CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

2.1. Vi sinh vật 2.1.1. Sinh vật nhân chuẩn 2.1.1.1. Nấm men Nấm men (Yeast, Levure) thường tồn tại ở dạng đơn bào, đa số sinh sản theo lối nảy chồi, cũng có khi theo hình thức phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng lên men đường và thích nghi với môi trường chứa đường cao, có tính acid cao. Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, rỉ đường, trong đất trồng các loại cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỏ. Nhiều loài nấm men có ứng dụng cao trong sản xuất công nghiệp như lên men bia rượu, glycerine, sản xuất nấm men bánh mì, thức ăn gia súc... 2.1.1.2. Nấm sợi Nấm sợi (Microfilamentous fungi) là tất cả các nấm không phải nấm men và cũng không sinh mũ nấm. Nấm sợi còn gọi là nấm mốc, có dạng sợi phân nhánh, không hoặc có vách ngăn, lối sống hiếu khí, chủ yếu là hoại sinh. Nấm sợi phân bố rộng rãi trong tự nhiên, tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ và hình thành chất mùn. Rất nhiều loài nấm được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp dược phẩm, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng thực vật... Nhiều nấm sợi kí sinh trên người, động vật và thực vật gây ra các bệnh nấm nguy hiểm. Một số nấm sợi phát triển nhanh trên các chất hữu cơ gây hư hỏng lương thực, thực phẩm, nguyên vật liệu... 2.1.1.3. Tảo (Algae) Vi tảo (Microalgae) gồm các đại diện có khả năng quang hợp, có dạng đơn bào sống thành tập đoàn, phân bố chủ yếu ở môi trường nước ngọt, nước mặn và ở đất ẩm. Vi tảo có thể sinh sản theo hình thức dinh dưỡng, vô tính và hữu tính. Nhiều loài vi tảo có ứng dụng trong sản xuất và đời sống như thu sinh khối giàu protein làm thức ăn cho người và gia súc (Chlorella), nuôi tảo silic (Skeletonema costatum) làm thức ăn cho ấu trùng tôm, tách acid béo không no. Sử dụng vi tảo cho xử lí môi trường (Scenedesmus) hoặc làm sinh vật chỉ thị trong môi trường nghèo calcium (calcium) (tảo lục Desmid). 2.1.1.4. Nấm quả thể Nhiều loài nấm có quả thể được sử dụng để làm thực phẩm, do nấm giàu protein, chất khoáng, các vitamin A, B1, B2, C, D, E. Ngoài ra chúng còn có nhiều đặc tính của biệt dược, có khả năng phòng và chữa bệnh hạ huyết áp, chống béo phì, đường ruột, hỗ trợ chữa ung

9

thư. Đa số nấm ăn thuộc ngành nấm đảm (Basidiomycota), thường gặp nấm ăn thuộc bộ Agaricales như nấm rơm Volvariella volvaceae, Agaricus bisporus... Ngoài giá trị tài nguyên, thực phẩm và dược phẩm, nhiều loài nấm có ý nghĩa trong công nghệ sinh học và đời sống do chúng có khả năng sản sinh ra nhiều chất có ích như eter, acid acetic, acid tanic, các chất kháng sinh... Nhiều loài nấm có khả năng hấp thụ và đào thải các chất phóng xạ, một số loài nấm được sử dụng để phân giải các chất thải độc hại và các nguồn phế liệu gây ô nhiễm môi trường. 2.1.2. Sinh vật nhân sơ 2.1.2.1. Vi khuẩn Vi khuẩn (Bacteria) có nhiều hình thái và cách sắp xếp khác nhau, kích thước khá nhỏ so với nấm sợi và nấm men. Phần lớn vi khuẩn thuộc nhóm dị dưỡng, đời sống có thể hiếu khí, kị khí hoặc là dạng sống tuỳ nghi. Nhiều vi khuẩn có ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Điển hình như các loài vi khuẩn lên men các acid hữu cơ (lactic, propionic...), sản sinh enzyme, acid acetic, acid glutamic, lysine, vitamin, lên men methane, sản xuất phân bón, thuốc trừ sâu sinh học..

2.1.2.2. Xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn xạ khuẩn là hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ti). Xạ khuẩn là một trong những nhóm vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên. Chúng tham gia vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong tự nhiên. Trên 80% chất kháng sinh được phát hiện là do xạ khuẩn sinh ra. Xạ khuẩn còn được dùng để sản xuất nhiều loại enzyme, vitamin, acid hữu cơ... 2.1.2.3. Vi khuẩn lam Trước đây vi khuẩn lam (Cyanobacteria) được gọi là tảo lam (Cyanophyta) hay tảo lam lục. Thực ra đây là một nhóm vi sinh vật nhân nguyên thủy thuộc vi khuẩn thật. Vi khuẩn lam có khả năng tự dưỡng quang năng nhờ có chứa sắc tố quang hợp. Vi khuẩn lam phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhiều loài có ý nghĩa trong sản xuất sinh khối giàu protein, cố định đạm hay sử dụng trong công nghiệp xử lí nước thải... 2.2. Các tiêu chuẩn của một vi sinh vật dùng trong công nghiệp 2.2.1. Khả năng sử dụng nguyên liệu Tính kinh tế của một quá trình sản xuất đòi hỏi phải sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, đơn giản và các chủng vi sinh vật không đòi hỏi quá cao về nhu cầu dinh dưỡng. Thông thường, nguồn carbon và nitơ (nitrogen) dùng cho sản xuất là những nguồn thông dụng như các loại rỉ đường, tinh bột, dịch kiềm sulfid, nguồn nitơ kĩ thuật như cao ngô, bột đậu tương.

10

2.2.2. Tính chất sản phẩm phụ Yêu cầu các chủng vi sinh vật dùng trong sản xuất là không tạo thành các sản phẩm phụ không mong muốn. Thực ra thì trong quá trình sống vi sinh vật luôn tạo thành nhiều sản phẩm trao đổi chất tích luỹ trong môi trường, một số sản phẩm trao đổi chất có thể không có lợi cho chính trao đổi chất của tế bào và có thể gây ức chế tế bào. Sự tích luỹ nhiều các sản phẩm phụ trong môi trường một mặt làm giảm hiệu suất tạo thành sản phẩm chính, mặt khác gây nhiều khó khăn cho quá trình thu nhận và tinh khiết sản phẩm. 2.2.3. Mức độ mẫn cảm với sự lây tạp và khả năng tách sản phẩm khỏi môi trường Trong quá trình lên men thường bị nhiễm các vi sinh vật lạ. Nguồn lây nhiễm có thể từ nguyên liệu, không khí hay từ thiết bị lên men. Nếu các vi sinh vật lạ cũng thích nghi với điều kiện sống trong môi trường lên men thì chúng sẽ cạnh tranh với chủng sản xuất đồng thời tạo ra các chất có tác dụng ức chế hoặc gây chết đối với chủng sản xuất. Do đó, các chủng sản xuất phải được lựa chọn sao cho không mẫn cảm với sự tạp nhiễm do các vi sinh vật lạ và đặc biệt là với bacteriophage. Trong trường hợp bị nhiễm bacteriophage lượng giống trong môi trường lên men có thể giảm rất nhanh. Ví dụ trong môi trường bị nhiễm vi khuẩn butiric có thể ảnh hưởng mạnh đến sức sống của giống bởi vì một lượng nhỏ của acid butiric tạo thành đã gây độc đối với tế bào. Ngoài các chỉ tiêu trên, khả năng tách sản phẩm ra khỏi môi trường lên men cũng là một tiêu chuẩn để chọn chủng vi sinh vật cho sản xuất, bởi vì có nhiều quá trình sản xuất cho sản phẩm nhiều nhưng việc tách sản phẩm khó thực hiện và hiệu quả kinh tế thấp. 2.3. Dinh dưỡng cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật 2.3.1. Nguyên tố đại lượng C, O, N, H, P, S, Mg, Ca, Fe Môi trường dinh dưỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng và tạo thành sản phẩm. Các môi trường để nuôi cấy vi sinh vật cần thiết bổ sung các nguyên tố khoáng. Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phải được cung cấp với liều lượng lớn được gọi là các nguyên tố đại lượng, bao gồm các nguyên tố như C, O, N, H, P, S, Mg, Ca, Fe. Nhu cầu về chất khoáng của vi sinh vật khác nhau phụ thuộc loài, giai đoạn sinh trưởng phát triển. Nồng độ cần thiết về muối khoáng của các nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn thường thay đổi trong các phạm vi sau (bảng 2.1).

Bảng 2.1. Nồng độ cần thiết về muối khoáng của nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn

Nồng độ cần thiết (g/l) Muối khoáng

Đối với vi khuẩn Đối với nấm và xạ

khuẩn

11

K2HPO4.3H2O KH2PO4

MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O FeSO4.7H2O Na2MoO4

ZnSO4.7H2O CoCl2

CaCl2

CaSO4.5H2O

0,2 - 0,5 0,2 - 0,5 0,1 - 0,2 0,005 - 0,01 0,005 - 0,01 0,001 -0,005 - tới 0,03 0,01 - 0,03 0,001 - 0,005

1 - 2 1 - 2 0,2 - 0,5 0,02 - 0,1 0,05 - 0,2 0,01 - 0,02 0,02 - 0,1 tới 0,06 0,02 - 0,1 0,01 - 0,05

2.3.2. Nguyên tố vi lượng Mn, Na, B, Mo, Zn, Cu, Ni, Va, Cl, Si Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật chỉ đòi hỏi với liều lượng rất nhỏ được gọi là các nguyên tố vi lượng, bao gồm các nguyên tố như Mn, Na, B, Mo, Zn, Cu, Ni, Va, Cl, Si... Nồng độ cần thiết của từng nguyên tố vi lượng trong môi trường thường chỉ vào khoảng 10-6 - 10-8 M. Thông thường, khi chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng vì trong các thành phần khoáng đại lượng hoặc trong nguyên liệu hay nước để pha chế môi trường đã có đủ thành phần vi lượng. Ngoại trừ một số trường hợp như bổ sung Zn vào môi trường nuôi cấy nấm mốc, Co vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh tổng hợp vitamin B12 nhưng với hàm lượng thấp (khoảng 3-5 µg/l). 2.3.3. Dịch dinh dưỡng cho các vi sinh vật dị dưỡng Trong quá trình lên men, một môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn nhất và giá thành thấp nhất đối với chủng giống vi sinh vật. Những chủng vi sinh vật dùng cho công nghiệp đều là các giống dị dưỡng, trừ các chủng tảo thuộc giống tự dưỡng. Các chủng của tảo thường được nuôi cấy trong các quá trình khử bẩn cho nước thải hoặc nuôi tảo thu sinh khối. Những vi sinh vật dị dưỡng chỉ sản sinh năng lượng trong ATP dùng cho sinh trưởng nhờ quá trình ôxy hoá những hợp chất hữu cơ. ATP là thành phần quan trọng nhất mà tế bào dùng để vận chuyển năng lượng. Trong những phản ứng không thuận lợi về phương diện nhiệt động, ATP cho phép thực hiện những phản ứng với tốc độ thích hợp.

12

Trong công nghệ vi sinh, môi trường nuôi cấy những chủng dị dưỡng thường có các thành phần như sau: 2.3.3.1. Nguồn carbon và năng lượng Nguồn carbon và năng lượng thường được sử dụng là tinh bột, mật rỉ, saccharose, glucose, dịch đường thuỷ phân từ bột hoặc gỗ v.v... Một số loài vi sinh vật có khả năng sử dụng cellulose, hemicellulose đặt biệt là carbuahydro (alkan, methane). Chủ yếu nguồn carbon sử dụng là carbohydrate. Lượng carbon được bổ sung vào môi trường tuỳ thuộc chủng giống vi sinh vật. Một số chủng hiếu khí sử dụng khoảng 50% cơ chất, còn các chủng kỵ khí tuỳ tiện chỉ dùng tới 10% cho sinh trưởng. Rỉ đường Rỉ mật là một phụ phẩm của ngành sản xuất đường, là sản phẩm cuối cùng của quá trình sản xuất đường mà từ đó đường không còn có thể kết tinh.

Bảng 2.2. Thành phần hóa học của rỉ đường củ cải và rỉ đường mía

Thành phần Tỷ lệ Rỉ đường củ cải Rỉ đường mía

Đường tổng số % 48-52 48-56

Chất hữu cơ khá đường % 2-17 9-12

Protein (N x 6,25) % 6-10 2-4

K % 2-7 1,5-5,0

Ca % 0,1-0,5 0,4-0,8

Mg % khoảng 0,09 khoảng 0,06

P % 0,02-0,07 0,6-2,0

Biotin mg/kg 0,02-0,15 1,0-3,0

Acid pantoteic mg/kg 50-110 15-55

Inositol mg/kg 5000-8000 2500-6000

Tiamin mg/kg khoảng 1,3 khoảng 1,8

Có hai loại rỉ đường: rỉ đường củ cải, rỉ đường mía. Trong rỉ đường có tới 70 – 80% chất khô, trong đó chủ yếu là đường sacaroza 46 – 54%, đường khử 6-9%, rafinoza 1 – 2%,

13

nitơ tổng số là 0,45-2,88% và chất khoảng 3 – 4% (hơn 30 loại khoáng chất đã được phát hiện trong rỉ đường). Hàm lượng các muối photphat trong rỉ đường rất thấp. Phần lớn các hợp chất photpho ở phần lắng cặn. Khi dùng rỉ đường đã xử lý hoặc loại bỏ cặn thì nhất thiết phải bổ sung nguồn photpho vào môi trường dinh dưỡng. Rỉ đường có chứa hàm lượng lớn biotin (vitamin H) – một chất sinh trưởng rất cần thiết đối với nhiều loại vi sinh vật và là chất điều hòa trong quá trình sinh tổng hợp axít amin. Ngoài ra, trong rỉ đường còn chứa vitamin B1, B2, PP, axít pantotenic, mezoiozit. Tuy nhiên, rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp với quá trình lên men. Cả hai loại rỉ đường đều có màu nâu thẫm do được nấu và cô nhiều lần, caramen và melanoit tạo thành. Màu này khó bị phá hủy trong quá trình lên men. Sau lên men chúng bán vào sinh khối vsv và sản phẩm. Việc tách màu ra khỏi sinh khối vsv và sản phẩm thường rất khó khăn và tốn kém. Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình lên men là hệ keo trong rỉ đường. Keo càng nhiều khả năng hòa tan của ôxy càng kém. Do đó công việc quan trọng nhất khi sử dụng rỉ đường là phải phá hệ keo này. Để giải quyết những đặc điểm không thuận lợi có trong rỉ đường đối với quá trình lên men, axít sunfuric đậm đặc được sử dụng với lượng 3,5 kg cho một tấn rỉ đường, có ba cách thực hiện quá trình xử lý này: - Cách thứ nhất: khi cho 3,5 kg H2SO4 vào một tấn rỉ đường, khuấy đều ở nhiệt độ thường trong thời gian 23 giờ, sau đó ly tâm thu dịch trong. - Cách thứ hai: khi cho 3,5 kg H2SO4 vào một tấn rỉ đường, duy trì 850C và khuấy liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch trong. - Cách thứ hai: cho H2SO4 vào cho đến khi pH của rỉ đường đạt giá trị 4 tì đun nóng đến 120 – 1250C trong 1 phút để các chất vô cơ kết tủa, sau đó ly tâm thu dịch trong. Rỉ đường đã qua xử lý loại keo và màu được pha chế thành các loại môi trường có nồng độ đường khác nhau. Ví dụ: môi trường nuôi cấy thu nhận sinh khối, nồng độ đường 2 – 4%; môi trường lên men cồn và axít hữu cơ, nồng độ đường từ 16 – 20%. Dịch kiềm sulfid Trong công nghiệp men còn sử dụng dung dịch thủy phân từ gỗ - dịch kiềm sulfid là phế thải của công nghiệp giấy. Thành phần chính của dịch kiềm sulfid là linhosunfonate và các đường pentose. Thành phần của dịch kiềm sulfid từ gỗ của cây lá bản và cây lá kim là khác nhau. Ngoài ra, thành phần này cũng thay đổi nhiều tuỳ theo mức độ khai thác. Dịch kiềm sulfid của gỗ cây lá bản chiếm tỉ lệ cao các đường pentose (khoảng 80% đường) thường sử dụng để nuôi cấy thu sinh khối nấm men. Còn dịch kiềm sulfid gỗ cây lá kim thì các hexose lại chiếm ưu thế (khoảng 70% đường) dùng để lên men thu rượu.

14

Việc tiền xử lý chất thải này trước lên men là tối thiểu. Bơm hơi nước hoặc thông khí ở pH 1,5 - 3,0 là cần thiết để loại SO2 là chất vốn kìm hãm sinh trưởng của vi sinh vật. Sau đó pH sẽ được điều chỉnh tới tối ưu (pH khoảng 5) và môi trường được bổ sung các chất dinh dưỡng chứa nitơ và phosphate. Các nguyên liệu thủy phân tinh bột Để cung cấp nguồn carbon chủ yếu là glucose thì bột sắn có lẽ là nguồn nguyên liệu tốt nhất. Trong bột sắn chứa chủ yếu là tinh bột, hàm lượng N hữu cơ, chất khoáng, vitamin có với lượng rất nhỏ. Thủy phân các loại tinh bột thường thực hiện theo hai cách: - Thủy phân bằng acid với áp lực dư. Dịch thủy phân thu được qua trung hòa bằng Na2CO3 hoặc NaOH, nếu dùng H2SO4 làm tác nhân thủy phân thì có thể dùng CaCO3 hoặc nước vôi để trung hòa, sau đó đem lọc qua lọc ép khung bản với than hoạt tính khử màu. Dịch thủy phân này chứa chủ yếu là đường glucose, một lượng nhỏ các acid amin, có mặt các chất bẩn, khoáng được dùng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy hoặc đem cô đặc tới 60 - 70% chất khô để sử dụng dần. - Thủy phân bằng enzyme: Các chế phẩm enzyme chủ yếu là từ nấm mốc được nuôi cấy bề mặt hoặc bề sâu, dùng với tư cách là phức hệ amylase gồm có α, β - amylase và glucoamylase. Sản phẩm thu được là hỗn hợp maltose và glucose. Cũng có trường hợp dùng phối hợp chế phẩm enzyme từ mốc và chế phẩm enzyme từ vi khuẩn nuôi bề sâu (α - amylase chịu nhiệt) nên hiệu quả của quá trình sẽ cao hơn. Phương pháp thủy phân các loại bột (bột sắn, gạo, ngô, bột mì, cao lương, khoai Hạt và bột ngũ cốc Các loại bột ngũ cốc thường được dùng là bột gạo, bột ngô được tách phôi, bột mỳ, bột đại mạch... Ngoài thành phần chủ yếu là tinh bột, các loại bột này còn chứa khoảng vài phần trăm các hợp chất protein, các chất xơ (chủ yếu là cellulose) và các chất khoáng. Bột sắn là loại nguyên liệu khá rẻ tiền so với các loại bột khác hiện nay đang được sử dụng nhiều cho công nghệ lên men đặc biệt là lên men cồn. Các nguyên liệu tinh bột trong lên men có thể dùng trực tiếp làm thành phần của môi trường dinh dưỡng cho các chủng sinh ra enzyme amylase ngoại bào, đặc biệt là trong phương pháp nuôi cấy bề mặt. Ngoài ra, nguồn nguyên liệu này còn qua một giai đoạn thủy phân thành dung dịch các loại đường rồi mới dùng chuẩn bị môi trường dinh dưỡng.

15

Khoai mì Trong công nghiệp lên men, khoai mì được coi như loại nguyên liệu chứa tinh bột rẻ tiền. Ngoài hàm lượng tinh bột cao, khoai mì còn chứa nhiều khoáng chấy như kali, natri, photpho, magiê và sắt. Vi sinh vật rất cần các chất khoáng này quá trình phát triển và chuyển hóa để tạo ra các sản phẩm thứ cấp. Trong công nghiệp lên men thường sử dụng khoai mì khô. Để sử dụng khoai mì làm môi trường cho vi sinh vật tiến hành các quá trình chuyển hóa thì tinh bột khoai mì phải được đường hóa bằng enzyme thành đường glucose. Hiện nay, khoai mì được sử dụng để sản xuất đường glucose bằng phương pháp thủy phân tinh bột bằng enzyme sản xuất bột ngọt, Ngô mảnh Ngô mảnh là loại nguyên liệu rất thông dụng trong các quá trình lên men. Ưu điểm lớn nhất của ngô mảnh là loại vật liệu rời, tinh bột có trong ngô mảnh không tạo thành khối kết dính nên thuận lợi để làm môi trường bán rắn trong nuôi cấy bề mặt. Mặt khác, ngô mảnh có thể bảo quản được lâu dễ mua và giá rẻ. Hiện nay, ngô mảnh được sử dụng trong các quá trình nuôi cấy nấm sợi để thu nhận enzyme, là nguyên liệu trong sản xuất rượu, nguyên liệu thay thế malt trong sản xuất bia, làm môi trường để bảo quản nấm sợi, xạ khuẩn rất tốt. Cám gạo Trong các nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên, cám gạo được sử dụng nhiều trong nuôi cấy vsv. Cám gạo chứa đầy đủ các dưỡng chất phù hợp với sự phát triển của vsv, đặc biệt là nấm sợi. Tuy nhiên trong quá trình thanh trùng, tinh bột cám gạo bị kết dính tạo nên một khối khá chặt ngăn chặn sự vận chuyển của ôxy trong khối môi trường. Vì vây, khi sản xuất môi trường nuôi cấy nấm sợi cần phải bổ sung vào môi trường 25% trấu để tạo độ xốp tăng khả năng thâm nhập của không khí vào môi trường. Ngoài ra, các parafin có mạch từ C8 - C18, khí methane... có thể được sử dụng làm nguồn carbon nuôi cấy vi sinh vật thu cồn hoặc protein đơn bào cho sản xuất thức ăn gia súc. 2.3.3.2. Nguồn nitơ Nguồn nitơ chủ yếu trong công nghệ lên men là nước amoniac và muối ammon. Dùng vào mục đích này còn có các nguồn nitơ hữu cơ như cao ngô, dịch thuỷ phân nấm men, thuỷ phân khô lạc, đậu tương, hạt bông, các bã thải của công nghệ bia (dịch ngâm malt hoặc rễ mầm malt), bã thải rau quả, khoai tây, sữa loại bỏ mỡ, phụ phẩm khi chế biến pho mát, thịt cá... Các nguồn nitơ hữu cơ với vai trò làm nguồn nitơ và cả nguồn carbon, đồng thời còn

16

cung cấp các chất sinh trưởng. Vì vậy, khi sử dụng các nguồn nitơ hữu cơ, vi sinh vật thường phát triển mạnh hơn. Nitơ tham gia vào tất cả các cấu trúc trong tế bào vi sinh vật, giúp tế bào hoàn thiện mọi chức năng của hoạt động sống. Nguồn nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không kém nguồn carbon. Nitơ được cung cấp cho tế bào vi sinh vật dưới nhiều dạng khác nhau: - Dưới dạng các hợp chất vô cơ và hữu cơ khá thuần khiết như: NH4

+ , NO3- , pespton

các loại, các amino acid. Trong lên men công nghiệp người ta thường sử dụng nguồn nitơ dưới dạng sản phẩm thô gọi là nguồn nitơ kỹ thuật bao gồm các loại sau: + Dịch thuỷ phân nấm men: Một trong những lý do con người quan tâm nhiều đến nấm men vì trong tế bào nấm men chứa nhiều chất dinh dưỡng có giá trị, nổi bật là protein và vitamin. Hàm lượng protein của nấm men dao động trong khoảng 40 - 60% chất khô của tế bào. Về tính chất protein của nấm men gần giống protein nguồn gốc của động vật, có chứa khoảng 20 amino acid, trong đó có đủ các amino không thay thế. Thành phần amino acid trong nấm men cân đối hơn so với lúa mì và các hạt ngũ cốc khác; kém chút ít so với trong sữa và bột cá. Vì vậy dịch thuỷ phân nấm men là một loại dịch rất giàu chất bổ dưỡng, gồm amino acid, các peptid, các vitamin, đặc biệt là vitamin thuộc nhóm B. Người ta sử dụng nấm men thuỷ phân với mục đích bổ sung nguồn nitơ và nguồn các chất kích thích sinh trưởng vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Có thể thu nhận nấm men bằng nhiều phương pháp khác nhau: bằng tác động của enzyme; phương pháp tự phân ở 45 - 50oC, pH = 6,2; phương pháp tiêu nguyên sinh chất bằng dung dịch NaCl ở nồng độ cao...Thành phần hóa học của các dịch thuỷ phân nấm men phụ thuộc vào nguyên liệu và quy trình sản xuất. + Bột đậu nành: Bột đậu nành sau khi tách lấy dầu là một nguyên liệu lý tưởng dùng trong công nghệ vi sinh. Loại bột này chứa tới 40- 50% protein, 30% carbohydrate, hàm lượng dầu còn lại 1%, lecithin 1,8%. + Cao ngô: Có dạng lỏng màu nâu thẫm được tạo nên từ nước chiết ngâm ngô thông qua quá trình cô đặc. Thành phần của cao ngô chất khô chiếm 40 - 50% (trong đó chứa: 3 -5% N, 1-3% đạm amine). Trong cao ngô còn chứa một ít protein, một số amino acid tự do và các peptid có phân tử lượng thấp. + Khô lạc hay bánh dầu phộng: Là xác bã thu được sau khi ép lạc lấy dầu. Thành phần giàu protein và một số acid béo. Hàm lượng đạm tổng số và đạm amine gần giống như ở cao ngô. + Nước mắm, nước tương: Nước mắm, nước tương cũng được sử dụng với vai trò là nguồn nitrogen vì có chứa khá đầy đủ các amino acid cần thiết. Nước mắm: Là sản phẩm

17

chế biến từ quá trình lên men tự nhiên, phân huỷ protein của cá dưới tác dụng của hệ enzyme protease. Nước mắm có giá trị dinh dưỡng cao, có đầy đủ các amino acid hợp phần của protein.Thành phần: đạm tổng số 15 - 25 g/l, đạm amine chiếm 60 - 70% đạm tổng số. Nước tương: Là dịch thuỷ phân từ bánh dầu lạc hay dầu đậu nành bằng HCl hoặc thông qua quá trình thuỷ phân bằng enzyme của nấm mốc. Thành phần của nước tương: đạm tổng số: 20 - 25 g/l, đạm amine là 70- 75% đạm tổng số. Dịch amino acid thu được này sẽ thiếu hai amino acid là acid tryptophan và cysteine vì hai amino acid này bị phá huỷ trong môi trường acid. Do vậy, nếu nước tương thu được bằng thuỷ phân bánh dầu do enzyme của nấm mốc sẽ có đầy đủ thành phần amino acid hơn. 2.3.3.3. Nước Trong công nghệ vsv cần phải coi nước là nguồn nguyên liệu quan trọng, vì các môi trường lên men (hoặc nuôi cấy) cần một lượng nước rất lớn. Nước dùng cho sản xuất lên men là nước sạch và mềm. Các chỉ số quan trọng của nước là: độ cứng, độ ôxy hóa, chỉ số vi sinh vật. - Độ cứng thể hiện sự có mặt các ion Ca++ và Mg++ có trong nước. Các muối bicacbonat của hai muối này là độ cứng tạm thời (khi đung sôi chúng chuyển sang dạng cacbonat và lắng cặn), còn muối của các ion khác như: Cl-, SO4

-- và NO- là độ cứng vĩnh cửu. Độ cứng của nước tính bằng mg đương lượng trong một lít nước, 1 mg đương lượng tương đương 20,04 mg Ca++ hoặc 12,16 mg Mg++. Nước dùng trong lên men phải có độ cứng chung không vượt quá 7 mg đương lượng. - Độ ôxy hóa của nước cho biết mức độ nhiễm bẩn của nước bởi các chất hữu cơ. Chỉ số này được biểu hiện bằng số mg ôxy có trong một lít nước. - Chỉ số vsv cho biết mức độ nhiễm bẩn của nước bằng tổng số vi sinh vật và lượng vi sinh vật đường ruột (đại diện là E.coli) có trong một lít nước. Nước dùng trong lên men trước tiên phải đạt tiêu chuẩn dùng làm nước uống, không mùi vị, trong suốt không màu, đặc biệt là không chứa sắt, không có mùi ammoniac, không chứa kim loại năng (thủy ngân, chì, asen….) và đạt các tiêu chuẩn sau: - Độ cứng chung: ≤ 7 mg đương lượng/l - Cặn khô ≤ 1000 mg/l - Cặn sunfat ≤ 500 mg/l - Cặn clorua ≤ 350 mg/l - Tổng lượng vi khuẩn trong nước ≤ 1000 tế bào/lít Xử lý nước bằng phương pháp trao đổi ion Ba loại cation được sử dụng trong xử lý nước là:

18

- Natri ký hiệu là NaR - Hydro ký hiệu là HR - Amon ký hiệu là NH4R Trong đó : R là gốc cation không tan trong nước. Nếu sử dụng natri cationit, phản ứng sẽ xảy ra như sau : Ca(HCO3)2 + 2NaR = CaR2 + 2NaHCO3

Mg(HCO3)2 + 2NaR = MgR2 + 2NaHCO3

CaCl2 + 2NaR = CaR2 + 2NaCl Kết quả là toàn bộ độ cứng của nước được khử nhưng độ kiềm trong nước sẽ thay đổi Nếu sử dụng hydro cationit, phản ứng sẽ xảy ra như sau: Ca(HCO3)2 + 2HR = CaR2 + 2CO2 + H2O Mg(HCO3)2 + 2HR = MgR2 + 2CO2 + H2O CaCl2 + 2HR = CaR2 + 2HCl Kết quả là độ cứng và độ kiềm của nước được khử nhưng sẽ tạo thành các axít trong nước. Nếu sử dụng amon cationit, phản ứng sẽ xảy ra như sau : Ca(HCO3)2 + 2NH4R = CaR2 + 2NH4HCO3

Mg(HCO3)2 + 2NH4R = MgR2 + 2NH4HCO3

CaCl2 + 2NH4R = CaR2 + 2NH4Cl Kết quả là độ cứng giảm đi nhưng các muối amon sẽ chuyển thành NH3 theo phản ứng NH4Cl = NH3 + HCl NH3 được tạo thành tiếp xúc với ôxy sẽ gây ra sự ăn mòn kim loại đồng. Trong thực tế, thường phối hợp cả ba phương pháp để hạn chế nhược điểm của từng phương pháp. Sau một thời gian sử dụng, các cationit dần dần bị cạn kiệt hết các cation. Để tái sử dụng, các cationit được hoàn nguyên. Với natri cationit sử dụng dung dịch NaCl, hydro cationit sử dụng dung dịch H2SO4 hay HCl, amon cationit sử dụng dung dịch muối amon. Quá trình trên xảy ra các phản ứng như sau: CaR2 + 2NaCl = 2NaR + CaCl2

MgR2 + 2NaCl = 2NaR + MgCl2

Hay CaR2 + 2H2SO4 = 2HR + CaSO4

MgR2 + 2H2SO4 = 2HR + MgSO4

19

CaR2 + 2NH4Cl = 2 NH4R + CaCl2

Các liên kết tách ra sau khi hoàn nguyên là nhưng liên kết tan trong nước và được thải ra khỏi lớp cationit bằng cách rửa. Những ion Natrium trong hạt nhựa sẽ thay thế Calcium và Magnesium tạo ra một loại nước mềm theo phản ứng như sau:

Ca ++ / Mg ++ + Na2- Zeolite → Ca / Mg (Zeolite) + 2Na+

Để loại trừ Calcium, Magnesium người ta dùng một loại muối Aluminium (Sodium Aluminosilicates) có trong thiên nhiên gọi là Zéolite hay hạt nhựa nhân tạo (Cation exchange resin). Sau khi hạt nhựa đã hút được Calcium và Magnesium, trở nên bão hòa, mất tác dụng, thì dùng nước muối để tái sinh nhựa trở lại để sử dụng theo phản ứng:

Ca / Mg (Zeolite) + 2NaCl → Na2- Zeolite + CaCl2 / MgCl2

(Nhựa thải ra) → (Nhựa trao đổi Ion tái sinh) + (Thải ra ngoài) Ngày nay các nhà sản xuất hạt nhựa trao đổi Ion nhân tạo từ nguyên lý nói trên đã trừ khử được cả những Anion vô cơ trong nước như Nitrates, Sulphate, Chlorides, Silicates và Carbonates bằng những hạt nhựa Anion mạnh theo phản ứng sau:

CaNO3 + R-Cl → RNO3 + CaCl

MgNO3 + R-Cl → RNO3 + MgCl

(Anion exchange resin)

Hình 2.1. Sơ đồ hệ thống xử lý nước bằng trao đổi ion

Đây là một phương pháp khá kinh tế và thuận lợi trong công nghệ xử lý nước công nghiệp, đặc biệt có hiệu quả đối với các nhà máy dùng nước làm nguyên liệu như trong linh vực y dược, nước uống có pha các loại Vitamin và mỹ phẩm. Cần lưu ý thêm là các hạt nhựa

20

trao đổi Ion không có khả năng diệt khuẩn nhưng lại có tác dụng tích cực loại trừ các chất phèn, muối khoáng dư thừa trong nước, đặc biệt là các loại nước giếng có hàm lượng muối khoáng quá mức cho phép. Cho nên hệ lọc sử dụng phương pháp này thường được gọi là máy làm mềm nước (Water Softener) hay khử Ion (Deionizer). Hiện nay các nhà sản xuất đã cho ra đời các loại máy khử Ion kèm theo hệ rửa ngược tự động để tái sinh hạt nhựa bị bão hòa trong ống lọc. 2.3.3.4. Các nguyên tố khoáng Trong công nghệ lên men, người ta nhận thấy vai trò của dinh dưỡng khoáng rất lớn, nó ảnh hưởng nhiều đến chất lượng của quá trình lên men. Trong số dinh dưỡng khoáng, người ta đặc biệt chú ý đến vai trò của phospho (P). Khi lên men công nghiệp, người ta thường bổ sung P dưới dạng bột đậu, bột bắp, bã rượu, hay ở dạng phosphate vô cơ. Với các chất khoáng khác như: Mg, Na, Fe... vi sinh vật sẽ nhận từ môi trường dinh dưỡng ở dạng muối vô cơ hoặc có khi ngay cả trong nước pha môi trường dinh dưỡng. Vì vậy khi pha môi trường người ta thường dùng nước máy mà không dùng nước cất. Các nguyên tố vi lượng như: Mn, Mo, Co... thường có mặt trong các nguyên liệu tự nhiên ban đầu khi đưa vào môi trường lên men như dịch trái cây, nước chiết các loại hạt. - Nguồn lưu huỳnh bổ sung vào dịch lên men ở dạng muối sulfate. - Nguồn Mg và K thường được đưa vào dưới dạng cation của muối phosphate và sulfate. Trong một số quá trình lên men, calcium được đưa vào môi trường ở dạng muối carbonate để duy trì pH ở vùng trung tính hoặc gần trung tính khi acid được tạo thành (ví dụ như lên men tạo các acid hữu cơ) - Nguồn Fe: thông thường trong các nguyên liệu sử dụng đã có đủ sắt, nên ít khi phải bổ sung. Tuy vai trò của các nguyên tố khoáng rất quan trọng, nhưng trong quá trình lên men cũng chỉ cần một lượng thích hợp, nếu vượt quá giới hạn sẽ giảm hiệu quả của quá trình lên men. Vì vậy khi thiết kế nồi lên men, người ta chế tạo từ thép carbon, bên trong nồi còn quét lớp keo bảo vệ. 2.3.3.5. Vitamin và các yếu tố sinh trưởng khác Trong các môi trường dinh dưỡng dùng cho công nghiệp, vitamin và các yếu tố sinh trưởng thường được bổ sung ở dạng nguyên liệu làm giàu vitamin như cao ngô, rỉ đường, cao nấm men. Chúng chứa hỗn hợp các acid amin, vitamin và cả một số yếu tố khác chưa biết rõ, ví dụ như các dịch chiết động vật hay thực vật. Lượng có ích của các yếu tố đặt biệt đó đôi khi chỉ cần rất ít. Ví dụ α - alanine có hiệu lực ở nồng độ 1/100.000.000, còn acid pantotenic có hiệu lực ở nồng độ 1/50.000. Những yếu tố chưa biết rõ đó gọi chung là các yếu tố sinh trưởng.

21

Cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân từ nguồn protein thực vật, động vật vừa đóng vai trò là nguồn nitơ hữu cơ vừa là nguồn cung cấp các chất sinh trưởng cần thiết. Ngoài ra, trong công nghệ vi sinh còn dùng nước chiết cám, dịch ép khoai tây, dịch ép giá đậu, dịch ép cà chua, bắp cải hoặc một số rau quả khác cũng chứa nhiều vitamin và dùng làm nguồn kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy vi sinh vật. Dịch dinh dưỡng chứa các chất dinh dưỡng ở một nồng độ đủ đảm bảo suốt quá trình nuôi. Như vậy, nguồn carbon và năng lượng được đưa vào ở phạm vi 10-100g/l. Ở nhiều cơ thể, nồng độ cần thiết để duy trì tốc độ sinh trưởng cực đại là rất nhỏ; đối với đường thì khoảng 1-10mg/l. Với amino acid và vitamin thì tế bào chỉ cần nồng độ 1-100 μg/l. Các trị số có tính đặc hiệu cơ thể và đặc hiệu quá trình. Dịch dinh dưỡng dùng trong lên men chứa các thành phần cần thiết thường không ở một tỷ lệ cân đối mà sinh trưởng đòi hỏi. Nhờ những điều kiện như tỷ lệ C : N cực trị hoặc sự thiếu phosphate mà trao đổi chất có thể được điều khiển theo hướng có ý nghĩa cho việc tổng hợp sản phẩm mong muốn. Điều đó đúng với các nguyên tố đại lượng cũng như vi lượng. Chẳng hạn bằng cách đưa Co vào mà đạt được thu hoạch cao về vitamin B12, hay sự thiếu sắt kích thích quá trình tổng hợp acid citric. 2.3.3.6. Nhu cầu về ôxy và sự thông khí trong quá trình lên men Độ hoà tan của ôxy trong nước Tế bào sử dụng ôxy để hô hấp và làm giảm lượng ôxy trong môi trường. Vì thế trong nuôi cấy hiếu khí phải cung cấp ôxy một cách đều đặn. Thiếu ôxy nhất thời tại một thời điểm nào đó trong môi trường sẽ dẫn đến sự phá vỡ quá trình trao đổi chất của tế bào. Vi sinh vật sử dụng ôxy trong môi trường lỏng. Lượng ôxy hoà tan trong nước thường là rất ít. Phải cung cấp ôxy sao cho tốc độ hoà tan của nó bằng tốc độ tiêu thụ ôxy của vi sinh vật. Tốc độ hoà tan của ôxy vào môi trường lỏng được tính theo công thức: R = K. (C - C1) Trong đó: R- tốc độ hoà tan ôxy, C - nồng độ ôxy bảo hoà ở áp suất riêng đã biết, C1- nồng độ ôxy hoà tan ở thời điểm lựa chọn, K - hằng số tỉ lệ, t - thời gian. Độ hoà tan ôxy còn phụ thuộc vào nhiệt độ khi nuôi cấy, vào nồng độ các chất hợp phần và độ nhớt của môi trường. Khi nhiệt độ tăng lên thì độ hoà tan của ôxy giảm. Độ hoà tan của ôxy trong môi trường giảm đi 2 lần khi nhiệt độ tăng từ 30 - 370C. Điều này có thể khắc phục bằng cách cho sục khí mạnh hơn trong quá trình lên men. Nồng độ ôxy hoà tan cũng sẽ giảm khi dùng các chất hoạt động bề mặt, các chất phá bọt và hàm lượng sinh khối vi sinh vật tăng. Trong quá trình nuôi cấy không khí nén được thổi vào thùng lên men có hệ thống cánh khuấy. Tốc độ sục khí mạnh sẽ tăng tốc độ hoà tan ôxy và trộn đều cơ chất dinh dưỡng

22

trong môi trường. Nhưng không nên khuấy quá mạnh vì có thể dẫn đến sự hư hỏng cơ học các tế bào và dẫn đến hiện tượng tự phân. Nồng độ ôxy giới hạn Ôxy rất cần đối với đời sống của vi sinh vật hiếu khí. Tăng thông khí đến giới hạn nhất định thì sự phát triển của vi sinh vật cũng tăng lên theo. Đối với nhiều vi sinh vật, thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao lượng sinh khối. Khi tăng tốc độ hoà tan ôxy từ 0 - 5 milimol O2 /l.phút, lượng sinh khối cuối cùng của Serratia marsescens sẽ tăng một cách đáng kể; sinh khối cực đại đạt được khi cường độ thông khí khoảng 5 milimol O2/l.phút. Nếu tiếp tục tăng thông khí hơn nữa thì lượng sinh khối cuối cùng sẽ giảm. Hiện tượng này còn gặp ở rất nhiều giống vi sinh vật. Để duy trì việc cung cấp ôxy tối thích cho tế bào không cần thiết phải làm bão hoà môi trường bằng ôxy hoà tan. Chỉ cần một nồng độ ôxy nhỏ hơn rất nhiều cũng đủ để cung cấp cho các enzyme phản ứng với cơ chất đó. Nồng độ ôxy gây ra hô hấp tối đa được gọi là nồng độ ôxy tới hạn (hoặc áp suất riêng phần của ôxy). Đó không phải là một đại lượng cố định mà là một hàm số của tốc độ sinh trưởng hoặc của tốc độ hô hấp có liên quan với nó. Trị số này vào khoảng 10 μmol/l. Khi sự vận chuyển ôxy bị cản trở bởi những tập hợp tế bào (các cục sợi nấm) hoặc bởi lớp chất nhầy bao quanh các tế bào thì nồng độ ôxy giới hạn có trị số cao hơn. Sự cung cấp ôxy cho các tế bào chìm

Sự cung cấp ôxy cho các tế bào chìm là một quá trình chuyển dịch chất, trong đó ôxy được chuyển từ bóng không khí vào môi trường dinh dưỡng và từ đó vào tế bào. Quá trình xảy ra nhờ dòng chảy và sự khuếch tán. Lực đẩy là sự chênh lệch nồng độ ôxy. Sự chuyển dịch chất từ tướng khí sang tướng lỏng được quy định bởi bề mặt giới hạn giữa hai tướng và do vậy bởi số lượng và kích thước các bóng không khí. Chỉ một phần nhỏ của không khí được cung cấp đi vào dung dịch. Bởi vậy trong thực tiễn, người ta thường sử dụng tỷ số của thể tích không khí/thể tích nồi lên men/phút. Đối với mỗi quá trình lên men cần phải nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ thông khí đối với hiệu suất tạo thành sản phẩm. Trong sản xuất công nghiệp không khí được nén qua máy nén, qua một hệ thống làm nguội, qua hệ thống lọc để loại hết tạp khuẩn rồi thổi vào các thùng lên men. Trong các thùng lên men và các thùng nuôi cấy nhân giống đều có hệ thống khuấy tuỳ thuộc vào yêu cầu của từng loại vi sinh vật, vào từng điều kiện nuôi cấy để nhằm thu được hiệu suất tối đa.

23

2.4. Nguyên lý trao đổi chất ở tế bào vi sinh vật Vi sinh vật được cấu tạo tự một tế bào (cơ thể đơn bào) nên chịu sự tác động trực tiếp từ môi trường. Sự trao đổi chất ở vsv xảy ra theo hai quá trình: quá trình đồng hóa và quá trình dị hóa. Quá trình đồng hóa: thúc đẩy quá trình sinh trưởng và sinh sản của tế bào Quá trình dị hóa: là quá trình phân giải các chất. Quá trình dị hóa có thể diễn ra trong tế bào (do các enzim nội bào thực hiện) hoặc ngoài tế bào (do các enzim ngoại bào thực hiện) Do ảnh hưởng của điều kiện tự nhiên rất khắc nghiệt, các vi sinh vật thường phải trải qua quá trình đấu tranh để sinh tồn. Chính vì vậy chúng phải có khả năng thích nghi rất cao khả năng này giúp vsv loại trừ quá trình trao đổi chất không thích hợp và hoàn thiện dần quá trình giúp nó thích nghi với môi trường. Có nghĩa là khi vi sinh vật tiến hành quá trình trao đổi chất thường không tạo ra các sản phẩm dư thừa. Các sản phẩm tạo ra trong quá trình trao đổi chất đủ để tiến hành các quá trình sinh hóa cơ bản trong tế bào. Như vậy sản xuất công nghiệp vi sinh vật, ta thu nhận một số quá trình tổng hợp là các sản phẩm thường không có ý nghĩa lớn đối với vsv, nhưng với người sản xuất các sản phẩm này có ý nghĩa quan trọng trong quá trình kinh doanh. Trong quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật sẽ tạo ra các sản phẩm sau: - Sinh khối vsv (các vật chất có trong tế bào vsv – sản phẩm bậc một) - Các vật chất được tạo ra trong quá trình trao đổi chất, tế bào tách chúng ra môi trường, chúng không tham gia quá trình tạo ra sinh khối tế bào – sản phẩm trao đổi chất bậc hai. - Ngoài ra còn có một dạng sản phẩm khác là sản phẩm của sự chuyển hóa. Chúng thường là các chất trung gian không bền về mặt hóa học và chúng còn tiếp tục được chuyển hóa trong chuỗi chuyển hóa của tế bào. 2.5. Nguyên lý điều hòa trao đổi chất ở vi sinh vật Trong quá trình trao đổi chất, vi sinh vật không bao giờ tạo ra quá nhiều chất này hay chất khác mà chỉ ở mức độ cần thiết nhất định cho sinh sản, phát triển và duy trì loài. Như vậy, trong tự nhiên không có quá trình tạo ra sự dư thừa các sản phẩm trao đổi chất. Điều khiển cho sự không tạo ra những dư thừa của quá trình trao đổi chất của vsv trong tự nhiên là quá trình phức tạp nhưng rất chặt chẽ. Các nhà khoa học đã tìm ra ba cơ chế điều hòa quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật là: Điều hòa hoạt tính enzyme nhờ sự ức chế của sản phẩm cuối cùng Cơ chế này được gọi là sự kìm hãm theo cơ chế ngược. Theo cơ chế này, sản phẩm cuối cùng của một quá trình phản ứng sẽ gây sự ức chế quá trình phản ứng. Các sản phẩm

24

cuối cùng cũng có thể là các sản phẩm được tạo thành trong quá trình trao đổi chất, cũng có thể là chất đưa vào quá trình nuôi cấy. Các sản phẩm này sẽ tham gia gây ức chế hoạt tính của enzyme đầu tiên tham gia phản ứng đầu tiên của chuỗi phản ứng. Các enzyme bị ức chế thường là các enzyme dị lập thể. Khi có sự tác động của sản phẩm cuối cùng, các enzyme này sẽ bị thay đổi cấu hình không gian và như vậy các trung tâm hoạt động sẽ bị thay đổi cấu hình không phù hợp với cấu hình không gian của cơ chất. Khi đó tốc độ phản ứng sẽ giảm hay bi tiêu diệt. Về mặt lý thuyết, muốn chuỗi phản ứng tiếp tục xảy ra thì phải triệt tiêu sản phẩm cuối. Tuy nhiên trong thực tế, cơ chế ức chế bởi sản phẩm cuối cùng rất nhanh và có hiệu quả tức thì. Trong quá trình sống, vsv thường sử dụng các sản phẩm cuối cho quá trình phát triển và sinh sản. Cũng có thể các sản phẩm cuối cùng là một sản phẩm không cần thiết cho quá trình trên. Mà nó lại là chất dinh dưỡng cho các vsv khác. Và như vậy trong thiên nhiên có sự thay đổi nhịp nhàng giữa quá trình tạo ra và mất đi. Điều hòa quá trình này là do sản phẩm cuối tạo ra. Khi sản phẩm được tạo ra dư so với nhu cầu của vsv, sản phẩm cuối sẽ ức chế quá trình tạo ra chúng. Khi hết, cơ chế ức chế này không còn được duy trì và cơ chế tạo ra sản phẩm cuối cùng được tái lập. Cứ như vậy, sự điều hòa trở nên nhịp nhàng trong suốt quá trình phát triển của vsv. Trong quá trình sản xuất, ta có thể điều khiển quá trình này bằng việc làm tăng hay giảm lượng sản phẩm cuối cùng của phản ứng. Điều hòa cơ chế kiềm dị hóa sự tổng hợp enzyme bằng cơ chất phản ứng Trường hợp các enzyme tham gia quá trình dị hóa được điều hòa bằng cơ chế kiềm dị hóa, các enzyme tham gia vào quá trình dị hóa được gọi là enzyme cảm ứng. Chất mà enzyme tham gia phân hủy gọi là cơ chất cảm ứng. Các cơ chất này có khả năng kích thích sự tổng hợp các enzyme cảm ứng tương ứng. Do đó các enzyme tương ứng chỉ được ra khi trong môi trường nuôi cấy có mặt các cơ chất tương ứng. Thực tế, trong môi trường không chỉ tồn tại một loại cơ chất mà nó có rất nhiều cơ chất. Các cơ chất này đều có khả năng kích thích sự tạo ra các enzyme cảm ứng, còn quá trình tổng hợp enzyme lại phụ thuộc hoàn toàn vào tính chất của cơ chất. Cơ chất nào dễ dàng bị phân hủy thì sẽ dễ bị kích thích sự tổng hợp ra các enzyme cảm ứng tương ứng trước. Lần lượt như vậy cho đến khi tất cả các cơ chất được phân hủy và tất cả các enzyme được tạo thành. Trong những trường hợp glucose có mặt trong môi trường, sẽ xảy ra hiện tượng trong tế bào vsv tăng quá trình sinh tổng hợp enzyme phân hủy glucose. Các quá trình khác bị ức

25

chế cho đến khi không còn glucose trong môi trường. Sự ức chế quá trình sinh tổng hợp các loại enzyme khác bởi glucose trong trường hợp này gọi là hiệu ứng glucose. 2.6. Nguyên lý sinh tổng hợp thừa ở vi sinh vật Các enzyme thường tồn tại loại cấu trúc không gian. Trong cấu trúc không gian của enzyme tồn tại hai trung tâm: một trung tâm phản ứng với cơ chất và một trung tâm chịu sự kiểm soát của chất kiềm chế. Cấu tạo không gian của trung tâm hoạt động trong enzyme có hình dạng giống như cơ chất mà chúng tham gia phản ứng. Sự trùng lặp về cấu trúc không gian này giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme tạo ra phản ứng dị hóa. Trong trường hợp enzyme bị ức chế ngược bởi sản phẩm cuối thì sản phẩm cuối này được coi như chất kiềm chế (trung tâm dị lập thể) làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm phản ứng không phù hợp với cấu trúc không giam của cơ chất. Khi đó phản ứng sẽ khó xảy ra. Như vậy, muốn phản ứng xúc tác diễn ra liên tục thì trung tâm dị thể phải luôn luôn được biến đổi để chùng không tương tác với chất kiềm chế (Ví dụ: sản phẩm cuối cùng). Khi đó cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động không còn bị biến dạng và chúng hoàn toàn tương ứng với cơ chất. Như vậy, sản phẩm của các phản ứng sẽ được tạo ra liên tục. Sản phẩm này được tạo ra không có sự kiểm soát của chất kiềm chế được gọi là sản phẩm thừa đối với vsv. Một vấn đề khác cũng cần được là sáng tỏ để hiều hơn cơ chế sinh tổng hợp thừa – đó là vị trí của các axít amin trong cấu trúc của enzyme. Do có sự sai lệch về thứ tự sắp xếp hay số lượng các axit amin nằm trong các trung tâm hoạt động đều dẫn đến sự sai lệch về chiều hướng phản ứng hay tốc độ phản ứng. Sự thay đổi các axít amin trong trung tâm kiềm chế sẽ làm mất khả năng kết hợp với chất kiềm chế. Khi đó trung tâm hoạt động sẽ không thay đổi cấu trúc không gian và quá trình phản ứng sẽ liên tục xảy ra. Kết quả ta nhận được sản phẩm thừa liên tục. Trong thiên nhiên luôn xảy ra nhiều đột biến khác nhau. Các đột biến này thường không định hướng. Các đột biến làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm kiềm hãm. Từ đó, các chất kiềm hãm không có khả năng phong tỏa được các trung tâm hoạt động. Như vậy, muốn cho vsv sinh tổng hợp thừa một nào đó, phải tác động vào trung tâm dị lập thể để chúng không còn khả năng hoạt động, hoặc tác động vào chất kiềm hãm làm cho chúng không còn khả năng tương tác với trung tâm dị lập thể. Tóm lại, muốn có quá trình sinh tổng hợp enzyme hay sản phẩm trao đổi chất diễn ra liên tục cần phải giải tỏa sự kiềm chế.

26

2.7. Các sản phẩm của quá trình lên men Các chất được sản xuất bằng con đường lên men nhờ vi sinh vật rất đa dạng. Để tiện cho nghiên cứu và ứng dụng thì phải tiến hành phân loại sản phẩm lên men công nghiệp dựa vào tiêu chuẩn sinh lý sinh hóa trao đổi chất của vi sinh vật. Chính vì vậy công tác phân loại sản phẩm là việc làm cần thiết của công nghệ vi sinh. 2.7.1. Sinh khối (vật chất tế bào) Quá trình nuôi cấy chủ yếu là sinh sản, phát triển các tế bào của giống vi sinh vật, các chất dinh dưỡng được chuyển hóa thành vật chất tế bào. Các dạng sản phẩm loại này có thể là: protein đơn bào ở dạng nấm men, men bánh mì, các tế bào vi khuẩn trong thuốc trừ sâu vi sinh, chế phẩm phân bón vi sinh cố định đạm, các chế phẩm có tế bào sống của nấm men hay vi khuẩn để làm tăng men tiêu hóa, các chế phẩm làm vaccine trong y học… Trong lên men thu sinh khối chủ yếu là quá trình sinh sản và phát triển các tế bào của chủng nuôi cấy. Sinh sản là sự tăng lên về số lượng tế bào, còn sinh trưởng đòi hỏi sự tổng hợp tất cả các chất cấu trúc và thành phần tế bào, như acid nucleic, protein, lipid, polysacharide của thành tế bào. Sinh trưởng phục vụ cho sự duy trì và sinh sản của vi sinh vật. Trong nuôi cấy tối ưu với các nguồn hydratcacbon thích hợp thì có khoảng một nửa lượng cơ chất được dùng cho sinh trưởng tăng sinh khối, nửa kia dùng để trao đổi năng lượng phục vụ cho quá trình hô hấp của vi sinh vật và sản phẩm cuối cùng của sự hô hấp là CO2 và nước. Các sản phẩm lên men không có chức năng nào đối với tế bào. Vì vậy trong quá trình nuôi cấy cần chọn các điều kiện sao cho càng nhiều cơ chất được chuyển hóa thành cơ chất càng tốt. Lên men thu sinh khối nấm men chứa rất nhiều protein và được gọi là protein đơn bào (sinh khối nấm men trong chăn nuôi ). Men bánh mì là sinh khối của nấm men Saccharomyces cerevisiae, còn chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh là sinh khối của một vài loài thuộc giống Bacillus (chúng còn sống và có khả năng sinh tinh thể độc trong ống tiêu hoá của sâu làm sâu bị chết), và những vi khuẩn cố định nitơ thường chúng sống cộng sinh ở cây họ đậu gây nốt sần ở rễ hay tự do trong đất. Trong chế phẩm phân bón, các vi khuẩn này còn sống và có hoạt tính cố định đạm. 2.7.2. Các sản phẩm trao đổi chất 2.7.2.1. Các sản phẩm cuối cùng của sự trao dổi năng lượng

27

Đó là các sản phẩm của quá trình lên men. Lên men là một trong những con đường của quá trình trao đổi năng lượng. Ngoài việc cung cấp năng lượng cho tế bào, lên men còn cung cấp các sản phẩm rất có giá trị đối với đời sống con người. Đó chính là các sản phẩm lên men cổ điển : etanol, metanol, propanol, acid lactic, axetol butanol, metan… 2.7.2.2. Các sản phẩm trao đổi bậc một Gồm các sản phẩm: acid amin, nucleotit, vitamin, acid citric… Các chất trao đổi bậc một là những chất cấu trúc tế bào, các acid hữu cơ. Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật hay các quá trình lên men ở qui mô công nghiệp, phục vụ, người ta cần điều chỉnh các điều kiện sao cho các chủng có khả năng tổng hợp thừa hay “siêu tổng hợp” các sản phẩm đối với yêu cầu sinh trưởng của chúng. 2.7.2.3. Các sản phẩm trao đổi bậc hai Gồm các sản phẩm: chất kháng sinh, alcaloit, chất kích thích hoặc kìm hãm sinh trưởng, các độc tố từ vi sinh vật… Các chất trao đổi bậc hai là những hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, không gặp ở mọi cơ thể. Chúng chỉ có ở một số nhóm vi sinh vật nhất định. Chúng không có chức năng chung trong trao đổi chất của tế bào , nhưng có thể có ý nghĩa với sự sinh trưởng của những cơ thể sản sinh ra chúng. Các chất kháng sinh là tiêu biểu cho những hợp chất này. 2.7.2.4. Các enzyme Là những protein xúc tác cho sự biến đổi các chất của tế bào. Mỗi tế bào vi sinh vật có khoảng 1000 loại enzyme, bao gồm enzyme nội và ngoại bào. - Enzyme ngoại bào: protease, amylase, pectinase,.. - Enzyme nội bào: asparaginase, penicilinase,.. Tế bào vi sinh vật có khoảng trên 1000 enzyme khác nhau, phần lớn các enzyme ở trong tế bào khi cần thiết mới tiết enzyme ra ngoài tế bào để phân huỷ những chất tương ứng (như amylase thủy phân tinh bột, pectinase thuỷ phân pectin…). Do đó vi sinh vật có thể sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau cho sự sinh sản và sinh trưởng của nó. Các sản phẩm của sự chuyển hóa chất

tế bào vi sinh vật Tiền sản phẩm Sản phẩm

Các tế bào vi sinh vật thông qua hệ enzyme của mình đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất. Về mặt lý thuyết những phản ứng này có thể xảy ra nhờ những xúc tác hóa học nào đó. Tuy nhiên các quá trình này đôi khi không thực hiện được ở

28

điều kiện bình thường, mà chỉ thực hiện ở điều kiện đặc biệt (nhiệt độ, áp suất, độ ẩm) thích hợp cho quá trình chuyển hóa, trong trường hợp này người ta chuyển sang sản xuất bằng công nghệ vi sinh vật. Ví dụ: từ ethanol chuyển đến acetic acid phải dùng chủng Acetobacter.

Hình 2.2. Các sản phẩm của quá trình lên men

29

Filename: CHƯƠNG 2i.doc Directory: C:\Documents and Settings\welcome\Desktop\New

Folder Template: C:\Documents and Settings\welcome\Application

Data\Microsoft\Templates\Normal.dot Title: CHƯƠNG 2 Subject: Author: User Keywords: Comments: Creation Date: 9/5/2010 5:36:00 PM Change Number: 14 Last Saved On: 9/9/2011 8:42:00 AM Last Saved By: User Total Editing Time: 76 Minutes Last Printed On: 9/9/2011 8:42:00 AM As of Last Complete Printing Number of Pages: 21 Number of Words: 10,030 (approx.) Number of Characters: 36,412 (approx.)