SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maximalwert, GEO=Geome-
trisches Mittel. ................................................................................................. 101
Tab. 3.4 Pharmakokinetische Parameter der Kompartiment-Analyse (Definition der
Parameter siehe Absatz 2.11.2) nach Anpassung des Mittelwertes und des
Medianes an ein Zweikompartiment-Modell. ................................................... 103
Tab. 3.5 Bestimmung der Eliminationshalbwertszeit aus den jeweiligen Sigma-Minus-
Plots. MW=Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert,
Max=Maximalwert, GEO=Geometrisches Mittel.............................................. 105
Tab. 3.6 Bestimmung der renalen Clearance aus den jeweiligen Clearance- Plots.
MW=Mittelwert (n=11), SD=Standardabweichung, Min=Minimalwert, Max=Maxi-
malwert, GEO=Geometrisches Mittel. ............................................................. 105
Tab. 8.1 Demographische Daten der Probanden. ...................................................132
Tab. 8.2 Stabilität der Plasmaproben nach 24 h im Autosampler........................... 133
Tab. 8.3 Kalibrierfunktionen während der Vermessung der Plasmaproben. .......... 133
Tab. 8.4 Ergebnisse der Qualitätskontrollproben (Plasma). ................................... 134
10 Tabellenverzeichnis 164
Tab. 8.5 Stabilität der Urinproben im Autosampler nach 24 h. ............................... 134
Tab. 8.6 Kalibrierfunktionen während der Vermessung der Urinproben................. 135
Tab. 8.7 Ergebnisse der Qualitätskontrollproben (Urin). ........................................ 135
Tab. 8.8 Berechnungsgrundlagen der in Kinetica 2000 verwendeten
pharmakokinetischen Parameter für extravaskuläre Applikation. .................... 136
Tab. 8.9 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden A-D. ..... 137
Tab. 8.10 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden E-H. ... 138
Tab. 8.11 Plasmakonzentrationen [ng.mL-1] von Thymolsulfat, Probanden I-L. ..... 139
Tab. 8.12 Kumulative Urinausscheidung Ut [µg] von Thymol nach enzymatischer
Spaltung der Thymol-Konjugate. ..................................................................... 140
Tab. 8.13 Individuelle Pharmakokinetische Parameter der Nichtkompartiment-
Analyse............................................................................................................ 141
Tab. 8.14 Tabellarische Darstellung des Fittings der Thymol-Plasmakonzentrationen
für ein Zweikompartiment-Modell (Proband A-K) bzw. Einkompartiment-Modell
(Proband L). .................................................................................................... 142
Tab. 8.15 Prozentuale Verhältnisse der Fragmente von Thymol (Plasma). ........... 143
Tab. 8.16 Prozentuale Verhältnisse der Fragmente von Thymol (Urin).................. 144
11 Abkürzungsverzeichnis 165
11 Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
AP alkalische Phosphatase
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CK Creatinkinase
Cp Plasmakonzentration
CRP c-reaktives Protein
CV Variationskoeffizient (coefficient of variation)
EI Elektronenstoßionisation
ESI Electrospray Ionisation
FDA Food and Drug Administration
FID Flammenionisiationsdetektor, -detektion
GC Gaschromatographie
GEO geometrisches Mittel
GOT Glutamat-Oxalacetat-Transaminase
GPT Glutamat-Pyruvat –Transaminase
h Stunde(n)
HPLC high performance liquid chromatography
I.D. Innendurchmesser
IC50 Halbmaximale Hemmkonzentration
Istd Interner Standard
i.v. intravenös
LC Liquid Chromatography
LD50 mittlere tötliche Dosis, bei der 50 % der Versuchstiere sterben
LDH Lactat-Dehydrogenase
LOQ Limit of Quantification, Bestimmungsgrenze
M mol⋅L-1
MCV mittleres zelluläres Erythrozytenvolumen
min Minute(n)
MS Massenspektrometrie
11 Abkürzungsverzeichnis 166
MW Mittelwert
n Anzahl
NMR Nuclear Magnetic Resonance
PA Polyacrylat
PDMS-DVB Polydimethylsiloxan-Divenylbenzen
PGE2 Prostaglandin E2
PTT Thromboplastin-Zeit
QCs Qualitätskontrollproben
R.t. Retentionszeit
RE Relativer Fehler
Rel.Resp. relative Response
R2 Korrelationskoeffizient
LC Liquid Chromatography
rpm rounds per minute
s. siehe
SD Standardabweichung
SIM Selected Ion Monitoring
SPME Festphasenmikroextraktion, Solid-Phase-Microextraction
SRM Selected Reaction Monitoring
Tab. Tabelle
TIC Total Ion Current (Totalionenstrom)
TSH Thyreotropin
UDPGA Uridin-5`-Diphosphoglucuronsäure
UV Ultraviolett
z.B. zum Beispiel
Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und
nur mit den angegebenen Hilfsmitteln angefertigt habe. Diese Dissertation hat in
gleicher oder ähnlicher Form zuvor keinem anderen Prüfungsverfahren vorgelegen.
Ich habe noch keine anderen akademischen Grade erworben oder zu erwerben
versucht.
CURRICULUM VITAE
Persönliche Angaben Geburtsdatum:
30. Januar 1973
Geburtsort: Bad Kissingen, Deutschland Staatsangehörigkeit: deutsch
Ausbildung 09.98 - heute
Promotion
Bei Privatdozent Dr. Markus Veit „Systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Thymol nach oraler Applikation einer thymianhaltigen Zubereitung im Menschen“
06.00 – 06.01 Bionorica AG
04.00 - 05.00 DAAD Stipendium, University of Florida, Gainesville, USA, bei Prof. Dr. H. Derendorf, Department of Pharmaceutics
09.98 - 03.00 Universität Würzburg,
Lehrstuhl für Pharmazeutsiche Biologie
01.98 - 08.98 Apothekenpraxis
Elisabeth Apotheke, Schweinfurt
11.96 - 11.97 3. Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung
05.97 - 11.97 2. Hälfte des Praktischen Jahres: Henneberg-Apotheke, Nüdlingen
11.96 - 05.97 1. Hälfte des Praktischen Jahres: Apotheke des Klinikums St. Marien, Amberg
11.92 - 10.96 Pharmaziestudium
Bayerische Julius-Maximilians-Universität Würzburg, 1. Staatsexamen September 1994 2. Staatsexamen Oktober 1996
1983 - 1992 Mai 1992
Gymnasium Bad Kissingen Abitur
1979 - 1983 Anton-Kliegl Schule Bad Kissingen