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(J. Appl. Glycosci., Vol. 49, No. 1, p. 45--55 (2002))

平成13年 度日本応用糖質科学会奨励賞受賞講演

糖水酸基が α-グリコシダーゼ とリパ ーゼの活性 と特異性 に

及ぼす影響 について

西尾俊幸*

日本 大学 生物 資源 科学 部(252-8510藤 沢市 亀 井野1866)

Effect of Sugar Hydroxyl Groups on Activities and Specificities of

a -Glycosidase and Lipase

Toshiyuki Nishio

Department of Biological Chemistry, College of Bioresource Sciences, Nihon University (1866, Kameino, Fujisawa 252-8510, Japan)

Using possible monodeoxy derivatives of p-nitrophenyl (pNP) ƒ¿-D-glucopyranoside, -mannopy

ranoside, and -galactopyranoside as probe substrate, glycon specificities of ƒ¿-glucosidases, -man

nosidases, and -galactosidases from various sources were investigated, through hydrolysis of them.

ƒ¿ -Glucosidases of Saccharomyces cerevisiae, Bacillus stearothermophilus, and honeybee hydro

lyzed no deoxy derivatives, while the enzymes of rice, sugar beet, flint corn, and Aspergillus (A.)

niger hydrolyzed the 2-deoxy derivative with substantially high activities. Moreover, flint corn and

A. niger enzymes showed, although low, activities against the 3-deoxy derivative. Jack bean and

almond a-mannosidases both showed sufficient activities toward 6-deoxy derivative. A. niger ƒ¿-

galactosidase acted on only 2-deoxy derivative with substantially high activity, while the enzymes

of green coffee bean and Mortierella vinacea hydrolyzed not only the 2-deoxy derivative but also

6-deoxy one with low activities. Oligosaccharides that contain 2- or 3-deoxygenated glucose were

synthesized by the transesterification reaction of A. niger a-glucosidase. ƒ¿- and ƒÀ-Anomers of

methyl 6-O-(p-tolylsulfonyl)-D-glucopyranoside, -mannopyranoside, and -galactopyranoside were

acetylated partially by lipase-catalyzed transesterification with vinyl acetate. A lipase from Pseudo

monas cepacia (lipase PS) reveaed high activity and regioselectivity for the esterification of them.

ƒ¿ -Glycopyranosides were acetylated preferentially at the C-2 hydroxyl group, while corresponding

ƒÀ-anomers were acetylated preferentially at the C-3 hydroxyl group. The best selectivity was ob-

served in the reaction of the glucopyranosides. Using methyl 3-O -acetyl-6-O -(p-tolylsulfonyl)-ƒÀ-D-

glucopyranoside, which was prepared in quantitative yield by the lipase PS-catalyzed regioselective

acetylation, as a common starting material, highly deoxygenated monosaccharides, namely 2,6-

dideoxy-D-arabino-hexopyranose, 2,4-dideoxy-D-threo-hexopyranose, and 2,4,6-trideoxy-D-threo

hexopyranose, respectively, were chemically synthesized in good yields.

　はるか太古から,光 合成を行うことができる生物

は,太 陽光のエネルギーを使って豊富に存在する二酸

化炭素と水を糖類に変換することで,光 エネルギーを

貯蔵可能な化学エネルギーの形に変えて利用できるよ

うにしてきた.こ のようにして地球上に大量に蓄えら

れるようになった糖類に対 し,多 くの生物はそれを認

識 して分解することで生命活動のエネルギーを獲得す

るようになり,ま た,生 体構成分子の生合成のための

材料としても利用するようになった.こ の過程におい

て,生 物は糖類に係わる酵素の糖構造認識能と反応性

をより高度に進化させていったものと思われる.

　糖類は,複 数の不斉炭素原子を骨格として持つポリ* nishio•—brs.nihon-u.ac.jp

46 J. Appl. Glycosci., Vol. 49, No. 1 (2002)

ヒドロキシアルデヒドあるいはケ トンとして特定さ

れ,多 くのジアステレオマーが存在し,一 般に環状構

造をとっている.こ のような糖分子の生物学的認識に

おいて,単 糖やオリゴ糖のレベルでは,多 くの場合そ

の水酸基個々の 「存在」と 「立体配置」が重要な要素

になっていると考えられる.つ まり,糖 の構造 を認識

する種々のタンパク質は,そ の水酸基群を正確に捉え

ることで他の化合物や糖分子と区別していることが推

測される.実 際に,糖 に結合する数種類のタンパク質

について,X線 回折などによりその水酸基群との正確

な相互作用(水 素結合など)が 示唆されている.部 分

的に修飾した糖誘導体を基質として用い,各 種の酵素

の作用における糖水酸基群の役割と重要性について調

べた研究が,近 年いくつか報告されるようになってき

た.し かし,こ のような研究の報告数はまだ非常に少

ない.そ こで,本 研究では糖質加水分解酵素の一種で

あるα-グリコシダーゼと,糖 質関連酵素ではないが

糖類にも作用する油脂加水分解酵素リパーゼに関し,

糖水酸基がこれら酵素の活性や特異1生に及ぼす影響に

ついて,合 成したさまざまな誘導体に対する作用を通

して調べた.

α-グ リコ シダ ーゼ の作用 にお け る

基 質 グ リコン水酸 基 の重 要性 につ い て

　一般 に,グ リコシ ダーゼ は オ リゴ糖 に対 し高 い加水

分 解活 性 を示 すエ キ ソ型酵 素 と して知 られ てい るが,

アル キル または ア リール グ リコシ ドや多糖 に対 して も

高 い活 性 を示 す もの も数多 くあ る.本 酵 素 は,基 質 グ

リコシ ドの非還 元性 末端 糖(グ リコ ン)の 構造 に対 す

る高 い特異 性 に よ り分類 されて お り,そ の ため,基 質

特 異性 につい て は従 来 か らア グ リコ ンの種 類 や その結

合 の位 置(ア グ リ コンが糖 の場 合)な どに関 して調べ

られ て きた.グ リ コシ ダーゼの グ リ コ ン特 異 性 につ い

て調べ る場 合 に は,一 般 に糖 の種 類 は 固定 しそ の部分

修 飾体 を用 い て行 う こ とが 多 い.た とえ ば,古 くは

Emn Fischerら に よるエ ムル シ ンな どに関 して行 われ

た 研 究1)に遡 るが,最 近 で はAspergillus(A.)属 糸 状

2-4)やAgrobacterium属 細 菌5)のβ-グ ル コ シ ダ ー ゼ,

大 腸 菌6)や子 羊 小 腸7)のβ-ガ ラ ク トシ ダ ー ゼ,お よび

大 麦 のα-グル コ シ ダーゼ8)の部 分 デ オ キ シ基 質 な ど に

対 す る反応性 の結 果 か ら,こ れ らの酵素 の作 用 にお け

る基 質 グ リコ ンの 各水 酸 基 の重 要 性 が論 じ られ て い

る.し か し,グ リコシ ダーゼ の グ リコ ン特 異性 に関す

る研 究 に は,ま だ十分 なデー タが 蓄積 され て いる とは

い え ない.そ こで,よ り多 くの種類 と由来 の異 な る酵

素 につ いて グ リ コン特 異性 を調 べ る こ とに よ り,グ リ

コシ ダーゼ に よる グ リコ ン認 識 に関す る何 らかの傾 向

を見 出せ るので は ないか と考 え た.本 研 究 で は,ま だ

研 究例 の 少 な いα-グ リ コ シダ ー ゼの う ち,α-グ ル コ

シ ダ ー ゼ(EC3.2.1.20),α-マ ン ノ シ ダ ー ゼ(EC

3.2.1.24),お よび α-ガラ ク トシ ダーゼ(EC3.2.1.22)

を対 象 と し,各 種 デオ キ シ基 質 に対 す る それ らの加水

分 解 活性 に つ い て調 べ た.ま た,α-グ ル コ シ ダー ゼ

の糖 転 移反応 を利 用 したデ オキ シ糖 含 有 オ リゴ糖 の合

成 につ い て も検討 し,オ リゴ糖 生 成 に及 ぼす糖水 酸 基

の 影響 につ い て も調べ た.

1.α-グ リコ シダ ー ゼ の モ ノデ オ キ シ基 質 に対 す

る反応 性 につ いて

　 P-ニ トロ フェニ ル(pNP)α-D-グ ル コシ ド(1),-マ

ンノ シ ド(6),お よび-ガ ラク トシ ド(11)の2-,3-,

4-,6-モ ノデ オ キ シ体(Fig.1)を そ れ ぞ れ化 学 合 成

し,そ れ らの コ ンホ ー メ ー シ ョ ン を重 水 中 で のIH-

NMRやMM2を 用 い た分 子 力 場 計 算 に よ る エ ネ ル

ギ ー最小 化 に よ り調べ た ところ,い ず れ も非 デ オキ シ

体 と同様 に4C1イ ス型 で あ る こ と を確 認 で きた9-11).そ

こで,さ まざ まな 生物 由来 のα-グ ル コシ ダ ーゼ,-マ

ン ノシ ダー ゼ,お よび-ガ ラ ク トシ ダー ゼ(い ず れ も

精 製 した もの)を 対応 す る デオ キ シ基 質 に作用 させ て

Fig. 1. Structures of substrates used in this study.

4?糖水 酸基 が α-グリコ シダー ゼ と リパ ーゼ に及 ぼす 影響

Table 1. Relative rates of hydrolysis of each a-glyco

sidase against corresponding PNP a-D-glyco

pyranoside and its monodeoxy derivatives.

A) Hydrolytic activity of each a-glucosidase was as-

sayed under following condition: S. cereviciae and B.

stearothermophilus; in 50 mi t sodium phosphate buffer

(pH 7.0) at 37•Ž, honeybee I; in 50 mM sodium acetate

buffer (pH 4.5) at 35•Ž, honeeybee ‡V; in 50 mM sodium

acetate buffer (pH 5.5) at 35•Ž, rice and A. niger; in 50

mM sodium acetate buffer (pH 4.0) at 37•Ž, sugar beet

and flint corn; in 50 mM sodium acetate buffer containing

0.05% Triton X-100 (pH 4.5) at 37•Ž. B) Hydrolytic ac

tivity of each a-mannosidase was assayed in 100 mM so

dium citrate buffer (pH 4.5) at 25•Ž. C) Hydrolytic activ

ity of each a-galactosidase was assayed under following

condition: green coffee bean; in 50 mM sodium phosphate

buffer (pH 7.2) at 25•Ž, M. vinacea; in 50 mM sodium

phosphate buffer (pH 4.9) at 40•Ž, A. niger; in 50 mM so

dium acetate buffer (pH 4.0) at 25•Ž. aRelative rate of hy

drolysis was expressed by comparison with the amount of

p-nitrophenol that was released from corresponding a-D-

glycopyranoside for 30 min by each a-glycosidase, which

was taken as 1.00%. -, activity was too low to be mea

sured.

み た.Tablelは,お の お の の酵 素 につ い ての デ オキ

シ基 質分 解 の様 子 と非 デ オキ シ基 質 分解 活 性 を100%

と した と きの相 対 活性 を示 した もので あ る.反 応 はそ

れぞ れの酵 素 につい て 最適pHで 行 い,酵 素 活性 は反

応 に よ り遊 離 したP-ニ トロ フェ ノ ー ル を定 量 す る こ

とに よ り評 価 した.α-グ ル コ シ ダー ゼ につ い て は,

Saccharomyces(S.)cerevisiae(注1),Bacillus(B.)

stearothermophilus(注2),お よ び ミツ バ チ12)の酵 素 の

よ うにいず れ のデ オ キ シ基 質 に も有 意 な活性 を示 さな

い もの と,ラ イス13),テ ンサ イ14),フ リン トコー ンIS),

お よびA.niger16)の 酵素 の ように2-デ オ キ シ体(2)に

対 し高 い 活 性 を示 す もの が あ っ た.ま た,フ リ ン ト

コー ンやA.nigerの 酵素 は,活 性 は低 いが3-デ オ キ シ

体(3)に も作用 す るこ とが わ か った9).こ の よ うに,

α-グル コシ ダー ゼ に は そ の作 用 にお い て,基 質 グ リ

コ ンのすべ て の水酸 基 の存在 が必 須 で あ る もの と,特

定 の水 酸 基(2位 や3位)の 重要 性 が低 い,少 な くと

も二つ の タ イプの もの があ る こ とが 明 らか となっ た.

α-グル コシ ダー ゼ は,そ の ア ミノ酸 配 列 の 相 同性 に

基 づ いて フ ァ ミリー ＩとⅡ の二 つ の グルー プ に大 き く

分 け られ て い る17」8).前者 の タイ プ の酵 素 は フ ァ ミ

リー1に,ま た,後 者 の タイ プの酵 素 は フ ァミ リーH

に属 して いる.こ の こ とは,本 酵 素 の デオ キ シ糖 認識

能 とア ミノ酸相 同性 には明 らか な相 関が あ る こ とを示

して い る.α-グ ル コ シ ダ ー ゼ に は,テ ンサ イ,ラ イ

ス,お よびA.nigerの もの の よ うに,マ ル トース の非

還元 性 末端 よ りも還 元性 末端 グル コース に対 して高 い

親 和性 を示 す もの が あ る16,19).酵素 作 用 にお け る ア グ

リ コン糖 の重要性 も考慮 して,今 後 は部分 デオ キ シ化

マ ル トース 誘導体 に対 す る作 用 につ い て も検 討 して ゆ

く必 要 があ る と考 えて い る.

　α-マ ンノシ ダーゼ につい て は,ナ タ豆(注3),ア ー

モ ン ド(注4)の 酵 素 と も6-デ オ キ シ体(pNPα-D-ラ

ムノ シ ド,10)を よ く加水 分 解 した こ とか ら,こ れ ら

の酵 素 の作用 にお いて は,基 質 グ リ コンの6位 水 酸基

は必 須 で ない こ とが 明 らか となっ た10).

’•1) Pure grade enzyme was purchased from Oriental

Yeast Co., and it was further purified by cation

exchange and gel-filtration chromatography.

’•2) Pure grade enzyme was purchased from Sigma

Chemical Co.

’•3) Pure grade enzyme was purchased from Wako

Pure Chemical Ind.

’•4) Pure grade enzyme was purchased from Sigma

Chemical Co.

48 J. Appl. Glycosci., Vol. 49, No. 1(2002)

　α-ガ ラ ク トシ ダー ゼ につ い て は,A.niger(注5)の

酵 素 の よ うに2-デ オ キ シ体(12)の み に 高 い 活性 を

示 す もの と,コ ー ヒー豆(注6)やMortierella(M.)vi

nacea(注7)の 酵 素 の よ うに活性 は低 いが2-デ オ キ シ

体 ば か りで な く6-デ オ キ シ体(pNPα-D-フ コ シ ド,

15)に も作 用す る二 つ の タ イプ の もの が あ った11).い

ず れ に して も,こ れ らの酵 素 の作 用 にお いて は,2位

水 酸基 は重 要 でな い こ とが 明 らか とな った.前 者 と後

者 の ア ミノ酸 配列 の 相 同性(A.niger-コ ー ヒ豆 間;

35%,A.niger-M..vinacea間;32%)は,後 者 の 二 つ

の 酵素 間 の相 同性(コ ー ヒー豆一M.vinacea間;43%)

よ りも低 か っ た.α-グ ル コシ ダ ーゼ ほ ど明 瞭 で は な

い が,こ の 事 実 はα-ガ ラ ク トシ ダー ゼ につ い て も デ

オキ シ糖認 識能 とア ミノ酸配 列 の相 同性 に は相 関 があ

る こ とを示 してい る.

　モ ノ デ オ キ シ体 と同様 に,お のお ののpNPα-D-グ

リコシ ドにつ いて モ ノメチ ル化体 をすべ て合 成 し,そ

れ らに上 記 のα-グ リコ シ ダー ゼ を作 用 させ て み た.

しか し,い ず れの誘 導体 に対 して も有 意 な加水 分解 活

性 を示 さなか った ため,こ こで はモ ノ メチ ル化 体 に関

して の実験 の詳 細 は特 に記載 しなか った.メ トキ シ基

の立体 障害 の ため に これ らの誘 導体 は酵 素活性 部位 に

入 れ な い こ とが,こ の 原 因 で は な い か と考 え て い

る20).

　い くつ か のβ。グ ル コ シ ダー ゼ やβ-ガラ ク トシ ダ ー

ゼで は,そ の作 用 にお い て基 質 グリ コ ンの2位 水 酸基

が 必 須 で あ る こ とが確 か め られ て い るト7).さ ら に,

Cellulomonas fimiの 生 産 す るβ-グル コシ ダーゼ では基

質 グ リ コ ンの2位 水 酸 基 が酵 素一基 質 中 間体 の遷 移 状

態 安定 化 に寄与 して いる こ とが,X線 回折 や ポ イ ン ト

ミュー テー シ ョンの手 法 を用 いた研 究 に よ り指摘 され

てい る21).こ の よ うな基 質 グ リ コンの2位 水 酸 基 の重

要性 は,酵 母 のα-グ ル コシ ダ ーゼ で も指 摘 さ れ て い

る22).一 方,大 麦 の α-グル コ シ ダーゼ につ い て は,基

質 グ リ コ ンの すべ ての水 酸 基 が酵 素一基 質 中間体 の遷

移 状態 安 定化 に寄 与 してい るが,4位 と6位 の水 酸基

は特 に酵 素へ の結 合 に重要 で ある こ とが 示唆 された8).

ま た,A.nigerの グル コ ア ミラ ーゼ につ い て も,マ ル

トース の非還 元性 末端 の4位 お よび6位 水酸 基が 酵素

へ の結合 におい て重要 な役 割 を してい る こ とが確 か め

られ てい る23-25).これ らの事 実 と本 研 究 の結 果 か ら,

酵素 の作 用 にお いて基 質 の各 グ リ コン水 酸基 の役 割 は

異 な り,ま た,そ の傾 向 はα-グ ル コ シ ダー ゼ とβ-グ

ル コシ ダ ー ゼ 間 ばか りで な く種 々の α-グリコ シ ダー

ゼ 間 におい て も違 ってい る こ とが 明 らか とな った.ま

た,デ オ キ シ糖 特 異 性 は 同種α-グ リコ シ ダ ー ゼ に お

い て は ほ ぼ 同 様 な 傾 向 が あ る もの の,α-グ ル コ シ

ダーゼ の よ うに大 き く二 つの グ ルー プに分 かれ る よ う

な場 合 もあ る.ことが わか った.一 方,用 い たすべ ての

α-グ リコ シ ダー ゼ にみ られ る 共通 点 と して は,そ れ

ぞ れ の4-デ オ キ シ体(4,9,14)に は作 用 しな い こ

とが挙 げ られ る.α-グ リコ シ ダ ー ゼ に 関 して は,基

質 グ リ コンの4位 水酸 基 が糖 との結 合 にお い て共通 に

重 要 な役 割 を担 っ てい るので は ないか と考 え てい る.

Table 2. Kinetic parameters of the a-glucosidases for the hydrolysis of PNP a -D-glucopyranoside (1) and its 2- and 3-deoxy derivatives (2 and 3).

Hydrolytic activity of each a-glucosidase was assayed

at substrate concentrations between 0.5 and 2.5 mM under

following condition: rice and A. niger; in 50 mM sodium

acetate buffer (pH 4.0) at 37•Ž, sugar beet and flint corn;

in 50 mM sodium acetate buffer containing 0.05% Triton

X-100 (pH 4.5) at 37•Ž. The values of Km and Vmax were

calculated from reciprocal plots of the reaction curves.

Protein in the solution was determined by the method of

Lowry using bovine serum albumin as a standard.

’•5) Pure grade enzyme was purchased from Sigma

Chemical Co.

’•6) Pure grade enzyme was purchased from

Boehringer Mannheim Co.

’•7) Pure grade enzyme was purchased from Seika-

gaku Ind.

49糖水酸基がα-グリコシダーゼとリパーゼに及ぼす影響

Table 3. Kinetic parameters of the a-mannosidases for the hydrolysis of PNP a-D-mannopyranoside

(6) and its 6-deoxy derivative (10).

Hydrolytic activity of each a-mannosidase was assayed

at substrate concentrations between 1.0 and 5.0 mM in

100 mM sodium citrate buffer (pH 4.5) at 25•Ž. The val-

ues of Km and Vmax were calculated from reciprocal plots

of the reaction curves. Protein in the solution was deter-

mined by the method of Lowry using bovine serum albu-

min as a standard.

Table 4. Kinetic parameters of the a-galactosidases for the hydrolysis of PNP a -D-galactopyranoside

(11) and its 2- and 6-deoxy derivatives (12 and 15).

Hydrolytic activity of each a-galactosidase was assayed

at substrate concentrations between 0.8 and 2.4 mM under

following condition: green coffee bean; in 50 mM sodium

phosphate buffer (pH 7.2) at 25•Ž, M. vinacea; in 50

mM sodium phosphate buffer (pH 4.9) at 40•Ž, A, niger;

in 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) at 25•Ž. The

values of Km and Vmax were calculated from reciprocal

plots of the reaction curves. Protein in the solution was

determined by the method of Lowry using bovine serum

albumin as a standard.

2.α-グ リコ シダ ーゼの モ ノデ オ キシ基 質分 解 の 反

応 速 度解 析

　デ オキ シ基質 を加 水分 解 した上 記 の酵素 につい て,

反応 の速度論 的解析 を非 デ オキ シ基 質 と ともに行 い比

較 し て み た.Table2に 示 し た よ う に,α-グ ル コ シ

ダー ゼ につい ては,ラ イス,テ ンサ イ,フ リ ン トコー

ン,A.nigerの 酵 素 と も2-あ るい は3-デ オ キ シ体(2

あ るい は3)に 対 す るKm値 は非 デ オキ シ体 の もの に

比 べ 大 き くな っ てお り,デ オ キ シ化 に よる酵 素-基 質

問の親 和性 の低 下が 確認 され た.し か し,2-デ オ キ シ

体(2)に 対 す るvmax/Kmの 値 はい ず れの 酵 素 に お い

て も非 デ オキ シ体 のそ れ とほ ぼ等 しいか または大 き く

な ってお り,反 応効 率 の点 か らは劣 っ てい なか った.

これ は,グ リ コンの2位 水酸 基 を水 素 に置 換 した こと

で電子 吸 引性 が失 われ,反 応 中間体 であ る カル ボニ ウ

ムーオキ ソニ ウム カチ オ ンが よ り生 じやす くな っ た こ

とが原 因 であ る と思 われ る.い ずれ に して も,こ れ ら

の酵 素 は(と くにA.nigerの 酵 素 は)高 い2-デ オ キ シー

α-D-ア ラ ビノーヘ キ ソシ ダ ーゼ活 性 を有 す る こ とが わ

か った9).

　α-マ ンノ シ ダー ゼ につ い て は,Table3に 示 した よ

うに ナ タ豆 お よび ア ーモ ン ドの 酵 素 と も6-デ オ キ シ

体(10)に 対 す るKm値 は非 デ オキ シ体 の もの に比べ

大 きくなっ た こ とか ら,や は りデ オキ シ化 に よる親和

性 の低 下 が確 認 され た.し か し,ア ー モ ン ドにおい て

は そ れ ほ ど大 きなKm値 の 低 下 は み ら れ ず,ま た,

Vmax/Km値 も非 デ オ キ シ体 の もの と ほ ぼ 同 じで あ っ

た.こ の こ とは,ア ー モ ン ドの 酵 素 はα-D-マ ン ノ シ

ダーゼ とほぼ 同等 のα-D-ラ ム ノシ ダーゼ と して の機 能

を有 してい るこ とを示 して い る10).

　α-ガ ラ ク トシ ダー ゼ につ い て は,Table4に 示 した

よ うに コー ヒー豆 とM.vinaceaの 酵 素 で は2-お よび

6-デ オ キ シ体(12お よび15)に 対 す るKm値 は非 デ

オキ シ体 の もの に比 べ 大 き くな って お り,ま たvmax/

Km値 も小 さか っ た こ とか ら,デ オキ シ化 に よ る親和

性,反 応 効 率 と も低 下 した こ とが 確 認 さ れ た.し か

し,A.nigerの 酵素 につ い て はα-グル コ シ ダー ゼの 場

合 と同様 に,基 質 グ リ コ ンの2-デ オ キ シ化 に よる 親

和 性 の 低 下 は見 られ る もの の,高 い2-デ オ キ シ グ リ

コ シ ド分解 活性(2-デ オキ シーα-D-リキ ソーヘ キ ソ シダー

ゼ活性)を 示 す こ とが わか った11).

3.A.nigerの α-グル コシ ダー ゼの デ オキ シ 糖 認 識

能 と糖転 移反 応 を利 用 したデ オ キ シ糖含 有 オ リ

ゴ糖 の酵 素合 成

　抗生 物 質 な どの 天然 由来 の生 物活 性物 質 には,そ の

構 成 成 分 と して オ リ ゴ糖 を有 す る もの が 数 多 くあ る

50 J. Appl. Glycosci., Vol. 49, No. 1 (2002)

Fig. 2. Oligosaccharides produced by transesterification reaction of A. niger a-glucosidase

が,そ の機 能 につ いて は明確 にな ってい ない.そ れ ら

オ リゴ糖の ほ とん どが特 殊糖 よ り構成 されて お り,中

で も2位 が デ オキ シ化 され た糖 を含 む ものが非 常 に多

い26).そ のた め,2-デ オ キ シオ リゴ糖 の化 学 合成 につ

い て は 多 くの報 告 が な され て い るn.し か し,2-デ オ

キ シ糖 の グ リコ シ レー シ ョン反応 は,用 い る ドナ ー糖

の 安定性 や1位 の立 体制御 の点で 通常 の グ リコ シ レー

シ ョン反応 に比べ て良好 な結 果 を得 るのが 難 しい.そ

こで,A.nigerのα-グ ル コシ ダー ゼの デ オ キ シ糖 認 識

能 と糖転 移 反応 を利 用 して,2-デ オ キ シ糖 含 有 オ リゴ

糖 や そ の他3-デ オキ シ糖 含 有 オ リゴ糖 につ い て も酵

素 合成 を検討 しだ81.

　基 質 と して,ド ナ ー糖 に は ρ-ニ トロ フ ェニ ルα-D-

グル コ シ ド(1)と その2-お よび3-デ オ キ シ体(2お

よび3,1当 量)を,ア クセ プ ター 糖 に はエ チ ルチ オ

β-D-グル コ シ ド(16,6当 量)を 用 い た.A.nigerの

酵 素は精 製 品 を用 い,反 応 はバ ッフ ァー とア セ トニ ト

リル=1:1の 反応 液 中 にお い て37。Cで 行 った .酵 素

添 加 量 は,そ れ ぞれ の ρ一ニ トロ フ ェニ ル化 基 質 に対

す る加水 分解 活性 単位 で 同量 に なる よ うに した.そ の

結果,い ず れ も主生成 物 と して イ ソマ ル トー ス誘導 体

(17,18,19)を 生成 し,ま た,1と16お よび2と16

の反 応 では副 生成 物 と してマ ル トー ス誘導体(20 ,21)

が確 認 で きた(Fig.2).い ず れ の反応 にお いて も,三

糖以 上 の オ リゴ糖 の生 成 は確 認で きなか った.イ ソマ

ル トシ ドや マ ル トシ ド(生 成 率約20%)に 比 べ ,そ

の非 還元 性 末端2-お よ び3-デ オ キ シ体 につ い て は約

60%と い う非 常 に高 い生 成率 が 得 られ た.酵 素 の添

加量 を増 や して もこれ らデ オキ シ2糖 の加 水分 解率 は

上 昇 せ ず,や は り高 い オ リゴ糖 生 成 率(約60%)を

保 って いた.こ の原 因 と して は,イ ソマ ル トシ ドや マ

ル トシ ドはA.nigerのα-グ ル コ シダーゼ に よ り速 や か

に加 水分 解 され るが,こ れ らの デオ キ シ体 は酵 素 に よ

る加 水分 解 を受 け に く く,そ の ため反応 液 中 に蓄積 し

て行 くため であ る と考 えてい る.デ オキ シオ リゴ糖 の

酵素 合成 につ い ては,中 野 らに よっ て もA.nigerのα-

グル コシ ダーゼ のデ オキ シグル コー ス縮 合 反応 を利 用

して検討 されて お り,や は り良好 な結果 が 得 られて い

る29〕.

　上 記の 結果 は,デ オキ シ糖 を認識 し作 用 で きる グ リ

コシ ダーゼの 糖転 移 反応が,化 学 合成 で は難 しいデ オ

キ シ オ リゴ糖 類 の合成 に利 用 で きる こ とを示す もの で

あ る.

リ パ ー ゼ に よ る 糖 エ ス テ ル 合 成 に

及 ぼ す 基 質 糖 水 酸 基 の 立 体 配 置

の 影 響 に つ い て

　リパ ーゼ(EC3.1」.3)は トリ グリセ リ ドの エ ステ

ル結 合 を加水 分解 す る酵 素 で あ り,微 生 物 か ら高等動

植物 に至 る まで さ まざ まな生物 に見い だ されて いる.

本酵 素 は三大 消化(加 水分 解)酵 素 の一 つ であ り,他

の二 つの ア ミラーゼ やプ ロテ アーゼ と同様 に,工 業 用

酵素 と して開 発 され油脂 分 解 な どに利用 されて い る.

リパ ーゼ の反 応 は可逆 的で あ り,反 応系 の水 分 を減 ら

す こ とに よ りエ ステ ル結 合 の生 成 を触媒 す る,ま た,

エ ステ ル交換 反応 を も触 媒 し,こ の 反応 は油 脂 の改 質

51糖水酸基がα-グリコシダーゼとリパーゼに及ぼす影響

に利 用 されて い る.リ パ ー ゼ は基 質 の立体 お よび反応

位 置 に対す る特 異性 が きわ めて高 い こ とや有機 溶媒 に

対 して比較 的安 定 であ る こ とか ら,有 機溶 媒 中で不 斉

触 媒 として使 用 され,そ の エス テル交 換反 応 に よっ て

さ まざ まな光学 活性 アル コール やエ ス テルの合 成 が検

討 され多 くの成 果 が挙 げ られ て い る.最 近 の10年 間

をみ て も,リ パ ー ゼ を用 い た光学 活性 アル コール やエ

ス テル の 合成 に 関 して膨 大 な 数 の報 告 が な され てお

り,ま た,優 れた総 説 やそ れ らを ま とめ た冊子 もた く

さん 出 されて い る.

　糖 もア ル コール の一種 で あ り,リ パ ーゼの基 質 に な

る こ とか ら,そ のエ ス テル交 換反 応 を利用 した部分 エ

ス テル 化糖 の酵 素 合 成 が さか ん に検 討 され 報 告 され

た30-45).それ らの多 くは,特 定 の糖 誘 導体 に つ い て行

われ た もので,糖 分 子構造 とエ ステ ル化 の位置 特異 性

に関す る規 則性 につ い て はあ ま り触 れ られて い ない.

そ こで本研 究 では,リ パ ー ゼの エス テル交 換反 応 に よ

る糖 エ ス テル合 成 にお いて,用 い る糖 の構 造 の違 いが

それ らの2-3位 の2級 水 酸基 の エス テル化 に及 ぼ す影

響 につ い て調べ るこ とに した.ま た,リ パ ーゼの 反応

に よって得 られた糖 エ ス テル を利 用 し,高 度 デ オキ シ

糖 の化 学合 成 につ いて も検討 した.

1.リ パ ーゼ に よる糖 の エ ステル 化 反応 に及 ぼ す基

質 糖構 造 の影響46)

　リパ ーゼ に よ る糖 エ ス テ ル合 成 の基 質 と して は,

Fig.3に 示 した6位 トシル化 メ チル グル コ シ ド,ガ ラ

ク トシ ド,マ ンノ シ ドのα,β 両 ア ノマ ー体 の 合 計6

種(22-27)を 用 い た.6位 水 酸 基 を トシ ル化 した の

は一級水 酸 基保護 の意味 だ けで な く,デ オ キ シ化,ア

ミノ化,ハ ロゲ ン化 な どが容 易 に行 え,さ ま ざま な6

位置 換 誘導体 を作 る こ とが で きるか らであ る.リ パ ー

ゼ につ い ては,主 業 用 に開発 され市販 され てい る微 生

物 由来 の粗 酵素 製剤 を使 用 し,反 応 は ア シル ドナー で

もあ る ビニル アセ テー ト中での非 水系 で行 った.反 応

は,500mgの 基 質 を含 む10mLの ビニ ル ア セ テ ー ト

中に リパ ーゼ製剤19を 加 え,45℃ でマ グ ネテ ィ ック

ス ター ラー によ り撹 拝 しなが ら行 った.

　α-グル コシ ド(22)を 基質 と して用 い,5種 類 の リ

パ ー ゼ製 剤 につ い て上 記 反 応 を行 った と ころ,Pseu

domonas cepacia由 来 の酵素 剤 であ る リパ ーゼPS(天

野 エ ンザ イム)の 反 応効 率が 最 も高 か った.そ こで,

以 降 の実 験 で は,す べ て リパ ー ゼPSを 用 い る こ と と

した.Table5は,各 誘 導 体 につ い て 反 応 を行 い,基

質 が ほぼ消失 した時 点 で得 られ た生成 物 の種 類 と収率

につい て示 した もので あ る.い ず れ の グ リコ シ ドにつ

い て もモ ノ ア セ チ ル体 が 主 生 成 物 と して得 られ,α-

Fig. 3. Structures of substrates used in this study.

Table 5. Lipase PS-catalyzed acetylation of a- and ƒÀ-anomers of the glucoside (22 and 23), mannoside (24 and 25),

and galactoside (26 and 27) derivatives.

aDetermined by HPLC analysis. Column: Shodex C-18 (4.6 X 150 mm); eluent: 55: 45 acetonitrile-H20 (22, 23, 25, 26 and 27), 40 : 60 acetonitrile-H20 (24). 6As determined by 'H-NMR. Obtained by column chromatography on silica gel. dMonoacetatee eMixture of 2-O -acetate and 3-O -acetate.

52 J. Appl. Glycosci., Vol. 49, No. 1 (2002)

ア ノ マ ー で は2位 の,β-ア ノマ ー で は3位 の水 酸 基

が優 先 的 に アセ チ ル 化 され て い た.し か し,α-ガ ラ

ク トシ ド(26)に つ いて は ジアセ テ ー トもか な りの量

が 生成 して い た.各 グ リ コ シ ドと も,α-ア ノ マ ー よ

りもβ-アノマ ーの 方 が 反 応 速 度 が 高 く,ま た,マ ン

ノシ ドは グル コシ ドや ガラ ク トシ ドに比 べ て反応 性 が

低 か った.こ れ らの こ とは,本 リパ ーゼ に よる単 糖誘

導体 の2-3位 水酸 基 のエ ス テ ル化 の位 置 につ い て は1

位水 酸基 の立 体 が,位 置 特異 性 の 高 さ につ いて は2-3

位水 酸基 の立 体 が,そ して反応 速度 につい て は両者 が

そ れぞ れ影響 してい る こ とを示 してい る.エ ス テ ル化

の速 度 お よび位置 特異 性 の高 さ関 し,グ ル コシ ドにお

い て 最 も良 い 結 果 が 得 られ,2一 ア セ テ ー トと3.ア セ

テ ー トがα-ア ノマ ー(22)お よびβ-ア ノマ ー(23)

か らそ れぞ れ ほぼ定量 的 に得 られ た.こ の よう に,リ

パ ーゼ が 自然 界 で最 も多 く存在 す る グル コース の構造

に対 して きわめ て高 い特異 性 と反応 性 を示 す こ とはた

ん な る偶 然 であ ろ うか,そ れ とも何 らかの 意味 が ある

の であ ろ うか,大 変興 味 が持 たれ る ところで ある.

2.リ パ ーゼ反 応 で合成 した部 分 ア セ チル化 糖 を原

料 と して用 い た高度 デ オキ シ糖 の化学 合成47)

　糖 の特 定 の水酸 基 を他 の原子 や 官能基 で 置換 した誘

導体 を化 学合 成 す る場 合,原 料 糖 の水 酸基 群 を部分 的

に保 護 す る ことが しば しば必 要 とな る.糖 水 酸 基 の部

分保 護 につ いて は,従 来 か ら さま ざまな方 法が検 討 さ

れ てお り,そ の 中で も有機 ス ズ試薬 を用い た方 法 は選

択性 ・収 率 ともに優 れ てい る.し か し,有 機 スズ につ

い て は,そ の毒性 や環 境 ホ ルモ ン と しての 有害性 が 指

摘 され てい る.リ パ ーゼ を利 用 した部 分保 護糖 の酵 素

合成 は,そ の簡便 性 と安全 性 か ら化 学 試薬 を用 い る方

法 に とって変 わ り有 用 な手段 にな る もの と思 わ れる.

こ こで は,上 記 の リパ ーゼ に よるエ ス テル交換 反応 に

よ り,β-グ ル コ シ ド(23)か ら定 量 的 に合 成 す る こ

と が で き た 部 分 ア セ チ ル 化 糖3-O-acetyl-6-O-(P-

tolylsulfonyl)-β-glucopyranoside(28)を 出 発 原 料 と し

て 用 い,Chromomycin48),Chlorothricin49),そ し てOlivo

mycin50)な ど数多 くの 天 然 生物 活 性 物 質 中 に構 成 成 分

と して見 出 され る2,6-ジ デ オ キ シーD-アラ ビノーヘ キ ソ

ピラノ ース(29)5卜53)や,そ の他2,4-ジ デ オキ シーD-ス

レオーヘ キ ソ ピラ ノ ー ス(30)54),2,4,6-ト リデ オ キ シ.

D-ス レオーヘ キ ソ ピ ラノ ー ス(31)と い っ た高 度 デ オ

キ シ糖 の化 学合 成 につ い て 検 討 した(Fig.4).2,6-ジ

デ オキ シ糖(29)は,2位 水 酸 基 の フ ェ ノキ シチ オ カ

ル ボニ ル化 → ラ ジ カル還 元 に よ る2位 デ オキ シ化 →4

位 水酸 基 の アセチ ル化→ 還 元 に よる6位 デ オキ シ化 と

それ に続 く脱 ア セチ ル化→ グ リコ シ ドの加水 分 解 の5

工 程 に よ り,28か ら全 収 率約37%の 好 収 率 で合 成 で

きた.2,4-ジ デオ キ シ糖(30)は,2,4位 水酸 基 の フェ

ノ キ シチ オ カル ボニ ル化 → ラ ジ カル還 元 に よ る2,4位

デ オキ シ化 →6位 の脱 トシ ル化 → グ リコ シ ドの加水 分

解 の4工 程 に よ り,28か ら全 収 率約40%の 好 収 率 で

合 成 で きた.ま た,2,4,6-ト リデオ キシ糖(31)は,2,4

位 水 酸基 の フェ ノキ シチ オカ ルボ ニル化 → ラ ジカル還

元 に よる2,4位 デオ キ シ化→ 還元 に よる6位 デ オキ シ

化 とそれ に続 く脱 ア セチ ル化 → グ リコシ ドの加水 分解

の4工 程 に よ り,28か ら全 収 率 約28%の 好 収率 で合

成で きた.

　以 上の ように,リ パ ー ゼに よ り合 成 した部 分 アセ チ

ル化糖 を用 い,簡 便 かつ好 収率 で各 種 の高度 デ オキ シ

糖 を合 成 す る こと に成功 した.こ れは,リ パ ー ゼ反応

Fig. 4. Syntheses of highly deoxygenated monosaccharides from compound 28 .

53糖水酸基がα-グリコシダーゼとリパーゼに及ぼす影響

の糖誘導体合成への有用性を示すものである.

　このたびは栄誉ある日本応用糖質科学会奨励賞をい

ただき,誠 にありがとうございました.身 に余る光栄

と存じます.岡 田嚴太郎会長,谷 口 肇副会長,三 橋

正和副会長,南 浦能至副会長,ご 推薦いただきました

東日本支部長の坂野好幸先生,な らびに学会賞受賞選

考委員の諸先生方に厚 くお礼申し上げます.ま た,ご

支援を賜 り,そ して貴重な酵素をご提供下さいました

北海道大学農学部の千葉誠哉先生,木 村淳夫先生,さ

まざまなご支援を賜 りました同大学の松井博和先生に

心より感謝申し上げます.ま た,本 研究を遂行するに

あたり,終 始暖かいご支援ご指導を賜 りました日本大

学生物資源科学部の奥 忠武先生,伊 藤定一郎先生,

研究プロジェクトに入れていただきご支援を賜 りまし

た同学部 ・生命科学研究所長の別府輝彦先生,な らび

に貴重なご助言を賜りました同学部の山崎真狩先生,

石津 敦先生に深 く感謝申し上げます.ま た,研 究プ

ロジェクトに入れていただき,さ らに各種の機器分析

においてご協力を賜 りました国立医薬品食品衛生研究

所の宮田直樹先生,栗 原正明先生,な らびに理化学研

究所の中田 忠先生,高 月 昭先生に深く感謝申し上

げます.ま た,貴 重な酵素をご提供下さいました天野

エンザイム(株)の住田光夫氏,な らびに機器分析におい

てご協力いただきましたバリアンテクノロジージャパ

ンの串田克彦氏,清 悦久氏,渡 辺裕之氏の各氏にお

礼申し上げます.

　本研究は,日 本大学生物資源科学部農芸化学科生物

有機化学研究室の大学院学生と共に行ったものであり

ます.精 力的に研究に取 り組み協力してくれました三

宅弥生 さん(現 ・加藤美蜂園本舗(株)),袴田 航氏

(現 ・理化学研究所),藤 倉 勉氏(現 ・キューピー

(株)),金 井知香さん(現 ・宮島醤油(株)),および積極的

に研究に協力 してくれました石井 圭氏(現 ・北興化

学工業(株)),安田真紀さん(現 ・曽田香料(株))の各氏

に感謝の意を表します.

文 献

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(2001年8月30日 受 付)