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CEBI_E9 Angélica Morales

CINÉTICA Y ESTEQUIMETRÍA DE LAS CÉLULAS


CINÉTICA Y ESTEQUIMETRÍA DE LAS CÉLULAS

UNIDAD 4

Crecimiento de células en cultivos discontinuos. Factores que afectan la velocidad de crecimiento. Definición de velocidad específica de crecimiento de células y formación de productos extracelulares. Expresiones cinéticas para describir la velocidad de crecimiento balanceado. Clasificación de modelos cinéticos. Modelos cinéticos no-estructurados. Ecuación de Monod y otras expresiones cinéticas de modelos no-estructurados. Modelos cinéticos estructurales. Modelos estadísticos. Estequiometría de procesos con crecimiento de células. Elección y optimización del medio de cultivo. Elección y optimización de las condiciones de cultivo. Cultivos mixtos. Interacciones entre especies. Competición y selección en un quimiostato. Problema de producción debido a cultivos mixtos.


Crecimiento de células

Crecimiento implica un aumento ordenado de todos los componentes de un organismo y no solamente

de alguno de ellos.

En organismos unicelulares el crecimiento conduce a un aumento en el número de células más que un

aumento en el tamaño celular.


Cultivo de los microorganismos

En la naturaleza: Los microorganismos usualmente existen en biofilms: grupos de diferentes microorganismos organizados en capas sobre una superficie: Cooperatividad – competencia.

En el laboratorio: Los organismos son estudiados como cultivos puros crecidos con abundancia de nutrientes a muy altas densidades (Cultivos estáticos o continuos)

Formación de una biopelícula de Escherichia coli en una manzana inoculada

Escherichia coli (Tinción de Gram)


Crecimiento de células en cultivos discontinuos (Batch)

• Tejido

• Células en adherencia

• Células en suspensión



Batch Batch


Crecimiento de células en cultivos discontinuos (Batch) Luego de la adición de microorganismos/células al medio líquido fresco se observa la siguiente cinética de crecimiento:

Fase lag: Es la fase de adaptación al medio., existe un aumento de la masa celular pero no hay aumento en el número de células. Las células se adaptan al nuevo ambiente, aún no se dividen. • Se puede minimizar con inóculos frescos y de mayor concentración. • Se incrementa cuando se utilizan varias fuentes de carbono • Se puede extender dependiendo los nutrientes que se tenga el medio



Fase exponencial (log): Velocidad máxima de crecimiento bajo condiciones particulares, tiempo de generación mínimo



Fase estacionaria: Sin crecimiento neto, υc = 0 ó estadísticamente = 0

Cuando υc = υm ( Vel. Crecimiento es igual a la Vel de muerte). •Nutrientes limitantes, pero suficientes para mantener actividad. •Acumulación de desechos, inhibición del crecimiento: Producción de metabólitos secundarios



Fase muerte: Velocidad de muerte celular > velocidad de división celular



Via

bles

Prod. X

Prod. De Metabólitos Secundarios

Desaceleración

Crecimiento balanceado


Crecimiento balanceado Una población microbiana/celular que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus parámetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular es un valor constante y similar en cada caso. El Nº de células, la masa celular u otros componentes se duplicará en un mismo lapso de tiempo determinado. Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza por: Todos los constituyentes celulares se duplican al mismo tiempo. Estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo.

Este factor es el coeficiente de crecimiento exponencial (µ) que es característico para cada cepa en cada medio determinado.



Se manifiesta en la fase exponencial de crecimiento. Todos los individuos de la población microbiana o celular crecen a igual velocidad.

La cinética es equivalente si se mide en UFC, Cel/mL ó masa celular (Células viables).

Cómo la [sustrato] es elevada, la velocidad de crecimiento es independiente de la misma.

El tiempo de duplicación requerido será:

X = X0 e (µnet t)


Velocidades de crecimiento de microorganismos y células


Crecimiento NO balanceado Se manifiesta en la fase estacionaria de crecimiento.

los individuos de la población microbiana no crecen a igual velocidad.

Agotamiento de nutrientes y/o

Presencia de toxinas inhibidoras (Prod. de etanol x levadura)

Las células son aún metabólicamente activas y producen metabolitos secundarios no relacionados al crecimiento.

Durante la fase estacionaria pueden tener lugar uno o más de los siguientes fenómenos: • La concentración total de células puede ser contante, pero el número de células viables disminuye.

• Puede haber lisis de la materia celular y puede bajar el número de células viables. Puede ocurrir una fase secundaria de crecimiento (crecimiento críptico) basado en las células lisadas (sustrato alternativo).

• Las células puede que no crezcan pero tienen un metabolismo activo para producir metabolitos secundarios.


Crecimiento NO balanceado

En la fase estacionaria, los microorganismos suelen adaptarse a la falta de nutrientes (Condición de starvation): supervivencia prolongada, incremento en la resistencia de condiciones de estrés (salino, térmico, oxidativo, osmótico etc.).

Hay expresión diferencial de genes al entrar en estado estacionario.

Algunas células pierden la capacidad de reproducirse, pero se mantienen vivas (viables no cultivables)

ENERGÍA DE MANTENIMIENTO

La célula debe gastar energía en forma permanente para: Mantener su membrana energizada

Transportar nutrientes para realizar funciones metabólicas esenciales

Reparar estructuras celulares


El final de la fase estacionaria se produce por agotamiento de nutrientes o por acumulación de sustancias tóxicas

Muerte

X = Xs e (-kd`t)

Xs = Concentración de células al final de la fase estacionaria Kd`= Cte de muerte (h-1)

X0 = Xs [Células] final fase estacionaria = [Células] inicial fase muerte


FACTORES QUE AFECTAN LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO


1) TEMPERATURA Relación temperatura-velocidad de crecimiento (Ecuación de Arrhenius)

Temperaturas cardinales: Mínima, máximas y óptimas


Clasificación • Psicrófilos: - Rango: < 0 – 20°C, óptimo <15°C - Organismos marinos. Algas: Chlamydomonas nivalis (nieve rosada) Bacterias: Pseudomonas, Flavobacterium - Membrana contiene un alto % de ácidos grasos insaturados

• Psicrótrofos o psicrófilos facultativos: - Rango: 0 – 35°C, óptimo 20-30°C - Pseudomonas: Crecen en la nevera

• Mesófilos: - Rango: 15 – 45°C, óptimo 30-40°C - La mayoría de los microorganismos (Del suelo, aguas, patógenos, etc.)

• Termófilos: - Rango: 40 – 70°C, óptimo 55-65°C - Membrana contiene un alto % de ácidos grasos saturados - Enzimas estables al calor. - Bacillus stearothermophilus. Organismos de compostaje

• Hipertermófilos: - Rango: 80 –113°C, óptimo > 90°C - Pyrococcus, Pyrodictium. Aguas termales


Clasificación


Efecto de la temperatura sobre µmax y Yx/s de un cultivo aeróbico en glucosa (A. aerogenes)


2) OXÍGENO Clasificación de los microorganismos según el efecto de oxígeno:

• Aerobios: → Obligados: Requiere O2 (21% ó más). Ej: Bacillus, hongos, etc. → Microaerofílos: Requieren O2 pero a niveles menores que el atmosférico (5-10%) Ej: Azospirillum; Lactobacillus. • Anaerobios: → Facultativos: No requieren O2 , pero el desarrollo es mejor con oxígeno. Ej: E. coli, Levaduras, etc. → Aerotolerantes: No son sensibles al O2 (Crecen en ausencia o presencia de O2) Ej: Enterococcus faecalis, Streptococcus spp. → Obligados: No toleran el O2 (Mueren en presencia de O2) Ej: Methanobacterium, Clostridium


Oxígeno…


Otros gases…

N2 → Componente principal de la atmósfera (~78%). Gas inerte. No es usado por la mayoría de los organismos, lo que pueden reducir el triple enlace de N2 con la enzima nitrogenasa se denominan diazotrofos o fijadores de N2 y pueden desarrollarse en ambientes sin N-combinado. CO → Tóxico para la mayoría de los organismos (cadena respiratoria) puede ser oxidado a CO2 por algunos mØ. CH4 → Liberado a la atmósfera por microorganismos metanogénicos, gas con efecto invernadero, puede ser oxidado a CO2 por bacterias metanotróficas. CO2 → Importante gas. Fuente de carbono para autótrofos, aerobios, anaerobios, fotosintéticos o quimiosintéticos. Muchos hongos lo requieren a niveles superiores a los atmosféricos, para ciertas síntesis. H2 → Poco usado. Tóxico para la mayoría de los microorganismos, brinda energía a bacterias Hydrogenomonas: H2 + O2 = H2O + ATP


Transferencia de oxígeno en procesos fermentativos

El oxígeno es un nutriente gaseoso y poco soluble Solubilidad es afectada por: - La T - La P parcial del gas (Pg) - Otros solutos (Ej: sales) Solubilidad de un gas en un líquido (Que tanto gas hay en el liquido):

→

→

[líquido] Cte. de Henry Pparcial de O2


Transferencia de oxígeno en procesos fermentativos

Velocidad de Consumo / Demanda ó “UPTAKE RATE” (OUR)

Velocidad de Transferencia ó “TRANSFER RATE” (OTR)

En el transcurso de la Fermentación → OTR debe satisfacer la OUR Si la Transferencia < Demanda → Limitación de Oxígeno Si la Transferencia > Demanda → Se gasta energía en exceso

CUANDO EL OXÍGENO SE CONVIERTE EN UN NUTRIENTE LIMITANTE, LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES DEPENDERA DE LA CONCENTRACIÓN DE

OXÍGENO DISUELTO


Cálculo de la Demanda (OUR)

Si el sustrato limitante es el O2 →

Velocidad específica de consumo de oxígeno ó demanda específica (mmol ó mgO2 /gX.h) Velocidad de Demanda Total

Cuando se grafica la velocidad de consumo en función de la concentración de oxígeno disuelto:

Región limitante de O2

υconsumo máx

Limitación de O2


Características de la Demanda

1. La demanda varía a lo largo del tiempo: x = f (t) qO2 = f (t)

2. La demanda es proporcional al crecimiento

3. La demanda específica ó velocidad específica de consumo de oxígeno depende de: - La concentración de oxígeno disuelto [O2] - La edad del cultivo - Fase de crecimiento (qO2 es máxima cuando µ es máxima, es decir durante la fase exponencial) - Tipo de cultivo


Transferencia de oxígeno en procesos fermentativos (OTR)

Donde: KL = Coef. De transferencia de masa de O2 a = Área de transferencia gas-liq (cm2/cm2) NO2 = Velocidad de trasferencia de masa de O2 (mg/L h) C* = Concentración de O2 saturado CL = concentración de O2 en el medio

Que ocurre durante el transcurso de una fermentación? 1. En ausencia de mØ: Mientras el TK no se ha inoculado el consumo de O2 es nulo. Se transfiere O2 hasta que el sistema se satura En estas condiciones: CL aumenta progresivamente hasta que CL = C*. Cuando CL = C*, entonces CL - C* = 0, y la transferencia se hace nula, pues cesa la fuerza impulsora. 2. Cuando hay un cultivo en crecimiento: CL se mantiene bajo, pues el O2 que se disuelve en el seno del líquido es

inmediatamente consumido por los mØ. el sistema no llega a saturarse pues en todo momento CL < C* y la fuerza impulsora

es >0

Oxygen Transference Rate (OTR)


Cuando el medio en que se encuentra un microorganismo es perturbado, el microorganismo pone en marcha una serie de mecanismos que actúan para mantener las actividades fisiológicas y los parámetros fundamentales relativamente sin modificación.

Homeostasis microbiana

Mecanismos homeostáticos activos (Células vegetativas) La célula microbiana debe gastar energía para contrarrestar el estrés impuesto por el medio ambiente externo Ej: Sintetizar de nuevos componentes, reparar componentes dañados, incrementar el transporte de moléculas específicas a través de las membranas celulares

Mecanismos homeostáticos pasivos (Esporas) Son parte de la constitución celular (Antes de que el estrés sea impuesto: Homeostasis refractaria) y no requiere energía para operar. Ej: Mecanismo construidos en la espora bacteriana durante su formación que le permiten resistir altas T y otros estreses extremos

Mecanismos homeostáticos de población En un dado nicho ecológico mantiene la población de un mØ relativamente contante, aunque el medio este cambiando, para excluir potenciales competidores. Ej: Excreción de ácidos y síntesis de agentes antimicrobianos naturales, tales como nisina y otros bactericidas por bacterias lácticas para prevenir la invasión del nicho ecológico por otro mØ.


3) pH

El pH es la acidez o alcalinidad de una solución, medida por el log 1/(H+) Clasificación de los microorganismos según su pH óptimo:

• Neutrófilo: - pH óptimo 7 - Bacterias patógenas humanas. • Acidófilo - pH óptimo < 7 - Muchas de las archeobacterias y hongos

• Alcalófilo: - pH óptimo > 7 - Presentes en suelo y aguas ricas en carbonatos


pH Ácidos fuertes: Modo de acción: Desnaturalización de enzimas de la superficie celular y disminución del pH citoplasmático por el pasaje de H+ a través de la membrana debido al gradiente de pH. Respuesta a la reducción de pH: Expulsión de protones a través de la membrana celular y/o prevención de la entrada de H+ al citoplasma Para mantener el pH citoplasmático mayor que el del medio y aproximadamente constante.

Ácidos lipofílicos débiles: (Cítrico, málico) Modo de acción: La forma no disociada del ácido permea a través de la membrana y debido al > pH celular la molécula se disocia, resultando en la acumulación de protones y de aniones adentro de la célula. El crecimiento se inhibe debido a un número de acciones: • Disrupción de membrana •Inhibición de reacciones metabólicas esenciales • Estrés sobre la homeostasis de pH intracelular • Acumulación de aniones tóxicos Respuesta a la reducción de pH: Algunos mØ degradan enzimáticamente el ácido débil (Ej. degradación de ácido sórbico a pentadieno por ciertas especies fúngicas) � Expulsión de H+ (bomba de H+ - ATPasa de membrana) � Algunos mØ remueven de la célula los aniones acumulados (bomba de resistencia multidroga) � Alteración de la composición de la membrana para reducir el coeficiente de difusión del conservador a través de la membrana plasmática.


pH

Ácidos lipofílicos débiles

Mecanismo de acción del ácido en la célula


4) ACTIVIDAD DE AGUA (aw)

El agua disponible en un hábitat para llevar a cabo el procesos metabólico. La aw del medio es la relación entre la presión de vapor del agua en el medio (P) y la del presión de vapor de saturación de agua pura (Po) a la misma temperatura Se relaciona con el punto de congelación, humedad relativa, ebullición y presión osmótica.

aw = P/Po La mayoría de las bacterias no pueden crecer a valores de aw inferiores a 0,91. Mientras que los hongos pueden crecer a valores inferiores a 0,80.

Efectos de la aw sobre los microorganismos: - Acumulación de prolina y glutamina - Acumulación de Alcohol - Acumulación de solutos y osmoreguladores (Hongos)


Actividad del Agua(aw)


Homeostasis activa… CELULAS VEGETATIVAS Reducción de la aw Modo de acción: Plasmólisis de la célula con pérdida del turgor de membrana. Respuesta a la reducción de aw (“osmoregulación”): • Acumulación de “solutos compatibles” (por síntesis y/o por transporte activo desde el medio extracelular) para evitar la pérdida de agua y mantener el turgor de membrana. �

•Alteración de la composición de los lípidos de membrana para impedir el pasaje de la fase lamelar (o bicapa) a la fase no lamelar (hexagonal), que alteraría su permeabilidad y las interacciones lípido – proteína, influenciando actividades proteína – mediadas (ej. sistema de transporte, bombeo de iones, etc.).


La actividad de agua (aw) mínima de crecimiento de los microorganismos varía de acuerdo a su capacidad de

osmoregulación

Osmoregulación…


5) OTROS FACTORES Potencial Redox: • Es un parámetro importante en reacciones de óxido reducción • Es la capacidad con la que un sustrato pierde o gana electrones • Cede = Reductor, Capta = Oxidante • Las sustancias del medio con estas propiedades favorecen el crecimiento de mØ aerobios y anaerobios respectivamente • Está en relación con el pH, la [O2 ]y la [Sust.reduct] o [Sust.oxid]

• Se puede reducir por inyección de N2 (baja la OUR) o agregado de agentes reductores (cisteina, Na2S,etc) • Se puede oxidar por agregado de O2 ó agentes oxidantes. • Los Lactobacilos y Estreptococos requieren condiciones ligeramente reducidas (microaerobios). • Los hongos y levaduras de los alimentos son aerobios y unos pocos anaerobios facultativas. • Conforme crecen los aerobios se reduce el oxígeno y el E0 , aumentando las sustancias reductoras en el medio. Entre mas aumenta la basicidad reduce el E0 .


CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO


CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Es una reacción auto-catalítica La velocidad de reacción depende de la concentración celular

Productos extracelulares

Velocidad específica neta de crecimiento (h-1) Alternativa…


Cinética de crecimiento microbiano…

μnet se define como la diferencia entre la velocidad de crecimiento (μg) y la velocidad de desaparición de biomasa (muerte celular ó metabolismo endógeno, kd)

CUANTIFICACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE CÉLULAS Es esencial para determinar la cinética y la estequiometría microbiana. Métodos de cuantificación - DIRECTOS - INDIRECTOS Se puede cuantificar: - Nº células/volumen - Masa celular/volumen (más frecuente)


COEFICIENTE DE MANTENIMIENTO

Se usa para describir el consumo de substrato para el mantenimiento celular

Se define en la forma:

El mantenimiento celular es la energía usada para reparar los componentes celulares dañados, transferir nutrientes y productos dentro y fuera de las células, para la motilidad, para ajustar la osmolaridad del interior celular. � Dado que en el crecimiento microbiano la formación de producto y la utilización de substrato son autocatalíticos, siempre se divide por X para normalizar. Si no se dispone de S, el mantenimiento inducirá pérdida de masa celular (metabolismo endógeno)


CLASIFICACIÓN DE LOS PRODUCTOS MICROBIANOS

1. Productos asociados con el crecimiento: Es decir, la velocidad especifica de formación de producto (qP) es proporcional a la velocidad especifica de crecimiento (μg)

2. Productos no asociados al crecimiento: Eso ocurre cuando los productos se forman en la fase estacionaria durante la cual la velocidad de crecimiento de células es igual a cero.

La velocidad especifica de formación de producto (qP) es constante (Ej: metabolitos secundarios, penicilina)

3. Formación de producto mixta: Se produce durante el crecimiento y durante la fase estacionaria.

Ej: fermentación láctica, goma xantano. Si α = 0, el producto no esta asociado al crecimiento Si β = 0, el producto esta asociado al crecimiento y α = YP/x


Clasificación de productos microbianos…

(a) Asociado al crecimiento (b) Semiasociado al crecimiento (c) No asociado al crecimiento


MODELOS CINÉTICOS

Se puede distinguir entre las células individuales: • Modelos segregados: Cuando la población se segrega en células individuales que son distintas unas a otras en términos de alguna característica distinguible. • Modelos no segregados: Considera a la población como un todo, como una biofase, la cual interacciona con sus alrededores y puede verse como una especie en solución. La concentración de células se puede expresar como una única variable. Se pueden examinar las reacciones dentro de la célula: • Modelos estructurados Consideran a las reacciones o a los grupos de reacciones que ocurren dentro de la célula. La biomasa se divide en un cierto numero de componentes, Ej: DNA, RNA, proteínas, etc. y se describen las reacciones que tienen lugar entre estos componentes. • Modelos no estructurados Ven a la célula como una entidad en solución que interacciona con su entorno.

Seleccionar el modelo más simple y que represente adecuadamente al sistema de interés

El crecimiento de los microorganismos se puede ver desde varias perspectivas y con distinta complejidad


Modelos cinéticos…

NO ESTRUCTURADO ESTRUCTURADO

NO SEGREGADO

Caso más ideal Un solo componente. Descripción de las células como promedio

Multicomponente. Descripción de las células como promedio

SEGREGADO Un solo componente. Población celular heterogénea

Multicomponente. Población celular heterogénea, Células tratada s a nivel individual

A A

B

B A = Aproximación que considera una población celular promedio, en lugar de una población de células individuales. B = Aproximación de crecimiento balanceado. Entre los múltiples componentes que hay en el medio, el crecimiento se describe en función de uno. Tampoco se consideran los distintos compartimientos que tiene la célula.


Modelos cinéticos…

Nos restringimos a modelos NO ESTRUCTURADOS / NO SEGREGADOS

Modelos NO ESTRUCTURADOS: Supone una composición fija de células (Equivalente a suponer crecimiento balanceado) • Son estrictamente válidos para la etapa de crecimiento exponencial en Batch y alimentación en cultivos continuos.

• No funcionan bien para transientes, salvo que la respuesta de la célula sea rápida y/o las perturbaciones sean leves.

Modelos NO SEGREGADOS: Consideran un medio homogéneo • Representan adecuadamente muchos casos.


MODELO DE MONOD

Es uno de los modelos más simples y fue propuesto por Monod en 1950. Ajusta a una amplia gama de resultados experimentales. Se supone que hay un solo sustrato que es limitante y que controla la velocidad de crecimiento de biomasa.

Si hay más de un sustrato limitante se diseña con el que da la mínima μg Parámetros:

μmax: velocidad máxima de crecimiento KS : constante de saturación


Modelos de crecimiento controlados por sustrato…

• Corresponde a la concentración de sustrato correspondiente a la mitad de la velocidad máxima:

μg=0,5 μmax cuando S= Ks

• Da una idea de la afinidad que tiene el microorganismo por el sustrato en cuestión. • A menor KS mayor afinidad • En general KS tiene valores muy bajos, del orden de los mg/L • Concentraciones relativamente bajas de S son suficientes para hacer que μ=μmax .


Calculo de µmax y Ks… Velocidad específica de crecimiento en función de la concentración de sustrato (recíproca).

El cálculo de KS y μmax es posible estimarlo reordenando la ecuación de Monod según Lineweaver-Burk:

1 Ks + 1 μg μmax S μmax

De tal manera que graficando 1/μ vs 1/s se obtiene una recta cuya pendiente es KS/ μmax y la intersección en el eje x es igual a -1/KS y la intersección en el eje y es igual a μmax . Otra modificación fue realizada por Langmuir S Ks + S m μg μmax μmax

1 µmax

1 µ

Ks µmax

- 1 Ks

1 S

μmax

=

=


Modelo de Monod…

Ajusta bien para cultivos con ↓ μg y ↑ [células] donde las condiciones ambientales se describen mejor para ↓ [sustrato]

Cultivos concentrados: Si el consumo del sustrato fuente de carbono es rápido, la liberación de productos tóxicos será determinante en la velocidad de la reacción:

Otras expresiones semi-empiricas ajustables de acuerdo a la forma de la curva de crecimiento:

•Ecuación de Blackman:

• Ecuación de Moser:


MODELOS CINÉTICOS - INHIBICIÓN

• Inhibición por sustrato • Inhibición por producto • Inhibición por productos tóxicos

Competitiva

No competitiva

Acompetitiva


Inhibición competitiva…

Un exceso de sustrato inhibe la reacción de formación de biomasa. Un producto tóxico que compita con el sustrato pero que no genere biomasa Cambia Ks y se mantiene μmax

I= inhibidor; sustrato; producto


Inhibición NO competitiva…

Ks no se altera. μmax disminuye.


�Ej: Producción de etanol (>5%) por levaduras a partir de glucosa.


Inhibición Acompetitiva…


Tanto la μmax como la Ks disminuyen, lo que se manifiesta en la representación de dobles inversos como rectas paralelas.

La reducción en μmax es mayor que en Ks por lo tanto el efecto neto es una reducción de la velocidad.


ESTEQUIMETRÍA DEL CRECIMIENTO

Formulación del medio y factores de rendimiento


COMPOSICIÓN MEDIOS DE CULTIVO

MICRORGANIMOS CÉLULASVEGETALES CÉLULAS ANIMALES

Fuente de Carbono y

energía

Carbohidratos, ácidos orgánicos, alcoholes, hidrocarburos, etc.

Carbohidratos Glucosa

Fuente de Nitrógeno

Amonio suplementado com o (NH4)2SO4 em microorganismos, también extracto de levadura u otros hidrolisados

Amonio suplementado com o (NH4)2SO4 y KNO3

Aminoácidos Suero fetal bovino

Macroelementos Sales de fosfato, magnesio, po tasio, calcio y sulfatos.

Sales de fosfato, m agnesio, potasio, ca lcio y sulfato s.

Sales de fosfato, magnesio, potasio , calcio y sulfatos. Bicarbonato de sodio

Microelementos Zn, Mn, Fe, Cu, Co, Ca y otros menos requeridos com o B, Cr, Mo, etc.

Zn, Mn, Fe, Cu, Co, Ca y otros menos requeridos com o B , C r, M o, etc.

Zn, Mn, Fe, Cu, Co, Ca y otros menos requerid os como B , C r, M o, etc.

Factores de crecimiento

Vitaminas, aminoácidos, etc.

Vitaminas, fitohormonas (auxinas, citocininas, giberelinas, etc.)

Vitaminas, hormonas, etc.


DESTINO DE LOS NUTRIENTES

MANTENIMIENTO CELULAR

BIOMASA PRODUCTO CALOR

CwHxOyNz


CRECIMIENTO CELULAR

Fuente de C + Fuente de N + O2 + minerales + nutrientes específicos

Masa celular + Productos + CO2

Célula

Sustrato Biomasa Productos


FORMULA QUÍMICA ELEMENTAL DE MICROORGANIMOS


RENDIMIENTO DE BIOMASA

Yx/s: La cantidad de material celular producida por unidad de substrato consumido (rendimiento de biomasa con respecto al substrato)

Yx/s = gramos de biomasa formados/gramo de substrato usado También se pueden definir rendimientos en base a gr C celular/gr C de sustrato o C mol X/Cmol S. Los rendimientos se pueden calcular a partir de las reacciones estequiométricas.

Inversamente, las ecuaciones estequiométricas se pueden formular conociendo los rendimientos.

• El rendimiento de biomasa se ve afectado por factores como la composición del medio, la naturaleza de las fuentes de carbono y N, el pH y la temperatura. •� Yx/s es mayor en los cultivos aeróbicos que en los anaerobios. •� La elección del aceptor de electrones, es decir, O2 , nitrato o sulfato, también puede tener un efecto significativo.


Definición de Rendimientos

Rendimiento de células /sustrato consumido (g Cel / g S)

Es constante durante la fase exponencial Luego, pasa a ser Yx/s aparente porque el sustrato se emplea para otros fines

∆S = ∆SBiomasa + ∆SProducto extracelular + ∆SEnergía crecimiento + ∆S Energía mantenimiento

OTROS RENDIMIENTOS


Otros rendimientos…


Datos elementales de Candida utilis creciendo en dos fuentes de carbono diferentes


Para organismos que crecen aerobiamente en glucosa Yx/s ≈ 0,4 a 0,6 gX/gCconsumido

Yx/s ≅ 1,0 ±0,4 gX/g C consumido

Yx/O2 ≅ 0,2 gX/gO2


El crecimiento anaerobio es menos eficiente y los rendimientos más bajos


Curvas de rendimientos…

(a) Rendimiento YX/S = gX/gSconsumido (b) Rendimiento YP/X = gP/gXproducido (c) Rendimiento YP/S = gP/gSconsumido


ESTEQUIOMETRÍA

La estequiometría de una reacción química describe la cantidad exacta de cada reactivo que se necesita para formar un dado producto o productos. La reacción estequiométrica global observada es el resultado de dos reacciones distintas: - Una reacción de producción de energía - Una reacción de síntesis de masa celular � También puede haber una o más reacciones de producción de productos. En muchos casos se puede representar a un proceso de fermentación mediante una única pseudo reacción química.

Para glucosa: •Representa la cantidad de biomasa que se podría producir a partir de 1 mol de glucosa • Tiene en cuenta que la célula tiene que destinar parte del substrato a generar energía

→

→


Se ha determinado la estequiometría de otros sustratos y aceptores de electrones. (Las bacterias que reducen a los sulfatos pueden usar el acetato)

Ec. de generación de energía: CH3COOH

Estequiometría…

→


Formula elemental de algunos microorganismos

Componentes minoritarios, no se tienen en cuenta para la

formulación

Nutriente limitante: Substrato cuyo consumo controla la velocidad y/o concentración de la biomasa producida


Balance Elemental Si los únicos productos extracelulares son CO2 y H2O, el crecimiento aerobio se puede representar mediante:

El coeficiente de respiración RQ, moles de CO2 producidos por moles de O2 consumidos, permite resolver estas 4 ecuaciones con 5 incógnitas y hallar el valor de los coeficientes a, b, c, d, e :

� Esta ecuación no incluye a una gran cantidad de compuestos tales como el ATP (adenosin trifosfato) y el NADH, que integran el metabolismo celular y que sufren cambios cíclicos en la célula, pero que no sufren cambios netos con el ambiente . Las bacterias tienden a tener contenidos de N mayores (11- 14 %) que los hongos (6.3 – 9.0 %) � Para algunas especies, la composición depende también de las condiciones de cultivo y del substrato utilizados.

RQ moles de CO2 producidos e moles de O2 consumidos a

= =

Balances:

Coeficiente Respiratorio:


Ejemplo 1.

Determinar los coeficientes estequiométricos para el crecimiento aerobio de Saccharomyces cerevisiae a partir de glucosa siendo la formula de biomasa: CH1,703O0,459N0,171

Glucosa + O2 + Fuente de N2 → Biomasa + CO2 + H2O C6H12O6 + a O2 + b NH3 → c CHxOyNz + d CO2 + e H2O

Sistema de 5 ecuaciones con 5 incógnitas


Algunos problemas…

Antes de calcular los coeficientes estequiométricos hay que estar seguro que el sustrato no se utiliza para hacer otros productos extracelulares aparte del CO2 y H2O.

El agua se encuentra en gran exceso y sus cambios son difíciles de cuantificar, por lo cual se prefiere no usar los balances de O y H.

Otra complicación de los cultivos reales es que parte del sustrato se usa para el mantenimiento celular (mantener el potencial de membrana, el pH interno, reparación de componentes celulares y movilidad celular) Esas funciones consumen sustrato pero no producen biomasa.

Hay que distinguir entre rendimientos reales y aparentes, pues el gasto de mantenimiento depende de la condición metabólica.


BALANCE DE ELECTRONES � El balance de energía puede hacerse utilizando el concepto de grado de reducción. � Grado de reducción (γ): Nº e- que son transferidos desde el compuesto a oxidar al O2, tomando como base un C-mol. Expresa el Nº de e- disponibles/ C-mol. El valor de γ es una medida de la energía contenida en el compuesto.

• �El numero de electrones disponibles en los materiales orgánicos se calcula a partir de la valencia de sus elementos: 4 para el C, 1 para el H, -2 para el O, 5 para el P y 6 para el S. •El numero de electrones disponibles para el N depende del estado de referencia: -3 (NH3), 0 (nitrógeno molecular N2) y 5 (Nitratos). • �Para el sustrato CwHxOyNz, el numero de electrones disponibles/mol de compuesto es:

(4w + x – 2y – 3z) •�El grado de reducción γS del substrato (N° e- /C-mol) será entonces de:

γS = (4w + x – 2y – 3z)/w • �El valor de γ = 0 tanto para el CO2 como para el H2O y el NH3 (estados de referencia sin e- disponibles). • El grado de reducción del O2 es -4. • �Si en lugar de NH3 se hubiera elegido el N2 , la fórmula sería: γ = (4w + x - 2y)/w


Balance de electrones… 4 = C -2=O 6 =S 3 = NH3 1 = H 5 = P 0=N2 5=NO3

En una ecuación de crecimiento celular correctamente ajustada el numero de electrones disponibles se conserva, en virtud del hecho que las cantidades de cada elemento también se conservan. Si se aplica esto a la ecuación de crecimiento aeróbico: se tiene: w . γS – 4.a = c . γβ γs ; γβ son los grados de reducción del sustrato y la biomasa

→

El balance de electrones disponibles no es independiente del conjunto completo de balances elementales. Si la ecuación estequiométrica se ajusta en función de cada

compuesto que contenga H y O, el balance se satisface implícitamente.


Otra forma…

Se plantea la ecuación de oxidación del mismo a CO2 y H2O, y el valor de γ se obtiene multiplicando por 4 el coeficiente estequeométrico del O2 . Si el compuesto contiene nitrógeno, deberá especificarse el grado de oxidación final del mismo (NH3 o N2).


Ejemplo 2.

Se lleva a cabo una fermentación anaeróbica con Clostridium acetobutylicum el cual convierte glucosa en acetona y butanol, junto con cantidades menores de butirato, acetato, etc.

En la fermentación se obtienen los siguientes productos por 100 moles de glucosa y 11.2 moles de NH3 como fuente de nitrógeno:

Productos Formados Moles

Células 13

Butanol 56

Acetona 22

Acido butírico 0,4

Ácido acético 14

C=2 221

H2 135

Etanol 0,7

a) Hacer un balance de carbono, nitrógeno, hidrogeno y oxigeno y determinar la composición elemental de las células.

b) Encontrar el estado redox de la fermentación usando el concepto de balance de electrones disponibles.


Resolución… a) Fórmula de la biomasa

b) γ = ? CwHxOyNz 4w + x - 2y – 3z

Balance de C → 100(6) = a(13) + 56(4) + 22(3) + 0,4(4)+ 14(2) + 221(1) + 0,7(2) a = 4,46 Balance de H → 100(12) + 11,2(3) = 13b + 56(10) + 22(6) + 0,4(6)+ 14(4) + 135(2) + 0,7(6) b = 16,07 Balance de O2 → 100(6) = c(13) + 56(1) + 22(1) + 0,4(2)+ 14(2) + 221(2) + 0,7(1) c = 3,88 Balance de N2 → 11,2(1) = d13 d = 0,86

Se debe realizar un balance de electrones disponibles y ver si la reacción esta equilibrada Para un compuesto CwHxOyNz , el numero de electrones disponibles/mol de compuesto es igual a : (4w + x – 2y – 3z) ó bien (γ CwHxOyNz w)


Resolución…

Compuesto N°e- /mol Coef. Esteq. Reactivos Productos

C6H12O6 Glucosa 4(6)+12-2(6) = 24 100 2400

NH3 Amoniaco 3-3(1) = 0 11,2

C4H10O Butanol 4(4)+10-2(1) = 24 56 1344

C3H6O Acetona 4(3)+6 -2 = 16 22 352

C4H8O2 A. butírico 4(4)+8-2(2) = 20 0,4 8

C2H4O2 A. acético 4(2)+4-2(2) = 8 14 112

CO2 4-2(2) = 0 221 0

H2 2 135 270

C2H6O Etanol 4(2)+6-2(1) = 12 0,7 8,4

C4,66H16,01O3,88N0,86 4(4,66)+16,07-2(3,88)-3(0,86) = 23,57

13 306,41

2400 2400

La fermentación esta balanceada respecto del estado Oxido-Reducción


Balance de electrones con formación de Producto…

γs ; γβ son los grados de reducción del sustrato y la biomasa

w γS – 4 a = c γβ

w γS – 4 a = c γβ + f j γβ


Rendimiento máximo de biomasa…

4(1) + 1,8-2(0,5)-3(0,2)


Comparación del rendimiento microbiano en diferentes sustratos


Influencia del sustrato en los rendimientos y costos de operación


ESTEQUIMETRÍA DE LA ENERGÍA METABÓLICA: Generación de Calor

40-50 % de la E. suministrada por fuentes de C se convierten en ATP. El resto se libera como calor. La evolución del calor acompaña al crecimiento microbiano.

Balance de Energía a partir de las entalpías de combustión de sustrato y biomasa [kJ/g cel]


Generación de Calor por crecimiento microbiano…

• ∆HC = 20-25 kJ/g cel bacterianas • YH = 0,42 g/kcal glucosa 0.30 g/kcal malato 0.21 g/kcal acetato 0.18 g/kcal etanol 0.12 g/kcal metanol 0.061 g/kcal metano

Valores típicos

Para células en crecimiento activo, el requerimiento para mantenimiento es

bajo

La evolución de calor está directamente relacionada con

el crecimiento

• La generación de calor está fuertemente afectada por el grado de oxidación del sustrato. • El calor generado/tiempo en una fermentación batch: •En fermentaciones aeróbicas se cumple que QGR ≈ 0,12QO2 pues el O2 es el receptor final de electrones:

Calor de combustión de la célula

Calor metabólico /gX = 1/YH


Ejemplo 3.

En una experiencia realizada en un reactor batch (V=500 L) se cultivaron células de Pseudomona fluorescens utilizando glucosa como sustrato según la siguiente reacción biológica:

Con un cociente respiratorio (RQ) de 1,3. Se determinó que los calores de combustión de glucosa y de células fueron respectivamente 3,6 kcal/g glucosa y 5,8 kcal/g células mientras que la concentración de biomasa producida fue 5 g células/L a una velocidad específica de crecimiento de 0,4 h-1. a) Halle los coeficientes estequiométricos correspondientes a dicha ecuación b) Calcule el rendimiento celular respecto de glucosa consumida c) Halle el calor generado (kcal/h) en el reactor batch Nota : Suponga que no hay formación de productos extracelulares ni gasto por metabolismo endógeno


Resolución…

a) Balances elementales:

Datos… RQ = 1,3 ∆HGlucosa = 3,6 kcal/g glu ∆HCélulas = 5,8 kcal/g células Xproducida = 5g/L células µneta = 0,4h-1


Resolución…

b) Rendimiento celular respecto a glucosa consumida:

c) Calculo del calor metabólico por balance de energía a partir de las entalpías:

El calor generado/tiempo en una fermentación batch


Optimización del medio y las condiciones de cultivo…

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimización de los medios de cultivo:

No existencia de información respecto a coeficientes de rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo determinado. Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de microelementos y factores de crecimiento.

Uso de medios de cultivo conteniendo elementos en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestión, que pueden causar inhibición del crecimiento.

Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e inhibidoras del crecimiento y formación del producto.

Empleo de fuentes nutricionales no convencionales.


Optimización del medio y las condiciones de cultivo… METODOLOGÍA

• Realizar experimentos, en los cuales se varia la concentración del componente a ensayar manteniéndose constante las concentraciones de los demás ingredientes: Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados. En este caso, se analiza el efecto de la variable escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentración de biomasa obtenida. • Hace falta una gran cantidad de trabajo preliminar ya que el operador no conoce de antemano que nutriente es el limitante del crecimiento.

•Cuando son varios los posibles nutrientes limitantes el método resulta poco practico.

•� Puede ocurrir que la respuesta obtenida al variar la concentración de un componente dependa de los niveles de los otros, o sea, se produzca interacción entre componentes. �


•Se puede mejorar mucho la optimización en batch empleando técnicas estadísticas o utilizando sistemas continuos con pulsos de componentes.

• Utilizando cultivos continuos es posible obtener un cultivo limitado por un solo factor o sustrato a lo largo de todo el experimento, pudiéndose conocer por lo tanto el efecto que su variación ejerce sobre el cultivo al mantenerse los demás componentes constantes.

• En la figura se muestra la optimización de un medio lograda por el método de los pulsos trabajando con un cultivo continuo y en el cual se gráfica la variación de la concentración de biomasa en función del tiempo después del pulso de un componente dado.

Optimización del medio y las condiciones de cultivo… METODOLOGÍA


CULTIVOS MIXTOS


INTERACCIONES MICROBIANAS

EFECTO EN ESPECIE 1 EFECTO EN ESPECIE 2

Neutralismo 0 0

Competencia - -

Comensalismo + 0

Amensalismo - 0

Mutualismo + +

Predación - +

Parasitismo - +


Neutralismo

Neutralismo es el tipo menos común de las interacciones ínterespecíficas. Ninguna población afecta a la otra. En el neutralismo no hay cambio en la velocidad de crecimiento de ninguno de los dos microorganismos debido a la presencia del otro.

Cualquiera de las interacciones que se producen son indirectas o incidentales.

Se han estudiado muy pocos casos de neutralismo. Uno de ellos es el crecimiento de starters de yogur de Streptococcus y Lactobacillus en un quimiostato . La cuenta total de estas dos especies a una velocidad de dilución D = 0,4h-1 fueron muy similares si las dos poblaciones se cultivaban juntas o separadas.

El neutralismo parece ocurrir en casos donde cada microorganismo consume distintos substratos limitantes y donde los productos finales son diluidos o neutralizados.


Interacciones benéficas

COMENSALISMO

• Interacción en la cual una especie, B, afecta positivamente el crecimiento de otra, A. Sin embargo B no es afectada por A.

• Varios mecanismos resultan en este tipo de interacción, entre los más comunes: – La población B produce un nutriente esencial o un factor de crecimiento para la población A. – La población B elimina del medio un compuesto tóxico para la población A. Ejemplo: Remoción de ácido láctico por el hongo Geotrichium candidum, que permite el crecimiento del Streptococcus lactis. Esta interacción se utiliza en la fabricación de quesos usando S. lactis. El ácido láctico producido por S.lactis inhibe su crecimiento. El hongo metaboliza el láctico y mejora las condiciones de crecimiento para la bacteria.



PROTOCOOPERACIÓN-MUTUALISMO • Ambas especies crecen más rápido estando juntas que separadas • Para el mutualismo la interacción es esencial para la supervivencia de ambas especies. • No es mucho más común que el neutralismo e implica varios mecanismos diferentes

• Intercambio de factores de crecimiento: Ejemplo: El crecimiento de un Lactobacillus, que requiere fenil alanina y de un Streptococo, que requiere acido fólico. Los cultivos puros casi no crecen y la mezcla de ellos crece perfectamente • Intercambio de nutrientes: – Se conocen muchos casos de asociaciones mutuamente beneficiosas entre bacterias aeróbicas y algas fotosintéticas. La bacteria usa O2 y carbohidratos y producen CO2 y factores de crecimiento. – Las algas usan la luz del sol como fuente de energía, convierten el CO2 en carbohidratos y liberan también O2. Este sistema ilustra algunos aspectos del ciclo del C y del O2 .



SIMBIOSIS

• Cuando hay una relación (mutualista, parasitista; comensalista; etc.) muy estrecha, de tal modo que las especies se necesitan mutuamente para la supervivencia. Los microorganismos se encuentran en muchas relaciones simbióticas entre si y además con los organismos superiores.

Ejemplo: Mathanobacillus omelianski, que es una bacteria que abunda en los barros anaerobios. Se ha descubierto que es una mezcla de 2 especies. La primer especie convierte el etanol en H2 y acetato. Pero, dicha especie es inhibida por el hidrogeno que produce.

C2H6O + H2O → C2H3O2 + H+ + H2 La segunda especie de la bacteria no puede crecer en etanol, pero consume H2 dando metano:

4H2 +CO2 → CH4 + 2 H2O Una especie destruye una toxina para su asociado, el cual a su vez, da un nutriente para el primero.


Interacciones antagónicas

COMPETENCIA

• La competencia se produce cuando los organismos de la misma comunidad buscan la misma limitación de recursos. Este recurso puede ser presa, el agua, la luz, los nutrientes, los lugares de anidación, etc.

• La competencia entre los miembros de la misma especie es intraespecífica.

• La competencia entre individuos de especies diferentes es interespecífica.

• Los individuos experimentan los dos tipos de competencia, pero la importancia relativa de ambos varían de población a población y de especie a especie

→ Nutricional por el Carbono, nitrógeno, fosforo, hierro, etc. → Espacio → O2 → Luz



AMENSALISMO • Interacción en la cual una especie, B, afecta negativamente el crecimiento de otra, A. Sin embargo B no es afectada por A. • Mecanismos comunes en este tipo de interacción: – La población B elimina del medio un nutriente esencial o un factor de crecimiento para la población A. – La población B produce un compuesto tóxico para la población A. Ejemplos Producción de antibióticos por algunos hongos, que inhiben el crecimiento de otros microorganismos. Algunos microorganismos excretan enzimas que destruyen la pared celular de otros; no sólo eliminan al organismo competidor sino que emplean los productos de lisis como nutrientes . La síntesis microbiana de ácidos orgánicos baja el pH e inhibe el crecimiento de otros organismos.



PREDACIÓN Y PARASITISMO

Interacciones en las cuales una población se beneficia a expensas de otra. • Estas dos interacciones se distinguen entre si por el tamaño relativo de los organismos y por el mecanismo involucrado.

- Predación: En este caso ocurre la ingestión de la presa por el organismo predador. Es una interacción muy común en tratamiento aeróbicos de aguas residuales.

- Parasitismo: El huésped, que es generalmente el organismo más grande, es dañado por el parásito. El parásito se beneficia de la ingestión de nutrientes del huésped.

Si bien los mecanismos físicos de predación y parasitismo difieren, los dos fenómenos tienen muchas características comunes en su descripción conceptual y matemática.



PREDACIÓN Y PARASITISMO

Bdellovibrio bacteriovorus parasitando una célula de Pseudomona phaseolicola


MUCHAS GRACIAS!!!

cinÉtica y estequimetrÍa de las...

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