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1ª reunião em 10/12/1994 - Laboratório Fleury – INÍCIO
2ª reunião em 18/03/1995 - Laboratório Sergio Franco
3ª reunião em 05/08/1995 - Fundação Maria Cecília Souto Vidigal
4ª reunião em 09/02/1996 - Hemocentro de Botucatu – HC Faculdade de Medicina – UNESP
5ª reunião em 30 e 31/08/1996 - Hospital Israelita Albert Einstein
6ª reunião em 19/06/1997 - Hotel Casa Grande no Guarujá, I Congresso Ibero-Latino Americano de Citometria de Fluxo
7ª reunião em 24/03/2002 – II Simpósio Internacional de Citometria de Fluxo- Hospital Israelita Albert Einstein
8ª reunião em 16 a 18/04/2009 – III Simpósio Internacional de Citometria de Fluxo-Hospital Israelita Albert Einstein
HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE
FLUXO NO BRASIL
HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE
FLUXO NO BRASIL
HEMO 2009
1ª reunião do GBCFLUX : 24/abril/2010 - DASA
2ª reunião do GBCFLUX : 19/junho/2010 - Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo - SP
3ª reunião do GBCFLUX : Laboratório Fleury
CITOMETRIA DE FLUXO
HISTÓRICO E PRINCÍPIOS
CITOMETRIA DE FLUXO PARA CLÍNICOS
PROGRAMA EDUCACIONAL HEMO 2010
Mariester Malvezzi
Universidade Federal do Paraná
HC-UFPR
HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO
Inicia com a Microscopia no século XVII - Loewenhoek
Século XIX Corantes – Erlich – 1880-Fluoresceína
1934 Moldavan sugere um aparelho que conte células com um fotodetector que registra a passagem da célula.
Anos 40-50 Microscopia de fluorescência em lâmina
# - corantes para ácidos nucleicos de células neoplásicas
# - ligação de anticorpos a marcadores de fluorescência
1956 Coulter desenvolve um sistema que conta as células sanguíneas através de sinais elétricos, enquanto elas passam por um fluxo contínuo.
HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO
1965 Fulwyler – Lab Nac de Los Alamos desenvolve um
aparelho que separa eritrócitos, combinando a tecnologia
Coulter com a tecnologia do jato de tinta usada em
impressoras - vibração.
1967 Kamenstsky e Melamed colocam a célula em um
tubo capilar e a separam em fluxo.
1968 Wolfgang Gohde – Un. Munster+Partec
Impulszytophotometrie
1969 Van Dilla utiliza em um mesmo aparelho a
fluorescência + princípio de focalização hemodinâmica +
iluminação a laser.
HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO
1972 Herzenberg usou Anticorpos ligados à fluoresceína, BD e
cunhou o termo FACS Fluorescence Activated Cell Sorter
1975 Kohler e Milstein criam os primeiros anticorpos monoclonais,
através da fusão de material genético de células B antígeno-
específicas com células de mieloma múltiplo.
Após houve uma colaboração frenética entre cientistas e indústria
citômetros para pesquisa facilidade no uso citômetros mais
acessíveis para o laboratório clínico a partir de 1980.
1988 Conferência de Engenharia da Fundação Americana muda o
nome de Impulszytophotometrie para Citometria de Fluxo
CITÔMETROS
1968 1973
CITÔMETROS
FACSCan - 1974
EPICS – 1977/78
SHAPIRO, M.H. Practical Flow Cytometry, 3ed, New York, Wiley-Liss, 1995.
http://picf.ioc.fiocruz.br/apostila.docDr. Álvaro Luiz Bertho, PhD
HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO
ÁREAS DO CONHECIMENTO LIGADAS
À CITOMETRIA DE FLUXO
SISTEMA DE
FLUXO COULTER
LASER
SEPARAÇÃO CELULAR
ANTICORPO
MONOCLONALFLUOROCROMO
CITOQUÍMICA
COMPUTAÇÃO
PROGRAMAS
ANÁLISE
IMUNOFENOTIPAGEM
COMPARAÇÃO ENTRE IMUNOFLUORESCÊNCIA POR
MICROSCOPIA E CITOMETRIA DE FLUXO
MICROSCOPIA CITOMETRIA
* 100 - 1000 CÉLS/ EXAME * > 1 MILHÃO CÉLS/ EXAME
* 5 MINUTOS / TESTE * 1 MINUTO / TESTE
* SUBJETIVO * OBJETIVO
* POSITIVO/NEGATIVO * MULTIPARAMÉTRICO
* BAIXA REPRODUTIBILIDADE * ALTA REPRODUTIBILIDADE
* TRABALHOSO * AUTOMATIZADO
O QUE É?
Método de análise citológica através
de instrumento equipado com laser, que
permite a identificação, a caracterização, a
contagem e a separação física de células
em suspensão.
PROPRIEDADES
Permite avaliar um grande número
de células
Em curto período de tempo
Com grande sensibilidade e
especificidade
Proporcionando informação
multiparamétrica
1- Preparo da
amostra em
bancada -
Paineis
2- Passagem
da amostra
no citômetro
3- Análise dos
gráficos
FLUXO
1- Preparo
da amostra
em bancada
-Paineis
2- Passagem
da amostra
no citômetro
3- Análise dos
gráficos
FLUXO
É PRECISO SABER
O QUE É CD ?
NÃO É “COMPACT DISK”.
É “CLUSTER OF DIFFERENTIATION”.
PADRONIZA AS VÁRIAS ORIGENS DE CLONES
DE ANTICORPOS MONOCLONAIS UTILIZADOS
PELAS DIVERSAS EMPRESAS, AGRUPANDO-OS
NUM SÓ NÚMERO, SEGUIDO OU NÃO DE
LETRAS MINÚSCULAS.
O MESMO NOME DO CD DEFINE O ANTÍGENO.
Cada CD é ligado a um fluorocromo específico-ID
Paineis – Morfologia?
1- Preparo da
amostra em
bancada -
Paineis
2- Passagem
da amostra
no citômetro
3- Análise dos
gráficos
FLUXO
FUNDAMENTOS
ANALISA PARTÍCULAS em SUSPENSÃO.
PARTÍCULAS + AcMo LIGADO ao FLUOROCROMO.
ALINHAMENTO das CÉLULAS umas ATRÁS das OUTRAS em
uma CORRENTE FLUÍDICA.
PASSAGEM por uma FONTE LUMINOSA - LASER.
GERAÇÃO de DISPERSÃO de LUZ ao ENCONTRAR a CÉLULA.
EMISSÃO de NOVAS CORES PRODUZIDAS pelos DIFERENTES
FLUOROCROMOS, LIGADOS aos AcMo ESPECÍFICOS.
DETECÇÃO dos SINAIS LUMINOSOS.
TRANSFORMAÇÃO em IMPULSOS ELETRÔNICOS.
AMPLIFICAÇÃO dos SINAIS ELETRÔNICOS.
CONVERSÃO DESTES em SINAIS DIGITAIS.
ANÁLISE em PROGRAMA de COMPUTADOR.
É PRECISO SABER
*Parâmetros de dispersão de luz
FSC tamanho celular - viabilidade e conteúdo de DNA
SSC composição interna - grânulos, organelas e núcleo
*Parâmetros de fluorescência
# FL1 FITC = Fluoresceína
# FL2 PE = Ficoeritrina
# FL3 PECy5=Cianina, PerCP=Peridinina, ECD
# FL4 APC = Alocianina
Dispersão de Luz
Laser
Sensor FSC
Sensor SSC 900
5º
Fluorescência
Dispersão de Fluorescência
Dispersão de Luz +
Fluorescência
Laser
.FSC
. Detectores de Fluorescência
(PMT1, PMT2, etc.)
. SSC
INTERIOR DE UM CITÔMETRO DE
04 CORES
C
É
L
U
L
A
S
P
A
S
S
A
N
D
O
1- Preparo da
amostra em
bancada -
Paineis
2- Passagem
da amostra
no citômetro
3- Análise
dos gráficos-
Programas
de Análise
FLUXO
Tipos de diagramas
1 parâmetro
Histograma
2 parâmetros
Dot Plot
CÉLULAS CD34+
CD45 EM MO NORMAL
Eosinophils
Monocytic
cells
Mature
Lymphocytes
CD34+ B-cell
precursors
HPC
NRBC
A
UNGATED BM EVENTS
Basophils
pDC
CD34- B-cell precursors
CD45-PerCP
SSC
Orfao,A. 2009
CD45 EM MO NORMAL
EVOLUÇÃO
CITÔMETROS
FACSCaliburFC-500
FACSCanto II
CITÔMETROS
FACS-ARIA EPICS-ALTRA
NOVOS LASER/FLUOROCROMOS
1-Laser azul 488nm: FITC – 519nm, Alexa Fluor 488-519nm, PE- 578nm, PE-Texas Red- 615nm, PE-Cy5-667nm, PerCP- 678nm, PerCP-Cy5.5- 695nm, PE-Cy7-785nm.
2- Laser vermelho 640nm: APC- 660nm, Alexa Fluor647- 668nm, Alexa Fluor 700- 719nm, APC-Cy7- 785nm, APC-H7- 785nm.
3- Laser violeta 405nm: Horizon V450- 448nm, PacificBlue- 452nm, Am Cyan- 491nm, Horizon V500- 500nm.
4- Laser verde 532/561nm: PE- 578nm, PE-Texas Red-615nm, PE-Cy5- 667nm, PE-Cy7- 785nm.
O que mais podemos analisar
por Citometria de Fluxo?
Metabolismo
ReceptoresDNA Citocinas
Enzimas
Antígenos celulares
Tamanho
Complexidade
FUTURO
FUTURO
?
TUDO É POSSÍVEL
HOSPITAL DE CLÍNICAS - UFPRHOSPITAL DE CLÍNICAS DA UFPR
EQUIPE DE IMUNOFENOTIPAGEM
Ana Paula de AzambujaEdna MartinsEliana L LimaElisa NovelloJuli PimentelMaria Tadeu L RochaMiriam P Beltrame Noeli T Silva
OBRIGADA
1968- Wolfgang Gohde-Citometria de fluxo baseada em fluorescência-IMPULSZYTOPHOTOMETRIE-Un de Munster+Partec
1971-Cytofluorograph-Ortho diagnostics
1973-PAS 8000-Partec
1974-FACS-BD
1975-ICP22-Partec
1977-78-EPICS- Coulter
CITÔMETROS
Dispersão de Luz
Laser
SSC
FSC
LINFÓCITOS T MADUROS
CD4
CD8
CD2
CD7
CITÔMETROS
Partec
CyAn
Tamanho - FSC X
Complexidade - SSC
FSC X SSC
PLAQUETAS GIGANTES
PLAQUETAS DIÂMETROAUMENTADO
PLAQUETAS NORMAIS
FSC X SSC FSC X SSC
Gráfico de
Fluorescência
R2
O que é necessário para a
imunofenotipagem celular?
Citômetro de fluxo: compensação, calibração e
controles negativos
Anticorpos monoclonais
Fluorocromos
Paineis
Programas de Análise
CITÔMETROS
HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE
FLUXO NO BRASIL
Curitiba-antes de 1985-Ac trazidos da Itália pelo Dr.Eurípedes permitiam fazer diagnóstico de leucemias com E-roseta, Zimosan e a citotoxicidade.
Em 1985 Dr. Raul Ribeiro trouxe dos EUA Ac e a reação em placa , que colocada em lâminas eram lidas em microscópio de imunofluorescência.
FMUSP-1993-Beatriz Beutler
Em 1993-citometria de fluxo – 1997 – FACSVantage
EPM- 1987-imunofenotipagem por imunofluorescência
1989- APPAP-imunocitoquímica
1997-Citômetro FACSCalibur
Maria do Socorro Pombo de Oliveira-INCA, Valéria Buccheri-Fundação maria Cecília Vidigal, Neusa Melo -USP=Dr. Catovski
Lab Fleury-Dra.Maria Hsu – 1994=1ª reunião de Citometria de Fluxo, HAEinstein-Dra. Nydia Bacal