centro universitário feevale programa de pósgraduação em...
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Centro Univer sitár io Feevale Programa de PósGraduação em Gestão Tecnológica
Mestrado em Qualidade Ambiental
GRAZIELA MARIA SCHUH
ESTUDO DA INSTABILIDADE GENÔMICA CAUSADA POR VÍRUS,
DROGAS ANTIRETROVIRAIS E OUTROS FATORES AMBIENTAIS EM
PACIENTES HIV POSITIVO
Novo Hamburgo, 2007
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Centro Univer sitár io Feevale Programa de PósGraduação em Gestão Tecnológica
Mestrado em Qualidade Ambiental
GRAZIELA MARIA SCHUH
ESTUDO DA INSTABILIDADE GENÔMICA CAUSADA POR VÍRUS,
DROGAS ANTIRETROVIRAIS E OUTROS FATORES AMBIENTAIS EM
PACIENTES HIV POSITIVO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Gestão Tecnológica como requisito
para a obtenção do título de mestre em Gestão
Tecnológica: Qualidade Ambiental
Orientador: Prof. Dr. Sharbel Weidner Maluf
Novo Hamburgo, 2007
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DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Bibliotecária responsável: Rosângela Terezinha Silva – CRB 10/1591
Schuh, Graziela Maria Estudo da instabilidade genômica causada por vírus, drogas anti
retrovirais e outros fatores ambientais em pacientes HIV positivo / Graziela Maria Schuh – 2007.
XX f. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado em Qualidade Ambiental) – Programa de PósGraduação em Gestão Tecnológica: Mestrado em Qualidade Ambiental Impacto Biológico, Centro Universitário Feevale, Novo Hamburgo, 2007. Inclui bibliografia e apêndice. “Orientador: Prof. Dr. Sharbel Weidner Maluf”.
1. Pessoas HIVPositivo. 2. Antiretrovirais. 3. Genotoxicidade. I. Título.
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GRAZIELA MARIA SCHUH
ESTUDO DA INSTABILIDADE GENÔMICA CAUSADA POR VÍRUS,
DROGAS ANTIRETROVIRAIS E OUTROS FATORES AMBIENTAIS EM
PACIENTES HIV POSITIVO
Dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora em 28 de fevereiro de 2007,
conferindo ao autor o título de mestre em Gestão Tecnológica: Qualidade Ambiental.
Componentes da Banca Examinadora:
...................................................................... Prof. Dr. Sharbel Weidner Maluf
FEEVALE Orientador
...................................................................... Prof. Dr. Bernardo Erdtmann
UFRGS Examinador
...................................................................... Prof. Dr. Luciano Basso da Silva
FEEVALE Examinador
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por estar sempre ao meu lado, mostrando o caminho a seguir.
À minha família, agradeço a compreensão e todo o amor dedicado para que eu pudesse concluir
mais uma etapa profissional.
Ao Dr. Sharbel pela incansável dedicação para que este trabalho pudesse ser realizado, sempre
mostrando a direção a ser tomada nos momentos de dúvidas.
E não poderia esquecer dos grandes amigos que fiz ao longo do Curso Mestrado em Gestão
Tecnológica: Qualidade Ambiental, pela amizade e companheirismo.
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RESUMO
O vírus HIV pode causar mutações nas células infectadas, proporcionando maior risco para o
desenvolvimento de tumores. Este trabalho teve como objetivo geral avaliar a freqüência de
instabilidade genômica causada por vírus, por drogas antiretrovirais e outros fatores ambientais
através da técnica de micronúcleos com bloqueio da citocinese e ensaio cometa, em indivíduos HIV+
sem o com o uso de drogas ARVs e como objetivos específicos: avaliar o efeito genotóxico da
contaminação viral através dos índices de dano de DNA medidos pelas técnicas de micronúcleo e
cometa; avaliar o efeito das drogas através dos índices de dano de DNA medidos pelas técnicas de
micronúcleo e cometa; avaliar o efeito genotóxico de outros fatores como idade, sexo e tabagismo em
indivíduos HIV+ com e sem uso de ARVs e no grupo controle através dos índices de dano de DNA
medidos pelas técnicas de micronúcleo e cometa. A amostra constou de um total de 135 indivíduos.
Foram realizadas as técnicas do cometa e de micronúcleos com o bloqueio da citocienese. Os valores
desta avaliação, assim como outros parâmetros, como a carga viral (CV) e a taxa de TCD4+ foram
analisados e relacionados com o uso de drogas e outros fatores ambientais. Os dados demonstraram
que os pacientes HIV+ sem ARVs apresentam os maiores níveis de dano de DNA pela técnica do
cometa, quando comparados com os controles (p=0,007), demonstrando um efeito genotóxico da carga
viral, que apresentouse elevada em relação aos pacientes em tratamento (p<0,001). A taxa de TCD4+
não apresentou diferença estatisticamente significativa entre os grupos HIV+ sem e com medicação.
As drogas, quando analisadas individualmente, não apresentaram um efeito genotóxico detectável
pelas nossas avaliações. Entre os pacientes HIV+ com ARVs, os fumantes apresentaram uma
freqüência de micronúcleos estatisticamente maior do que os não fumantes (p=0,020), indicando um
possível efeito sinérgico entre as drogas ARVs e o tabagismo. Este achado é importante para o
7
aconselhamento dos pacientes no sentido de melhorar sua qualidade de vida e evitar outros problemas
secundários de saúde, como o desenvolvimento de neoplasias, que pode ser causado pelo acúmulo de
mutações. Não ficou evidenciado, neste estudo, a influencia do sexo e da idade nos índices de dano de
DNA.
Palavraschave: vírus HIV, drogas antiretrovirais, genotoxicidade, técnica de micronúcleo, técnica do
cometa.
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ABSTRACT
The human immunodeficiency virus (HIV) may cause mutations in infected cells. The general
objective of the present study was to evaluate the frequency of genomic instability caused by virus,
antiretroviral drugs
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Key words: human immunodeficiency virus (HIV), antiretroviral drugs, genotoxicity, micronucleus technique, comet technique.
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LISTA DE ABREVIATURAS
APRT Adenina fosforribosiltransferase ARVs Antiretrovirais AZT Zidovudina BPDE Benzopirenodiolepóxido CBMN Técnica de micronúcleo com bloqueio da citocinese CCI Câncer cervical invasivo CEP Comitê de ética da Feevale CONEP Conselho nacional de pesquisa CV Carga Viral d4T Stavudina ddI Didanosina DNA Ácido desoxirribonucléico DSTs Doenças sexualmente transmissíveis EBV Vírus EpsteinBarr EFV Efavirenz FDA Food and drug administration HBV Vírus da hepatite B HIV Vírus da imunodeficiência adquirida HPRT Gene hipoxantinaguanina fosforribosiltransferase HPV Papilomas vírus ICPEMC Comissão internacional de proteção a mutágenos e
carcinógenos ambientais KSHV Herpes vírus do sarcoma de l
l
m
omotodei ans r HPRT
F
om c
11
PHA Fitohemaglutinina Pis Inibidor da protease PN Ponte nucleoplasmática RNA Ácido ribonucléico SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida SK Sarcoma de Kaposi TK Timidina quinase UVA Ultravioleta A UVB Ultravioleta B 3TC Lamivudina
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Ensaio de MN com bloqueio da citocinese..................................... 30
Figura 2 Técnica do Cometa......................................................................... 46
13
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 FDA (Food and Drug Administration) Agentes Anti
Retrovirais Aprovados, Maio 1999................................................................. 36
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Características da amostra estudada...................................................... 42
Tabela 2 Freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e índice de DNA do Ensaio Cometa em 100 células dos grupos Controle e pacientes HIV+..................................................................................................... 47
Tabela 3 Freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos Controle e pacientes HIV+ sem medicação e com medicação................... 48
Tabela 4 Comparação da taxa de células TCD4+ e Carga Viral (CV) entre os grupos HIV+ sem e com medicação....................................................................... 49
Tabela 5 Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos Controle e pacientes HIV+ sem medicação e com medicação em relação ao sexo........................................................................................................ 49
Tabela 6 Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo controle em relação ao sexo..................................................................... 50
Tabela 7 Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ em relação ao sexo........................................................................ 50
Tabela 8 Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem medicação em relação ao sexo............................................... 50
15
Tabela 9 Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ com medicação em relação ao sexo.............................................. 50
Tabela 10 Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos HIV+ sem e com medicação e controle em relação ao tabagismo................................................................................................................ 51
Tabela 11 Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem e com medicação em relação ao tabagismo............... 52
Tabela 12 Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo controle em relação ao tabagismo............................................... 52
Tabela 13 Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem medicação em relação ao tabagismo.......................... 52
Tabela 14 Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos HIV+ com medicação em relação ao tabagismo...................... 53
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 18
1.1 – Dano de DNA em populações humanas........................................................ 18
1.2 Exposição a agentes genotóxicos no ambiente............................................... 22
1.3 – Fatores que podem influenciar na freqüência de mutações........................... 23
1.3.1 – Idade............................................................................................................ 23
1.3.2 – Sexo............................................................................................................. 24
1.3.3 – O hábito de fumar....................................................................................... 24
1.3.4 – Bebidas alcoólicas....................................................................................... 25
1.4 – MÉTODOS DE DETECÇÃO........................................................................ 27
1.4.1 – Micronúcleo (MN), Pontes Nucleoplasmáticas (PN) e Buds..................... 27
1.4.2 – Técnica do Cometa..................................................................................... 30
1.5 – SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA (SIDA)................ 32
1.6 – DROGAS ANTIRETROVIRAIS (ARVs)................................................... 36
1.6.1 – AZT............................................................................................................. 37
1.6.2 – AZT+3TC................................................................................................... 39
1.6.3 – d4T.............................................................................................................. 40
1.6.4 – EFV............................................................................................................. 40
2 – OBJETIVOS..................................................................................................... 41
2.1 – Objetivo Geral................................................................................................ 41
2.2 – Objetivos Específicos..................................................................................... 41
3 – MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 42
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3.1 – Delineamento................................................................................................. 42
3.2 – Procedimentos................................................................................................ 43
3.2.1 – Técnica de Micronúcleo com Bloqueio da Citocinese (CBMN)................ 43
3.2.2 – Técnica do Cometa..................................................................................... 45
4 – RESULTADOS................................................................................................. 47
4.1 – Sexo................................................................................................................ 49
4.2 – Idade............................................................................................................... 51
4.3 – Fumo.............................................................................................................. 51
5 – DISCUSSÃO.................................................................................................... 56
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 59
ANEXOS................................................................................................................ 74
Anexo I: Termo de Consentimento Informado....................................................... 74
Anexo II: Questionário de Saúde Pessoal............................................................... 75
18
1 INTRODUÇÃO
1.1 Dano de DNA em populações humanas
O DNA carrega um código genético para aminoácidos, com cada aminoácido sendo representado
por uma seqüência de três bases de DNA. Estes tripletes de bases são chamados de códons. A ordem
de códons na seqüência de DNA reflete na ordem dos aminoácidos unidos em uma cadeia de proteína.
A seqüência completa de DNA necessária para determinar a seqüência de aminoácidos de uma única
proteína é chamada de gene (Kreuzer e Masey, 2002). Nas células, o DNA está localizado dentro dos
cromossomos, no núcleo. O DNA contém as instruções para a produção de todas as proteínas do
corpo. No entanto, as proteínas são produzidas nos ribossomos localizados no citoplasma. Depois que
a seqüência de bases de um gene (DNA) é copiada no RNA mensageiro, este mRNA viaja até o
ribossomo, onde seu código é traduzido em uma proteína. O passo de tradução é realizado por um
segundo tipo de RNA, chamado de RNA transportador (tRNA). O tRNA combina os aminoácidos
corretos aos códons do mRNA, e os aminoácidos são ligados uns aos outros para formar a nova
proteína (Kreuzer e Masey, 2002).
Como entre outros genomas, o DNA do genoma humano não é uma entidade estática. Ao
contrário, ele está sujeito a diferentes tipos de mudanças hereditárias (mutações). Anormalidades
cromossômicas de grande escala envolvem a perda ou o ganho de cromossomos ou a quebra e a
reunião de cromátides. Mutações de menor escala podem ser agrupadas em diferentes classes de
mutações e podem, também, ser categorizadas com base se elas envolvemse numa única seqüência de
DNA (mutações simples) ou se elas envolvemse em trocas entre duas seqüências alélicas ou não
alélicas (Strachan e Read, 2002).
19
O DNA, molécula que carrega a informação genética, possui estabilidade química limitada.
Alterações do material genético podem resultar de radiações externas, genotóxicos químicos no
ambiente, infecções virais e, tanto de origem exógena, quanto endógena (Maluf e Erdtmann, 1999).
As alterações que ocorrem no DNA são denominadas como mutações. Elas podem ser resultado
tanto de erros durante a duplicação do DNA, na divisão celular, quanto de danos causados por agentes
externos diretamente no DNA. Ocorrem em todos os seres vivos, sendo fundamentais para a evolução
e diversificação das espécies (Ribeiro et al., 2003; Silva et al., 2003).
Muitas vezes a mutação causa mudanças não detectáveis, ou então determina a morte celular.
Somente quando ocorrem em genes específicos podem evoluir para um crescimento celular
desordenado (Ribeiro et al., 2003; Silva et al., 2003). Genes específicos são aqueles que estão relacionados com a estimulação e inibição da proliferação celular. E, somente quando há um
determinado número de alterações nesses genes, é que surgem as células neoplásicas, já que os danos
no DNA além de irreversíveis são cumulativos. Os agentes mutagênicos podem acelerar ou aumentar o
aparecimento de mutações que se associam ao surgimento de neoplasias (Ribeiro et al., 2003).
A exposição a agentes genotóxicos no meio ambiente pode produzir uma ampla variedade de
efeitos na saúde humana. Alguns destes efeitos aparecem imediatamente, enquanto que outros indicam
evidências muitos anos depois. Sabese que efeitos tardios incluem carcinogênese e doenças genéticas
que podem afetar gerações futuras e desenvolvendo incapacidades (Au, 1991).
Em várias síndromes raras, a instabilidade genética, expressa como instabilidade
cromossômica, é conhecida. Pacientes com estas síndromes têm predisposição a câncer. Evidências
têm sido acumuladas, mostrando que instabilidade cromossômica ocorre em algumas outras doenças,
embora a freqüência não seja tão elevada. Instabilidade genética pode induzir a um evento mutacional
em genes cujo homólogo tenha uma alteração congênita, ou pode induzir dois eventos de mutação
nestes genes em indivíduos não portadores desta alteração, levando ao desenvolvimento de uma
neoplasia na célula alvo. É altamente provável que a instabilidade genética na população humana não
se expresse como "presente ou ausente" nos indivíduos. Graduações de instabilidade genética podem
20
existir por uma variedade de causas. Ocorrendo uma lesão no DNA nas células de pessoas com
sistema de reparo deficiente, haverá pouco ou nenhum reparo, logo, maior freqüência de aberrações
cromossômicas. Quando as células de indivíduos com o sistema de reparo deficiente são expostas a
agentes clastogênicos, podemse observar aumento das taxas de aberrações cromossômicas, quando
comparadas a pessoas com maior estabilidade genética (Hsu, 1983).
A ativação de oncogenes e o conhecimento atual sobre as síndromes de instabilidade
cromossômica mostram que tanto mutações gênicas como aberrações cromossômicas são importantes
para iniciar o processo carcinogênico. Um agente pode produzir alterações genéticas em um
determinado tecido sem produzir câncer, dependendo da alteração e do tecido. Uma aberração
cromossômica pode ser irrelevante a nível de epitélio, mas significante na medula óssea, e viceversa.
Isto tem implicações vitais para a genética toxicológica: (1) tanto mutações gênicas como aberrações
cromossômicas devem ser medidas, e (2) agentes carcinogênicas podem ser mutagênicos em tecidos
em que não causam câncer (Heddle, 1991).
Existe uma variação na freqüência de alterações cromossômicas entre indivíduos saudáveis e,
células do mesmo doador podem mostrar diferentes níveis de aberrações em diferentes períodos.
Informações variadas vêm sendo reunidas e parece quase impossível encontrar indivíduos
completamente não expostos, porém é necessário, tanto quanto possível, conhecer a freqüência
espontânea normal, suas variâncias e os fatores que a influenciam (Ganguly, 1993).
Além disso, existem indivíduos que apresentam uma freqüência de alterações citogenéticas
elevada, sem estarem, aparentemente, expostos a agentes mutagênicos fora do padrão normal. Parece
existir um gradiente de instabilidade genética, com as síndromes de instabilidade cromossômica
representando o extremo do espectro. Indivíduos que apresentam aumento na freqüência de alterações
cromossômicas nas células cultivadas sem qualquer indução, mostram uma sensibilidade maior
quando submetidos a um "stress" mutagênico. Isto foi testado pela exposição de fibroblastos em
cultura a uma variedade de agentes mutagênicos. Foi usada irradiação com UV como agente físico, e
químicos selecionados que agem por diferentes mecanismos genotóxicos, como mitomicina C (MMC),
NmetilNnitroNnitrosoguanina (MNNG), e benzopirenodiolepóxido (BPDE) (Rümmelein et al., 1992).
21
O aumento de instabilidade cromossômica está bem documentado em quatro doenças
autossômicas recessivas associadas com alto risco de câncer: anemia de Fanconi, síndrome de Bloom,
xeroderma pigmentosum e ataxia telangiectasia. Apesar das diferenças clínicas e genéticas entre estas
quatro doenças, elas são, muitas vezes, tratadas juntas, não só pelo aumento na freqüência de
alterações cromossômicas, como também pelo risco aumentado dos pacientes desenvolverem câncer
(Schroeder, 1982; Heim et al.,1992).
German (1969) sugere que xeroderma pigmentosum e síndrome de Down sejam chamadas de
"síndromes de instabilidade cromossômica condicional", por que as taxas de aberrações
cromossômicas espontâneas nestas duas síndromes não são elevadas, mas as taxas de aberrações
induzidas por exposição mutagênica são mais altas que em células normais. A síndrome de Down é a
anormalidade cromossômica mais comum no homem, sendo a principal causa de retardo mental.
Caracterizase pela trissomia do cromossomo 21 e ocorre com uma freqüência de 1/700 nascidos
vivos. A predisposição dos indivíduos portadores desta síndrome para desenvolver leucemia é bem
conhecida (Heidemann et al., 1985).
A anemia de Fanconi caracterizase como uma doença autossômica recessiva, envolvendo
pancitopenia progressiva e uma série de malformações congênitas em vários sistemas, como o sistema
nervoso central, musculoesquelético, urogenital, renal, tegumentário, cardíaco, ocular, auditivo e
gastrointestinal, e prédisposição ao desenvolvimento de câncer, especialmente leucemia mielóide
aguda (LMA) (Fanconi, 1927; Auerbach e Allen, 1991). Alguns distúrbios mitóticos, como pontes
entre núcleos, fragmentos aberrantes e micronúcleos foram observados em medula óssea de pacientes
com anemia de Fanconi, já em 1966, por Schroeder. Tem sido sugerido que uma deficiência no
sistema de reparo ou processamento de DNA danificado esteja associado a um aumento na incidência
de câncer, e também com várias anormalidades clínicas. Um aumento no nível de aberrações
cromossômicas espontâneas tem sido detectado em cultura de linfócitos e fibroblastos obtidos de
pacientes com anemia de Fanconi (Schroeder et al., 1964; Zakrzewski e Sperling, 1989; Arwert e Kwee, 1989; Natarajan et al., 1989).
22
Em adição, instabilidade cromossômica tem sido descrita em pacientes com variados tipos de
câncer (Hsu et al., 1985; Delhanty et al., 1983). Em fibroblastos cultivados, de pacientes com melanoma, foi descrito um aumento espontâneo nas taxas de micronúcleos e um aumento na
sensibilidade a UVA e UVB, quando comparados a controles normais (Roser et al., 1989).
1.2 Exposição a agentes genotóxicos no ambiente
A espécie humana tem atravessado sua evolução sendo exposta a uma infinidade de
genotóxicos pela ingestão de alimentos e bebidas (contaminantes naturais da dieta), e pela inalação de
fumaças e irradiações diversas do meio ambiente. A análise de alterações citogenéticas devidas a
fatores genotóxicos em uma população requer um valor "normal" de micronúcleos para ser usado
como referência da taxa de mutação basal. Esse valor já estaria influenciado por vários fatores, alguns
destes endógenos, outros exógenos (Koteles, 1993), como estilo de vida, dietas, consumo de fumo e
álcool, várias terapias médicas e até mudanças climáticas (aumento de exposição a radiação
ultravioleta devido à destruição do ozônio atmosférico). Por isso, tornase relevante: (a) determinar
quais são os níveis aceitáveis de dano genético na população humana; (b) identificar indivíduos que
possam ser hipersensíveis a determinadas genotoxinas; (c) testar, de maneira efetiva, os novos
químicos que estão sendo sintetizados para serem lançados no meio ambiente; (d) monitorar,
rotineiramente, indivíduos expostos a agentes que possam ser perigosos a nível genético e (e)
determinar o nível de aumento na freqüência de alterações genéticas em uma população após
exposição acidental (Fenech, 1993).
O tipo de câncer que predomina na população varia em diferentes partes do mundo: câncer de
estômago é o mais freqüente no Japão, câncer de fígado nos países do sudeste asiático, câncer
nasofaringial no sul da China, câncer da cavidade oral na Índia, e câncer de bexiga urinária no Egito.
Suspeitase que as diferenças se devam às condições relativas a estilos de vida particulares, ou por
doenças endêmicas específicas de cada região. Desta maneira, câncer de bexiga urinária no Egito está
relacionado à infecção com Schistosoma mansoni, e câncer da cavidade oral na Índia está relacionado ao hábito de mascar tabaco (Doll, 1977).
23
Investigações epidemiológicas resultaram na formulação da hipótese que pôde ser testada no
laboratório: altos níveis de gordura na dieta aumentam o risco de câncer de mama. Guias de dieta, com
respeito à gordura e câncer, costumam considerar a percentagem total de calorias derivadas da
gordura. Por este caminho, obtevese uma correlação positiva para incidência de morte por câncer de
mama, comparada com a ingestão diária de gordura em populações de diferentes países. Na dieta da
maioria dos países industrializados, o consumo de gordura fica em torno de 40% do total de calorias
diárias, enquanto os guias de dieta recomendam apenas 30%. Resultados de outros estudos
epidemiológicos têm demonstrado correlação entre consumo de gordura e a freqüência de câncer em
outros órgãos, particularmente na próstata e cólon (Renner, 1990).
Durante os últimos dez anos, uma grande variedade de químicos mutagênicos e carcinogênicos
foram sendo detectados nos alimentos, medicamentos, cosméticos, inseticidas e também na atmosfera
e na água que nós utilizamos diariamente. Alguns mutágenos agem diretamente nas células para
produzir mutações, e outros devem ser modificados por enzimas ou outros fatores para se tornarem
cancerígenos. Estes mutágenos indiretos podem ser metabolicamente ativados por enzimas em órgãos
ou tecidos, ou podem ser inativados e inibidos por algum componente de nossa dieta ou por fatores
presentes em nossas células (Kuroda, 1990).
1.3 Fatores que podem influenciar na freqüência de mutações
A seguir seguem alguns fatores que podem influenciar na freqüência de mutações.
1.3.1 Idade
Tem sido demonstrado que a idade afeta significativamente a freqüência da formação
espontânea de micronúcleos ou o dano de DNA em linfócitos de homens e mulheres (Ganguly, 1993).
Anormalidades cromossômicas numéricas surgem, usualmente, devido à nãodisjunção durante a
meiose. Tanto células aneuplóides em mitose como nãodisjunção em meiose aumentam com o avanço
da idade (Nakagome et al., 1984). Alterações cromossômicas estruturais também apresentaram correlação com a idade (Mattevi e Salzano, 1975). O aumento de mutações com a idade pode também
24
ser devido ao acúmulo de DNA lesado não reparado e/ou à diminuição da capacidade de reparar DNA
(Fenech e Morley, 1985b). Com a idade, a proporção de células com falta de cromossomos do grupo
C aumenta em mulheres, e a freqüência de nãodisjunção meiótica aumenta com o avanço da idade
materna (Trimble e Baird, 1978). No homem, a incidência de nãodisjunção pode também aumentar
com o avanço da idade (Matsunaga et al., 1978). Fenech e Morley (1985b) demonstraram uma
correlação positiva na expressão de micronúcleos em linfócitos, com o aumento da idade. O mesmo
sendo encontrado por Koteles et al. (1993) ao monitorarem uma amostra de 188 indivíduos residentes
em uma área urbana industrial.
1.3.2 Sexo
O "Grupo de Estudos Colaborativos para o Teste de Micronúcleos" (The Colaborative Study
Group for the Micronucleus Test, 1986) demonstrou que existem diferenças entre os sexos quanto às
freqüências de micronúcleos induzidas por algumas drogas em eritrócitos de camundongos. Estas
diferenças são específicas, ou seja, cada droga testada se comporta de maneira diferente, dependendo
dos mecanismos de interação das mesmas com o organismo.
O sexo é um fator que deve ser considerado na escolha dos indivíduos controles, apesar de
geralmente não haver diferença significativa quanto à freqüência de aberrações cromossômicas. Para
troca de cromátides irmãs, há tanto estudos que demonstram não haver diferença entre os sexos
(Galloway e Evans, 1975; Crossen et al., 1977; Livingston et al., 1983), quanto os que demonstram haver esta diferença. Margolin e Shelby (1985) encontraram uma diferença estatisticamente
significante de aproximadamente 0,5 % mais alta em mulheres. Um aumento similar em mulheres foi
também encontrado por Soper et al. (1984). Em estudos onde as diferenças esperadas são pequenas, o pareamento dos controles deve respeitar o sexo. Freqüências mais elevadas de troca de cromátides
irmãs foram também encontradas em mulheres grávidas (Sharma e Das, 1986).
1.3.3 O hábito de fumar
25
O hábito de fumar também pode alterar a freqüência de mutações. Fumar causa uma variedade
de problemas no homem. Desta maneira, um quarto a um terço de todos os fumantes morrem como
resultado do seu hábito (Doll e Peto, 1976). Evidências epidemiológicas têm demonstrado claramente
que o fumo está relacionado com carcinoma bronquial (Doll e Peto, 1976). Com respeito à indução de
câncer de pulmão, pode ser observada uma relação doseefeito entre o hábito de fumar e a incidência
da doença (Doll e Peto, 1976). Extratos de cigarros demonstraram ter atividade de iniciadores de
tumor em testes com roedores e em células humanas in vitro (Benedict et al., 1975), e no teste de
Ames são mutagênicos na presença de metabolizador preparado a partir de pulmão e fígado de
mamíferos (Hutton e Hackney, 1975; Mizusaki e cols., 1977). Obe e Herha (1978) observaram que
linfócitos de fumantes mostram um aumento significante de cromossomos dicêntricos, anéis e trocas
cromatídicas, indicando uma forte correlação entre a atividade carcinogênica e mutagênica do cigarro.
Larramendy e Knuutila (1991) observaram um aumento na freqüência de micronúcleos, tanto em
linfócitos B como em linfócitos T8 de fumantes, em relação aos controles. O hábito de fumar aumenta
a freqüência de micronúcleos (Cruz et al., 1994).
1.3.4 Bebidas alcoólicas
Várias bebidas alcoólicas têm sido descritas como contendo substâncias mutagênicas (Loquet et
al., 1981; Bull et al.,1987; Obe e Anderson, 1987), mas as evidências indicam que a atividade mutagênica associada a estes produtos não vem do etanol, mas preferencialmente de outros
componentes derivados dos processos envolvidos na produção de bebidas (Yu et al., 1986; Brusick et al.,1988).
Problema relativo a danos de saúde por exposição química está dirigido aos agentes químicos
produzidos ou concentrados, e de uso intensivo, pelo homem. Contaminantes atmosféricos depositados
no solo e na água participam também, via ingestão de alimentos e da água, do conjunto de substâncias
que podem afetar a saúde humana. Na realidade, modelos de exposição humana são complicados, se
considerarmos a quantidade de agentes simples e de misturas complexas envolvidas. O quadro torna
se mais complicado quando consideramos agentes e exposições agindo sinergisticamente ou
moduladores com efeitos contraditórios de aumento e/ou redução da genotoxicidade. Na avaliação de
26
exposições biologicamente significantes, pode ser mais relevante dar atenção para os primeiros efeitos,
diretamente nos indivíduos ou grupos expostos, do que tentar prever o risco potencial de um modelo
de exposição tão complexo como este. Metodologias aplicáveis ao monitoramento humano ganham
crescente atenção (Sorsa et al., 1990).
A exposição a agentes genotóxicos em nosso ambiente pode causar uma variedade de efeitos
sobre a saúde humana. Alguns deles se expressam imediatamente, enquanto outros levam anos para se
manifestarem. Efeitos tardios bem reconhecidos incluem a indução de câncer, doenças genéticas nas
gerações seguintes, desordens de desenvolvimento, entre outros (Au, 1991). Esforços contínuos têm
sido feitos para identificar os agentes perigosos, reconhecer condições de exposição danosa e
monitorar populações que podem estar sofrendo exposição excessiva, com o objetivo de prevenir
conseqüências adversas sobre a população.
É crescente a preocupação sobre o efeito mutagênico e carcinogênico de agentes genotóxicos
em populações humanas expostas ocupacionalmente, acidentalmente ou por estilo de vida (Carrano e
Natarajan, 1988). Mutação é toda a alteração do material genético de uma célula, que não resulta de
recombinação t
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27
destes estágios, embora existam muitos outros fatores envolvidos. Muitos dos agentes potencialmente
carcinogênicos estão presentes na nossa alimentação e no nosso ambiente. Há evidências convincentes
de que o sítio de ação destes agentes é o material genético celular, sendo que muitos dos carcinógenos
químicos conhecidos atuam via mutações (Wigley, 1987).
A freqüência espontânea de aberrações cromossômicas em recémnascidos é da ordem de 6 por
1000. A análise cromossômica de abortos espontâneos em humanos indica que mais de 50% de todos
os abortos são cromossomicamente anormais (Thompson e Thompson, 1980). Populações expostas à
radiação ionizante e a genotóxicos químicos têm a freqüência de aberrações cromossômicas
aumentada em seus linfócitos. Muitas formas de câncer humano estão associados a aberrações
cromossômicas específicas e nãoespecíficas (Yunis, 1983). Algumas doenças hereditárias humanas,
como as síndromes de instabilidade cromossômica resultam num aumento da freqüência de aberrações
cromossômicas e também estão associadas a um aumento na incidência de câncer. O aumento na
freqüência de alterações citogenéticas em relação a taxa basal da população, pode ser uma indicação
de sensibilidade genética ou de exposição a mutágenos. Estas situações produzem sempre o aumento
do risco de câncer e de doenças genéticas (Carrano e Natarajan, 1988). Segundo Ashby (1991), todos
os produtos que são clastogênicos in vivo são também cancerígenos para o organismo testado.
Nas últimas décadas, a quantidade de produtos químicos produzidos e usados pelo homem
aumentou muito. Estas substâncias podem afetar a saúde humana por sua disseminação no meio
ambiente, mas são os trabalhadores que manipulam rotineiramente estes agentes que constituem o
maior grupo de risco, devido à constante exposição. Testes de mutagenicidade, incluindo
monitoramento citogenético em populações humanas, são de máxima importância para o
conhecimento e prevenção de doenças públicas e ocupacionais (Koteles et al., 1993).
1.4 Métodos de Detecção
1.4.1 Micronúcleo (MN), Pontes Nucleoplasmáticas (PN) e Buds
Dentre os testes que analisam mutações cromossômicas em mamíferos, destacase o teste de
micronúcleos em medula óssea de camundongo (Heddle, 1973), que detecta agentes genotóxicos
28
clastogênicos e os que interferem na formação do fuso mitótico, afetando a distribuição eqüitativa dos
cromossomos na divisão celular. O ensaio serve como primeiro passo no estudo de compostos
mutagênicos, tendo a vantagem de ser mais rápido do que a análise de quebras cromossômicas
(clastogênese), sendo mais eficiente para detectar a perda de cromossomos inteiros (aneugênese)
(Maluf, 1994).
Micronúcleos são fragmentos cromossômicos ou cromossomos inteiros perdidos durante a
divisão nuclear (Migliore et al., 1991). São formados durante a anáfase pela falha da ligação ao fuso mitótico. Derivam de fragmentos de cromossomos ou cromossomos inteiros que foram perdidos
durante esta fase (Norppa, 2003). Na análise microscópica, pela formação de carioteca ao seu redor, é
possível a visualização de um pequeno núcleo que pode ter um diâmetro entre 1/16 e 1/3 do diâmetro
dos núcleos principais. Acreditase que estas estruturas também podem ser formadas na fase S da
replicação celular, através da amplificação gênica, projetando buds nucleares, os quais possivelmente
serão cortados após a telófase (Schubert e Oud, 1997). Já as pontes nucleoplasmáticas representam
cromossomos dicêntricos que tiveram os centrômeros puxados para os pólos opostos da célula em
anáfase. Aproximadamente 60% das amostras que contêm esta difusão também apresentam
micronúcleos, pois quebras são necessárias para que os cromossomos dicêntricos sejam formados e,
ambos ocorrem em células expostas a agentes causadores de quebras no DNA, como radiação
ionizante (Maluf, 2004).
A freqüência de micronúcleos em linfócitos do sangue periférico humano foi estudada por
Countryman e Heddle (1976), que observaram o efeito da radiaçãoX e mitomocina C in vitro, mostrando a possibilidade de se medir dano cromossômico através da análise de micronúcleos em um
tecido de mais fácil acesso, já que, originalmente a técnica de micronúcleos tinha sido descrita apenas
para eritrócitos de medula óssea, em 1975 por Schmid. A dificuldade desta técnica era distinguir as
células que, em cultura, haviam passado por um ciclo de divisão, daquelas que não haviam se dividido,
o que torna difícil quantificar a freqüência de micronúcleos com o propósito comparativo (Maluf,
1994).
A expressão de micronúcleo pode ser conseqüência de aberrações cromossômicas causadas por
quebras de DNA (clastogênese) ou por disfunção de fuso mitótico, caracterizando a perda de
29
cromossomos inteiros (aneugênese) (Surralés, 1992). Além da detecção de eventos clastogênicos e
aneugênicos, o micronúcleo pode expressar amplificação gênica. Com o bloqueio da citocinese, é
possível analisar aquelas células que completaram apenas uma divisão e se apresentaram binucleadas
(Norppa, 2003).
A freqüência de MN nas células humanas iniciou de um critério de testes citogenéticos por
monitorização de populações de risco. O teste de micronúcleo com o bloqueio da citocinese (CBMN)
é o método preferido para mensurar micronúcleos em cultura de células humanas, pois a contagem é
restritamente específica para uma divisão celular. Estas células são reorganizadas pelo aparecimento
de binucleações após a inibição das citocinas pelas citocalasinaB (Maluf, 2004).
Comparando com outra técnica citogenética, o ensaio de MN possui várias vantagens sobre a
quantificação de MN, incluindo a rapidez a facilidade da análise, e sem o requerimento de células em
metáfase (Tucker e Preston, 1996). Diferentes mecanismos podem ser envolvidos na formação do
micronúcleo (Heddle et al; 1983; Evans, 1988) incluindo o rompimento cromossômico (clastogênese)
e ruptura do fuso (aneuploidogênese). As vantagens observadas no ensaio de bloqueio da citocinese é
descrito por Fenech (1997): identificação confiável das células que foram completadas apenas em uma
divisão celular, sensitividade, precisão e detecção de outros pontos finais tal como as pontes
dicêntricas.
Os linfócitos de sangue circulante de mamíferos, inclusive o homem, são um ótimo sistema para
se testar uma substância quanto à sua capacidade em produzir aberrações cromossômicas. A técnica
serve também para o monitoramento de populações expostas a drogas, seja por razões profissionais,
terapêuticas ou por acidente (Natarajan e Obe, 1980). Supondose que haja uma correlação entre o
dano induzido no sangue e em outras células somáticas, os linfócitos serviram como um sistema
sentinela para grupos de alto risco (Nordenson et al., 1984).
Os linfócitos do sangue periférico encontramse em um estágio de repouso, présíntese (G0). Ao
serem colocados em cultura, na presença de fitohemaglutinina (PHA) são estimulados, sintetizam
RNA, proteína e DNA; após cerca de 48 horas estão, na maioria, em sua primeira mitose. A PHA
estimula, principalmente, os linfócitos T, que constituem de 40 a 70% da população total de linfócitos
31
O dano de DNA induzido por agentes genotóxicos depende do transporte entre as
membranas celular e nuc
32
A utilização do ensaio cometa também está sendo desenvolvido em estudos relacionados a
intervenção dietética, no monitoramento do aumento dos danos de DNA resultando em doenças ou
tratamento com drogas genotóxicas e no monitoramento de grupos ou indivíduos expostos a
substâncias genotóxicas devido ao estilo de vida, poluição ambiental ou ocupacional tem aumentado
substancialmente (Faust, 2004).
Geralmente, células com altos níveis de dano de DNA exibem um aumento dos parâmetros de
cometa, cujo pode ser expresso pelo comprimento da cauda, porcentagem de DNA na cauda e o
momento da cauda (comprimento da cauda X %DNA na cauda), ou simplesmente dano alto, médio ou
baixo (Fairbairn et al., 1995).
Os efeitos da interação do DNA com as drogas são observados em diferentes níveis. O primeiro,
o nível mais básico, é a interação química da droga com o DNA dupla hélice. Variedade de técnicas
tem sido desenvolvidas para examinar os níveis de interação, e é mostrada qual a química da interação
que é mais similar do estudo da região exposta do DNA ou das células em cultura. Alcalização de
sítios específicos e seqüências em células podem ser examinadas usando ensaio de clivagem térmica
(Nelson et al., 2004).
1.5 Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA)
A síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) é uma doença retroviral, causada pelo vírus
da imunodeficiência adquirida (HIV), caracterizada por imunossupressão profunda, que leva a
infecções oportunistas, neoplasias secundárias e manifestações neurológicas (Melo, 2002).
As tentativas atuais de terapia gênica para desordens infecciosas são predominantemente
dirigidas ao tratamento de pacientes com SIDA. O agente infeccioso dessa desordem, geralmente fatal,
é uma classe de retrovírus conhecida como HIV1, capaz de infectar linfócitos T auxiliares, um
subgrupo fundamental de células do sistema imune. Duas características do HIV1 o tornam
especialmente mortal: ele acaba por matar as células T auxiliares (tornando os pacientes suscetíveis a
outras infecções) e o próvírus tende a persistir em um estado latente antes de ser subitamente ativado
(a ausência de produção de vírus durante o estado latente complica o tratamento com drogas
33
antivirais). Um problema importante reside no fato de o genoma do HIV estar mutando com uma
freqüência extremamente elevada (Melo, 2002).
A estrutura genômica típica do vírus HIV1 consiste de duas monofitas idênticas de RNA, com
aproximadamente 9,2 kb de comprimento, que, supostamente existe na forma de uma
ribonucleoproteína contendo as enzimas RT, integrase, protease e a proteína p7 de ligação ao RNA
(Peçanha et al., 2002). Envolvendo o genoma, e suas enzimas associadas, há um cerne ou capsídeo
formado pela proteína p24, que está contido em uma matriz protéica (proteína p17) circundante.
Finalmente, a parte mais externa do vírus é formada por um envelope de membrana fosfolipídica
(derivada das células do hospedeiro), contendo proteínas de membrana (gp41 e gp120) – codificadas
pelo genoma viral – que se ligam às moléculas de CD4 da membrana do hospedeiro (Peçanha et al.,
2003).
A infecção se inicia com a ligação das subunidades da proteína gp120 às moléculas de CD4 e
seus coreceptores de quimiocinas. Em seguida há uma alteração conformacional da proteína gp41 que
se insere na membrana celular (fusão peptídica) e induz a fusão da membrana viral com a membrana
celular da célula hospedeira. Ocorre, então, a liberação do genoma viral no citoplasma da célula. A
partir deste momento são ativadas as enzimas virais do complexo nucleoprotéico, iniciandose assim o
ciclo replicativo do HIV. O genoma RNA do vírus é transcrito, pela RT viral, formando o DNA viral
de fita dupla que, juntamente com a integrase viral, penetra no núcleo da célula e, com o auxílio desta
enzima, integrase ao genoma do hospedeiro (Hoffmann et al., 2005).
Em princípio, várias estratégias de terapia gênica poderiam ser utilizadas no tratamento da SIDA.
Como no caso da terapia gênica do câncer, as células infectadas podem ser destruídas diretamente
(pela inserção de um gene codificando uma toxina ou uma pródroga) ou indiretamente, pela
estimulação de uma resposta imune contra elas. Isso, por exemplo, pode envolver a transferência de
um gene que codifica um antígeno de HIV1, como a proteína do envoltório viral gp120, e a sua
expressão de um gene codificando uma citocina, como um interferon. (Strachan e Read, 2002).
A suscetibilidade do hospedeiro depende da entrada do HIV nas células através dos receptores de
superfície CD4 (linfócitos T auxiliares) e das quimiocinas. Entre as células que expressam esses
34
receptores estão os linfócitos T, as células de Langerhans e as células dendríticas e outros macrófagos.
Com exceção dos linfócitos T, as outras células podem ser freqüentemente encontradas na mucosa
genital. Assim situações que aumentam a população local dessas células, tais como traumatismos
repetidos ou doenças sexualmente transmissíveis (DSTs) associadas, aumentam a chance de
transmissão do vírus; por outro lado, pessoas que expressam baixo número de tais receptores de
superfície, ou não os expressam, tem menor chance de serem contaminadas. Dessa forma, indivíduos
homozigotos que apresentam mutação no receptor CCR5 (com deleção no alelo ∆32) podem ser mais
resistentes à transmissão sexual, pois não expressam essa quimiocina na superfície celular dos
macrófagos. Por fim, a infectividade da pessoa depende da fase da doença e da quantidade de vírus em
seu organismo. Assim, pessoas no período agudo da infecção têm uma maior chance de contaminarem
outras pessoas, pois apresentam viremias plasmáticas extremamente elevadas. Da mesma forma,
pessoas com SIDA (fase avançada da doença) têm chance maior de contaminar outros (Sprinz et al., 1999).
O mecanismo bioquímico de algumas células linfóides desestabiliza seu genoma em pacientes
infectados pelo vírus HIV. Os linfócitos de pacientes HIV+ são caracterizados por uma intensa
liberação de radicais oxidativos juntamente com a ativação da xantina oxidase. Estas mudanças
aumentam com o progresso da doença com o estágio máximo da SIDA. O grau das manifestações
bioquímicas da instabilidade genômica aumenta na dinâmica da infecção pelo HIV (Kozhemiakin e
Bondarenko, 1992).
O sarcoma de Kaposi (SK) e o Linfoma de nãoHodgkin (LNH) são os cânceres relacionados
diretamente com pacientes HIV+, e considerados endêmicos (Spina, 1999). Outros específicos
cânceres também ocorrem em grande proporção, mas o risco paterno depende da região geográfica e
qual a exposição do grupo HIV estudado (Biggar, 2000; Frisch, 2001). De acordo com Spina (1999),
três malignidades são consideradas em pacientes com SIDA: SK; grau intermediário ou alto de células
B no LNH; câncer cervical invasivo (CCI).
Pacientes com HIV têm propensão ao desenvolvimento de neoplasia do sistema linfático,
presumivelmente devido à ativação da infecção do vírus EpsteinBarr (EBV) que está latente. O SK
pode desenvolverse devido ao vírus da herpes humana tipo 8, ou a neoplasia anogenital pode estar
35
relacionada a infecção pelo papiloma vírus (HPV). Infecções persistentes de viroses de DNA como o
HPV, EBV, vírus da hepatite B (HBV) e o herpes vírus do sarcoma de Kaposi (KSHV), tem implicado
na carcinogênese em humanos. O genoma das viroses de DNA oncogênicas estão integradas e formam
uma forte ligação com o grupo do genoma celular. Infecções sozinhas não são suficientes para causar
uma transformação neoplásica a menos que esteja acompanhada de mutações somáticas e eventos
epigenéticos, facilitados pela exposição de outros cofatores ambientais e alterações no mecanismo
imune (BeebeDimmer e Schottenfeld, 2006).
Pacientes com HIV possuem um risco consideravelmente maior de desenvolver um câncer
comparado a outras pessoas (Frisch, 2001). A infecção pelo vírus HIV está intimamente associada
com uma elevação do risco de desenvolvimento de linfomas sistêmicos da doença de Hodgkin e
também de linfomas primários no sistema nervoso central (Parekh et al., 2003). Além disto, alguns estudos demonstraram que, em situações nas quais os indivíduos têm seu sistema imunológico muito
debilitado, aumentam até cem vezes os riscos de desenvolverem cânceres associados ao vírus. Em uma
pesquisa realizada com dois grupos de pacientes imunossuprimidos para avaliar a incidência de SK –
um grupo de pessoas infectadas pelo HIV e outro de pessoas que receberam transplantes de órgãos e
utilizavam drogas imunossupressoras para evitar a rejeição – ficou demonstrado que o SK foi quase
quatro vezes mais freqüente em indivíduos infectados pelo HIV do que em transplantados, tornando
evidente que o HIV é um agente potencialmente indutor deste tipo de neoplasia (Serraino et al., 2005).
Neste mesmo estudo evidenciouse que o desenvolvimento do SK em indivíduos HIV+ é
significamente mais baixo em mulheres do que em homens, porém há um aumento significativo do
risco relacionado com a idade. E o histórico individual da administração de drogas antiretrovirais é
consistentemente associado com a redução do risco ao SK (Serraino et al., 2005; Spin, 1999).
De acordo com Hoffmann et al. (2005), as drogas antiretrovirais não diminuem significamente o risco de desenvolver o LNH e o SK. E conclui que pacientes com SIDA terão uma sobrevida maior,
porém o índice de linfomas malignos serão as principais causas de morbidade e mortalidade no futuro.
36
Um outro agente causador de lesões escamosas intraepiteliais, de alto e baixo grau, precursoras
de câncer cervical em mulheres, é o HPV. Mulheres infectadas pelo vírus HIV têm um grande risco de
desenvolver câncer cervical em conseqüência de infecções secundárias pelo HPV. O mecanismo pelo
qual a infecção pelo HIV eleva os riscos de neoplasia cervical não é completamente conhecido. Uma
explicação plausível é que a imunossupressão induzida pelo HIV leva a inabilidade em controlar a
expressão do HPV e a produção de oncoproteínas pelo HPV (Hawes et al., 2006).
1.6 Drogas AntiRetrovirais (ARVs)
Uma das principais armas contra o HIV, que promove uma maior sobrevida nos pacientes, são os
coquetéis para o tratamento da SIDA. Porém a medicação causa muitos efeitos adversos, fazendo com
que vários pacientes abandonem o tratamento (Kotwal, 2005).
O principal objetivo dos ARVs é agir na replicação viral, retardando a progressão da
imunodeficiência e tentar restaurar a imunidade do paciente para aumentar o tempo e a qualidade de
vida dos pacientes com HIV ou SIDA. Assim, a supressão máxima e contínua da replicação viral é
desejável para reduzir ou reverter o dano imunológico (Eron, 1999).
Quadro 1. FDA (Food and Drug Administration) Agentes AntiRetrovirais Aprovados, Maio 1999.
Inibidor Nucleosídeo da Transcriptase Reversa (NRTIs)
Inibidor nãoNucleosídeo da Transcriptase Reversa (NNRTIs)
Inibidor da Protease (PIs)
AZT (zidovudina, ZDV, Retrovir)
ddI (didanosina, Videx)
ddC (zalcitabina, Hivid)
3TC (lamivudina, Epivir)
d4T (stavudina, Zerit)
abacavir (ABC, Ziagen)
Nevirapina (NVP, Viramune)
Delavirdina (DLV, Rescriptor)
Efavirenz (EFV, Sustiva)
Saquinavir hardgel cápsulas (SQVHGC, Invirase)
Ritonavir (RTV, Norvir)
Indinavir (IDV, Crixivan)
Nelfinavir (NFV, Viracept)
Saquinavir softgel cápsulas (SQVSGC, Fortovase)
Amprenavir (APV,
37
Agenerase)
A terapia antiretroviral em pacientes HIV+ resulta em uma variedade virológica, imunológica, e
benefícios clínicos. A diminuição da concentração do vírus no soro ou no plasma, o aumento da
contagem de linfócitos TCD4+, melhora no ganho de peso, diminuição da hepatoesplenomegalia e
linfadenopatia, e melhora na associação do HIV com a encefalopatia (Kline, 1998). Os ARVs tem
melhorado a qualidade de vida em indivíduos HIV+. A diminuição da carga viral tem melhorado o
sistema imune e a clínica dos pacientes (Shah, 2005).
O benefício da terapia antiretroviral potente já foi claramente demonstrado em pacientes com
doença sintomática avançada e naqueles que, apesar de assintomáticos, apresentam imunodeficiência
acentuada (contagem de linfócitos TCD4+ abaixo de 200/mm 3 ). Para os assintomáticos e com
contagem de linfócitos TCD4+ acima de 350/mm 3 , os benefícios parecem ser insuficientes para
contrabalançar os potenciais efeitos adversos e o risco de falha terapêuti
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38
e Dong, 2001). Pancreatite é mais comum em pacientes que utilizam a Didanosina, Lamivudina e a
Stavudina provoca anemia; a neutropenia é mais comum quando administrado a Zidovudina. Abacavir
pode causar uma reação fatal de hipersensibilidade em aproximadamente 5% dos indivíduos
infectados pelo vírus HIV (Hervey e Perry, 2000).
O AZT também demonstrou ser um potente indutor de anormalidades estruturais dos
cromossomos, em concentrações iguais ou maiores que 3 µg.Ml 1 , em estudos citogenéticos utilizando
cultura de linfócitos humanos. Nestas mesmas culturas, a ddI (didanosina, 2’,3’didesoxiinosina), em
altas concentrações (≥ 5000 µg.Ml 1 ), elevou a freqüência de células com mutações cromossômicas
(Farmacopéia USPDI/98). A análise dos efeitos mutagênicos destas duas drogas, em cultura de
linfoblastos humanos, revelou um aumento complementar da incorporação do AZT no DNA humano e
também um aumento da freqüência de indução de mutações quando as drogas foram utilizadas
associadas em coquetéis, maiores que nas exposições às drogas em monoterapias. Foram observados,
como sítiosalvo de mutagênese induzida, o gene hipoxantinaguanina fosforribosiltransferase (HPRT) ligado ao cromossomo X e dois genes autossômicos, timidina quinase (TK) e adenina
fosforribosiltransferase (APRT). Os níveis de incorporação do AZT e ddI, mensuradas por radioimunoensaio, demonstraram aumentos nas taxas de incorporação de AZT no DNA (Meng et al., 2000 a e b; Olivero et al., 1999). Também nos ensaios para HPRT e TK foram observados efeitos mutagênicos em culturas de células expostas ao AZT, ou doses equimolares de AZT combinado com
ddI, em exposições a concentrações variando de 3 a 30 vezes os níveis máximos encontrados no
plasma humano (Meng et al., 2000 a e b).
Vpr, um gene presente no HIV tipo1, induz a anormalidade do ciclo celular pelo acúmulo de
células na fase G2M. Mari Shimura (1999) identificou que o Vpr causa formação de micronúcleo e
aneuploidia. Também induz quebras cromossômicas e amplificação gênica. A expressão do Vpr induz
aumento de mais de 10 dobras resistentes às colônias para N(phosphonacetyl)Laspartato, e inibição
da síntese da pirimidina (Shimura et al., 1999).
O dideoxynucleosídeo azidothymidina (AZT; Zidovudine) é uma droga que induz a formação de
MN em células eritróides de ratos com uma dosagem baixa (terapêutica). Não foram observadas
mudanças significativas na freqüência de micronúcleos no grupo controle, enquanto a continuação do
micronúcleo na entrada para o sangue periférico permanece com níveis secundários. Mutuamente, os
39
ratos tratados com AZT exibiram uma estatística significante no aumento de líquido nas células com
micronúcleo acima do curso da dosagem dos eritrócitos com a alta incidência de micronúcleos que
entram no sangue periférico. (Dertinger et al., 1996).
O AZT, sozinho ou combinado com uma outra droga antiretroviral, é usado em recémnascidos
para prevenir a transmissão do vírus HIV tipo1 da mãe para o filho. O AZT é mutagênico in vitro e
mutagênico e carcinogênico quando administrado em ratos neonatais (Von Tungeln et al., 2004).
1.6.2 AZT+3TC
A associação zidovudina/lamivudina (AZT/3TC) foi considerada a dupla de análogos de
nucleosídeos de primeira escolha para compor o esquema triplo inicial. O perfil favorável de
toxicidade de ambos NRTI, a facilidade de adesão à combinação e a larga experiência com ela
justificam esta opção (Ministério da Saúde).
Um dos componentes padrões no tratamento para a SIDA é o 3TC, segunda geração de
nucleosídio análogo da inibição da NRTI que é substancialmente melhor farmacologicamente que o
AZT e os inibidores da dideoxinucleotídeo. 3TC também é um potente inibidor da polimerase
hepadnavirus. Foi observado que o tratamento com 3TC mostra uma redução acentuada do HBV. A
resistência inicial ao 3TC está associado à substituição da isoleucina pela metionina na posição 184 da
transcriptase reversa do vírus HIV – 1, que resulta na troca de uma base simples (ATG – ATA)
(Serafianos, 1999).
O tratamento com 3TC é um efetivo inibidor da replicação do vírus HIV, e associado com a
dideoxycytidine (ddC) e AZT mostra efetividade contra o HIV pois podem fosforilar para resultar em
5’tripfosfato, cujo inibe competitivamente sobre a transcriptase reversa viral (Hart, 1992).
A transcriptase reversa é uma enzima que copia o genoma de fita simples do RNA do retrovírus
para dentro do DNA duplafita. Nesta enzima pode ocorrer mutações, causando resistência do HIV1
ao tratamento com 3TC (Essink, 1997).
40
1.6.3 d4T
O AZT e o 2’,3’didehydro3’deoxthymidine (d4T; Stavudina) tem mostrado eficácia clínica em
pacientes com infecção do vírus HIV e também é utilizado em conjunto com outras drogas. Estudos
clínicos e básicos indicaram que o AZT tem o potencial de cruzar as barreiras sangüíneas do cérebro e
do fluído cérebroespinhal e consegue entrar no cérebro. Porém o d4T é bem distribuído no organismo,
mas não tem habilidade de entrar no fluído cerebral (Thomas, 1998).
A Stavudina é uma piramidina nucleosídica, um potente agente antiretroviral com ativação in vitro contra o HIV e é similar à Zidovudina (Horton et al., 1995; Kline, 1995). De acordo com Kline (1995), esta droga é bem tolerada e não possui dose clínica relatada ou eventos laboratoriais adversos
como a Zidovudina. A ativação da Stavudina é mensurada indiretamente pela contagem de linfócitos
TCD4+ e pelas mudanças na concentração do antígeno sérico p24, e conclui que a Stavudina mostra
se muito eficaz no tratamento de infecções por HIV em crianças.
1.6.4 EFV
Muitas drogas antiretrovirais, incluindo a efavirenz (EFV), estão associadas ao aumento dos
lipídios séricos. A EFV, uma inibidora nãonucleosídea da transcriptase reversa (NNRTI), é a mais
utilizada, pois promove maior eficácia e tolerabilidade. Também é um indutor do citocromo P450
(CYP) e 3A4 (Gerber, 2005; Wire, 2004), e também reduz as concentrações do inibidor da protease no
plasma, incluindo o APV, indinavir, lopinavir e o atazanavir (Wire, 2004).
O regime alimentar é necessário quando é administrado a EFV devido a sua alta potência, a
longa meiavida e o potencial de efeitos adversos associados com o inibidor da protease. Porém, o
princípio genético para a resistência à droga é baixa com a EFV do que com o inibidor da protease: a
mutação simples no gene da transcriptase reversa do HIV1 produz altos níveis de resistência
fenotípica para a entrada do inibidor nãonucleosídico da transcriptase reversa na classe de agentes,
enquanto a importância clínica da resistência do inibidor da protease geralmente requer múltiplas
mutações (Lucas, 2001).
41
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a freqüência de instabilidade genômica, através da técnica de micronúcleos com
bloqueio de citocinese e ensaio do cometa, em indivíduos HIV+ com e sem o uso de drogas anti
retrovirais (ARVs) em relação aos indivíduos controles.
2.2. Objetivos Específicos
Avaliar o efeito genotóxico da contaminação viral através dos índices de dano de DNA medidos
pelas técnicas de micronúcleo e cometa.
Avaliar o efeito das drogas através dos índices de dano de DNA medidos pelas técnicas de
micronúcleo e cometa.
Avaliar o efeito genotóxico de outros fatores como idade, sexo e tabagismo em indivíduos HIV+
com e sem uso de ARVs e no grupo controle através dos índices de dano de DNA medidos pelas
técnicas de micronúcleo e cometa.
42
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Delineamento
O trabalho é um estudo transversal, onde foram analisadas 135 amostras, sendo 34 (25,2%)
indivíduoscontrole, 39 (28,9%) indivíduos HIV+ sem tratamento e 62 (45,9%) indivíduos HIV+ com
tratamento. A pesquisa foi realizada na Vigilância Sanitária do Município de Novo Hamburgo, Rio
Grande do Sul – Brasil. Os dados foram coletados a partir do “Questionário de Saúde Pessoal”
publicado pela Comissão Internacional de Proteção a Mutágenos e Carcinógenos Ambientais
(ICPEMC) (Carrano e Natarajan, 1988) e por revisão de prontuários. O protocolo do estudo foi
aprovado pelo Comitê de Ética da Feevale (CEP) e pelo Conselho Nacional de Pesquisa (CONEP).
Todos os participantes receberam e assinaram um “Termo de Conhecimento Livre e Esclarecido”
aprovado pelo Comitê de Ética do Centro Universitário Feevale (Anexo I) e preencheram o
Questionário de Saúde Pessoal (Anexo II). A tabela 1 mostra as características da amostra estudada.
Tabela 1. Características da amostra estudada.
Controles HIV sem medicação HIV com medicação Masculino 13 (38,24%) 15 (38,46%) 36 (58,06%) Feminino 21 (61,76%) 24 (61,54%) 26 (41,94%) Idade 42,97 ± 21,75 37 ± 7,61 38,89 ± 9,88 Fuma 11 (32,35%) 18 (46,15%) 22 (35,48%) Total 34 (25,19%) 39 (28,89%) 62 (45,93%)
Foram coletados 4 mL de sangue periférico dos pacientes HIV+ com e sem uso de ARVs e de
indivíduos controle no início da manhã. Esta quantidade foi suficiente para a realização do Ensaio
Cometa e da técnica de micronúcleos com bloqueio da citocinese (CBMN). O transporte das amostras
43
foi realizado pela executora do estudo nas normas de biossegurança, como também todo o
procedimento das mesmas no Laboratório de Citogenética do Centro Universitário Feevale.
3.2. Procedimentos
3.2.1. Técnica de Micronúcleos com Bloqueio da Citocinese (CBMN)
As freqüências de MN, de núcleos ligados por pontes de material nuclear e de “buds” nucleares
(indicativos de amplificação gênica) foram determinadas em 1000 células binucleadas por indivíduo,
em lâminas feitas a partir de cultura de linfócitos, em meios de cultura RPMI mais aditivos, com
bloqueio da citocines
44
8. Adicionar 4 gotas de Formalina, previamente aquecida a 37°C e agitar;
9. Deixar 5 minutos em banhomaria;
10. Adicionar 5 mL de citrato de sódio já aquecido em banhomaria a 37°C;
11. Ressuspender com pipeta Pasteur;
12. Deixar por 7 minutos em banhomaria;
13. Adicionar 0,5 mL de fixador (3metanol/1 ácido acético);
14. Ressuspender;
15. Centrifugar a 1000 r.p.m. por 7 minutos;
16. Adicionar 5 mL de fixador;
17. Ressuspender;
18. Centrifugar a 1000 r.p.m. por 7 minutos;
19. Desprezar o sobrenadante;
20. Adicionar 5 mL de fixador;
21. Ressuspender;
22. Estocar no congelador com tampa, ou em geladeira por, no mínimo, 15 minutos.
Confecção da Lâmina:
1. Após tirar do congelador, centrifugar a 1000 r.p.m. por 7 minutos;
2. Desprezar o sobrenadante;
3. Adicionar 5 mL de fixador;
4. Ressuspender;
5. Centrifugar a 1000 r.p.m. por 7 minutos;
6. Desprezar o sobrenadante, desta vez deixando aproximadamente 1 mL no tubo;
7. Ressuspender;
8. Pingar duas gotas do material a ser analisado na lâmina, a uma altura de aproximadamente 18
cm;
9. Esperar secar na bancada;
10. Sob a pia, preencher toda a lâmina com o corante Giemsa (20% em água destilada) com uma
seringa;
11. Deixar agir por 4 minutos;
45
12. Desprezar o corante em água corrente abundante, deixando que a água escorra pela lâmina na
horizontal (na direção do dedo para fora);
13. Desprezar o excesso de água batendo a lâmina lateralmente em papel absorvente.
Foram utilizadas lâminas novas, lavadas com detergente e guardadas em álcool 70% no
refrigerador. Para o uso, foram lavadas novamente em água corrente (nas cubetas) e por último, com
água destilada. Estas foram retiradas das cubetas com pinça e permanecem com o lado superior
molhado. Todas as lâminas foram identificadas com o número da amostra.
3.2.2. Técnica do Cometa:
O ensaio cometa foi desenvolvido de acordo com o protocolo padrão de preparação e análise
(Tice et al., 2000). Lâminas foram preparadas pela adição de 300 µl de solução de agarose e colocadas em geladeira para solidificar a solução (530 mim à 4ºC). Uma mistura de 5 µl de sangue total com 95
µl de 0,7% agarose lowmeltingpoint foi adicionado à lâmina. A lamínula foi imediatamente
adicionada e após a lâmina foi novamente colocada na geladeira por 5 min para que a agarose
solidificasse. Depois de transcorrido este tempo a lamínula foi retirada e as lâminas foram submersas
na solução de lise que estava previamente preparada na geladeira (2,5 M NaCl, 100mM EDTA, 10mM
Tris, pH 10,2, com 1% de Triton X100 e 10% DMSO foi adicionado). Após 124h à 4ºC, as lâminas
foram retiradas da solução de lise, e o excesso de líquido foi retirado. As lâminas foram colocadas na
horizontal na cuba de eletroforese à 4ºC e cobertas com tampão alcalino (300 mM NaOH, 1 mM
EDTA, ph>13). O líquido cobre as lâminas, que ficam expostas ao tampão por 20 min, sem corrente
elétrica. A eletroforese é então iniciada a 25 V e 300 mA (~0,95 V/cm) por 20 min. Esses passos são
realizados sob luz vermelha para evitar dano de DNA que a luz branca pode causar. Depois da
eletroforese, as lâminas são gentilmente retiradas da cuba e um tampão neutralizador (0,4 M Tris, pH
7,5) é adicionado sobre as lâminas três vezes, com intervalo de 5 min cada vez. As lâminas são lavadas
também três vezes com água destilada e colocadas para secar por 24 h à temperatura ambiente. Após,
são fixadas e coradas com o corante de prata, de acordo com Nadin et al. (2001). Para a avaliação do dano de DNA, 100 células por indivíduo foram analisadas com o microscópio óptico em aumento de
400x. As células foram classificadas em cinco classes, a partir da intensidade do dano: nenhum dano =
46
0; dano máximo = 4. Depois da análise, os valores obtidos na contagem dos danos podem ir de 0 a 400
(Figura 2) (Maluf e Erdtmann, 2001).
Figura 2: Técnica do Cometa. As imagens foram obtidas do laboratório de Citogénetica do Centro Universitário Feevale.
As lâminas de pacientes e controles foram analisadas e os valores foram tabulados para posterior
avaliação estatística. Os testes utilizados foram nãoparamétricos. Para a análise de correlação entre
variáveis quantitativas foi realizado o teste de correlação de Pearson e Spearman, para analisar a
diferença entre dois grupos foi utilizado o teste de MannWhitney. Para as análises foi utilizado o
programa SPSS versão 10.0.
47
4 RESULTADOS
Quando comparamos os pacientes HIV+ com e sem medicação com o grupo controle, não
encontramos diferença significativa para nenhum dos indicadores de dano de DNA da técnica de MN.
Porém, ficou evidenciada a diferença significativa entre estas duas amostras para o índice de dano
medido pelo ensaio cometa (p=0,016). Outros resultados gerais como as médias e os desvios padrões
dos grupos HIV+ e controle, assim como os níveis de significância estatística encontrados quando
comparamos as amostras, estão apresentados na Tabela 2. As alterações medidas pela técnica CBMN
estão apresentadas em forma de médias e desviospadrão, obtidas a partir de valores absolutos da
contagem de 1000 linfócitos binucleados por indivíduo. Mesmo as anomalias encontradas em células
com mais de dois núcleos, seguem as médias e desviospadrão da contagem geral de 1000 células
binucleadas, ou seja, a contagem de todas as anomalias era feita até ser encontrado o linfócito
binucleado de número 1000, em cada indivíduo. Os índices de dados da técnica do cometa
apresentados são obtidos através do somatório dos dados observados em 100 células por indivíduo e
na Tabela 2 estão apresentados em forma de média.
Tabela 2. Freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e índice de dano de DNA do Ensaio Cometa em 100 células dos grupos Controle e pacientes HIV+.
Controles HIV+ p Cometa 9,62±8,96 (n=34) 33,61±44,87 (n=101) 0,016 PN 0,88±0,88 (n=25) 1,13±1,34 (n=38) 0,800 BUD 1,32±1,35 (n=25) 1,92±1,95 (n=38) 0,213 MN 3,80±2,04 (n=25) 3,13±2,02 (n=38) 0,233
A média das freqüências de micronúcleos, pontes dicêntricas e buds e o índice de dano de DNA
medido pela técnica do cometa dos pacientes HIV+ sem e com medicação e indivíduos controle estão
apresentados na Tabela 3.
48
Encontramos diferença significativa no dano medido pelo ensaio cometa quando comparado os
grupos HIV+ sem medicação e controle (p=0,007). Para esta técnica a média e o desviopadrão foi de
38,03±45,43 e 9,62±8,96, respectivamente. Os grupos HIV+ sem medicação e controle apresentaram
como médias para MN, PN e BUD os seguintes valores: 3,71±1,96 e 3,80±2,04 (p=1,000); 1,35±1,62
e 0,88±0,88 (p=0,655) e 1,94±2,16 e 1,32±1,35 (p=0,323), respectivamente. As médias não
apresentaram diferença estatística significante (Tabela 3).
Tabela 3. Freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensai
49
obtivemos diferenças estatisticamente significativas (cometa: p=0,751; MN: p=0,070; PN: p=0,950;
BUD: p=0,418).
Os pacientes HIV+ sem e com medicação possuem média das células TCD4+ igual a
415,29±205,38 e 388,84±299,38, respectivamente (p=0,169) (Tabela 4). A média da carga viral (CV)
dos respectivos grupos foi de 26.987,93±40.909,37 e 5.818,73±26.734,74, apresentando diferença
significativa, com p<0,001 (Tabela 4).
Tabela 4. Comparação da taxa de células TCD4+ (mm³) e Carga Viral (cópias/mL) entre os grupos HIV+ sem e com medicação.
HIV+ sem medicação HIV+ com medicação p
TCD4+ 415,29±205,38 (n=35) 388,84±299,38 (n=56) <0,169
Carga Viral (CV) 26.987,93±40.909,37 (n=34) 5.818,73±26.734,74 (n=51) <0,001
Foram testadas as correlações entre os grupos HIV+, HIV+ sem medicação e com medicação em
relação à CV. Nesta análise não houve uma correlação estatisticamente positiva para estes dados. Este
resultado também foi encontrado quando testado os referidos grupos com a taxa de TCD4+.
4.1. Sexo
Considerando toda a amostra (grupos controle, HIV+ sem e com medicação), os indivíduos do
sexo masculino apresentaram uma média de 3,34 (n=32) linfócitos binucleados com micronúcleos e
um desvio padrão de 1,86, enquanto os do sexo feminino, uma média de 3,45, com desvio padrão de
2,23. Não ficou evidenciada diferença estatisticamente significante entre os sexos, quanto a freqüência
de micronúcleos, pontes dicêntricas, buds e ensaio cometa (Tabela 5).
Tabela 5. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos Controle e pacientes HIV+ sem medicação e com medicação em relação ao sexo.
Cometa MN PN BUDS
Masculino 25,77±34,99 (n=64) 3,34±1,86 (n=32) 1,12±1,18 (n=32) 2,03±2,06 (n=32)
Feminino 29,20±44,89 (n=71) 3,45±2,23 (n=31) 0,94±1,18 (n=31) 1,32±1,30 (n=31)
Total 27,57±40,39 (n=135) 3,40±2,04 (n=63) 1,03±1,18 (n=63) 1,68±1,75 (n=63)
50
Quando avaliamos o grupo controle em relação ao sexo, também não observamos diferença
estatística. Indivíduos do sexo masculino e do sexo feminino apresentaram as seguintes médias e
desviospadrão para a técnica do cometa, MN, PN e BUD: 9,62±6,44; 3,57±1,62; 1,00±1,00 e
1,86±1,35, respectivamente (Tabela 6).
Tabela 6. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo controle em relação ao sexo.
Cometa MN PN BUDS
Masculino 9,62±6,44 (n=13) 3,57±1,62 (n=7) 1,00±1,00 (n=7) 1,86±1,35 (n=7)
Feminino 9,62±10,37 (n=21) 3,89±2,22 (n=18) 0,83±0,86 (n=18) 1,11±1,32 (n=18)
Total 9,62±8,96 (n=34) 3,80±2,04 (n=25) 0,88±0,88 (n=25) 1,32±1,35 (n=25)
Não obtivemos valores significativos para o grupo HIV+ em relação ao sexo. As médias e
desviospadrão estão apresentados na Tabela 7.
Tabela 7. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células do grupo HIV+ em relação ao sexo.
Cometa MN PN BUDS
Masculino 29,88±38,05 (n=51) 3,28±1,95 (n=25) 1,16±1,25 (n=25) 2,08±2,23 (n=25)
Feminino 37,42±51,00 (n=50) 2,85±2,19 (n=13) 1,08±1,55 (n=13) 1,62±1,26 (n=13)
Total 33,61±44,87 (n=101) 3,13±2,02 (n=38) 1,13±1,34 (n=38) 1,92±1,95 (n=38)
Nas tabelas 8 e 9 estão apresentadas as médias e desviospadrão, e após análise verificouse que
os dados não apresentam significância estatística.
Tabela 8. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem medicação em relação ao sexo.
Cometa MN PN BUDS
Masculino 27,40±28,85 (n=15) 3,44±2,01 (n=9) 1,11±1,54 (n=9) 2,00±2,69 (n=9)
Feminino 44,67±52,75 (n=24) 4,00±2,00 (n=8) 1,63±1,77 (n=8) 1,88±1,55 (n=8)
Total 38,03±45,43 (n=39) 3,71±1,96 (n=17) 1,35±1,62 (n=17) 1,94±2,16 (n=17)
Tabela 9. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células do grupo HIV+ com medicação em relação ao sexo.
Cometa MN PN BUDS
Masculino 30,92±41,61 (n=36) 3,19±1,97 (n=16) 1,19±1,11 (n=16) 2,13±2,03 (n=16)
Feminino 30,73±49,41 (n=26) 1,00±0,71 (n=5) 0,20±0,45 (n=5) 1,20±0,45 (n=5)
51
Total 30,84±44,66 (n=62) 2,67±1,98 (n=21) 0,95±1,07 (n=21) 1,90±1,81 (n=21)
4.2. Idade
Foi testada a correlação de Pearson entre idade e técnica do cometa, freqüência de micronúcleos,
pontes dicêntricas e buds. Quando correlacionamos as técnicas do cometa e de CBMN de toda a
amostra com a idade, foi observado uma correlação positiva em um dos danos de DNA avaliado pela
técnica de MN, o BUD, com nível de significância igual 0,024. Esta correlação estatística não foi
observada na técnica do cometa (p=0,858), nas PN (p=0,119) e no MN (p=0,169).
Os grupos foram testados separadamente, e quando analisamos apenas o grupo HIV+ não foi
evidenciado correlação estatística significativa para cometa (p=0,453), MN (p=0,716), PN (p=0,581) e
BUD (0,696). O mesmo ocorre quando correlacionamos o grupo HIV+ sem medicação: Cometa
(p=0,829), MN (p=0,500), PN (0,192) e BUD (0,824); e o grupo HIV+ com medicação: Cometa
(p=0,400), MN (p=0,989), PN (p=0,718) e BUD (p=0,748). Porém, quando correlacionamos o grupo
controle com a idade obtivemos valor significativo para BUD, com p=0,010. A técnica do Cometa
(p=0,263), o MN (p=0,377) e a PN (p=0,115) não apresentaram correlações positivas.
4.3. Fumo
Quando relacionamos os indivíduos de todos os grupos em fumantes e não fumantes,
observamos uma diferença significativa para o dano de DNA medido pela técnica de MN (p=0,006),
como observado na Tabela 10.
Tabela 10. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio Cometa em 100 células dos grupos HIV+ sem e com medicação e controle em relação ao tabagismo.
Cometa MN PN BUDS
Não Fuma 26,69±41,74 (n=84) 3,03±2,13 (n=39) 0,97±1,09 (n=39) 1,51±1,60 (n=39)
Fuma 29,02±38,42 (n=51) 4,00±1,74 (n=24)* 1,13±1,33 (n=24) 1,96±1,97 (n=24)
Total 27,57±40,39 (n=135) 3,40±2,04 (n=63) 1,03±1,18 (n=63) 1,68±1,75 (n=63)
*p<0,05
52
Separamos os grupos para verificar a presença de alguma alteração estatística significativa. O
nível de significância, para a técnica de MN, se manifesta quando comparamos pacientes HIV+ que
fumam com aqueles pacientes HIV+ que não fumam (p=0,033). A técnica do cometa (p=0,956), PN
(p=0,754) e BUD (p=0,611) não apresentou alterações significativas (Tabela 11). Já entre os
indivíduos controle não há diferença significativa entre fumantes e não fumantes para todas as
técnicas: Cometa (p=0,435), MN (p=0,120), PN (p=0,672) e BUD (p=0,970) (Tabela 12).
Tabela 11. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem e com medicação em relação ao tabagismo.
Cometa MN PN BUDS
Não Fuma 33,46±47,13 (n=61) 2,55±1,84 (n=22) 1,05±1,29 (n=22) 1,77±1,97 (n=22)
Fuma 33,85±41,77 (n=40) 3,94±2,02 (n=16)* 1,25±1,44 (n=16) 2,13±1,96 (n=16)
Total 33,61±44,87 (n=101) 3,13±2,02 (n=38) 1,13±1,34 (n=38) 1,92±1,95 (n=38)
*p<0,05
Tabela 12. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células do grupo controle em relação ao tabagismo.
Cometa MN PN BUDS
Não Fuma 8,74±7,21 (n=23) 3,65±2,37 (n=17) 0,88±0,78 (n=17) 1,18±0,88 (n=17)
Fuma 11,45±12,04 (n=11) 4,13±1,13 (n=8) 0,88±1,13 (n=8) 1,63±2,07 (n=8)
Total 9,62±8,96 (n=34) 3,80±2,04 (n=25) 0,88±0,88 (n=25) 1,32±1,35 (n=25)
Quando separamos os grupos de pacientes HIV+ e realizamos a comparação com as técnicas do
cometa, danos de DNA medido pelo MN, observamos que o grupo HIV+ sem uso de medicação não
possui diferença significativa (cometa: p=0,877; MN: p=0,620; PN: p=0,646; BUD: p=0,878) em
relação ao fumo (Tabela 13). E entre os pacientes HIV+ com medicação há diferença significativa nos
fumantes em relação aos não fumantes para a técnica de MN (p=0,020). As outras técnicas
apresentaram os seguintes valores: cometa (p=0,935), PN (p=0,316) e BUD (p=0,502). Estes dados
estão apresentados na Tabela 14.
Tabela 13. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células do grupo HIV+ sem medicação em relação ao tabagismo.
Cometa MN PN BUDS
Não Fuma 35,95±42,07 (n=21) 3,56±2,01 (n=9) 1,56±1,74 (n=9) 2,11±2,76 (n=9)
Fuma 40,44±50,19 (n=18) 3,87±2,03 (n=8) 1,13±1,55 (n=8) 1,75±1,39 (n=8)
53
Total 38,03±45,43 (n=39) 3,71±1,96 (n=17) 1,35±1,62 (n=17) 1,94±2,16 (n=17)
Tabela 14. Médias das freqüências de micronúcleo, pontes dicêntricas e buds em 1000 células, e dano de DNA de acordo com o Ensaio de Cometa em 100 células dos grupos HIV+ com medicação em relação ao tabagismo.
Cometa MN PN BUDS
Não Fuma 32,15±50,04 (n=40) 1,85±1,41 (n=13) 0,69±0,75 (n=13) 1,54±1,27 (n=13)
Fuma 28,45±33,67 (n=22) 4,00±2,14 (n=8)* 1,38±1,41 (n=8) 2,50±2,45 (n=8)
Total 30,84±44,66 (n=62) 2,67±1,98 (n=21) 0,95±1,07 (n=21) 1,90±1,81 (n=21)
*p<0,05
54
5 DISCUSSÃO
Aproximadamente 15% dos cânceres humanos são associados a infecções por vírus. Nas últimas
décadas, uma grande série de dados experimentais e epidemiológicos tem apontado vários vírus
humanos como agentes causais de tumores específicos (Hilleman, 1998).
Os mecanismos através dos quais os vírus podem contribuir para o desenvolvimento de tumores
no homem incluem a inflamação crônica, o estímulo da proliferação celular, a alteração da resposta
imune e o acúmulo de mutações na célula infectada. Pacientes infectados com o vírus HIV apresentam
um risco maior de desenvolver certos linfomas. De fato, a tríade infecção viral, exposição a um
carcinógeno e deficiência imunológica do hospedeiro está presente em muitos tumores (Boccardo e
Villa, 2006).
A partir deste contexto, comparamos 101 pacientes HIV+ com 34 controles, e obtivemos uma
diferença estatisticamente significante (p=0,016) para o índice de dano medido pela técnica do cometa.
Este resultado pode estar indicando tanto um efeito do vírus, quanto um efeito das drogas utilizadas.
Quando separamos os pacientes HIV+ sem e com tratamento, observamos que o grupo constituído
pelos pacientes HIV+ sem o uso de ARVs tem um índice de dano de DNA maior do que os pacientes
que já estão em tratamento. Este fato é devido à ação do vírus sobre as células, pois pacientes que não
administram os ARVs permitem que o vírus atue de forma mais agressiva sobre as células. Nosso
estudo deve ser analisado a partir de dois grupos amostrais: em um deles a ação do vírus pode ser
observada de maneira isolada, tendo interferência apenas dos mesmos fatores que interferem no dano
de DNA na amostra controle; no outro grupo amostral, temos uma diminuição da ação do vírus e o
acréscimo da ação das drogas como fatores que influenciam no dano de DNA.
55
A técnica do cometa detecta principalmente quebras de cadeia simples, uma lesão de DNA que
pode ser efetivamente reparada pelas células, enquanto que a técnica de micronúcleos detecta o
resultado das lesões, como micronúcleos, pontes dicêntricas e buds nucleares, que não são reparáveis.
Portanto, os resultados encontrados com o ensaio cometa são um indicativo de dano de DNA
aumentado em pacientes HIV+. De um modo geral, é importante salientar os altos valores de desvio
padrão na técnica do cometa, que refletem uma grande variação interindividual, que é um achado
freqüente quando esta técnica é utilizada (DeMéo, et al., 1991; Tice, 1995; Vaghef, et al., 1997).
Quando comparado os grupos HIV+ com medicação e controle, notamos que os valores para a
técnica do Cometa e MN se aproximaram do nível de significância (p=0,078 e p=0,061,
respectivamente). Em relação ao grupo amostral sem tratamento, podemos dizer que o dano de DNA
medido pela técnica do cometa está menor, porém parece haver um aumento na freqüência de
alterações estabelecidas não reparáveis, medidas pela freqüência de micronúcleos. Esse achado pode
estar relacionado com o fato de que os pacientes que estão sendo tratados foram contaminados com o
vírus há mais tempo, estando, portanto, expostos a um agente genotóxico biológico e, posteriormente,
a agentes genotóxicos químicos por um período maior de tempo.
Na Tabela 4 está evidenciado que a média da CV está aumentada em pacientes HIV+ que não
administram os ARVs (p<0,001), porém a taxa de TCD4+ não mostrou alterações significantes. Este
resultado está de acordo com a alteração encontrada no grupo HIV+ sem medicação, os quais estão
apresentando maior dano genômico. A combinação dos ARVs deve ser suficiente para suprimir a
replicação viral abaixo dos limites de detecção do teste (<50 cópias/mL). A supressão máxima diminui
a evolução viral, limitando o potencial para a seleção de cepas virais resistentes, pois o
desenvolvimento de resistência à determinada droga pode diminuir a potência de outras drogas
(principalmente dos ARVs com mecanismo de ação semelhante). Porém, Hatano et al (2000) apresentaram em seu estudo que a replicação viral ativa pode persistir em vários locais do organismo
(células mononucleares do sangue periférico, fluido cerebroespinhal, nódulos linfáticos) depois de
baixos níveis de viremia. Outro estudo aponta que a replicação viral inicia quando é retirada as drogas
ARVs.
56
Não percebemos diferença significativa nas drogas analisadas individualmente, isto é, não
detectamos alterações estatísticas quando um paciente HIV+ administrava alguma droga em
específico. Este resultado foi contraditório aos estudos feitos por Von Tungeln et al. (1997), o qual
observou que o AZT é mutagênico in vitro e carcinogênico quando administrado em ratos neonatais. Nossos dados apresentam muitos fatores que podem influenciar nas taxas de dano de DNA, por isso,
talvez fosse necessário o aumento no tamanho das amostras que utilizam determinada droga para
detectar o dano de DNA causado por cada uma delas. Entretanto, os pacientes que utilizam a droga
ARV 3TC apresentaram uma diferença estatisticamente próxima do significativo para a técnica de
MN, com p=0,070. Este resultado demonstra que esta droga pode estar promovendo um maior dano de
DNA sobre as células. De acordo com Hoffman et al (2005), a Lamivudina (3TC) desenvolve resistência rapidamente: somente um único ponto de mutação é requerido (M184V), entretanto esta
mutação pode aumentar a sensibilidade de alguns vírus AZTresistentes, reduzindo a adaptação viral e
tornando a droga bastante eficiente.
Segundo a literatura, a supressão da viremia plasmática para a redução de níveis detectáveis é
conseguido em pacientes HIV+ tipo 1 através de drogas antiretrovirais administradas corretamente
(Gulick et al., 1997; Perelson et al., 1996). Porém, a replicação de vírus competente persiste nestes indivíduos e a viremia rapidamente aumenta quando a supressão dos ARVs é interrompida (Davey et al., 1999). A partir destes dados, verificamos que o vírus HIV provoca alterações importantes a nível
de DNA quando não é administrado os ARVs nos casos de viremia plasmática alta (>50 cópias/mL),
pois a replicação viral persistente é sinônimo de dano progressivo do sistema imunológico e,
conseqüentemente, aumento de alterações citogenéticas. E de acordo com os dados encontrados,
observamos que nossos pacientes HIV+ estão tendo boa resposta à medicação, porém os pacientes que
não estão recebendo ainda os ARVs, ou por terem abandonado o tratamento, apresentam instabilidade
genômica mais acentuada em relação aos pacientes em tratamento.
Quanto ao fator sexo, como indicado na literatura, não houve diferença significativa entre o sexo
masculino e feminino. Para testar a sensibilidade ao vírus e às drogas, foram testadas as diferenças
entre freqüências de micronúcleos, pontes dicêntricas e buds, assim como o índice de dano medido
pela técnica do cometa encontradas entre os sexos, separadamente, nas amostras controle, HIV+ não
tratada e HIV+ tratada. Nenhuma das amostras apresentou diferenças entre os sexos, nas taxas de dano
57
de DNA. Esse achado está em concordância com a maioria das publicações que testaram as diferenças
entre os sexos (Galloway e Evans, 1975; Crossen et al., 1977; Livingston et al., 1983).
As médias de idade dos pacientes com HIV+ sem medicação, dos pacientes HIV+ com
medicação e dos controles foram de 37 ± 7,61, 38,89 ± 9,88 e 42,97 ± 21,75, respectivamente. As
médias dos pacientes HIV+ demonstram um aumento da faixa etária dos indivíduos infectados. No
Brasil houve aumento do número de casos em idosos e da proporção de indivíduos afetados nessa
faixa etária entre os anos de 1991 e 2000 (Melo et al., 2002).
O aumento na freqüência de MN dependente da idade é uma questão muito discutida. Enquanto
alguns autores sugerem um aumento definitivo com a idade (Fenech e Morley, 1986; Scarfi et al.,
1990; Cruz et al., 1994), outros não encontram tal correlação (Hogstedt, 1984; Sbrana et al., 1991). Nosso estudo não apresentou correlação estatisticamente significativa entre as idades e as freqüências
de MN, pontes nucleoplasmáticas e o índice de dano do teste de cometa, quando a amostra total foi
testada. Porém foi encontrada correlação entre idade e freqüência de buds (p = 0,024). Quando estas
correlações foram testadas em cada amostra, também não foram encontrados resultados positivos nas
amostras de indivíduos HIV+ com tratamento e sem tratamento. Já para o grupo controle, encontramos
uma correlação positiva entre idade e freqüência de buds (p = 0,010), o que explica o resultado
encontrado na amostra total. A freqüência de buds foi muito baixa em todas as amostras e,
particularmente, nos controles, com média de 1,32 ± 1,35 nos 25 indivíduos analisados. Além disso, o
desvio padrão tem um valor maior do que a média. Esses fatores citados influenciam negativamente na
importância desse achado, podendo esta, ser uma análise com baixo poder estatístico.
Nossa amostra total havia 51 fumantes e 84 não fumantes. Os fumantes apresentaram uma
freqüência de MN maior que os não fumantes (p=0,006) (Obe e Herha, 1978; Larramendy e Knuutila,
1991; Cruz et al., 1994). Esta diferença também foi observada no grupo de pacientes HIV+ que utilizam a medicação antiretroviral, no qual, os pacientes que fumam apresentam maior freqüência de
MN em relação aos pacientes nãofumantes (p=0,020). Já esta diferença não foi encontrada nos grupos
HIV+ que não utilizam a medicação antiretroviral e controle em relação ao tabagismo. Este achado
demonstra um efeito sinérgico entre as drogas antiretrovirais e o tabagismo, o que deve ser levado em
consideração no aconselhamento destes pacientes, na busca de uma melhor qualidade de vida, no
58
sentido de evitar o desenvolvimento de neoplasias pelo acúmulo de mutações ocasionadas por estes
dois fatores. Para o grupo controle, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas
entre as freqüências de dano de DNA em fumantes e não fumantes. O tabagismo tem efeito genotóxico
comprovado apenas em amostras maiores e quando o hábito é mais freqüente, ou seja, quando os
fumantes consomem maiores quantidades de cigarros.
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74
ANEXOS
Anexo I: Termo de Consentimento Informado
I Justificativa e objetivos da pesquisa: Este estudo consiste em uma avaliação das alterações no material genético (DNA) de cada
participante. Estas alterações ocorrem normalmente nas células em níveis bastante baixos, e são apontadas como responsáveis, entre outros efeitos, pelos processos de envelhecimento e câncer.
II Procedimentos que serão utilizados: Será feita uma coleta de 5 ml de sangue periférico com o propósito de avaliar a freqüência de
mutações através da técnica de micronúcleos (que avalia quebras cromossômicas e perdas do cromossomo inteiro) e da técnica do "cometa" (que acusa lesões menores do material genético).
Pelo presente Consentimento PósInformação, declaro que fui informado de forma clara e detalhada, dos objetivos, da justificativa, dos procedimentos que serei submetido, dos riscos, desconfortos e benefícios do presente Projeto de Pesquisa, assim como dos procedimentos alternativos aos quais poderia ser submetido.
Fui igualmente informado: da garantia de receber resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida a cerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados com a pesquisa; da liberdade de retirar meu consentimento, a qualquer momento, e deixar de participar do estudo, sem que isto traga prejuízo à continuação do meu cuidado e tratamento; da segurança de que não serei identificado e que se manterá o caráter confidencial das informações relacionadas com a minha privacidade.
O Pesquisador Responsável por este Projeto de Pesquisa é Graziela Maria Schuh (fone: 9718 6622). Data: ___/___/___.
Nome e assinatura do Paciente ou Voluntário: ________________________________________________________________
Nome e assinatura do Responsável Legal, quando for o caso: ________________________________________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsável: _______________________________________________________________
75
Anexo II:
QUESTIONÁRIO DE SAÚDE PESSOAL (De acordo com modelo recomendado por: International Commission for Protection against
Environmental Mutagens and Carcinogens (ICPEMC) Mutation Research, 204:379406, 1988)
Este questionário, assim como o estudo a ele relacionado, deve ser de seu interesse. A participação e espontânea e constará destas informações gerais sobre saúde e dieta, mais uma coleta de sangue para estudo citogenético. O estudo consiste em uma avaliação de mutações nos cromossomos de cada participante. Mutações cromossômicas ocorrem normalmente nas células de todas as pessoas em nível bastante baixo, e são apontadas, entre outros efeitos, nos processos de envelhecimento e do câncer.
Trabalhadores em atividades de risco (por exemplo, radiologia, quimioterapia, uso de óxido de etileno e outras), se não seguirem normas adequadas de segurança, podem aumentar a freqüência de mutações cromossômicas em suas células. Este estudo poderá servir como sinal de alerta para prevenir e melhorar as condições de segurança. Caso não se encontrem diferenças entre trabalhadores de atividades de risco e outros de atividades diversas, poderemos concluir que os itens de segurança são efetivos neste aspecto. Isto servirá de estímulo para continuar tomando cuidados com a vida no local de trabalho.
Leia e responda cuidadosamente as seguintes questões. A informação dada por você não será associada com o seu nome, sendo conhecida apenas pelos pesquisadores associados a este estudo. As respostas deste questionário poderão ter influência direta na interpretação de nossos resultados. Por isso, contamos com sua cooperação em fornecer informações corretas.
Obrigado pelo seu interesse.
1.Nome:________________________________________________________
Data:_____/_____/_______
2.Para ser preenchido pelo pesquisador: Código n.:_____________ .
Essa folha será destacada das demais do questionário e arquivada. Apenas o número do código será usado como identificação nas próximas páginas. Se espaços adicionais forem necessários para completar uma resposta, por favor escreva atrás da página e identifique o complemento da resposta com o número da questão.
76
Código n.:___________ . HISTÓRIA PESSOAL
3.Data de hoje:_________________________________________________. 4.Qual a sua idade? _______________(em anos). 5.Sexo: ( )Masculino ( )Feminino 6.A qual grupo étnico você pertence:
( )Caucasiano ( )Negro ( )Chinês ( )Japonês ( )Outro. Qual?____________________________________ .
7.Qual o seu estado civil? ( )Casado ( )Solteiro ( )Separado ( )Divorciado ( )Viúvo 8.De quantos filhos você é pai natural (isto é, não inclua filhos adotados e de criação, e inclua filhos que moram separadamente)? ______________________
HISTÓRIA OCUPACIONAL
9.Qual o seu local de trabalho ? _______________________________________. 10.Há quanto tempo você trabalha neste local? ___________________________. 11.Se há menos de dez anos, onde você trabalhou previamente e por quanto tempo? ________________________________________________________ . 12.Que tipo de trabalho você faz? ___________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________ ___________
EXPOSIÇÃO
13.Liste os agentes químicos (por exemplo, gases tóxicos, benzeno, chumbo, fármacos, agrotóxicos,etc.) ou físicos (radiação) a que você se expôs nos últimos 10 anos em seu trabalho. Nos últimos 12 meses: Quantas vezes por mês: ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ Nos últimos 10 anos: Quantas vezes por mês: ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________
77
Código n.:__________
14.Liste os agentes químicos (agrotóxicos e outros que julgar necessário) ou físicos a que você se expôs nos últimos 10 anos fora de seu trabalho.
Nos últimos 12 meses: Quantas vezes por mês: ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________
Nos últimos 10 anos: Quantas vezes por mês: __________________ ___________________ __________________ ___________________
HISTÓRIA DE FUMO
15.Alguma vez você fumou? ( )Sim ( )Não Se não, passe para a questão 16. Se sim, continue: a).Quanto tempo você fumou?______________(em anos) b).Você fuma atualmente? ( )Sim ( )Não
Se sim, passe para a 15.c) Se não: Quando você parou de fumar?___________________(mês e ano).
c).Você fuma cigarros? ( )Sim ( )Não Se sim, quantas carteiras por dia? ( )Menos de ½ carteira
( )½ a 1 carteira ( )Mais de 1 carteira, quantas?______
Você fuma cigarros com filtro? ( )Sim ( )Não Qual a sua marca usual?_________________________________ .
d).Você fuma charutos? ( )Sim ( )Não Se sim, quantos charutos por dia? ( )1 charuto
( )2 a 3 charutos ( )4 ou mais charutos. Quantos?____
e).Você fuma cachimbo? ( )Sim ( )Não Se sim, quantas vezes por dia? ( )1 vez
( )2 a 3 vezes ( )4 ou mais vezes. Quantas?_______
f)..O que você fumava no passado? ( )Cigarros ( )Charutos ( )Cachimbo
g)..Você mastiga tabaco? ( )Sim ( )Não
78
Código n.:_________
MEDICAMENTOS E DOENÇAS 16.Você tem tomado algum medicamento prescrito pelo médico no último ano (por exemplo,comprimidos para pressão, insulina, tranquilizantes, relaxantes musculares, etc.)?
( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique:
Per íodo . Tipo de medicamento: Dose: Quantos por dia: Início(mês): Término(mês): _________________ ________ ___________ _________ ___________ _________________ ________ ___________ _________ ___________ _________________ ________ ___________ _________ ___________
17.Você tem tomado algum medicamento não prescrito por médico no último ano (por exemplo, aspirina, antiácidos, antihistaminas, sedativos ou outras drogas)?
( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique:
Per íodo : Tipo de medicamento: Dose: Quantos por dia: Início(mês): Término(mês): _________________ ________ ___________ _________ ___________ _________________ ________ ___________ _________ ___________ _________________ ________ ___________ _________ ___________
18.Você toma ou tomou alguma vitamina nos últimos 6 meses? ( )Sim ( )Não
Se sim, por favor indique: Tipo de vitamina: Dose: Quantas vezes por semana: _________________ __________ _______________________ _________________ __________ _______________________ 19.a). Você teve ou tem alguma dessas doenças?
Câncer ( )Sim ( )Não Hepatite ( )Sim ( )Não Mononucleose ( )Sim ( )Não Herpes ( )Sim ( )Não AIDS ( )Sim ( )Não Meningite ( )Sim ( )Não Infecção bacteriana ou viral ( )Sim ( )Não Doença cardiovascular ( )Sim ( )Não Diabete ( )Sim ( )Não Outras doenças importantes ( )Sim ( )Não
79
Código n.:__________
b).Se sim, indique abaixo: Doença: Per íodo da doença: Tratamento: ________________ _________________ ___________ ________________ _________________ ___________
c).Liste as vacinações que você recebeu nos últimos 12 meses. Vacina: Data: ___________________________ ___________________ ___________________________ ___________________
d).Liste os raiosX diagnósticos e terapêuticos, recebidos nos últimos 10 anos. Razão para o raioX Data(ano) ___________________________ ___________ ___________________________ ___________ ___________________________ ___________
e).Você fez alguma cirurgia durante o último ano? Data: Razão: ______________ _______________________________________ ______________ _______________________________________
f).Dê as datas de quando você teve febre nos últimos 12 meses. Data(mês): Doença associada: Medicamento tomado: _______________ __________________ ____________________ _______________ __________________ ____________________
DIETAS (deve refletir apenas os hábitos frequentes)
20.Você come apenas vegetais? ( )Sim ( )Não 21.Você come carne? ( )Sim ( )Não
a).Se sim, com que frequência você come o seguinte: Dias por semana :
1 a 2 3 a 4 5 a 6 todos dias
80
Carne bovina ( ) ( ) ( ) ( ) Peixe ( ) ( ) ( ) ( ) Galinha ( ) ( ) ( ) ( ) Porco ( ) ( ) ( ) ( ) Outras ( ) ( ) ( ) ( )
Código n.:__________
b).Como você prefere sua carne? ( )Mal passada ( )No ponto ( )Bem passada
22.Você usa adoçantes? ( )Sim ( )Não Quantos por dia?____________
23.Você bebe refrigerantes? ( )Sim ( )Não Quantos por dia?____________
24.Comente sobre sua dieta, caso ela tenha algo de especial (por exemplo, dieta rica em proteínas e pobre em carbohidratos,etc). ____________________________________________________________________________ ____________________________________________________________
25.Você bebe café? ( )Sim ( )Não Quantos xícaras pequenas por dia?__________
26.Você bebe chá? ( )Sim ( )Não Quantos xícaras por dia?__________
27.Você toma chimarrão? ( )Sim ( )Não Com que freqüência?__________________________________________.
28.Você bebe cerveja? ( )Sim ( )Não
Se sim, por favor indique sua média de consumo semanal: ( )16 garrafas por semana ou menos. ( )712 garrafas por semana. ( )1324 garrafas por semana. ( )Mais de 24 garrafas por semana. Quantas?_________ .
29.Você bebe vinho? ( )Sim ( )Não
81
Se sim, por favor indique sua média de consumo semanal: ( )14 copos por semana ou mais. ( )58 copos por semana. ( )916 copos por semana. ( )Mais de 16 copos por semana. Quantos?__________ .
30.Você bebe outras bebidas alcoólicas (excluindo cerveja e vinho)? ( )Sim ( )Não
Se sim, qual ou quais?____________________________ Código n.:________
.Por favor, indique sua média de consumo semanal: ( )14 copos por semana ou menos. ( )58 copos por semana. ( )916 copos por semana. ( )Mais de 16 copos por semana. Quantos?___________ .
HISTÓRIA GENÉTICA
31.Você tem conhecimento de algum defeito de nascimento ou outra desordem genética ou doença hereditária que tenha afetado seus pais, irmãos, irmãs ou seus filhos?
( )Sim ( )Não Se sim, por favor especifique: ___________________________________
32.Você ou a sua esposa teve ou tem dificuldade para engravidar? ( )Sim ( )Não
Se sim, por favor especifique: ___________________________________ 33.Você já teve um filho que tenha nascido prematuramente ou que tenha sido abortado?
( )Sim ( )Não 34.Você tem um gêmeo idêntico vivo? ( )Sim ( )Não
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