PHẦN I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đại cương về hệ enzyme chitinase

1.1.1 Khái quát về enzyme

1.1.1.1 Định nghĩa [1, 23]

Enzyme là một loại phân tử protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia xúc tác cho các

phản ứng sinh học.

Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, được cấu tạo từ các L-acid amin

liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt

động của enzyme.

Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme một cấu tử gồm những enzyme có thành phần hóa học

duy nhất là protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm những enzyme có hai thành phần: phần

protein thuần gọi là apoenzyme có vai trò xúc tác, phần thứ hai phi protein là coenzyme là

những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác. Ngoài ra có một số kim loại

như Zn, Cu, Mn, Fe ... đóng vai trò liên kết enzyme và cơ chất trong quá trình xúc tác phản

ứng, liên kết giữa apoenzyme và coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện

tử.

1.1.1.2 Cơ chế hoạt động [16, 23]

Trung tâm hoạt động của enzyme (E) có cấu trúc không gian tương ứng với cơ chất mà chúng

xúc tác, phản ứng hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất như “chìa khóa-ổ

khóa“ tạo phức hợp enzyme-cơ chất. Quá trình tác động của enzyme vào cơ chất để tạo sản

phẩm trải qua ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với cơ chất (S) nhờ những liên kết tạo phức E-S

Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzyme (E), cơ chất sẽ bị thay đổi cấu hình không

gian và mức độ bền vững các liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm.

Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, được giải phóng nguyên vẹn. Sản phẩm (P) tạo thành.

Sơ đồ cơ chế tác động enzyme:

E + S ← → E-S → E + P

1.1.2 Enzyme chitinase

1.1.2.1 Định nghĩa

Chitinase hay poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid,

glucanohydrolase, thuộc nhóm enzyme thủy phân (Hydrolase), là

enzyme thủy phân chitin thành chitobiose qua việc xúc tác sự thủy

giải liên kết 1,4- β-glucosid giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-

acetylglucosamine liên kết nhau trong chitin.

1.1.2.2 Phân loại

a. Dựa vào phản ứng phân cắt [67]

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-chitobiosidse, N-acetyl- β-D-

glucosaminidase (exochitinase).

- Endochitinase: (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu

nhiên tạo các đoạn oligosaccharide. Các enzyme này đã được nghiên cứu từ dịch chiết môi

trường nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (e loại endochitinase: M1= 36kDa, pI1= 5,3

± 0,2 và M2= 40kDa, pI2=3,9), Gliocladium viens (M=41kDa, pI=7,8).

- Chitin-1,4-chitobiosidse: là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các

dimer chitobiose.

- N-acetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase): là enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ một đầu

cho snr phẩm chính là các monomer N-acetyl- β-D-glucosamin.

Hình: sơ đồ phân cắt chitin bởi các enzyme thuộc nhóm chitinase

b. Dựa vào cấu trúc phân tử [67]

Enzyme chitinase được sắp xếp vào 2 họ Glycohydrolase:

- Họ Glycohydrolase 18: là họ chitinase lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định

gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và

virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như

chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl- β-D-glucosaminidase. Các chitinase này hoạt động

thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β- polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm

β-anomer.

Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ Aeromonas hydrophila, Bacillus

circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcscens …

- Họ Glycohydrolase 19: họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật như cà

chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)…, ngoài

ra còn ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophillus influenzae …Chúng có cấu

trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển.

c. Dựa vào trình tự amoni acid [75]

Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của

enzyme, điểm đẳng điện, peptid nhận biết và vùng

cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5

nhóm:

- Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử

có đàu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua

một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl (C)

(peptid nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan

trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin

nhưng không cần cho hoạt động xúc tác.

- Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử

chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và

peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương

tự chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực

vật, nấm và vi khuẩn; chúng được cảm ứng bởi các

tác nhân bên ngoài.

- Nhóm III: Trình tự amino acid hoàn toàn khác với

chitinase nhóm I và II.

- Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở

lá cây hai lá mầm, 41 – 47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như

chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng

kể so với chitinase nhóm

- Nhóm V: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận tháy vùng gắn chitin (vùng giàu

cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao.

1.1.2.3 Cấu trúc của hệ enzyme chitinase

a. Cấu trúc enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18

Cấu trúc không gian (cấu trúc bậc 3) của một số enzyme chitinase huộc họ Glycohydrolase 18

đã được nghiên cứu, cụ thể là chitinase vi khuẩn (Serratia marcascens) và chitinase thực vật.

Tâm hoạt động của các enzyme này tạo thành từ 8 sợi xoắn α/β cuộn tròn. Sợi số 8 của phiến

cuộn vào bên trong cấu trúc hình nhộng với vòng xoắn thể hiện như một chiếc nhẫn hướng ra

ngoài (hình vẽ [92])

Hình 3: Mô hình cấu trúc không gian của enzyme chitinase Serratia marcescens

b. Cấu trúc enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19

Chitinase tách chiết từ lúa mạch (Hodeum vulgare) đã được tinh thể hóa và phân tích cấu trúc

bằng tia X. Đầu tiên người ta tiến hành quan sát ỏ độ phân giải 2,8 A0 và sau đó quan sát ở độ

phân giải 1,8 A0(hình vẽ). [93]

Hình 4: Mô hình cấu trúc không gian của chitinase Hodeum

1.1.2.4 Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase [11]

a. Trọng lượng phân tử

Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng

30kDa (kilodalton). Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú),

một số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa hoặc cao hơn cả là khoảng

120kDa. Trọng lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng

biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa.

b. Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis

Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3- 10 ở thực vật bậc cao và

tảo; pI từ 4,7-9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5 – 8,8 ở vi sinh vật. Hằng số

Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml).

c. Ảnh hưởng của nhiệt độ [32, 63]

Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20 – 500C (Frandberg

và Schnure, 1994; Huang và cộng sự, 1996; Bhushan và Hoondal, 1998; Wiwat và cộng sự,

1999; Bendt và cộng sự, 2001).

Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 400C,

ngoại trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối

thích là 50OC (Jeuniaux, 1963). Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các enzyme

chitinase có thể có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Các enzyme chitinase thực vật

thuộc nhóm III và chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả

năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 800C. Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân

chitin mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp. Từ 30-450C và chitinase chịu nhiệt từ chủng

Bacillus sp. BG-11 hoạt tính cao nhất ở 40-600C.

Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum

Rifai nhận thấy enzyme này có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25-600C,

nhiệt độ tối ưu là 400C.

d. Ảnh hưởng của pH [32]

Giá trị pH tối thích (pHop) của hệ enzyme chitinase từ 4-9 đối với các enzyme chitinase

ở thực vật bậc cao và tảo; hệ enzyme chitinase ở động vật là 4,8- 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5-

8,0.

Theo các nhà khoa học, pHop của enzyme chitinase có thể có sự phụ thuộc vào cơ chất

được sử dụng. Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu có pHop khoảng 5,0 khi cơ

chất là glycol chitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu.

Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được trong khoảng pH từ 4,0-8,5

(Morrisey và cộng sự, 1976; Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt và cộng sự, 2001). Chitinase của

nấm hoạt tính cao nhất ở pH = 5, trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8,0. Theo Bhushan và

Hoondal (1998), hoạt tính của chitinase từ Bacillus sp. BG-11 cao nhất ở pH = 8,5.

e. Chất tăng hoạt – chất ức chế

* Allosamidin: allosamidin là chất ức chế được nghiên cứu, đặc biệt là với chitinase côn

trùng. Allosamidin ức chế cạnh tranh với enzyme chitinase, giá trị KI khoảng 0,1μm. Chất

này có cấu tạo tương tự dạng trung gian của cơ chất: một vòng oxazoline; vòng này có thể ở

giữa carbonyl oxygen của nhóm N – acetyl và C1 của N-acetyl-D-glucosamin trong quá trình

thủy giải. [67]

Hình 5: Cấu trúc hóa học của allosamidin và dẫn xuất allosamidin [94]

Allosamidin: R1=R2=CH3

Demethylallosamdin: R1=CH3,R2=H

Didemethylallosamidin: R1=R2=H

* Các ion kim loại: Các ion kim loại: Hg2+, Ag+ là những chất ức chế, còn ion Cu+ thì

tùy theo dạng enzyme chitinase: dạng chitinase bị ức chế hoặc tăng cường hoạt tính (tìm thấy

ở mọt số loài cá và vi sinh vật). Bên cạnh đó albumin cũng có vai trò làm tăng hoạt đông của

enzyme chitinase, nhưng sự ảnh hưởng nỳ chỉ rõ ràng sau 2 – 3 giờ đầu của phản ứng.

f. Ổn định hoạt tính [65]

Enzyme chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh khoảng 2 năm.

Chúng bị mất hoạt tính nhanh chóng ở 370C trong trường hợp không có mặt cơ chất. Chu kỳ

bán hủy ở 370C là 40 ngày và ở 50C là 230 ngày.

Sự ổn định của enzyme chitinase sẽ cao hơn khi có mặt của cơ chất là chitin.

Enzyme chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 200C là K = 0,145/h.

1.1.2.5 Các loại cơ chất của enzyme chitinase

a. Chitin [67]

Cơ chất chủ yếu của enzyme chitinase là chitin. Chitin được tìm thấy trong thành tế bào

của nấm sợi và là chất hữu cơ chiếm khối lượng lớn hình thành nên lớp vỏ ngoài của động vật

không xương khớp (côn trùng, giáp xác, thân mềm).

Chitin là một polymer mạch thẳng có cấu tạo dạng chuỗi, thành phần chủ yếu là các

monomer N- acetyl – D – glucosmin nối với nhau bằng liên kết 1,4 – β – glucosid. Mỗi đoạn

chitin được xác định có độ dài là 10,4 A0. Về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tương tự như

cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon

của chitin được thay bằng nhóm hydroxyl (-OH) ở cellulose [1,76]. Ngoài ra, chitin cũng có

cấu trúc liên hệ với murein – cấu trúc polymer hiện diện ở vách tế bào v khuẩn.

Ở lớp vỏ côn trùng và giáp xác chitin được gắn kết với các polysaccharid khác (cellulose,

mannan, glucan...) hàm lượng chiếm tối đa khoảng 3-5% sinh khối nấm tươi. (hình vẽ)

Hình 5 : cấu trúc hóa học của chitin [95]

Về mặt cấu trúc lập thể, chitin có 3 dạng : α, β, δ ; Sự khác nhau này biểu hiện ở sự sắp

xếp các chuỗi. Ở α- chitin các chuỗi xuôi và ngược xen kẽ nhau, ở β- chitin thì cùng hướng và

ở δ- chitin có 2 chuỗi xuôi xen kẽ với 2 chuỗi ngược. Dạng chiếm nhiều nhất là α- chitin. [64]

Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong lớp vỏ của một

số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong giới

thực vật, chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae.

Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đó là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối

với nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống sợi. Trong tự nhiên, chitin hiếm khi

tồn tại ở trạng thái tự do mà gần như luôn luôn liên kết dưới dạng phức hợp chitin- protein.

Điều này dẫn đến sự đề kháng với các hóa chất và các enzyme thủy phân, gây nhiều khó khăn

cho việc chiết tách, tinh chế chúng. Tùy thuộc vào các đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai

đoạn sinh lý mà trong cùng một loài có thể thấy sự thay đổi về lượng và chất của chitin.

Tính chất của chitin [27, 31]

Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch.

Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm loãng, trong cồn và trong các dung

môi thông thường. Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…).

b. Các dẫn xuất của chitin [64, 65]

Enzyme chitinase có thể tác động lên một số dẫn xuất của chitin như glycol – chitin,

carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4- methylumbellferyl – tri – N – acetyl

chititrioside (MUC – phát huỳnh quang).

Enzyme chitinase không tác động trên các cơ chất : chitin nitrat, cellulose, hyaluronic

acid, alginic acid hoặc mucin.

1.1.2.6 Cơ chế cảm ứng của hệ enzyme chitinase [57] tl tham khảo

Hiện nay, cơ chế cảm ứng của hệ chitinase của Trichoderma là chủ đề rất được nhiều

nhà khoa học quan tâm. Sự cảm ứng enzyme ngoại bào rất hiệu quả khi nuôi cấy Trichoderma

trong môi trường có nguồn cacbon duy nhất là chitin tinh sạch, vách tế bào nấm hoặc hệ sợi

nấm. Không có hoặc rất ít có hiện tượng cảm ứng khi thành phần môi trường có chứa

chitosan, cellulose, chitin chưa tinh sạch hoặc laminarin.

Các enzyme khác nhau thì có cơ chế cảm ứng khác nhau. Ví dụ : N-acetyl-glucosamine

chỉ cảm ứng đặc trưng cho việc tạo ra β-N- acetyl-glucosamine chỉ cảm ứng đặc trưng cho

việc tạo ra β-N- acetyl-hexosaminedase ( N-acetylglucosaminidase) mà không cảm ứng tạo ra

endochitinase ở Trichoderma.

Trong quá trình ký sinh của Trichoderma trên những ký chủ khác nhau thì mức độ cảm

ứng và thành phần các sản phẩm enzyme tạo thành khác nhau, chủ yếu là 1,4- β – N –

acetylglucosaminiase 102 kDa và 72 kDa (CHIT102, CHIT72) và một vài enzyme

endochitinase của nhóm II. Hơn nữa vách tế bào nấm thu nhận từ những loại nấm đảm

Basidiomycetes khác nhau, được sử dụng để cảm ứng endochitinase từ các chủng

Trichoderma cũng khác nhau.

Sự hình thành hệ enzyme chitinase in vitri bị ức chế bởi tỷ lệ gia tăng của lượng đường

glucose, sucrose và snr phẩm cuối, điều này cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp enzyme

được điều chỉnh một cách đặc hiệu bởi sự ức chế dị hóa. Điều này đã được nghiên cứu rõ hơn

ở endochitinase 42kDa (CHIT42) và gen mã hóa ThEn-42 của T. Harzianum. Nhiều tác giả

cho rằng, glucose ức chế sự hình thành CHIT42 cũng như ở cấp độ mRNA. Sự hình thành

CHIT72, CHIT42 và CHIT33 được điều hòa ở cấp độ phiên mã.

Inbar và Chet đã chứng minh sự tạo thành enzyme chitinase của chủng T. Harzianum ký

sinh được bắt nguồn bởi việc tiết ra chất trung gian tương tác với ký chủ là lectin. Hiện tượng

này xảy ra khi có sụ cảm ứng của chitooligomer. Lectin là hệ thống nhận biết ký chủ của vi

nấm ký sinh và rất có giá trị trong nghiên cứu pha sớm của quá trình ký sinh nấm. Sự thật là

trong điều kiện in vitro hệ sợi nấm đã hấp khử trùng có tác dụng cảm ứng CHIT33 và

CHIT42 mạnh hơn tác nhân cảm ứng là chitin tinh sạch. Do đó, khi có sự tồn tại của ký chủ

nhưng không có chitin cũng đủ để vượt qua được sự ức chế của glucose đối với CHIT42. [58]

Sự cảm ứng cũng bị hạn chế bởi ánh sáng, quá trình tạo bào tử hay sự tiếp xúc vật lý

giữa tế bào và cơ chất. Cũng có ý kiến cho rằng, hiện tượng bị ‘bỏ đói’ cũng là tác nhân cảm

ứng mạnh mẽ khả năng sinh tổng hợp CHIT42. Sự hoạt động của hệ enzyme chitinase bị ảnh

hưởng bởi các hoạt động của những hợp chất cảm ứng khác nhau như các enzyme phá hủy

vách khác (protease và glucanase), các liên kết protein trong vách tế bào chất, permease và

chất kháng sinh.

1.1.2.7 Cơ chế tác dụng của hệ enzyme chitinase (TLTK)

Enzyme chitinase xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4- β-glucosid trong chitin.

Nó phân cắt dọc theo mạch carbon của chitin và sản phẩm tạo thành chủ yếu là chitobiose và

chiotriose. Những chất này sau đó tiếp tục bị phân cắt thành các monomer là các N-acetyl D-

glucosamine. [65]

Quá trình phân giải chitin được tóm tắt như sau :

Chitin → Citobiose, chitotriose → N-acetyl D-glucosamine

Sự thủy phân chitin có thể xảy ra theo 2 cơ chế : cơ chế giữ lại các cấu tử β-anomer

trong sản phẩm và cơ chế nghịch chuyển từ dạng β sang dạng α (hình 29)

Vị trí kết nối giữa cơ chất chitin và enzyme chitin được giả định bao gồm tối thiểu 6

tiểu phần đường được ký hiệu từ A đến F (bắt đầu từ đầu không khử). Tại vị trí này,

hexasaccharid sẽ được phân cắt thành hai trisaccharid (hình 2.10) [86]

1.1.2.8. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase [30, 57, 58]- LASH

Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polyme sinh học được

tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới chỉ

đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm/1m2 bề mặt trái đất. Trong

tự nhiên chitin hiện diện ở hầu hết các giới vi sinh vật. Đến nay đã có nhiều nghiên cứu về

enzyme chitinase của các vi sinh vật, thực vật, động vật. [53]

a. Chitinase vi khuẩn [67]

Enzyme chitinase được tìm thấy ở các vi khuẩn : Chromobacterium, Klebsiella,

Pseudomonas, Clostridium, Vibrio và đặc biệt là ở nhóm Streptomyces.

Enzyme chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy nhiên trong

các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, người ta đều cho thêm chitin – cơ chất của enzyme

chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp enzyme chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính

enzyme chitinase sau quá trình chiết tách. Vi khuẩn tổng hợp enzyme chitinase nhằm phân

giải chitin trong môi trường tạo nguồn cacbon cho vi khuẩn sinh trưởng, phát triển.

b. Chitin nấm [67]

Chitinase cũng được tạo ra bởi các loại nấm sợi. Các chủng nấm mốc cho enzyme

chitinase cao như : Trichoderma, Gliocladium, Calvatia,...đặc biệt là ở các loài nấm lớn như

Lycoperdon, Coprinus...các nấm phân hủy chitin cũng được tìm thấy trong các thủy vực như

loài nấm Karlinggiomyces asterocystic thuộc lớp Phycomycetes.

Tương tự như ở vi khuẩn, enzyme chitinase của nấm đóng vai trò quan trọng về mặt

dinh dưỡng, nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và

trong sụ phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm.

Chitinase còn giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh nấm đối kháng lại các lòi nấm gây

bệnh thực vật.

c. Chitinase thực vật [67]

Chitinase tham gia vào cơ chế tự vệ của thực vật chống lại các loại côn trùng và nấm

ký sinh gây bệnh [54]. Người ta đã quan sát thấy chitinase tách chiết từ cây cần tây có khả

năng ức chế sợi nấm phát triển. Tuy nhiên cũng có tác giả cho rằng chitinase còn có vai trò

khác như tham gia vào quá trình hình thành phôi [41]. Các thực vật bậc cao có khả năng tạo

enzyme chitinase như : cao su (Hevea brasiliensis), thuốc lá (Nicotiana sp), lúa mạch

(Hordeum vulgare), cà rốt, hạt đậu nành ... và đặc biệt một số loài tảo biển cũng là nguồn

cung cấp enzyme chitinase [52].

d. Chitinase động vật [65]

Từ một số động vật nguyên sinh và từ các mô, tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của

nhiều loài động vật không xương : ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt (ví dụ trong

dịch ruột của ốc sên Helix aspersa), ta có thể thu nhận được enzyme chitinase. Đối với động

vật có xương sống enzyme chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá,

lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ ; trong dung dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ.

Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin

chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô.

Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau [45,51]

Bọ cánh cứng 37%

Nhện 38%

Bò cạp 30%

Sâu 20-38%

Nấm 5-20%

Tôm 33%

Cua 70%

Mực 3-20%

Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của

chitin là từ vỏ cua và tôm. Trong công nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạng phức hợp với

một số chất như: CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ … nên việc tách chiết còn khó khăn

vì phải đảm bảo cả hai yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời không làm biến

đổi tính chất của chitin.

Ngoài ra, enzyme chitinase còn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt

quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da.

Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cutincun) trong quá trình biến thái hay

lột xác.

1.2 Ứng dụng của chitinase trong nông nghiệp và y học

1.2.1 Một số ứng dụng hệ enzyme chitinase trong nông nghiệp

Các loại côn trùng và vi sinh vật (chủ yếu là nấm mốc) phần lớn đều có hại cho động

thực vật, chúng gây ra nhiều loại dịch bệnh cho cây trồng và vật nuôi, ảnh hưởng trực tiếp

đến sản xuất nông nghiệp. [85, 113]

Hầu hết các nhân tố có hoạt tính kháng nấm (fungicid) hay diệt côn trùng (insecticid)

kiểm soát dịch bệnh thông qua việc tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây bệnh, các ký

chủ trung gian hoặc các vector mang bệnh đều sử dụng một trong các kiểu tác động sau :

- Các chất độc gây ngạt thở hoặc làm chết khô.

- Các chất độc làm kết tủa hoặc bất hoạt các enzyme, làm giảm chức năng của các

bào quan trong nguyên sinh chất.

- Các chất độc gây bất hoạt các enzyme trong chuỗi hô hấp.

- Các chất độc ảnh hưởng lên các cơ quan như hệ thần kinh, hệ tuần hoàn,…

Dĩ nhiên là một loại thuốc tốt nhất sẽ gây hại cho vật chủ của các loài ký sinh mà nó

tác động. Tuy nhiên, do sự phức tạp và sự phụ thuộc qua lại lẫn nhau trong các quá trình sống

thì không lúc nào người ta đạt được mục đích trên và vì thế một số fungicid và insecticid gây

độc ở chừng mực nào đó, một số khác gây ra các hiệu ứng phụ không mong muốn,…

Vì chitin không phải là thành phần phổ biến ở thực vật và động vật có xương nên

người ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin trong các fungicif và

insecticid như nikkomycin, polyoxin D,… Khi áp dụng trên cây cảnh, cây lương thực, trên

động vật, những tác nhân trên chứng tỏ không gây hại đáng kể cho thực vật hoặc động vật có

xương.

1.2.1 Cơ sở khoa học của ứng dụng enzyme chitinase trong phòng trừ nấm gây bệnh

thực vật

Thành tế bào của vi nấm dày khoảng 0.2 µm, có tính phản quang rất mạnh nên có thể

phân biệt được rõ ràng ở kính hiển vi quang học. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh

cấu tạo thành tế bào vi nấm có cấu trúc bản mỏng, vừa có cấu trúc sợi [15]

Cấu tạo chính của thành tế bào ở các nhóm nấm chủ yếu : [15]

Nhóm phân loại Cấu tạo chính của thành tế bàoNấm nhầy myxomyces

Plasmodiphore

Cellulose

ChitinNấm noãn oomycetes Cellulose – GlucanNấm cổ Hyphytridiomycetes

Chytridiomycetes

Cellulose – Chitin

Chitin – GlucanNấm tiếp hợp Zygomycetes Chitin – chitosanNấm nang Ascomycetes

Nấm đảm Basidiomycetes

Nấm bất toàn Deuteromycetes

Chitin – Glucan

Theo Hirohi Ihui [80], enzyme chitinase luôn có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù

trong cây không chứa chitin. Chitinase và β – 1,3 – glucanase được tạo ra trong mô thực vật

khi tế bào bị kích thích bởi nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm

và ngăn cản sự phát triển của bệnh. [59]

Sự kích thích hoạt tính enzyme chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối với tác động

của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải amoniac, phenylalanin

làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực vật...

Bên cạnh đó các nhà khoa học cũng đã chứng minh quá trình chống lại các mầm bệnh

thực vật có liên quan đến việc sản xuất ra enzyme chitinase. Thật vậy, vi khuẩn có khả năng

chống lại nấm bệnh bằng cách sản xuất ra chitinase [48]. Chitinase của Streptomyces có khả

năng ức chế sự phát triển của nấm bệnh. [112]

Chủng Serratia marcescen hoang dại có khả năng kiểm soát sinh học đối với các mầm

bệnh thực vật. Ở chủng Serratia marcescens đột biến có mang gen ChiA (gen mã hóa enzyme

chitinase), khi gen bị bất hoạt thì chủng này mất hiệu lực kiểm soát sinh học. Khi tái tổ hợp

gen ChiA từ Serratia marcescens vào E.coli, E.coli có khả năng làm giảm các bệnh gây ra

bởi Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia solani [87].[8]

Trong chu kỳ sống của ký sinh với nấm bệnh, Trichoderma có tiết ra enzyme chitin

phân hủy chitin, bao gồm phức hợp với 6 enzyme khác biệt nhau : hai enzyme β-1,4-N-acetyl

glucosaminidase có trọng lượng phân tử lần lượt là 102, 73, kDa và bốn enzyme

endochitinase có trọng lượng phân tử lần lượt là 52, 42, 33 và 31 kDa. Trong đó.

Endochitinase (42 kDa) có khả năng thủy phân vách tế bào botrytis cinerea in vitro. Quá trình

kháng nấm bệnh muốn đạt được hiệu quả cao nhất cần có sự phối hợp hoạt động bổ sung cho

nhau của 6 enzyme này,…[76]

1.2.2 Phối hợp chitinase và chủng vi khuẩn Enterobacter cloecae kháng nấm

Đây là sự kết hợp giữa enzyme phân hủy thành tế bào nấm mốc với vi khuẩn kháng

nấm Enterobacter cloecae ( vi khuẩn thường thấy trên bề mặt hạt và các vùng rễ của thực

vật ). Sự kết hợp này nhằm mục đích kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của cá loài nấm

mốc thông qua sự tác động kép : chitinase phân giải thành tế bào của nấm mốc, tạo môi

trường dinh dưỡng cho Enterobacter cloecae tăng sinh trưởng trong tự nhiên, đồng thời tăng

khả năng kiểm soát sinh học thông qua tăng khả năng gắn vào thành phần khuẩn ty của nấm

mốc.

Sự tương tác giữa chitinase và Enterobacter cloecae trong hỗn hợp gia tăng khả năng

kháng nấm mốc gây bệnh nhờ chủng vi khuẩn có thể bám vào thành tế bào, thậm chí khi có

sự hiện diện D-glucose, saccharose, do đó có thể trải rộng phạm vi sử dụng trên các hạt giống

và thực vật có sự tiết rỉ các loại đường này.

Hiện nay, người ta sử dụng hỗn hợp này để bảo vệ hạt giống, lá, rễ hoặc quả, vùng đất

xung quanh hạt… Hỗn hợp này có thể dùng để kháng các loài nấm mốc gây bệnh thực vật

như Fusarium, Gliocladium, Trichoderma, Saccharomyces,…

1.2.3 Chế phẩm biocid – sự tác động cộng hưởng của hệ enzyme chitinase, các enzyme

khác và các tác nhân kháng nấm

Các nhà khoa học đã nghiên cứu sự thủy phân vách tế bào vi nấm bởi các enzyme

chitinase, glucanase, cellulase,…[107] và đã thử nghiệm trên đồng ruộng tác dụng của các

chế phẩm biocid. Khi sử dụng riêng biệt chế phẩm chitinase, nhận thấy hiệu quả tiêu diệt thấp

trên nấm mốc, giun tròn, chí có khả năng kìm hãm. Chế phẩm thủy phân bởi các enzyme

protease phối trộn với một số tác nhân khác có hiệu quả tiêu diệt nấm mốc, giun tròn, và côn

trùng cao. [111]

Khi phối trộn 2 chế phẩm này theo tỷ lệ 1 :1 thì thu được hiệu quả cao hơn khi sử dụng

riêng lẻ. Đây có thể là do sự cộng hưởng hoạt tính của hệ sinh hóa phức tạp đa nhân tố.

Ngoài ra, người ta còn tìm cách tăng cường hoạt tính kháng nấm thông qua tác động

cộng hưởng giữa hỗn hợp chế phẩm trên với các tác nhân kháng nấm : captan, manzate,

chloroneb, … [111]

1.2.4 Bổ sung chitin vào đất nhằm tạo điều kiện sinh trưởng tốt cho các chủng vi sinh

vật trong đất tổng hợp chitinase kháng nấm

Toyoda đã đề nghị cung cấp vào đất một lượng thích hợp chitin nhằm kích thích sự

phát triển của các chủng vi khuẩn sản sinh chitinase (những vi sinh vật này chiếm ưu thế ở

vùng rễ).

Xạ khuẩn Streptomyces anulatus được cố định trong một giọt gel alginat Ca và đưa

vào đất, chủng xạ khuẩn này phát triển mạnh trong đất có chứa chitin và ức chế một cách

mạnh mẽ sự phát triển của những mầm bệnh từ nấm (ví dụ kiểm soát bệnh héo của cây cà

chua gây ra bởi nấm Fusarium oxysporum).

1.2.5 Tuyển chọn loài nấm đối kháng côn trùng gây hại cây trồng [10, 53,87]

Trong công tác bảo vệ thực vật, người ta đã đạt được nhiều kết quả tốt trong việc dùng

một số loài nấm phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng. Cụ thể như nấm Metarhizium anisopliae

dùng phòng trừ sâu xám, sâu đục thân ngô, sâu đục nõn dừa. nấm Beauveria bassiana trừ

trên 80 loại sâu hại khác nhau, trong đó có sâu đục thân ngô, bọ xít, bọ hung,..

Phần lớn các loài nấm xâm nhập vào cơ thể sâu bằng sợi nấm xuyên qua lớp vỏ

cutincun (phức hệ protein – chitin) vào trong. Các vòi nấm tiết ra enzyme chitinase phân giải

chitin tạo thành một lỗ để xâm nhập vào trong… Các nhà khoa học đã chứng minh mối liên

hệ giữa khả năng tiêu diệt sây bệnh của vi nấm đối kháng và sự tổng hợp enzyme chitinase ở

các loài vi nấm này.

Hiện nay, các nhà khoa học đã chủ động tuyển chọn các giống vi nấm đối kháng sâu

bệnh hại cây trồng dựa trên chỉ tiêu hoạt tính chitinase, sử dụng môi trường cảm ứng để kích

thích biểu hiện hoạt tính enzyme chitinase và nhân sinh khối loài vi nấm này, đồng thời thu

nhận các gel mã hóa chitinase, chuyển sang những loài vi nấm khác không có gel này để làm

tăng khả năng tiêu diệt sâu bệnh của chúng.

1.2.2 Một số ứng dụng trong Y học

1.2.2.1 Tổng hợp chitooligosaccharid

Hiện nay hoạt tính sinh học của các chitooligosaccharis ngày càng được nghiên cứu

sâu. Trong y học người ta sử dụng các oligomer chitohexaose và chitoheptaose làm tác nhân

kháng ung thư. Enzyme chitinase của Vibrio alginolyticus phân cắt huyền phù chitin thành

chitopentaose và chitotriose. Enzyme N,N’ – diacetylchtobiase được sử dụng rộng rãi làm

nguyên lieuj khởi đầu cho sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học. Chitinase thu

nhận từ S. Griseus có khả năng thủy phân chitin huyền phù thành chitobiose tiếp tục được cải

biến hóa học thành một dẫn xuất disaccharid mới 2- acetamido- 2- deoxy- D- allopyranose,

đây là chất trung gian để tổng hợp nên chất ức chế enzyme. Ngược lại, Kobayashi và cộng sự

cho biết có thể sử dụng chitinase của Bacillus để tổng hợp chitobiose nhờ sự kết nối N-

acetyl- D- glucosamin với dẫn xuất đường oxazolin. [34]

1.2.2.2 Chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do vi nấm bằng enzyme chitinase [76]

Nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh nấm được đề xuất như ELISA, sự ngưng kết

kháng thể, mẫu dò phân tử ..., để phát hiện đặc hiệu các nấm gây bệnh trong các dịch cơ thể

nhưng giá thành quá cao. Những bất lợi chung trong hầu hết các phương hiện sử dụng là khó

áp dụng đối với các mẫu dịch cơ thể bởi vì khó cố định được các mẫu này. Các phương pháp

nhuộm như GMC (Grocott methenamine AgNO3 staining), calcofluor/cellufour, India Ink,

lectin label, rylus BSU được dùng nhuộm cố định các tiêu bản nấm nhưng không có tính đặc

hiệu cao và cần sử dụng các thiết bị đắt tiền.

Chitin hiện diện nhiều trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là một giai đoạn

trong chu trình sống của nấm hay ở nấm men thì hiện diện trong những vết chồi. Do đó cần

một phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một phương pháp chẩn

đoán nhanh chóng, hiệu quả các loài nấm gây bệnh.

Hiện nay, các nhà khoa học đã đề xuất một phương pháp chản đoán mới các bệnh

truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng enzyme chitinase đã được phân lập tạo dòng từ

Vibrio parahemolyticus (đặt tên là chitinase VP1), nó kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể sử

dụng như một mâu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao, để nhận diện một cách đặc hiệu

các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh.

1.2.2.3 Chế phẩm thuốc mới : enzyme chitinase và các dược chất kháng nấm [5, 52]

Hiện nay, các nhà khoa học đề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân kháng nấm có

thể chấp nhận khác nhằm bổ trợ cho hoạt động nội sinh của chitinase.

Các tác nhân đó bao gồm :

- Amphotericin B và những phức chất có cấu trúc tương tự nystatin và Pyramycin.

- 5-fluorocytosin và các dẫn xuất azol như fluconazol, ketoconazol, itraconazol,

miconazol...

- Allylamines – thiocarbamates như olnaftat, terbinafin...

- Griseofulvin ; acid undecylenic ; bezoic...

Enzyme chitinase có thể phát huy hiệu quả các tác nhân kháng nấm ở liều lượng không

gây tác dụng phụ cho bệnh nhân. Ngoài ra việc kết hợp giữa enzyme chitinase và

laminarinase được ghi nhận là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm (so với

chỉ dùng enzyme chitinase).

Các nhà khoa học đã thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của enzyme chitinase tái tổ hợp

trong cơ thể chuột và thỏ bị nhiễm các loại nấm khác nhau thuộc nhóm Aspergillus,

Candida...Hiệu quả của sự điều trị với tác nhân kháng nấm được ước lượng trên 3 điểm :

- Giảm tỷ lệ chết.

- Giảm số lượng tế bào nấm được nuôi cấy từ các cơ quan.

- Giảm mức độ lưu thông kháng nguyên nấm.

1.3 Đặc điểm sinh học của Trichoderma

1.3.1 Phân loại và đặc điểm hình thái của Trichoderma

1.3.1.1 Phân loại

Trichoderma là một trong những vi nấm gây nhiều khó khăn cho công tác phân loại do

còn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ.

Persoon ex Gray (1801) phân loại Trichoderma như sau:

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Euascomycetes

Bộ: Hypocreales

Họ: Hypocreaceae

Giống: Trichoderma

Ainsworth và Sussman lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromyctes, bộ

Moniliales, họ Moniliaceae.

Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva (1998), Trichoderma thuộc

họ Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; các loài Trichoderma được phân thành 5 nhóm:

Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum. Trong đó, 3

nhóm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum có giai đoạn telemorph (hình thái ở giai

đoạn sinh sản hữu tính ) là Hypocrea; nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp dưới dạng

teleomorph độc lập; nhóm Saturnisporum không tìm thấy hình thức teleomorph.

1.3.1.2 Đặc điểm hình thái của Trichoderma

Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn ty.[12]

Khuẩn ty của nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh phát triển

thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách, không màu, liên kết nhau thành

chum nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy. Bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn. Khuẩn lạc

nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục vàng, xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng của

Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh ( có hình) chúng có thể đạt được đường kính khuẩn

lạc từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 200C.

1.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Môi trường sống

Trichoderma spp là nhóm vi nấm phổ biến ở đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng, đầm

muối và đất sa mạc. Hầu hết chúng là những vi sinh vật hoại sinh, nhưng chúng cũng có khả

năng tấn công các loại nấm khác. Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và không

sống nội kí sinh với thực vật. Chúng có thể tồn tại trong tất cả các vùng khí hậu từ miền cực

Bắc đến những vùng núi cao cũng như miền nhiệt đới. Tuy nhiên, có một số tương quan giữa

sự phân bố các loài và các điều kiện môi trường.

T.polysporum và T.viride có mặt ở vùng khí hậu lạnh, trong khi T.harzianum có ở các

vùng khí hậu nóng. Điều này tương quan với nhu cầu cần nhiệt độ tối đa cho từng loài.

Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid, và Gochenaur (1970) cho rằng có

tương quan giữa sự hiện diện của T.viride với đất acid trong vùng khí hậu rất lạnh ở Peru,

Trichoderma phát triển ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và có thể phát triển tốt ở đất kiềm nếu như

ở đó có sự tập trung một lượng CO2 và bicarbonat.

Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ Carbonhydrat, amino

acid đến ammonia.

Trichoderma là vi nấm ưa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt,

những khu rừng khác nhau. T. hamatum và T. pseudokoningii có thể chịu điều kiện độ ẩm cao

hơn so với những loài khác. Tuy nhiên, Trichoderma spp thường không chịu được độ ẩm thấp

và điều này được cho là một yếu tố góp phần làm cho số lượng Trichoderma giảm rõ rệt trong

những nơi có độ ẩm thấp, song các loài Trichoderma spp khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và

độ ẩm cũng khác nhau.

Trichoderma spp có thể được phát hiện trong đất bởi mùi hương của chúng, hương

dừa (6-pentyl-α-pyrone dễ bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của

Trichoderma.

Với phương pháp pha loãng người ta ước tính Trichoderma có thể đạt đến 3% tổng số

vi nấm hiện diện trong các loại đất rừng và 1,5% số lượng trong đất trồng cỏ.

Turner và cộng sự (1997) chỉ ra rằng T.longibrachiatum và T.citrinoviride có nhiều sự

trùng nhau về khu vực phân bố địa lí. Sự phân bố rộng khắp này lẽ do sự phát tán hiệu quả

( nhờ gió hoặc côn trùng) hoặc biểu hiện một quá trình tiến hóa rất sớm.

Chất chuyển hóa thứ cấp và kháng sinh

Trichoderma spp sản xuất nhiều loại kháng sinh. Ngày nay, danh sách của các chất

trên được kéo dài thêm ra, bao gồm đa dạng các chất có hoạt tính: glioviridin ( một

diketopiperazin), sesquiterpenoids, trichothecenes ( trichodermin), cyclic peptides, isocyanid

– bao gồm các chất chuyển hóa (trichoiridin). Bên cạnh khả năng ức chế vi sinh vật khác,

chắc chắn những chất chuyển hóa này liên quan đến sự tăng trưởng yếu kém của thực vật bậc

cao hơn và cũng là nguyên nhân gây ra bệnh còi ở cừu thông qua hoạt động ức chế vi sinh vật

phân giải cellulose trong dạ cỏ của chúng. Các chủng Trichoderma cũng sinh ra nhiều loại

hợp chất ức chế dẽ bay hơi có thể trợ giúp cho sự hình thành khuẩn lạc cả chúng trong đất.

Trichoderma và Gliocladium sản xuất đa dạng chất chuyển hóa thứ cấp. Những chất

này bao gồm sắc tố anthroqinon (pachybasin-[1,8-dihydroxy-3-methyl-,10-anthraquinon];

emodin- [1,6,8-trihydroxy-3-methyl-9,10-anthroquinon]), chức năng của chúng vẫn chưa

được biết, một số chất khác như benzoquinon (thermophyllin), cardinan (avocettin);

dihydrocoumarins, polyacetyl mạch nhánh (trichodermen) và dẫn xuất các acid béo (methyl-

2,4,6-triene-1-1 carboxylat). Những chất này cũng chưa được biết rõ về hiệu quả của chúng

trong sự hình thành khuẩn lạc.

1.3.2.1 Dinh dưỡng và con đường trao đổi chất cơ bản của Trichoderma

a. Nguồn Cacbon [56]

Trichoderma nổi bật về khả năng tiết ra enzyme phân hủy nhiều loại polysaccharide

( như cellulose, hemicellulose) và những polymer liên quan như chitin. Những enzyme này

được công nhận có giá trị thương mại.

Manczinger và Pollner (1985) [74] đã sử dụng nguồn cacbon là phương thức để phân

loại các giống Trichoderma thành từng nhóm. Theo phân tích, những nguồn cacbon sau được

sử dụng bởi tất cả những chủng đã nghiên cứu: D-glucose, D-galactose, D-fructose, D-

mannose, D-cellobiose, trehalose, D-xylose, L-arabinose, d-mannitol, D-arabitol, glycerol,

salacin, esculin, arbutin, glycerol-1-monoacetat, β-methyl-D-glucosid và N-acetyl- β-D-

glucosamin. Nói chung nguồn cacbon tốt nhất là glucose, fructose, mannose, galactose,

xylose, rehalose và cellobiose.

Ngược lại Trichoderma spp thường không có khả năng sử dụng α-methyl-D-xylosid,

α-methyl-D-mannosid, methanol, ethanol, n-propanol, ethylamine, 5-ketogluconic acid, L-

tartaric, propionic acid, butyric acid, oxalic acid, glyoxalic acid, DL-isocitric acid, adipic acid,

DL-lactic acid, manolic acid, acetoin, maltitol, dertran, uracil, cytosine, cytidin, L-lysin, L-

histidin, L-methyonin, L-cystein, α-DL-aminoadipic acid, β-alanin, ethanolamine, nhiều loại

D-amino acid, benzoic acid, ferrulic acid và anthanilic acid. Việc sử dụng một vài nguồn

cacbon (như inulin, tinh bột, xylan, pectin, lactose, sucrose, maltose, một vài polyol, sugar

acid, hàu hết các amino acid và một vài pentoses) thì tùy thuộc vào từng loài, và có thể sử

dụng cho mục đích phân loại hóa học.

b. Nguồn Nitơ [56]

Trichoderma sppcó khả năng sử dụng cả những nguồn nitơ khá phức tạp hay đơn giản

để tăng trưởng. Khi Trichoderma đang tăng trưởng trên nguồn cacbon là carbohydrate, nguồn

nitơ thường được sử dụng là ammonium hơn là nitrat. Một vài chủng như

T.reesei hay T.koningii T-1 cũng không thể sử

dụng nitrat. Đó là sự thiếu enzyme nitrate permease.

Nguồn nitơ hữu cơ như peptone thường được sử dụng trong môi trường để hạn chế sự

tăng trưởng chậm trên cơ chất polymeric như là cellulose. Tuy nhiên cần chú ý rằng peptone

được sử dụng như là cả nguồn nitơ lẫn nguồn cacbon, và được ưu tiên sử dụng khi được cung

cấp đồng thời với polysaccharide. Trong số những amino acid, nguồn nitơ hữu cơ tốt nhất cho

Trichoderma là alanin, aid aspartic và aicd glutamic. Ngoài amino acid thì T.lignorum ( =

T.viride) được báo cáo là có thể sử dụng bazơ purin, purin nucleoside và nucleotide tương

ứng như là nguồn nitơ duy nhất.

c. Nguồn dinh dưỡng khác [56]

Hầu hết các chủng phân lập hoang dại của Trichoderma không yêu cầu những nhân tố

tăng trưởng phức tạp hay vitamin. Thành phần ion kim loại của sợi nấm T.reeei đã được phân

tích bởi Gaunt và cộng sự (1984) và được sử dụng để tính toán nhu càu về ion kim loại.

Những ion kim loại như sắt thì càn thiết ch sự tăng trưởng và có thể được tìm thấy ở một

nồng độ rất thấp trong môi trường.

Một số lượng lớn những ion kim loại khác cũng rất quan trọng cho sự tăng trưởng ở

những nồng độ thấp, ngược lại nồng độ cao lại ức chế tăng trưởng. Sự thêm vào của Cd2+ và

Hg2+ ở nồng độ 1 – 10mM dẫn đến ức chế tăng trưởng T.viride và dẫn đến kiểu hình bất

thường của nấm. Tuy nhiên tương tự như loài nấm khác, Trichoderma cũng bắt các ion kim

loại trong màng tế bào của chúng, phát hiện này đã được sử dụng trong viêc loại bỏ những ion

kim loại nặng ra khỏi nước thải công nghiệp bằng hệ sợi nấm Trichoderma.

d. Oxi và CO2 [56]

Trichoderma là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, mặc dù những chủng đã phân lập đều

được thu nhận trên những môi trường sống có áp suất từng phần oxi rất thấp. Sự cung cấp oxi

và hoạt động của ti thể cũng được báo cáo là những nhân tố điều hòa sự hình thành cellulase

của T.reesei [53], và nồng độ O2 ở mức dưới cực thuận dường như là thích hợp cho sự tổng

hợp enzyme.

CO2 sản phẩm cuối cùng của sự oxi hóa cacbon, sẽ được tích lũy ở một mức độ nào đó

trong môi trường tăng trưởng rắn, phụ thuộc pH và nhiệt độ. Vì vậy, vài loài Trichoderma spp

bị ức chế bởi CO2 theo phương thức phụ thuộc vào pH, sự ức chế mạnh nhất trong môi

trường kiềm nhẹ và trung tính. Hutchinson và Cowan (1972) [61] báo cáo rằng T.harzianum

tạo ra hiệu ứng ức chế CO2 và ethanol trên sự tăng trưởng và tạo bào tử của nhiề nấm khác

(Aspetgillus niger, Pestalotia rhododendri), trên cây con của Lactuca sativa. Điều này cho

thấy môt vài chủng Trichoderma có thể chấp nhận sự tích tụ CO2 nhiều hơn một số nấm khác.

1.3.2.2 Ảnh hưởng của yếu tố bên ngoài lên sư phát triển của nấm Trichoderma [56]

a. Nước.

Jackson và CS (1991) đã khảo sát trên T.virens, T.citrinovride và T.viride và thấy

rằng mức độ phát triển của sợi nấm của tất cả các loại nấm giảm khi tăng điện thế nước vượt

qua ngưỡng -0,7 đến -14,0 Mpa. Trong khoảng này tát cả những chủng phân lập này dễ chấp

nhận điện thế thấm lọc (NaCl, glycerol) hơn là điện thế chất nền (polyethyeneglycol) [32]

Sự giảm lượng nước đã thúc đẩy sự tạo bào tử của T.harzianujm,đặc điểm này có thể

sử dụng trong môi trường nuôi cấy lỏng để tạo đính bào tử cùng với việc tăng mức độ sấy

khô rất có ích cho những mục đích điều khiển sinh học. Sự nảy mầm của đính bào tử của

Trichoderma đặc biệt nhạy cảm với việc tăng áp suất thấm lọc [32]

b. Nồng độ ion H+

Nồng độ ion H+ có ảnh hưởng lớn trên sự tăng trưởng của nấm, vì nhiều chất dinh

dưỡng (ví dụ như đường và amino acid), đều được thu nhận bằng sự đồng vận chuyển với H+.

Vì vậy nấm thường phù hợp với môi trường có pH hơi acid. Sự tăng trưởng tối ưu thường

trong khoảng pH= 4 – 6,5, và một vài chủng Trichoderma spp thích hợp với pH < 3.

c. Nhiệt độ

Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của hầu hết Trichoderma là trong khoảng 25 –

300C.

Sự tăng trưởng phụ thuộc nhiệt độ là một hiện tượng có tính thích nghi ở

Trichoderma, là loài có nguồn gốc từ vùng khí hậu ấm áp, có nhiệt độ tối ưu cao. Những loài

thuộc Trichoderma nhóm Longibrachium có nhiệt độ tối ưu cao nhất từ 38 – 440C. Bên cạnh

đó, T.polysporum và T.viride được quan sát có mật độ cao nhất ở nhiệt độ hơi lạnh 20 –

250C. Những chủng phân lập của T.viride thậm chí có thể tăng trưởng ở 50C [32].

1.3.3.3 Môi trường

Việc phân lập và định hướng được tiến hành bằng cách nuôi Trichoderma trên môi

trường nuôi cấy chọn lọc. Trong môi trường dùng những hóa chất và thuốc nhuộm như

Bengal đỏ, tím kết tinh ( crystal violet), oxgall (2-deoxycholat) và pentachloronitrobenzen

(PCNB) đều có phối hợp với nhiều thuốc diệt nấm. Môi trường phục hồi cổ điển là TSM

(Trichoderma Selective Medium) sau đó dược cải tiến để hạn chế sự phát triển của Fusarium

bằng cách phối hợp với benomyl cho những chủng kháng lại thuốc diệt nấm này. [44, 45]

1.3.3.4 Cấu trúc ở mức tế bào – phân tử

a. Vách tế bào [56]

Bề mặt tế bào của hầu hết các loại nấm bao gồm 3 lớp lưu thông: màng nhầy, vách tế

bào và màng tế bào. Cấu trúc vách tế bào của Trichoderma thuộc dạng chitin-β-glucan. Tuy

nhiên, chitin hiện diện ở hệ sợi lại không có ở bào tử của T.viride. Sự tổng hợp chitin rất cần

thiết cho sự nảy mầm của bào tử đính.

Vách tế bào của một vài chủng Trichoderma cũng đã được phát hiện là chứa galactose

và N-acetyl-β-D-galactosimin lectin. Lora và cộng sự (1994) [72] đã mô tả sự hiện diện của

một protein vách tế bào có khả năng ức chế chitinase trong S.cerevisiae.

b. Nhân [56]

Giống như ở tất cả Eukaryot các tế bào nấm mang một nhân điển hình được bao quanh

bởi một màng đôi. Nhân của nấm thường nhỏ hơn (đường kính từ 1-5μm), và chứa ít hơn 1pg

DNA. Bào tử đính thường chứa nhiều hơn một nhân. Tuy nhiên Trichoderma spp có số lượng

nhân khác nhau. Một vài chủng đơn nhân (Hammill, 1974 [83]) ngược lại vài chủng đa nhân

(như T.atroviride ATCC 36042). T.reesei hình thành nhân nhỏ sau khi xử lý colchicin do sự

phân chia nhân bất bình thường. Hàm lượng DNA trung bình của những nhân nhỏ này bằng

30% của nhân bình thường, gọi là đa bội lệch. Những nhân này có thể hữu ích cho việc vận

chuyển những lượng DNA nhỏ vào trong thể nguyên sinh [85]

c. Bào quan và màng tế bào [56]

Những nghiên cứu trên T.reesei cho thấy trong tế bào của chúng hiện diện tất cả các

bào quan của Eukaryot, tương tự với các chủng Trichoderma khác. Cấu trúc của một số bào

quan (như thể Golgi) thì khác biệt so với Eukaryot, nhưng vẫn chưa biết rõ những đặc tính về

sinh hóa có khác nhau hay không. Một vài loài Trichoderma spp chứa một lượng lưới nội chất

khá lớn và nhiều nhất là ở chủng T.seesei đột biến.

1.3.3.5 Hiện tượng ki sinh của nấm Trichoderma

Hiện tượng kí sinh của nấm Trichoderma spp bao gồm một số bước sau:

Bước 1: Tương tác đầu tiên là tơ nấm Trichoderma hướng về tơ nấm ký chủ [38] .

Hiện tượng này là đặc tính hướng hóa của Trichoderma spp, hướng về nơi có chất hóa học do

tơ nấm ký chủ tiết ra (Chet vf Elad, 1983, [42]). Khi tơ nấm Trichoderma đã đến tơ nấm ký

chủ, chúng có xu hướng tiếp xúc và cuộn xung quanh sợi nấm ký chủ hình thành cấu trúc móc

hoặc ép sát sợi nấm và phát triển song song với nấm ký chủ. Theo Chet và Baker (1981), sự

tiếp xúc nhận biết của nấm Trichoderma với ký chủ của nó rất đặc trưng. Ví dụ: Trichoderma

harzianum nhận biết tơ nấm R.solani nhờ một chất bám dính (agglutinin), chất này liên kết

đặc hiệu với lectin có trong cấu trúc vách tế bào của nấm Rhizoctonia slain [38]

Bước 2: Tơ nấm ký sinh thủy phân vách nấm ký chủ bằng cách tổng hợp tiết ra các

enzyme: glucanase, chitinase, cellulose (Elad, 1983 [42]) Enzyme β-1,3-glucanase và

chitinase của Trichoderma harzianum không chỉ tác động kết hợp với nhau mà còn kết hợp

với các hợp chất kháng nấm.

Tóm lại, các chúng Trichoderma có thế được sử dụng làm tác nhân sinh học là dựa

trên khả năng ký sinh nấm của chúng (chủ yếu là ký sinh trên các loài nấm gây bệnh thực

vật). Quá trình ký sinh nấm của Trichoderma bao gồm các bước sau:

- Sự hóa dưỡng của Trichoderma

- Sự nhận biết ký chủ

- Tiết enzyme ngoại bào và chất kháng sinh

- Xâm nhập vào tơ nấm ký chủ

- Tiêu diệt ký chủ.

Đặc tính ký sinh của loài Trichoderma trên các loài nấm gây bệnh thực vật đã được

nghiên cứu khá kỹ [38,43]. Các nhà khoa học đa số tập rung tìm hiểu quá trình ký sinh nấm

trong kiểm soát bênh cây. Hình vẽ

1.3.3.6 Mối liên hệ giữa khả năng đối kháng nấm gây bệnh thực vật và hợt động

enzyme chitinase của Trichoderma spp. [58]

Trichoderma spp có khả năng phân giải vách tế bào nấm. Harran đã khảo sát cơ chế

phân tử của enzyme phân giải liên quan đến hoạt động kiểm soát sinh học của T. harzianum.

Sự thủy phân vách tế bào nấm chủ yếu dựa vào hoạt tính của chitinas, glucanase và protease.

Sau khi bám và quấn quanh nấm bệnh, khuẩn ty của nấm ký sinh tạo ra lỗ hổng trên vách của

khuẩn ty ký chủ. Màu sắc của khuẩn ty ký sinh thay đổi và phát huỳnh quang mạnh bởi sự kết

hợp của fluorescein isothiocyanat với lectin gắn vào chitotriose hoặc với calcofluor White. Cả

phức hợp này được gắn với β – glucan và oligomer N – acetyl – D – glucosamin. Hiện tượng

này được nhận định do enzyme phân giải được tiết ra tại vị trí tiếp xúc bởi T. harzianum khi

phân hủy vách của R. solani và S. rolfsii. Nếu có sự hiện diện của cycloheximid, hiện tượng

đối kháng bị ngăn chặn và hoạt tính của enzyme bị suy giảm. Hoạt tính của enzyme chitinase

cúng được tìm thấy khi Trichoderma tấn công R. solani và S. rolfsii trong môi trường đất.

T.harzianum có khả năng tấn công lên nấm bệnh thì tiết β – 1,3 – glucanase và

chitinase nhiều hơn những chủng không co khả năng tấn công nấm bệnh, khả năng đối kháng

của S. rolfsii khi bị T. harzianum tấn công cũng đã được nghiên cứu. Khuẩn ty T.

harzianum khi xâm chiếm vào hạch của S. rolfsii và tạ lỗ trên bề mặt của hạch này, cuối cùng

làm thay đổi hình dạng và làm biến mất tế bào chất của nó.

chủng Trichoderma khác nhau tùy thuộc ở cấp độ enzyme phân giải tạo ra để tấn công

sợi nấm của các loại nấm bệnh. Để tìm ra sự hình thành enzyme chitinase trong quá trình

tương tác ký sinh, Harran đã thực hiện thí nghiệm nuôi cấy ghép (dual - culture) trong đó

T.harzianum đương đầu riêng lẻ với hai loại nấm bệnh đều chứa chitin trong thành phần cấu

tạo vách tế bào là R. solani, nhưng khó có thể mọc tràn qua phần môi trường có chứa khuẩ ty

của S. rolfsii trong cùng điều kiện.

Sự biểu hiện của hệ enzyme chitinase T. harzianum trong tương tác này được điều

hòa rất đặc biệt bởi tùy loại tế bào ký chủ. Hiệu quả đối kháng chóng lại R. solani cao do sự

biểu hiện của cả 3 loại endochitinase là CHIT52, CHIT42 và CHI33 và N –

acetylglucosaminidase 102kDa. Ngược lại, iệc chống lại S. rolfsii của T. harzianum trong

tương tác ký sinh không có hiệu quả do chỉ có duy nhất 2 loại exochitinase là N-

acetylglucosaminidase (CHIT102, CHIT73) được phát hiện.

Những kết quả này chứng minh rằng hệ enzyme chitinase của T. harzianum không

phải được điều hòa một cách đơn giản theo cơ chế “bật/tắt” để phản ứng lại sự hiện diên hay

vắng mặt của chitin.

a. Sự đối kháng giữa T. harzianum và nấm bệnh S. rolfsii.

Inbar và Chet nghiên cứu sự cảm ứng chitinase đặc thù của T. harzianum trong suốt

quá trình ký sinh với S. rolfsii. Trước khi tiếp xúc, cả T. harzianum lẫn S. rolfsii đều có chứa

β-1,4-N-acetylgucosaminidase của riêng mình. Nhưng khi có sự tương tác β-1,4-N-

acetylgucosaminidase của S. rolfsii biến mất. Trong giai đoạn đầu của quá trình tương tác thì

enzyme 1,4-N-acetylgucosaminidase 102 kDa (CHIT102) của Trichoderma được cảm ứng

đầu tiên. Ngay sau đó ( khoảng 12 gờ sau khi tiếp xúc) thì hoạt động của CHIT102 bị suy

giảm nhanh chóng đồng thời với sự cảm ứng tạo ra nhiều enzyme β-1,4-N-

acetylgucosaminidase kDa (CHIT73). Hiện tượng này sẽ không xảy ra nếu sợi nấm của S.

rolfsii khử trùng trước khi bổ sung vào môi trường ủ với .T. harzianum.

Để nhận biết hiệu ứng của quá trình ký sinh, Inbar và Chet dã sử dụng hệ thống

biomimetic, gắn lectin tinh sạch từ S.rolfsii lên sợi nylon. Khi Trichoderma phát triển trên

những sợi nylon được phủ lectin, hoạt tính của CHIT102 tăng nhanh hơn so với nuôi trên môi

trường sợi nylon không gắn lectin. Điều lưu tâm ở đây là hệ thống biomimetic tuyệt đối

không có sự hiện diện của chitin, kết quả này cho thấy cảm ứng CHIT102 ở Trichoderma

trong quá trình đối kháng xảy ra rất sớm. [62]

b. Sự đối kháng giữa T. harzianum và nấm bệnh R. solani.

Xem xét sự phức tạp trong tương tác in vivo giữa nấm ký sinh và ký chủ của nó trên

vùng rễ của thực vật hoặc ở trong đất. Phương pháp phân tích tương tác kép (dual –

interaction assay) là phương pháp khả thi nhất để nghiên cứu các đặc tính sinh hóa của nấm

ký sinh. Flores đã sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sự biểu hiện của gen protease

(pbr1) ở T. harzianum trong quá trình tương tác giữa T. harzianum và R.solani. Ông nhận

thấy rằng, nồng độ mRNA của gen pbr1 tăng khi sự tương tác xảy ra. Carsolio nghiên cứu sự

biểu hiện của CHIT42 ở T. harzianum IMI 206040 trong suốt thí nghiệm nghiên cứu sự ký

sinh trực tiếp của nó trên R.solani và ông nhận thấy sự biểu hiện của CHIT42 được cảm ứng

mạnh mẽ trong suốt quá trình tương tác đối kháng. Trong quá trình đối kháng giữa T.

harzianum và R.solani; CHIT102 cũng là enzyme được cảm ứng đầu tiên. Tuy nhiên khoảng

12 giờ sau khi tiếp xúc hoạt tính của CHIT102 không hề suy giảm mà còn tiếp ục gia tăng,

đồng thời 3 loại endochitinase là CHIT52, CHIT42 và CHIT33 cũng được cảm ứng. Thời

gian sau đó, hoạt tính của CHIT102 mới bắt đầu giảm dần trong khi hoạt tính của CHIT52,

CHIT42, CHIT33 dần dần gia tăng [37]

1.3.3.7 Những hợp chất kháng nấm của các chủng trichoderma.

gliotoxin (C13H14N2S2O4): là chất kháng sinh từ nấm T. viride Gliotoxin không bền và

dễ bị phân hủy nhanh chóng trong ánh sang, phổ kháng sinh của gliotoxin bao gồm vi khuẩn

(chủ yếu vi khuẩn gram dương) và các nấm gây bệnh hoạt tính kháng sinh của gliotoxin liên

quan đến sự có mặt của phân tử lưu huỳnh trong cấu tạo của chúng.

Viridin (C9H16O6): ngoài gliotoxin, người ta còn tách được chất kháng sinh Viridin

(sắc tố vàng), chúng có khả năng ức chế một số loài nấm gây bệnh như Fusarium coeruleum,

Botrytis alli, Penicillium notatum.

Một số chất kháng sinh khác

- Theo Dennis và Webster (1971) [40], T. Viride có khả năng tiết trichodermin, T.

hamatum tạo ra các polypeptide có bản chất kháng sinh.

- Okuda (1982) cho rằng nhiều loài Trichoderma spp tiết isonitrile có bản chất kháng sinh.

- Trichozianine là kháng sinh có hoạt tính kháng nấm được phát hiện nhiều ở loài T.

harzianum. Trichozianine kết hợp với những enzyme thủy phân vách trong quá trình ức chế

sự nảy mầm và kéo dài tơ nấm trong quá trình ký sinh nấm [79]

- Trichothecene từ T. harzianum cũng có hoạt tính kháng nấm (Corley et al.1994).

- Tricholin là protein bất hoạt ribosome do T. viride tiết ra, chúng làm giảm sự hình thành

chuỗi polysome ở nấm bệnh Rhizoctonia solani [70]

- Claydon (1987) [30] xác định được chất alkylpyrons dễ bay hơi do T. harzianum ức chế

nấm R. solani gây bệnh héo rũ trên cải trong điều kiện in vitro.

1.3.3 Ứng dụng của vi nấm Trichoderma

1.3.3.1 Trong nông nghiệp

a. Bảo vệ thực vật [12,28]

Trichoderma spp hiện diện khắp nơi trong đất và trên các loài cây gỗ vừa bị đốn ngã là

một bằng chứng thể hiện tính cạnh tranh mạnh mẽ của chúng, mặt khác với đặc tính ký sinh

trên một số nấm gây bệnh thực vật, các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa ra những kết quả

thuyết phục về khả năng đối kháng nấm của Trichoderma spp thông qua hoạt động ký sinh

nấm.

Một số bênh do nấm liên quan đến các bộ phận của cây dưới mặt đất (rễ) rất khó trị

bằng phương pháp hóa học truyền thống, vì không thể tác động toàn bộ hệ rễ bằng thuốc diệt

nấm. Trichoderma spp là tác nhân đối kháng tự nhiên của các nấm gây bệnh trong đất và

được ứng dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học thành công trong nhà kính và ngoài đồng

ruộng, chúng là những ký sinh rất hữu hiệu trên nhiều loài nấm gây bệnh khác nhau như:

Phytophthora spp, Rhizoctonia solani, Pythium spp, Sclerotium rolfsii.

Năm 1993, Harman và Hayes thử nghiệm dung hợp tế bào trần nhằm tạo ra chủng có

khả năng kiểm soát bệnh hữu hiệu. Một số nhà khoa học khác tập trung vào cải biến một số

đặc tính liên quan đến các hoạt động đối kháng như tạo chủng đột biến sinh enzyme mạnh

hơn để tăng hiệu quả đối kháng.

Một số loài Trichoderma được sử dụng phổ biến trong kiểm soát sinh học là T.

koningii, T. harzianum; T. viride, T.hamatum. T. harzianum có thể dùng kết hợp với những

chủng Trichoderma khác hoặc dùng dưới dạng phân bón vi sinh.

Hiện nay trên thế giới đã có một số chế phẩm được thương mại hóa như: [15]

• TRICHODEX (tác nhân chính có T. harzianum)

• BINAB-T (tác nhân chính bao gồm T. harzianum và T. polysporum) của Thụy

Điển.

• TRI 002, TRI 003 (chủng T. harzianum) của Hà Lan.

• T22 Planter Box (đây là chủng dung hợp protoblast T. harzianum) của Hoa Kỳ.

• Trichopel, Trichoject, Trichodowels, Trichoseal (tác nhân chính là T. harzianum

và T. viride) của Úc.

b. Cải thiện năng suất cây trồng

Vài loài Trichoderma có khả năng kích thích sự nảy mầm và sự ra hoa. Đã có nhiều

công trình khoa học chứng minh rằng T. harzianum và T. koningii kích thích sự nảy mầm và

tăng trưởng của cây. Đối với các loại được trồng trong nhà kính, T. harzianum đẩy nhanh sự

ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng hoa.

Trichoderma đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cy trồng nhờ khả năng giúp cây trồng

tạo ra hệ rễ cứng cáp hơn. Một nghiên cứu gần đây còn cho biết nếu bắp T. harzianum T-22

hỗ sinh ở rễ thì cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có T -22.

Trichoderma cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi

sinh vật nốt sần cố định nito trong đất, duy trì sự can bằng của các vi sinh vật hữu ích trong

đất, bảo toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng.

Tăng sức đề kháng của cây trồng, một số chủng T. harzianum còn có thể xâm nhập

vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng.

Như vậy, các chúng nấm Trichoderma spp trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh

không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế các bệnh

gây hại cây trồng và taoh được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên. Những

loài Trichoderma được dùng phổ biến trong kiểm soát sinh học là T. harzianum, T. koningii,

T. viride, T. hamatum và T. polysporum.

1.3.3.2 Trong lĩnh vực xử lý môi trường [47]

T.harzianum có khả năng phân hủy các chất gây ô nhiễm trong đất rừng.

T.harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng trên ciliatin,

glycophosphat và amino methylphosphat acid (3-methoxyphenyl).

T.harzianum 2023 (Khoa sinh lý hực vật Trường Đại học California) có thể phân giải

DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachlorophenol.

T.harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong đất trong 24 giờ,

đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trog đất và trong đầm lầy.

1.3.3.3 Trong công nghệ thực phẩm [11]

Enzyme của chủng Trichoderma longibrachiatum đã được khảo sát và cho thấy có thể

làm tăng hương vị của men rượu. Đồng thời, các loại glucanase và glucosidase được tiết ra

bởi chủng này có khả năng thủy phân liên kết glycoside, do đó đã thủ giải các liên kết

glycoside-terpen phóng thích terpen, tạo mùi thơm đặ trưng.

Bột lúa mì để sản xuất bánh mì thường chứa đầy đủ hàm lượng β – amylase nhưng lại

thiếu α – amylase nhất định. α – amylase có thể lấy từ lúa đại mạch nảy mầm (malt), vi

khuaane hay nấm. Trong đó nấm là nguồn α – amylase phong phú và tốt nhất. Người ta đã

chuyển gen α – amylase ở nấm Trichoderma vào nấm men bánh mỳ dưới sự kiểm soát của

promoter ACT1. Bánh mỳ tạo ra có kích thước lớn hơn trước và ruột bánh mì cũng mềm hơn,

chậm cứng hơn làm tăng thời gin bảo quản.

Ngoài ra trong công nghiệp sản xuất dầu olive, có sử dụng cellulose và hemicelulase

chiết từ Trichoderma trộn với pectinase chiết tách từ Aspergillus, điều này đã làm tăng sản

lượng dầu sản xuất ra một cách rõ rệt, đồng thời chất lượng dầu cũng được cải thiện so với

phương pháp sản xuất dầu truyền thống.

1.3.3.4 Bổ sung thức ăn cho gia súc

Hiện nay tren thị trường có chế phẩm EconaseTM với các enzyme có nguồn gốc từ

Trichoderma reesei bổ sung vào thức ăn của gia cầm có các ưu điểm sau:

• Thành phần chất dinh dưỡng linh động hơn.

• Sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền hơn

• Dễ tiêu hóa hơn

• Làm tăng giá trị năng lượng thật của các loại ngũ cốc

• Các gia cầm tăng trưởng đồng dạng

• Giúp tăng trọng tốt hơn

• Trứng gia cầm sach sẽ hơn

• Tăng màu lòng đỏ trứng gà

• Giảm lượng rác thải ra môi trường

Bên cạnh đó, chế phẩm AvizymeTM cũng có những ưu điểm tương tự như EconaseTM

phù hợp cho gà trong giai đoạn đẻ trứng. PorzymeTM là thương hiệu của một hỗn hợp các

enzyme cellulose, hemicellulase, protease. Amylase bổ sung vào khẩu phần ăn của lợn con

vừa thôi bú. Tất cả các enzyme này đều có nguồn gốc từ Trichoderma.

1.3.3.5 Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen [12]

Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hóa các snr

phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học. Nhiều gen có nguồn gốc

Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra

cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có một gen nào được thương mại hóa tuy

nhien hiện có nhiều gen của Trichoderma được nghiên cứu và phát triển.

1.1.11. 1.3.3.6 Tình hình nghiên cứu và khả năng ứng dụng Trichoderma spp ở Việt

Nam

Ở nước ta, hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichodema:

theo báo cáo của Trần Thị Thuần ( Bộ môn nghiên cứu bệnh cây – Viện bảo vệ thực vật

(1995)), ghi nhận bước đầu thành công khi sử dụng một số chủng Trichoderma phân lập được

trong đất, nhằm hạn chế bệnh khô vằn hại bắp do nấm Rhizoctonia gây ra.

Gần đây (2001), TS. Hoàng Quốc Khánh (phòng vi snh ứng dụng – Viện sinh học

nhiệt đới) thử nghiệm thành công trên diện rộng chế phẩm BIOPROMOT (bao gồm 2 chủng

giống T. harzianum và T. Koningii) trên hai loài cây cà chua và cải, chế phẩm dùng để xử lý

đất nhằm hạn chế bệnh và kích thích cây tăng trưởng.

Năm 2005, Đinh Minh Hiệp và cộng sự bước đầu đã hoàn tất việc khảo sát sự phân bố

của các chủng nấm Trichoderma tại Thành Phố Hồ Chí Minh và các tỉnh miền Đông Nam Bộ.

Đồng thời nhóm nghiên cứu này cũng đã có những nghiên cứu sâu về hoạt tính đôi kháng của

vi nấm Trichoderma đã phân lập đối với các loài nấm gây bệnh cây trồng phổ biến như

Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Phytophthora primulae và thử nghiệm ứng dụng chế

phẩm Trichoderma tại một số nơi như xã Bầu Lâm (huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa Vũng

Tàu), trạm bảo vệ thực vật Long Khánh…đã thu được một số kết quả bước đầu khá tốt.

Các kết quả nghiên cứu của trường đại học cần thơ, Viện Nghiên cứu lúa Đồng bằng

Sông Cửu Long, Công ty Thuốc sat trùng Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới đã cho thấy hiệu

quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cay trồng ở phí nam. Các nghiên cứu cho

thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bênh thối rễ trên cam

quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loài nấm gây bênh khác như Sclerotium

rolfsii, Fusarium Oxysporum, Rhizoctonia solani. Công dụng thứ 2 của nấm Trichderma là

khả năng phân hủy cellulose, hòa tan lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta đã phối

trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh, để thúc đẩy quá trình phân hủy

hữu cơ được nhanh chóng. Các sản phẩm hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu

mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt (TP. Hồ Chí

Minh), phân VK của Công Ty Viễn Khang (Đồng Nai) dã được nông dân các vùng trồng rau,

cây ăn trái, cây tiêu, cây điều, hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả.