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BIOLOGÍA MOLECULAR DE ROTAVIRUS: UNA MIRADA ATRAVÉS DE LA INTERFERENCIA DE RNA

Margarito Rojas, Camilo Ayala-Breton y Susana López*Departamento de Genética y Fisiología Molecular.

Instituto de Biotecnología/ UNAM Av. Universidad, 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos, 62210

*[email protected]

Resumen

Los rotavirus son el agente etiológico mas importante de gastroenteritis infantil, siendoresponsables de alrededor de 600,000 muertes al año en todo el mundo. Recientemente hansalido al mercado dos vacunas para la prevención de la diarrea severa causada por estos virus, pero la experiencia con la primera vacuna contra rotavirus, que tuvo que ser retirada del mercadoun año después de su liberación, debido a que se encontró una posible asociación conintususcepción, nos ha dejado claro que es necesario conocer profundamente la biología deestos virus para poder diseñar estrategias preventivas y/o terapéuticas que nos permitancontender con la infección causada por estos virus.

Los rotavirus están formados por tres capas concéntricas de proteína que envuelven algenoma viral que consta de once segmentos de RNA de doble cadena. Este genoma tan particular ha sido uno de los obstáculos mas importantes para hacer mutantes sitio dirigidas encada uno de los genes virales y estudiar su función. Recientemente se ha descrito un nuevo proceso en biología, la interferencia de RNA (RNAi), que consiste en el silenciamientosecuencia-específico de genes a través del apareamiento de pequeños RNAs (siRNAs omicroRNAs) con RNA mensajeros específicos, lo que dirige su degradación y por lo tanto, lafalta de expresión de la proteína que codifican.

En nuestro laboratorio hemos empleado exitosamente la RNAi para silenciar la expresiónde cada una de las proteínas de rotavirus, lo que nos ha permitido conocer las funciones de

estas durante la infección. En este trabajo, presentamos algunos de los hallazgos con los quenos hemos encontrado al utilizar esta metodología.

Palabras clave: Rotavirus, gastroenteritis viral, RNA de interferencia, morfogénesis viral,silenciamiento génico.

Bustos Jaimes I, Castañeda Patlán C, Oria Hernández J,Rendón Huerta E, Reyes Vivas H, Romero Álvarez I,(eds). Mensaje Bioquímico, Vol XXXII. Depto deBioquímica, Fac de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. Cd Universitaria, México, DF,MÉXICO (2008).(http://bq.unam.mx/mensajebioquimico)

(ISSN-0188-137X )


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MENSAJE BIOQUÍMICO, Vol. XXXII (2008)

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Abstract

Rotaviruses are the single most important agent of acute severe gastroenteritis inchildren worldwide. It has been estimated that they are responsible for about 600,000 deathsannually. Two new vaccines against these viruses have been released recently, however the

previous experience with the first human rotavirus vaccine, which had to be withdrawn from themarket after the finding of a possible correlation of vaccinated children with intussusceptions, hasmade clear the need for a deep knowledge of the biology of rotaviruses to be able to design novel preventive and/or therapeutic measures against the infection caused by these viruses.

Rotaviruses are formed by three concentric layers of protein which surround the viralgenome composed of eleven segments of double stranded RNA. The genome of these viruseshas not been amenable to reverse genetics and thus the biochemistry and molecularcharacterization of the genes of this virus have been limited to a few mutants that have beenisolated. Recently, a new phenomenon in biology has been described; the RNA interference(RNAi), this is a sequence-specific process by which small fragments of double stranded RNAhybridize with the corresponding mRNA and direct its degradation, with the consequent silencingof the expression of the protein encoded by it. In our laboratory, we have used RNAi to silencethe expression of each of the rotavirus proteins to study their function and the effect of their

absence during the infection. In this manuscript we describe some of the findings that we haveencountered using this methodology to study the molecular biology of rotaviruses.

Keywords: rotavirus, viral gastroenteritis, RNA interference, viral morphogenesis, RNA silencing.

Introducción

Rotavirus

Las gastroenteritis infecciosas agudas son la causa más frecuente de morbilidad y

mortalidad en niños menores de cinco años en los países en desarrollo, con alrededor de milmillones de episodios diarreicos y entre cuatro y cinco millones de muertes por año. Los rotavirusdel grupo A son la causa principal de las diarreas deshidratantes severas en niños menores dedos años, y se ha estimado que una vacuna efectiva contra estos virus podría evitar cerca de600,000 muertes de infantes cada año [1]. Resulta interesante notar que, aunque la mortalidaddebida a las infecciones por rotavirus es mucho mayor en países en desarrollo que en paísesdesarrollados, la frecuencia de infección es muy similar en todo el mundo. Ya que los rotavirus juegan un papel tan importante en las enfermedades diarreicas infantiles, y debido a que inclusoniveles de higiene avanzados no son capaces de controlar significativamente las infecciones porestos virus, existe un interés considerable para desarrollar estrategias efectivas de vacunacióny/o terapéuticas. Recientemente se aprobaron dos vacunas vivas atenuadas contra rotavirus y afinales del 2007 se inició la aplicación de una de estas vacunas en México. Sin embargo, laexperiencia previa con la primera vacuna de rotavirus, que fue autorizada en Estados Unidos en1998 y que fue retirada del mercado al año siguiente debido a una posible correlación entre laaplicación de esta vacuna y la aparición de intususcepción en niños vacunados [2], ha reforzadola idea de que es necesario desarrollar estrategias alternativas para la inducción de proteccióncontra estos virus. Es fundamental para este desarrollo el conocimiento básico de losmecanismos moleculares por los cuales los rotavirus interaccionan con su célula huésped.


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Estructura

Los rotavirus del grupo A, miembros de la familia Reoviridae, son virus no envueltos quetienen aproximadamente 100 nm de diámetro. El virión maduro está compuesto por tres capasconcéntricas de proteínas que engloban al genoma viral, el cual consta de once segmentos deRNA de doble cadena (dsRNA) (Figura 1). La capa más interna del virión está formada por 60

dímeros de la proteína VP2, que rodea al genoma del virón y de pequeñas cantidades de la RNApolimerasa VP1 y de la guanilil-transferasa VP3. Doscientos sesenta trímeros de VP6, laproteína más abundante del virión, constituyen la capa intermedia. La capa más externa estáformada por dos proteínas, VP4 y VP7. La superficie lisa del virus está compuesta por 780copias de la glicoproteína VP7, organizada en forma de trímeros, mientras que 60 espículas,formadas por VP4, se proyectan hacia el exterior de la superficie viral [3]. La proteína VP4 tienefunciones esenciales en el ciclo de vida del virus, incluyendo la unión al receptor y la penetracióna la célula que infecta; por lo tanto, las propiedades de esta proteína son determinantesimportantes del rango de huésped, virulencia, tropismo, e inducción de inmunidad protectora [3].El papel de VP7 durante las primeras interacciones del virus con la célula no es muy claro,aunque se ha demostrado recientemente que esta proteína interacciona con la superficie celularen eventos posteriores a la unión inicial [4].

Figura 1. a) Diagrama de la partícula viral madura (TLP) con sus tres capas; b)Electroforesis del genoma viral; c) Proteínas marcadas de células infectadas (+), o no (-)

con rotavirus.

Después de unirse a la superficie de la célula, el virus penetra la membrana plasmáticadurante el proceso de entrada. Esta penetración se incrementa y muy probablemente depende,del tratamiento del virus con tripsina. Este tratamiento proteolítico resulta en el corte específicode VP4 en dos polipéptidos de menor peso molecular, llamados VP8 y VP5 [5]. Los rotavirustienen un tropismo muy específico, ya que únicamente infectan las puntas de las vellosidades delintestino delgado, esto sugiere que deben existir receptores específicos que permitan su entradaa la célula huésped. In vitro, estos virus también muestran un tropismo restringido ya que,aunque pueden unirse a la superficie de una gran variedad de líneas celulares, sólo son capaces

de infectar eficientemente aquellas derivadas de epitelio renal o intestinal. Este tropismo esdebido, cuando menos en parte, a la interacción del virus con sus receptores celulares;aparentemente, la entrada de estos virus a la célula huésped es un proceso que se lleva a caboen varios pasos, en el cual están involucrados diferentes dominios de las proteínas de superficiedel virus, así como varios receptores celulares, que incluyen a las integrinas a2b1, a4b1, axb2,avb3 y a la proteína hsc70 [6]. Además de estas proteínas, se ha sugerido que las balsaslipídicas (microdominios ricos en colesterol y esfingolípidos) tienen un papel importante en lainfección [7]. Aun se desconoce la vía de internalización del virus, aunque se ha propuesto quepodría ser a través de endocitosis dependiente de balsas lipídicas o mediante un mecanismo depenetración directa a través de la membrana plasmática [8].


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Ciclo replicativo

Durante el proceso de entrada, la partícula viral pierde las proteínas de la capa externa yse activa la trascripción que depende de la RNA polimerasa viral (VP1) (Figura 2). Los transcritosvirales recién sintetizados tienen dos funciones; por una parte funcionan como mRNAs quedirigen la síntesis de las seis proteínas estructurales (VP1-VP7) y las seis proteínas no-

estructurales (NSP1-NSP6) del virus [3] y por la otra, sirven como templados para la síntesis dela cadena negativa (que es complementaria al mRNA) y da lugar al RNA de doble cadena(dsRNA) que constituye el genoma viral [9].

Una vez que se acumula una masa crítica de proteínas virales, de 3 a 4 horas despuésde la infección, se forman en el citoplasma celular estructuras electrodensas llamadasviroplasmas (Figura 3), en donde se ha propuesto que se lleva a cabo la replicación del genomaviral. En estas estructuras también se ensamblan las partículas de doble capa queposteriormente geman al interior del retículo endoplásmico y adquieren durante este proceso latercera capa protéica, dando lugar a la partícula madura [10,11] (Figura 2) . Las proteínas NSP2 yNSP5 son esenciales para la formación de los viroplasmas, ya que en ausencia de cualquiera deellas no se forman estas estructuras y el ciclo replicativo del virus se interrumpe [12,13].

Figura 2. Ciclo replicativo de rotavirus. El virus interacciona con sus receptores en lasuperficie de la célula y penetra por un mecanismo aun desconocido. En el interior de lacélula se activa la transcriptasa viral y los mRNAs dirigen la síntesis de proteínas virales.

Las proteínas se acumulan en estructuras llamadas viroplasmas donde se replica el RNAviral y se ensamblan las partículas de dos capas (DLPs) para proseguir la morfogénesisen el retículo endoplásmico.

Poco tiempo después de su entrada, el virus se apodera de la maquinaria de síntesis deproteínas de la célula, de modo que la mayoría de las proteínas que son sintetizadas durante lainfección son las proteínas virales y la síntesis de proteína celular se ve casi abatidacompletamente (Figura 1C). Los mRNAs virales tiene una estructura Cap- en el extremo 5’, peroa diferencia de la mayoría de los mRNAs celulares, no contienen poli-A en el extremo 3’, y en su


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lugar, tienen una secuencia consenso (GACC3’) que está conservada en los once segmentos delRNA viral [9].

Figura 3. Célula infectada con rotavirus. En verde se tiñeron las fibras de actina, en azullos núcleos y en rojo los viroplasmas utilizando un anticuerpo contra la proteína NSP2.

Replicación

En los viroplasmas, o fábricas virales, es donde los mensajeros virales cumplen susegunda función, servir como templado para la replicación del genoma. La serie de eventosnecesarios para este proceso no se conocen completamente, sin embargo, se han descritocomplejos de RNAs con proteínas virales que han sido propuestos como intermediarios dereplicación (IRs). La unidad mínima está formada por las proteínas VP1 y VP3 en asociación conel mRNA. El siguiente intermediario se define como el pre-core, en el que además de VP1 y VP3,se añaden las proteínas NSP2 y NSP5, las cuales probablemente ayudarían a un proceso activode entrada del mRNA hacia el interior del core, al que se ha agregado VP2; es en estos IRsdonde se lleva a cabo la replicación del genoma viral. Posteriormente, VP6 se ensambla sobre elcore, para formar a la partícula de dos capas o DLP, la cual ya contiene los elementos

necesarios para llevar a cabo una nueva ronda de transcripción del genoma [9].

La falta de un sistema eficiente de genética reversa para rotavirus ha hecho muycomplicada y limitada la investigación acerca de la función de cada una de las proteínas viralesdurante el ciclo replicativo del virus. Recientemente, se ha utilizado el sistema de interferencia deRNA como una alternativa para inhibir de manera específica la traducción de cada una de lasproteínas virales y analizar el fenotipo resultante en células infectadas.

Interferencia de RNA

En los últimos años hemos presenciado la implementación de una nueva tecnología quepromete revolucionar la manera en que la investigación post-genómica se llevará a cabo, y elcampo de la virología está incluido en esta revolución. Esta nueva tecnología esta basada en unfenómeno biológico recientemente descrito, al que se la ha llamado interferencia del RNA(RNAi), silenciamiento de RNA, o silenciamiento génico postranscripcional. Este es un fenómenoconservado evolutivamente que se encuentra en hongos, plantas y animales. La interferencia delRNA es un proceso de respuesta al RNA de doble cadena (dsRNA) en el que se silencia, demanera específica, la expresión del gene que tiene identidad con el dsRNA [14].

Originalmente, el sistema de RNAi fue descubierto en plantas y hongos al encontrar que,la introducción de genes quiméricos involucrados en la producción de pigmentos, resultabaparadójicamente en la producción de plantas y hongos sin color. Estos resultados parecían


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indicar que la introducción de un gene extra inhibía la expresión del gene endógeno [15,16], aeste fenómeno se le denominó silenciamiento postranscripcional de genes (PTGS por sus siglasen inglés). Posteriormente en 1998, A. Fire y C. Mello [17], encontraron que la introducción defragmentos de dsRNA, pero no de cadena sencilla, al gusano Caenorhabditis elegans causaba lainhibición de la expresión del gene que presentaba identidad en secuencia con el dsRNAintroducido. A este fenómeno le llamaron interferencia de RNA (RNAi), descripción que les valió

ganar el premio Nobel en el 2006. Más tarde, gracias a la contribución de varios grupos deinvestigación, se demostró que en el interior de las células, las moléculas largas de dsRNAs erancortadas en fragmentos pequeños de 21 a 25 nucleótidos, estos fragmentos fueron denominadosRNAs interferentes pequeños (siRNAs, por sus siglas en inglés small interfering RNAs) [18-20]. Actualmente se sabe que estas moléculas median el proceso de RNAi. A partir de entonces, elsistema de RNAi empezó a ser utilizado como herramienta biológica para apagar la expresión degenes de plantas, nemátodos y otros organismos.

Fue mas difícil demostrar la existencia de este fenómeno en células de vertebrados, yaque en éstas, los dsRNA de mas de 30 pb de longitud activan la respuesta de interferón, lo quelleva a una inhibición inespecífica de la síntesis de proteína celular y a la degradación, tambiéninespecífica, de todos los mRNAs de la célula; este es un mecanismo que las células demamífero han desarrollado como defensa ante las infecciones virales. Afortunadamente, el grupo

de T. Tuschl encontró que la introducción de 21 meros de dsRNA a células de mamífero encultivo, escapa a la respuesta del interferón y es capaz de inducir la inhibición secuencia-específica de la expresión de un determinado gene, sin afectar la síntesis del resto de lasproteínas celulares [18]. Esta observación ofreció la gran oportunidad de utilizar la RNAi paraestudiar la función de cada uno de los genes de una célula y también la de los genes de distintosvirus que infectan a células de mamífero.

La RNAi se dispara en plantas y en animales invertebrados ante la presencia demoléculas de dsRNA, las que son reconocidas y procesadas por una RNAsa específica dedsRNA llamada Dicer. Esta enzima corta el dsRNA en fragmentos pequeños de ~20-25 pb(siRNAs) que se asocian específicamente con un complejo multiprotéico llamado RISC (delinglés, RNA-induced silencing complex), en el que una helicasa los desnaturaliza y una de lascadenas del siRNA sirve como guía del complejo RISC hacia el RNA mensajero (mRNA) que

tiene la secuencia complementaria. Una vez que el complejo RISC reconoce al mRNA blanco,una ribonucleasa presente en RISC corta al mensajero hacia la mitad del híbrido. El mRNAcortado es sustrato de endo- y exonucleasas celulares que lo degradan, lo que tiene comoconsecuencia el silenciamiento postranscripcional de la expresión de dicho gene [14] (Figura 4).

Se ha propuesto que naturalmente la RNAi juega un papel central en la regulación demuchos procesos celulares a nivel de traducción, que incluyen la movilización de transposones,el silenciamiento de transgenes, la regulación de algunos estadios tempranos en el desarrollo,así como también en la regulación de la expresión a nivel de genoma. En plantas, se hademostrado que, entre otros papeles, la RNAi representa un mecanismo de defensa contra lasinfecciones virales y se ha propuesto que este fenómeno juegue un papel similar en algunosorganismos invertebrados [14].

El estudio del sistema de RNAi conllevó al descubrimiento de los microRNAs (miRNAs),los cuales presentan similitud estructural y funcional con los siRNAs. A diferencia del siRNAs, losmicroRNAs se producen a partir de la transcripción de genes celulares, dando lugar a lo que seconoce como microRNA primario (pri-microRNA). Esta molécula es procesada en el núcleo poruna enzima llamada Drosha, dando origen a una molécula de RNA de 70 a 100 pb, con unaestructura tipo tallo-asa (pro-microRNA) (Figura 4). Posteriormente, el pro-microRNA estransportado al citoplasma donde es procesado por Dicer, la misma que enzima que procesa eldsRNA. Finalmente, los microRNAs maduros (de 21-25 pb) se incorporan a complejos similaresa RISC. En estos complejos los microRNAs también dirigen el silenciamiento génico (Figura 4).Sin embargo, a diferencia de los siRNAs, los microRNAs pueden reprimir a su blanco a través de


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dirigir su degradación como los siRNAs o mediante la inhibición de la traducción de dicho mRNA,sin causar su degradación; los mecanismos exactos por lo que esto ocurre aún no han sidoesclarecidos completamente [21,22].

Figura 4. 1) Generación de siRNAS por Dicer; 2) Asociación de los siRNAs a RISC; 3)Hibridación con mRNA blanco y degradación; 4) Trascripción de primicroRNAs yprocesamiento por Drosha; 5) Corte de los pre microRNAs por Dicer; 6 ) Asociación delmicroRNA con RISC y 7) Hibridación con el mRNA blanco y arresto de la traducción.

Aunque aun esta por definirse la función biológica precisa de este mecanismo, campo enfebril actividad, la observación de que este sistema es funcional en vertebrados y que se puedeaplicar a células en cultivo, ha dado lugar a su utilización como herramienta de silenciamientoespecífico de genes. La RNAi ha resultado particularmente útil para estudiar aquellos virus para

los que no ha sido posible aun implementar un sistema de genética reversa. Es posiblepronosticar que pronto se utilizará la RNAi para analizar los genes celulares que interaccionancon el genoma y las proteínas virales que participan durante el ciclo replicativo de un virus, y amediano plazo, al análisis de la función que los genes virales tienen durante la infección de unorganismo completo. Hay también grandes esperanzas de que se pueda aplicar la RNAi altratamiento de enfermedades virales, ya sea como medida profiláctica o terapéutica. Estametodología parece particularmente atractiva para aquellos virus que establecen infeccionescrónicas (VIH, virus de la hepatitis B y C) o latentes (virus del herpes). Actualmente, uno de losprincipales retos es desarrollar métodos que permitan introducir los siRNAs de manera eficientey estable en organismos completos, de modo que lleguen al órgano blanco donde se espera queactúen.

Actualmente, los siRNAs se pueden sintetizar químicamente e introducirlos en las células

de interés por diferentes métodos, entre los que destacan la transfección, la electroporación y lamicroinyección. Recientemente demostramos que se puede utilizar la RNAi para silenciar demanera específica la expresión de un gene viral sin afectar la expresión del resto de los genesdel virus, a través de introducir a la célula un siRNA cuya secuencia es complementaria a la delgene viral que se desea silenciar [23,24]. Esta metodología está permitiendo estudiar la funciónde cada uno de los genes rotavirales en el contexto de una infección, lo que no había sidoposible anteriormente dado que, como hemos mencionado, el genoma de estos virus no sepresta para hacer genética reversa. En nuestro laboratorio en el Instituto de Biotecnología hemosempleado exitosamente esta metodología para el estudio de cada uno de los genes de rotavirus,generando nueva información acerca de cada uno de los pasos del ciclo replicativo de estos


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virus. A continuación expondremos algunos ejemplos de la aplicación de esta estrategia en elestudio de la biología de estos virus.

Interferencia de genes de rotavirus

Como estrategia general para este tipo de ensayos, diseñamos y mandamos sintetizarun oligonucleótido de dsRNA de 21 pares de bases con la secuencia homóloga al gene que sedesea silenciar. Este siRNA se introduce a células en cultivo mediante lipofección (utilizandoliposomas cargados positivamente que facilitan la entrada de ácidos nucleicos a través de lamembrana celular), posteriormente las células se infectan con rotavirus y estudiamos si el siRNAes capaz de silenciar la expresión de la proteína blanco mediante ensayos deinmunofluorescencia de las células transfectadas e infectadas; por inmunoensayos utilizandolisados de las células infectadas, también determinamos el efecto del siRNA sobre la infectividadviral y sobre la producción de progenie infecciosa. Todos estos ensayos se comparan concélulas control que son tratadas de la misma manera que las células experimentales, pero quefueron transfectadas con un siRNA control irrelevante, que tiene una secuencia para la que nohay homólogos en el genoma de la célula (por ejemplo, un siRNA con secuencia homóloga a laproteína verde fluorescente).

Papel de las proteínas virales durante la morfogénesis de la partícula viral

La morfogénesis viral es el proceso que comprende todos lo pasos necesarios para elensamble de las partículas virales infecciosas. La morfogénesis de los rotavirus inicia en losviroplasmas, con el ensamble de los intermediarios de replicación que posteriormente dan origena las DLP’s. En células infectadas, la proteína VP7 y la proteína no estructural NSP4 songlicoproteínas que durante su traducción se insertan y modifican en la membrana del retículoendoplásmico (RE) (Figura 5). Las DLP’s presentes en los viroplasmas (que se encuentranalrededor del RE), geman hacia el lumen del RE y se ha propuesto que la proteína NSP4 fungecomo receptor de la DLP en la membrana del RE y favorece su gemación; durante este proceso,las DLP’s adquieren una membrana lipídica transitoria que contiene, además de NSP4, a la

glicoproteína VP7 y a VP4 que es la proteína que forma las espículas del virus. Finalmente, laspartículas envueltas pierden la membrana lipídica, NSP4 se disocia y la capa externa, formadapor VP4 y VP7, adquiere su conformación final (Figura 5). El mecanismo por el cual se lleva acabo este último paso en la morfogénesis no esta claro; en estudios previos se había observadoque, in vitro, tanto VP4 como NSP4 tienen actividad desestabilizante de membranas y por lomismo, estas proteínas habían sido propuestas como las responsables de remover la membranalipídica de las partículas presentes en el lumen del RE [3,25]. Por otra parte, se había propuestoque las proteínas VP4, VP7 y NSP4 formaban un receptor hetero-trimérico que permitía elproceso de gemación de las DLP’s, hacia el interior del RE [26,27].

En nuestro laboratorio decidimos estudiar nuevamente el proceso de morfogénesis derotavirus utilizando como herramienta la interferencia de RNA, con la idea de establecer masclaramente el papel de las proteínas virales en este proceso. La primera proteína cuya expresiónsilenciamos fue VP4. Como hemos mencionado, VP4 forma las espículas de la partícula viral ysu función en el proceso de unión y entrada a la célula hospedera ha sido demostrada a partir dela caracterización de cepas de rotavirus mutantes en VP4 y por el uso de anticuerpos quebloquean la interacción entre VP4 y los receptores celulares. Utilizando estas herramientas, sedescribió que la unión y entrada de los rotavirus a su célula hospedera requiere delreconocimiento secuencial de diferentes receptores en la superficie celular. Para esto, losrotavirus utilizan diferentes dominios de las proteínas de superficie VP4 y la glicoproteína VP7.


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Figura 6. Silenciamiento de la expresión de VP4. a) Inmunoblot de lisados celularesinfectados en presencia de los siRNAs indicados; b) Autorradiografía de los lisadosmostrados en a); c) Rendimiento viral.

El silenciamiento del gene que codifica para VP4 también nos permitió determinar que elmRNA viral destinado a la replicación de los rotavirus no es degradado por el sistema de RNAi.En células infectadas, el mRNA viral puede ser traducido a proteína viral o bien puede ser usadocomo templado para la replicación de los segmentos de dsRNA virales, por lo que se esperabaque el silenciamiento del gen que codifica para VP4 resultara una reducción en la síntesis de laproteína VP4 y en una reducción en la replicación del segmento de dsRNA que codifica para

VP4. Sin embargo, al analizar el genoma de las partículas spikeless, observamos que el númerode segmentos de dsRNA y la abundancia de cada uno era similar a la observada en las TLP’s.Estos datos sugieren que en las células infectadas existen dos pozas de RNA viral: una que sedirige a la traducción de proteínas virales y que puede ser degrada por el sistema de RNAi y otrapoza que se utiliza para la síntesis de los segmentos de dsRNA y que no es susceptible alsistema de RNAi. Sin embargo, el mecanismo por el cual los mRNA, destinados a la replicación,evaden el sistema de RNAi permanece desconocido.

Posteriormente, analizamos la función de VP7 y NSP4 en la morfogénesis de losrotavirus utilizando siRNAs dirigidos contra estas proteínas. El silenciamiento de VP7 o NSP4resultó en una reducción de la producción de progenie viral de aproximadamente 75% en amboscasos; sin embargo, la explicación en cada caso fue diferente. El silenciamiento de la expresiónde VP7 resultó en la reducción de la formación de TLP’s, efecto esperado ya que VP7 formaparte de la tercera capa de los rotavirus. Al analizar las células por microscopía electrónica, seobservó que la reducción en la formación de TLP’s correlacionaba con la acumulación de DLP’senvueltas en el lumen del RE. Esta observación nos permitió establecer que la glicoproteína VP7no es indispensable para la gemación de las partículas al interior del RE. Si bien en ausencia deVP7 se forman partículas virales, la falta de maduración de éstas, explica la disminución eninfectividad [28].

Por otra parte, al silenciar la expresión de NSP4 la distribución celular de la mayoría delas proteínas virales se vio alterada y se redujo notablemente la formación de partículas virales,lo que explica la reducción en la producción de progenie viral. Sin embargo, al analizar al


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microscopio electrónico estas células, encontramos que, aun en estas condiciones, se lograformar una pequeña proporción de partículas maduras y sin envoltura lipídica en el interior delRE. Estos datos indican que NSP4 y no el heterotrímero VP4/VP7/NSP4 es suficiente para servircomo receptor de las DLP’s en el RE [28].

El último paso en la morfogénesis de los rotavirus es la pérdida de la envoltura lipídica.

Como hemos mencionado antes, en ausencia de VP4 se acumulan partículas spikeless en elRE; sin embargo, estas partículas ya han perdido la envoltura lipídica. Los resultados de estetrabajo sugieren que NSP4 podría tener una función importante en el proceso de ensamble delas DLP´s; y que VP4 y NSP4 no son importantes en la remoción de la envoltura lipídica de laspartículas inmaduras. Sorprendentemente, silenciando la expresión de VP7, una proteína que nohabía sido considerada importante durante este evento, se observó la acumulación partículasenvueltas en el lumen del RE. El hecho de que la capa de lípidos sea retenida cuando no seencuentra VP7, aun en presencia de VP4 y NSP4, sugiere que VP7 es la proteína viral queparticipa en el proceso de remoción de la envoltura de DLP’s. Esta hipótesis se ve reforzadapor el hecho de que el tratamiento con drogas que inhiben la glicosilación de VP7 en célulasinfectadas, también produce acumulación de partículas envueltas en el RE, similar a lo queocurre al silenciar la expresión de VP7.

Proteínas involucradas en el ciclo replicativo de rotavirus

Por ensayos de replicación y transcripción in vitro se ha encontrado que las proteínasVP1 y VP2 son necesarias y suficientes para replicar el RNA viral. Sin embargo, estudios conmutantes termosensibles de VP3, mostraron que esta proteína también es necesaria para lareplicación viral en células en cultivo. En vista de la diferencia en los resultados obtenidos in vitro con respecto a in vivo, decidimos investigar el papel de las proteínas que forman a la DLP (VP1,VP2, VP3 y VP6) en el ciclo replicativo del virus, utilizando RNAi para inhibir específicamente latraducción de esas proteínas virales y analizar el fenotipo de las células infectadas en suausencia. Una vez que se demostró que los siRNAs eran efectivos para silenciar la expresión deestas proteínas por inmunoensayos, lo siguiente fue analizar la producción de los mRNAs ydsRNAs virales en ausencia de VP1, VP2, VP3 y VP6. En estos ensayos, las células

transfectadas con los diferentes siRNAs y posteriormente infectadas, fueron cosechadas adistintos tiempos post-infección y se extrajo el RNA total de la célula para cuantificar el mRNA ydsRNA virales mediante un ensayo de RT-PCR cuantitativo, para obtener una cinética deacumulación del RNA viral. Encontramos que cuando las células fueron transfectadas con lossiRNAs dirigidos contra VP1, VP2, VP3 y VP6, pero no cuando se transfectaron con el siRNAcontrol, tanto la síntesis de mensajero, como la de RNA doble cadena se inhibieron (Fig 7b),demostrando que estas proteínas son necesarias, directa o indirectamente, para la replicación ytranscripción del genoma del rotavirus (Ayala-Breton et al , resultados no publicados).

Estos resultados confirman los obtenidos al utilizar el sistema de replicación in vitro, yaque encontramos que tanto VP1 como VP2 son importantes para la replicación del virus, peroademás nos permitió establecer que VP3 y VP6 también son relevantes para este procesodurante la infección.

Continuando con el análisis del fenotipo obtenido al silenciar las proteínas que forman ala DLP, estudiamos como era la traducción de proteínas virales y celulares bajo estascondiciones. Cuando se silenciaron las proteínas VP1 o VP3, la síntesis de proteínas tantovirales como celulares se mantenía muy similar a la observada en células control; en contraste,al silenciar VP2 o VP6, la síntesis de proteínas virales se vio seriamente inhibida (Figura 7a).

Estos resultados son interesantes ya que a pesar de que en todos los casos la cantidadde mRNA fue muy similar, observamos que el poco mRNA producido cuando se interfieren VP1o VP3 es suficiente para dirigir la traducción de las proteínas virales a niveles comparables con


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el control. En contraste, cuando se silenció la expresión de VP2 y/o VP6, observamos que lasíntesis de proteínas virales disminuyó considerablemente. Estos resultados sugieren que tantoVP2 como VP6 pueden jugar un papel ya sea directo o indirecto sobre la regulación de latraducción de los mRNAs virales, aunque aun no sabemos cuál es el mecanismo por el queestas proteínas pudieran estar actuando.

A la fecha no tenemos un modelo para explicar el papel de VP2 y VP6 en la traducciónviral. Una posibilidad es que estas proteínas protejan al mRNA viral de la degradación, o bienque estas proteínas se unan a factores de traducción, y estas interacciones permitan latraducción viral durante la infección.

Figura 7. Silenciamiento de la expresión de VP1, VP2, VP3, VP4 y VP6. a) Autorradiografía de células infectadas en presencia de los siRNAs indicados, Luc es elcontrol. b) RT-PCR en tiempo real del mRNA y dsRNA producido en células en las queVP1 fue silenciada.

En conclusión, el sistema de RNAi nos ha permitido conocer la importancia de VP1, VP2,VP3 y VP6 en la replicación y transcripción virales. Aprendimos además que VP2 y VP6 sonimportantes en la traducción viral, por lo que en su ausencia no hay síntesis de proteínas virales,esta regulación traduccional es un hallazgo nuevo que requiere de ser explorado paracomprender el papel de estas proteínas (Ayala-Breton et al resultados no publicados). El uso deRNAi para inhibir la traducción específica de cierta proteína viral ha ampliado el conocimientoobtenido mediante replicación y transcripción in vitro y con mutantes termosensibles. Con estaherramienta se hace posible el estudio in vivo del papel de otras proteínas virales durante lainfección por rotavirus.

Perspectivas

En general, como hemos ejemplificado en este trabajo, la RNAi tiene un gran potencialcomo herramienta en muchos de los campos de la biología. De hecho, recientemente se haempezado a utilizar de manera generalizada en estudios genómicos para analizar la función decada uno de los genes de organismos completos, como en el gusano C. elegans, la mosca de lafruta Drosophila melanogaster y mas recientemente se han descrito bibliotecas de siRNAs para


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Rojas y cols.

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silenciar todos los genes del genoma humano [29-31]. Los invitamos a meditar si no creen quesea posible utilizar esta valiosa metodología en su sistema de estudio.

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Semblanza de la Dr. Susana López Charreton

La Dra. Susana López Charreton es InvestigadoraTitular “C” del Instituto de Biotecnología de la UNAM ypertenece al nivel III del Sistema Nacional de Investigadores.La Dra. López hizo la licenciatura y el Doctorado enInvestigación Biomédica Básica, en la UNAM. Posteriormenterealizó estudios postdoctorales en el Instituto Tecnológico deCalifornia (CalTech), EUA. Su área de investigación es lavirología molecular, con particular interés en el estudio de laepidemiología y la biología molecular de virus causantes degastroenteritis infantiles Ha publicado 85 artículos en revistasde circulación internacional de alto impacto, entre las que seencuentran el Journal of Virology, Virology, Nucleic AcidsResearch, Proceedings of the National Academy of Sciences,EMBO Reports y Trends in Microbiology. Sus trabajos han sido

citados en más de 1700 ocasiones en la literatura mundial. Ha formado 19 estudiantes, 6 delicenciatura, 9 de maestría y 5 de doctorado. Ha presentado más de 200 ponencias en congresos

nacionales e internacionales. Ha sido revisor de trabajos enviados a numerosas revistasinternacionales y actualmente es miembro del comité editorial del Journal of Virology, una de lasrevistas especializadas más importantes del área. Ha sido profesor invitado en el InstitutoNacional de Salud de Japón, en el Instituto Tecnológico de California y en el Institute de laRecherche Agronomique (INRA) de Francia. Entre sus distinciones, recibió el premio de la Academia Mexicana de Ciencias en el área de Ciencias Naturales en 1993, el premio Carlos J.Finlay otorgado por la UNESCO en el 2001, y también recibió la medalla Sor Juana Inés de laCruz otorgada por la UNAM en el 2004. Actualmente tiene el nombramiento de InvestigadorInternacional del Instituto Médico Howard Hughes, desde el 2000 hasta el 2010, dentro delPrograma de Enfermedades Infecciosas y Parasitarias.

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