chemické a biochemické interakce -...

Strana 1

DNA čipy

• Zařízení pro detekci specifické sekvence bází v molekule DNA nebo RNA

• DNA čip je tvořen maticí detekčních míst (microarray)

• Detekční místa jsou obvykle tvořena gelem s imobilizovaným receptorem – ssDNA (denaturovaná jednořetězcová DNA)

• V analyzovaném vzorku jsou přivedeny fluorescenčně značené ssDNA (ligandy)

• V případě komplementarity ligandu a receptoru proběhne hybridizace a stabilní dsDNA (dvouřetězcová DNA) je vytvořena v detekčním místě

• Po odmytí nenavázané ssDNA, může být provedena fluorescenční detekce.

Strana 2

Princip DNA čipu- schéma

Typický fluorescenční obraz

DNA čipu po hybridizaci

Strana 3

DNA čipy

• DNA čipy vykazují extrémní specifitu, která je závislá na počtu párů bází (pb) ve vzniklém komplexu ligand-receptor (~ 4n, kde n je počet pb).

• Charakteristický rozměr detekčních míst bývá v mm, což umožňuje vytváření obrovských matic detekčních míst (fotolitografie, microspotting, inject printing).

• Na jednom DNA čipu mohou být vázány všechny sekvence DNA kódující nějaký gen určitého organizmu (cca desítky tisíc míst)

• DNA čipy jsou využívány pro detekci genetických poruch (mutací), identifikaci osob (DNA fingerprint), detekci přítomnosti virových nebo bakteriálních infekcí, zjišťování nejúčinnějšího léčebného postupu u závažných onemocnění (personal therapy)

Přednáška #12 Strana 4

Microarrays (mikromaticové systémy)

- Původně studie exprese genů (mRNA profily) - Nyní k celé řadě aplikací: transcriptional profiling, genotyping, comparative genomic hybridization, epigenetic analysis

- Limitace difusí: targety musí difundovat z jádra tekutiny k detekčním polím D(DNA)~ 10-12 až 10-13 m2/s (inkubace trvá hodiny) - Zkrácení difusního času: 1. integrace mikromaticového pole s mikrokanálem a recirkulace (vysoký poměr povrch/objem, vyšší počet oligonukleotidů k funkcionalizaci) 2. konvektivní míchání: v mikrofluidice dosti neefektivní Pe okolo 100 (zlepšení přestupu hmoty se škáluje s Pe1/3 což odpovídá přibližně jednomu řádu)


http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray

Strana 6

DNA čipy

• Pod detekčním místem (gelem) bývá umístěna elektroda

• Vložené elektrické pole urychluje transport DNA ze vzorku k detekčnímu místu vlivem elektroforetické migrace

• Analýzu na čipu tak lze urychlit z hodin na minuty • Zapojením vybraných elektrod je možné složky

vzorku usměrňovat (adresovat) pouze ke zvoleným detekčním místům

• Vzhledem k univerzálnosti interakce ssDNA-ssDNA a její vysoké specificitě, je již mnoho DNA čipů dodáváno komerčně

Strana 7

Příklady komerčních DNA čipů

DNA čip firmy Nanogen se 100

testovacími místy s uloženými

mikroelektrodami pro adresování.

DNA čip s možností adresování

standardního připojení k řídící

jednotce.

Typická čtečka signálu DNA čipů

Strana 8

Na DNA čipu může být umístěn celý genom libovolného organizmu

DNA čip – Escherichia coli

18880 detekčních míst (25 pb) o průměru 11 mm

Sledování exprese až 5500 transkriptů

Affymetrix, Inc.

DNA čip – Drosophila melanogaster (octomilka)



Affymetrix, Inc.

DNA čip – Myš



Affymetrix, Inc.

DNA čip – Člověk



Affymetrix, Inc.

Strana 9

Příklady komerčních DNA čipů

• Vzhledem k vysoké specificitě hybridizační reakce lze princip DNA čipů použít např. ke zvýšení bezpečnosti různých čipových karet

• Každá sekvence DNA je spojena se specifickým signálem elektronického čipu karty. Tento signál může být identifikován pomocí čtecího zařízení s komplementárním signálem.

Strana 10

Chemické a biochemické interakce

V biochemických reakcích dochází velmi často při

interakci ligandu a receptoru ke tvorbě ligand-

receptorového komplexu a/nebo jeho zpětné disociaci

Ligand + Receptor Komplex

Reaktanty Produkty katalyzátor

Při interakci jedné nebo několika chemických komponent (reaktantů) může

dojít k jejich chemické přeměně za vzniku produktů. Chemická přeměna

probíhá za přítomnosti nebo bez přítomnosti katalyzátorů, které se přímo

účastní transformace a snižují její aktivační energii.

Strana 11

Ag (aq) + Ab (aq) C (aq)

Uspořádání chemické interakce

• Homogenní – všechny reaktanty i katalyzátor jsou v jedné fázi,

obvykle kapalné – například kompetitivní imunoanalýza v roztoku

• Heterogenní – jeden nebo více reaktantů nebo katalyzátor je umístěn

v jiné fázi než ostatní reaktanty – například heterogenní imunoanalýza s antigenem nebo

protilátkou vázanou na pevný nosič

Ag (s) + Ab (aq) C (s)

Strana 12

Heterogenní biochemické reakce

Heterogenní uspořádání je obvyklé

u všech vysoce paralelizovaných

aplikací – DNA čipů nebo různých

proteinových čipů. Jeden z reaktantů –

receptor je imobilizován buď na povrchu

pevné fáze nebo v gelové vrstvě.

Receptorem může být antigen,

protilátka, proteinové ligandy a

receptory (GF, EGFR), jiné proteiny,

ssDNA, RNA atd.

Rozpoznávání se děje na základě

specifity komplementární interakce mezi

antigenem a protilátkou, ssDNA-ssDNA,

enzymem a substrátem atd.

Zatímco DNA čipy obsahují velké množství

vazných míst (až desítky tisíc), u proteinů

to bývají obvykle jednotky až desítky.

Protilátky

http://www.highlands.edu/academics/divisions/scipe/biology/faculty/harnden/2122/notes/immune.htm

Přednáška #12 Strana 14 http://en.wikipedia.org/wiki/Blood_type

hemaglutinace

Strana 15

Proteinové čipy

• Interakce mezi dvěma komplementárními proteiny nebo proteinem a molekulou nebílkovinné povahy

• Proteiny jsou velmi rozmanité molekuly – proteiny, lipoproteiny, glykoproteiny

– fibrilární a globulární

– hydrofilní nebo hydrofóbní charakter povrchu

– isoelektrický bod, celkový elektrický náboj

– protilátky, antigeny, enzymy, receptory, ligandy, substráty

– řádové rozdíly v molekulární hmotnosti

• Specificita nebývá absolutní, enzym je schopen zpracovávat více substrátů, protilátky se mohou vázat na více antigenů (epitopů)

Strana 16

Proteinové čipy

• Z uvedených vlastností plyne, že žádný proteinový čip nemůže být tak univerzální a specifický jako DNA čipy

• Přístup ke konstrukci proteinového čipu také není univerzální, protože každá aplikace vyžaduje zvláštní přístup, což je determinováno charakterem zkoumaného proteinového systému

• Obvykle není vyžadován vysoký stupeň paralelizace (jedno až několik desítek detekčních míst)

• Typickým příkladem může být čip pro paralelní detekci několika antigenů spjatých s různými infekčními chorobami

Strana 17

Proteinové čipy • Proteinové čipy mají řádově menší charakteristické rozměry než

klasické systémy pro detekci proteinů (např. ELISA destičky) – řádové snížení doby analýzy (např. rychlá diagnostika) – snížení spotřeby proteinových reaktantů (cena) – přenositelnost systému (k pacientovy, na místo analýzy) – snadnější paralelizace – reprodukovatelnější reakční podmínky (přesné dávkování, lepší

homogenizace vzorku, …)

• Protože proteinové čipy nejsou masově rozšířené – chybí univerzální porty – ceny analýz jsou podstatně dražší než v klasických systémech, protože

pořizovací náklady na detektory, obslužné zařízení i samotné čipy jsou obrovské

– čipy jsou vyráběny v malých sériích – výhody proteinových čipů nepronikly mezi odbornou veřejnost

Jamkové destičky

ELISA in a microfluidic chip

Ultrasensitive microfluidic solid-phase ELISA using an actuatable microwell-patterned PDMS chip, Lab Chip, 2013, 13, 4190

fluorescein di-b-D-galactopyranoside (FDG) – nefluoreskující substrát

Strana 20

Příklad imunoanalýzy v homogenním uspořádání

Kompetitivní imunoanalytické stanovení

teofylinu v homogenním uspořádání.

Dávkování reaktantů a manipulace

s roztoky je založena na

elektroosmotickém transportu.Teofylin ze

vzorku (5) a známé množství značeného

teofylinu (6) jsou nejprve smíchány. Poté

jsou inkubovány s omezeným množstvím

protilátky (7). Vznikají komplexy

značeného a neznačeného teofylinu

s protilátkou a zůstává část

nespotřebovaného značeného teofylinu.

Značený teofylin a značený teofylin

v komplexu jsou následně na základě

různé elektroforetické mobility odděleny

v separačním kanále a jejich množství je

detekováno. Teofylin: lék k léčbě nemocí dýchacího ústrojí

Strana 21


Míchání a inkubace

Separace

Kalibrační křivka – relativní poměr

značeného teofylinu volného

a v komplexu vypovídá o koncentraci

neznačeného teofylinu ve vzorku.

Strana 22


Vysoce integrované

šestikanálové zařízení pro

paralelní imunoanalýzu

v homogenním uspořádání.

Zařízení obsahuje pouze

jeden fluorescenční

detektor. Separace

komplexu a značeného

antigenu se provádí na

základě rozdílných

elektroforetických mobilit.

Využit elektroosmotický

transport roztoků.

Strana 23

Mikrofluidní čip pro detekci proteinů na pevné fázi

Heterogenní stanovení IgG ze vzorku vazbou na imobilizovaný Protein A

Reakční komora

Zařízení kombinuje následující procesy:

imobilizace proteinu, inkubace,

proplachování, detekce a regenerace.

Transport je uskutečněn výhradně

elektrokineticky.

Strana 24

Mikrofluidní čip pro detekci proteinů na pevné fázi

Fluorescenční detekce

vázané protilátky

Kvantifikace signálu

v elektroosmotickém biosenzoru –

kalibrační křivka

Strana 25

Polystyrénový mikročip pro detekci IgG

Experimentální mikročip testovaný pro

přímou a sendvičovou detekci lidských

IgG na Proteinu A. Protein A je

imobilizován na stěně zařízení. Vzorek je

přiveden v roztoku. Doba inkubace je

5 minut.

Paralelizace kanálů umožňuje sestavení

kalibračních křivek nebo paralelní detekci

různých vzorků.

Strana 26


Intenzita fluorescenčního

zabarvení v konkrétním

kanále po vymytí zbytku

vzorku vypovídá o

koncentraci

imobilizovaného komplexu

PA-hIgG nebo PA-hIgG-

gIgG a tedy i o původní

koncentraci IgG

v analyzovaném vzorku.

Strana 27


Analýzou intenzity fluorescenčního signálu je možno získat kalibrační křivky

mikrofluidního zařízení. Z nich lze pomocí matematického modelu určit

rovnovážné a kinetické konstanty vazby ligand-receptor.

onoffd kkK

Rovnovážná konstanta

CAgAb onk

Rychlostní konstanta

Imobilizovaný Protein A

a lidské IgG v roztoku

kon = 5.5 m3mol-1s-1

Kd 3×10-6 mol m-3

PDMS mikročip pro kvantifikaci protilátek

Strana 28

hIgG mIgG FITC-gIgG glutardialdehyde

Mikročip z polydimethylsiloxanu (PDMS)

Vynikající optické vlastnosti, snadná výroba

Hydrofobní charakter povrchu

Dvoukroková detekce myších

protilátek mIgG


Strana 29

Měřen profil fluorescenční

emise napříč čipem

Schéma detekční

aparatury

Zařízení obsahuje

excitační laser a

fotonásobič


Strana 30

Výsledkem je kalibrační

závislost intenzity

fluorescenčního signálu na

koncentraci myších protilátek

ve vzorku

Strana 31

Mikročip pro heterogenní imunoanalýzu na vrstvě částic

Sendvičová heterogenní imunoanalýza – stanovení CEA (carcinoembryonic

antigen) při diagnostice rakoviny. Mikrofluidní zařízení obsahuje mikročástice

s imobilizovanou Ab proti CEA. CEA ze vzorku se váže na protilátku. Na vzniklý

komplex se váží protilátky proti CEA a dále zlatem značené protilátky proti CEA

protilátkám. Komplex obsahující zlaté částice může být detekován.

Strana 32

Mikročip pro heterogenní imunoanalýzu na vrstvě částic

Zařízení obsahuje lože mikročástic. Úniku mikročástic je zabráněno zúžením

kanálku. Roztoky obsahující analyty jsou dávkovány tlakem řízenou konvekcí.

Zařízení je schopno zpracovávat paralelně několik vzorků.

Strana 33

Příklad komerčních proteinových čipů

Kompaktní analyzátor

Sandia fluorescenčně

značených proteinových

toxinů – nM koncentrace

Jádrem analyzátoru je

mikrofluidní čip fungující na

principu kapilární elektroforézy

Modrý diodový laser

excituje fluorescenční

značku proteinů

Transport vzorků je

realizován elektrokineticky

34

Průtoková cytometrie Metoda slouží k

identifikaci a kvantifikaci

specifických buněk –

třídění buněk

Typické aplikace – detekce

rakovinných buněk v krvy,

detekce mikroorganizmů

Buňky se pohybují v sérii

kanálkem a specifické

buňky (například značené

fluoreskující protilátkou)

jsou opticky detekovány

35 Chen HT, Wang YN, MICROFLUIDICS AND NANOFLUIDICS 6, 529-537, 2009

Průtokový cytometr v mikrofluidním čipu


FACS - fluorescence activated cell sorting

http://www.thoughtyoumayask.com/picsbtqq/fluorescence-activated-cell-sorting/2

37

Elektrostatický dezintegrátor buněk

Carlos de la Rosa et al, IEEE TRANSACTIONS ON BIOMEDICAL

ENGINEERING, VOL. 55, NO. 10, OCTOBER 2008

Krátkodobé pulsy (50 ms) silného

elektrického pole (1×107 Vm-1) dezintegrují

buněčnou membránu/stěnu


Dielektroforéza v AC elektrickém poli

• Dielektroforetická síla působí částice dielektrika v nehomogenním elektrickém poli

• Jedná se o interakci časově proměnného elektrického pole (AC) a parciálního náboje molekul nebo částic dielektrika (dipólu)

• Částice nemusí nést celkový elektrický náboj • Velikost dielektroforetické síly závisí na tvaru částice, elektrických

vlastnostech částic a okolního kapalného média, frekvenci AC elektrického pole

• Dielektroforetická síla nezávisí na polaritě elektrického pole • Částice jsou vtahovány do oblastí s nejvyšší intenzitou elektrického pole,

pokud je jejich dielektrická konstanta vyšší (jsou lépe polarizovatelné) než dielektrická konstanta okolního média (pozitivní dielektroforéza)

• Částice jsou vtahovány do oblastí s nejnižší intenzitou elektrického pole, pokud je jejich dielektrická konstanta nižší (jsou hůře polarizovatelné) než dielektrická konstanta okolního média

• Vysoce selektivní metoda pro manipulaci a separaci mikro a nanočástic, buněk atd.


Dielektroforéza v mikročipu - příklad

• Separování a koncentrování směsi kvasinek a polystyrénových mikročástic

• Buňky – malé, světlé

• Polystyrénové mikročástice – velké, tmavé

(Zhou et al., 2005)


• Frekvenčně závislá – pozorovatelná až při velmi vysokých frekvencích (reorientace dipólů)

• Lépe (rychleji) jsou polarizovány dielektrika s větší dielektrickou konstantou

• Tato více polarizovaná dielektrika jsou vtahovány do oblasti větších intenzit elektrického pole (pozitivní dielektroforéza)

• Částice více polarizované vytlačují z těchto míst částice méně polarizované (negativní dielektroforéza)

Dielektroforéza - princip

+

d+

d d+

d

Strana 41

Dielektroforéza – celková síla působící na kulovou částici

• Pro malé frekvence je Clausius-Mossotiho faktor (člen v závorce záporný)

• Pro vyšší frekvence je kladný

fi

g

ErF

kk

rms

mp

mp

m

DEP

2

22

*

2

**

**

3

Strana 42

Detektor červených krvinek založený na dielektroforéze

• Ve AC elektrickém poli se částice s odlišnou dielektrickou konstantou než má nosný elektrolyt koncentrují v místech největší nebo nejmenší intenzity elektrického pole.

• Buňky jsou také odpuzovány z povrchu elektrod vlivem elektrodové polarizace interagující s polarizací buněčné membrány.

Minerick et al. Electrophoresis (2003).

Strana 43

Kombinovaný AC elektroosmotický mísič a dielektroforetický koncentrátor

• Systém dvou soustředných elektrod na které je vloženo AC elektrické pole.

• Tangenciální coulombovskou silou je ke středu centrální elektrody strháván elektrický náboj tvořený polarizací elektrody.

• Pohybující se náboj strhává tekutinu, která proudí tangenciálně ke středu elektrody a poté normálovým směrem od elektrody.

• Dochází tak k promíchávání roztoku. • Nad středem centrální elektrody jsou

potom dielektroforetickou silou selektivně zachytávány molekuly DNA.

Strana 44

Detektor bakterií založený na elektroosmotickém transportu ve střídavém elektrickém poli

• Páry ko-planárních elektrod. • AC zdroj vytváří časově

proměnné elektrické pole. • Vlivem tangenciální složky

elektrického pole dochází ke tvorbě vírů.

• Nad určitým místem elektrod vzniká stagnantní bod s nulovou tangenciální coulombovskou silou a bez pohybu tekutiny, kde jsou zachycovány částice – buňky.

Wu et al. Microfluid Nanofluid (2005).

Zachycení Escherichia coli ve stagnantních bodech elektrod.

chemické a biochemické interakce -...

Documents