UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS

MARINA FREIRE DE SOUZA

ALTERAÇÕES MOTORAS, COGNITIVAS E

NEUROQUÍMICAS CAUSADAS PELA ADMINISTRAÇÃO

REPETIDA DA DELTAMETRINA EM RATOS

SÃO CRISTÓVÃO

2015

i

MARINA FREIRE DE SOUZA

ALTERAÇÕES MOTORAS, COGNITIVAS E

NEUROQUÍMICAS CAUSADAS PELA ADMINISTRAÇÃO

REPETIDA DA DELTAMETRINA EM RATOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.

Orientador: Prof. Dr. José Ronaldo dos

Santos.

Coorientador: Prof. Dr. Murilo Marchioro.

SÃO CRISTÓVÃO

2015

ii

MARINA FREIRE DE SOUZA

ALTERAÇÕES MOTORAS, COGNITIVAS E

NEUROQUÍMICAS CAUSADAS PELA ADMINISTRAÇÃO

REPETIDA DA DELTAMETRINA EM RATOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.

Orientador: Prof. Dr. José Ronaldo dos

Santos.

Coorientador: Prof. Dr. Murilo Marchioro.

_________________________________________________________

Prof. Dr. José Ronaldo dos Santos (UFS)

Orientador (Presidente da Banca)

_________________________________________________________

Prof.ª Drª Regina Helena da Silva (UNIFESP)

1° Examinador (Avaliador externo)

_________________________________________________________

Prof. Dr. Luís Felipe Souza da Silva (UFS) 2° Examinador (Avaliador interno)

iii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus e a todos que me ajudaram a chegar até aqui e em todas as etapas

da minha vida. Obrigada meu Deus por ter me dado forças para largar tudo e encarar

o mestrado que tanto batalhei e por me encorajar a enfrentar os obstáculos durante o

curso.

Agradeço a meus pais que sempre me apoiaram nas minhas decisões, mostrando que

o estudo é a maior ferramenta que o homem pode adquirir e é através dele que as

oportunidades surgem. Eles me ensinaram a enfrentar a vida com ética, respeito e

amor.

Ás minhas irmãs Julianna e Luiza por serem um exemplo diário de dedicação e

esforço, que é incentivador.

Ao meu orientador e amigo, Dr. José Ronaldo dos Santos, que realmente foi um

orientador, ensinando cada passo deve ser seguido com paciência, apoio e

transmitindo conhecimento em todos os momentos. Um exemplo de determinação a

ser seguido.

Ao meu coorientador, Dr. Murilo Marchioro, que passou por sérios problemas de

saúde, mas que continua firme e forte nos ajudando sempre.

Agradeço a banca PROASA, que acompanhou cada etapa da pesquisa, criticando de

forma construtiva para o crescimento do trabalho.

À família do laboratório de Neurofisiologia da UFS, principalmente a Katty Anne, Lívia

Lins, Rachel Cintra, Polyana Leal, Auderlan Gois, Marcos Bispo e Luciano Gois que

sempre me apoiaram e ajudaram quando foi necessário e por tornar o laboratório um

ambiente estimulador nesses 2 anos e nos próximos anos (com fé em Deus).

Ao meu grande amor Venâncio Luiz por ter me suportado, pela paciência nos finais

de semana de experimentos e durante toda caminhada.

Por fim, agradeço a todos os professores do PROCFIS-UFS, pelo ensinamento

transmitido e a CAPES, pela bolsa de mestrado concedida.

iv

RESUMO

ALTERAÇÕES MOTORAS, COGNITIVAS E NEUROQUÍMICAS CAUSADAS PELA

ADMINISTRAÇÃO REPETIDA DA DELTAMETRINA EM RATOS, Marina Freire de

Souza, São Cristóvão, 2015.

Estudos tem demonstrado que a exposição a pesticidas é um fator de risco para o

desenvolvimento da doença de Parkinson (DP) em áreas urbanas e principalmente

em áreas rurais. Um desses pesticidas, a deltametrina (DM), é utilizada

indiscriminadamente no controle de vetores na lavoura, na medicina veterinária e no

controle de pestes domésticas. Diante disso, o objetivo da pesquisa é avaliar as

alterações motoras, cognitivas e neuroquímicas causadas pela administração repetida

da DM em ratos. Foram utilizados 38 ratos Wistar machos, com idade entre 9-10

meses, provenientes do Biotério do Laboratório de Neurofisiologia da UFS. O trabalho

foi dividido em dois experimentos: (1) administração intranasal (i.n.) e (2)

intracerebroventricular (i.c.v.) de DM. No experimento 1 (intranasal), os animais foram

divididos em 2 grupos: controle (CTR, solução salina 0,9%, n=9) e DM 0,5 (tratados

com DM 0,5 mg, n=10), que receberam 3 infusões intranasais administradas 1 a cada

7 dias. Durante o tratamento, os animais foram submetidos a testes comportamentais:

catalepsia, reconhecimento de objeto novo, alternação espontânea e medo

condicionado ao contexto. No experimento 2 (i.c.v.), os animais foram divididos em 3

grupos: controle (CTR, n=7), DM 0,5 (tratados com DM 0,5 µg em 2 µL, n=7) e DM 5

(tratados com DM 5 µg em 2 µL, n=5). Nessa etapa, os animais receberam 3 injeções

i.c.v. (2 µL por injeção), uma a cada 48h. Ao longo do tratamento, os ratos foram

avaliados nos testes da catalepsia, campo aberto e alternação espontânea. Após os

testes de comportamento em ambos experimentos, os ratos foram anestesiados,

perfundidos, seus cérebros removidos e submetidos a imunohistoquímica para

Tirosina Hidroxilase (TH) na substância negra parte compacta, área tegmental ventral

e estriado dorsal. Foi observado no experimento i.n. que houve alterações motoras no

campo aberto e cognitivas no reconhecimento de objeto novo e no medo condicionado

ao contexto. A imunohistoquímica mostrou redução de células TH+ na SNpc e VTA e

aumento de TH+ no estriado dorsal. No experimento i.c.v., foram observadas

alterações motoras no campo aberto e cognitivas na alternação espontânea. Na

imunohistoquímica houve diminuição de células TH+ nos animais DM 5 µg na SNpc e

em VTA e redução de seus níveis nos grupos DM 0,5 µg e DM 5 µg no estriado dorsal.

Em ambos os experimentos, alterações cognitivas precederam as alterações motoras.

Os dados apresentados contribuem no entendimento sobre alterações fisiológicas e

comportamentais após exposição a DM e mais estudos deverão ser realizados para

elucidar a DM como um possível causador de sintomas de parkinsonismo.

Palavras-chave: Parkinsonismo, pesticidas, piretróides e dopamina.

v

ABSTRACT

MOTOR, COGNITIVE AND NEUROCHEMICAL CHANGES CAUSED BY

REPEATED ADMINISTRATION OF DELTAMETHRIN IN RATS, Marina Freire de

Souza, São Cristóvão, 2015.

Studies have shown that pesticide exposure is a risk factor to Parkinson Disease (PD)

development in urban areas and mainly in rural areas. One of these pesticides,

Deltamethrin (DM), is used indiscriminately for vector control in crops, veterinary

medicine and control of domestic pests. The aim of the study is investigate the motor,

cognitive and neurochemical changes caused by repeated administration of DM in rats.

38 Male Wistar rats were used, 9-10 months-old, from the Neurophysiology Laboratory

animal house of UFS. The study was divided into two experiments: (1) intranasal (i.n.)

and (2) intracerebroventricular (i.c.v.). In the (1), the animals were divided into 2 groups

(CTR, 0.9% saline solution, n=9) and DM 0.5 (treated with DM 0.5 mg, n=10), that

received 3 infusions administrated one every 7 days. During the treatment, the animal

were subjected to behavior test: catalepsy, novel object recognition task, spontaneous

alternation and contextual conditioned fear. In i.c.v. experiment, the animals were

divided into 3 groups: control (CTR, n=7); DM 0.5 (treated with DM 0.5 µg diluted in 2

µL, n=7) and DM 5 (treated with DM 5 µg diluted in 2 µL, n=5). In the experiment (2),

the animals received 3 i.c.v. injections (2 µL/injection), one each 48 hours. During the

treatment, the rats were submitted to behavior test: catalepsy, open field test and

spontaneous alternation. After the behavior tests of both experiments, the rats were

anesthized, perfused transcardially, their brains removed and submitted to Tyrosine

Hydroxylase (TH) immunochemistry in Substancia Nigra pars compacta (SNpc),

Ventral Tegmental Area (VTA) and dorsal striatum areas. In i.n. experiment, there were

motor changes in open field and cognitive changes in novel object recognition task and

contextual conditioned fear. The immunohistochemistry shows a reduction of TH+ cells

in SNpc and VTA and an increase of Optical Density in dorsal striatum. In i.c.v.

experiment, it was observed motor changes in open field and cognitive changes in

spontaneous alternation. In immunohistochemical there was a decrease of TH + cells

in DM 5ug animals in SNpc and VTA and decreased their levels in DM 0.5 g and DM

5 ug groups in the dorsal striatum. In both experiments, cognitive changes preceded

the motor changes. The data presented contribute to understanding of physiological

and behavioral changes after exposure to DM and more studies are needed to

elucidate the DM as a possible cause of parkinsonism symptoms.

Keywords: Parkinsonism, pesticide, pyrethroid and dopamine.

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estrutura química de Deltametrina ............................................................ 17

Figura 2: Representação esquemática do circuito dos núcleos da base .................. 20

Figura 3: Ilustração esquemática do delineamento experimental da etapa intranasal

.................................................................................................................................. 29

Figura 4: Ilustração esquemática do delineamento experimental da etapa

intracerebroventricular ............................................................................................... 30

Figura 5: Animal no teste da catalepsia .................................................................... 32

Figura 6: Animal no teste do campo aberto .............................................................. 33

Figura 7: Animal no teste de Reconhecimento de objeto novo................................. 34

Figura 8: Esquema do aparato da alternação espontânea ....................................... 35

Figura 9: Teste do medo condicionado ao contexto ................................................. 36

Figura 10: Efeito do tratamento repetido com DM 0,5 mg ou veículo no comportamento

de catalepsia ............................................................................................................. 41

Figura 11: Efeito do tratamento repetido com DM 0,5 mg ou veículo no campo aberto

.................................................................................................................................. 43

Figura 12: Efeito do tratamento repetido com DM 0,5 mg ou veículo na tarefa de

reconhecimento de objeto novo ................................................................................ 44

Figura 13: Efeito do tratamento intranasal repetido com DM 0,5 mg ou veículo no

treino de medo condicionado ao contexto ................................................................. 45

Figura 14: Efeito do tratamento intranasal repetido com DM 0,5 mg ou veículo no teste

de medo condicionado ao contexto ........................................................................... 46

Figura 15: Efeito do tratamento intranasal repetido com DM 0,5 mg ou veículo no

teste de alternação espontânea ................................................................................ 47

Figura 16: Efeito do tratamento intranasal repetido com DM 0,5 mg ou veículo no

número de TH+ na SNpc e VTA ................................................................................ 48

Figura 17: Imagens representativas da SNpc e VTA dos animais tratados com DM

0,5 mg ou veículo ...................................................................................................... 49

Figura 18: Efeito do tratamento intranasal repetido com DM 0,5 mg ou veículo na

densitometria óptica relativa (DOR) do estriado dorsal ............................................. 49

Figura 19: Imagens do estriado dorsal de animais tratados repetidamente com DM

0,5 mg ou veículo ...................................................................................................... 50

Figura 20: Efeito do tratamento i.c.v. repetido com veículo, DM 0,5 e DM 5 no

comportamento de catalepsia ................................................................................... 51

Figura 21: Efeito do tratamento i.c.v. repetido com veículo, DM 0,5 e DM 5 no campo

aberto ........................................................................................................................ 53

Figura 22: Efeito do tratamento i.c.v. repetido com veículo, DM 0,5 e DM 5 no teste

de alternação espontânea ......................................................................................... 54

Figura 23: Efeito do tratamento i.c.v. repetido com veículo, DM 0,5 e DM 5 no número

de células TH+ na SNpc e VTA ................................................................................. 55

vii

Figura 24: Imagens representativas da SNpc e VTA dos animais tratados com veículo,

DM 0,5 e DM 5 ........................................................................................................ 56

Figura 25: Efeito do tratamento icv repetido com veículo, DM 0,5 e DM 5 na

densitometria óptica (DOR) no estriado dorsal .......................................................... 56

Figura 26: Imagens representativas do estriado dorsal dos animais tratados com

veículo, DM 0,5 e DM 5 ........................................................................................... 57

viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANOVA – Análise de Variância

AP - Anteroposterior

ATP – Adenosina Trifosfato

CEPA – Comitê de Ética e Pesquisa Animal

CTR - Grupo Controle

DA – Dopamina

DAB – Diaminobenzidina

DAT – Transportador de dopamina

DDT - 1,1,1-tricloro-2,2-di (ρ-clorofenil) etano

DOR - Densitometria óptica relativa

DP – Doença de Parkinson

DM – Deltametrina

DV – Dorsoventral

EPM - Erro padrão da média

FAO - Food and Agriculture Organization

GABA – Ácido gama-aminobutírico

i.n. – Intranasal

i.m. - Intramuscular

i.p. – Intraperitoneal

i.c.v. – Intracerebroventricular

L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine

mA – Miliampère

ML – Médio-lateral

MPTP – 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina

MPP+ - 1-metilfenilpiridina

PD - Parkinson´s disease

PE - Polietileno

PFA – Paraformaldeído

PNDA - Programa Nacional de Defensivos agrícolas

TF - Tampão fosfato

ix

TFS - Tampão fosfato salina

TH – Tirosina Hidroxilase

UFS – Universidade Federal de Sergipe

UI – Unidade Internacional

VMAT – Vesicular Monoamine Transporter

VTA – Ventral Tegmental Area

SNCA – Alfa sinucleína

SNpc – Substância Negra parte compacta

6 – OHDA – 6-hidroxidopamina

x

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 12

2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 13

2.1 Agrotóxicos ...................................................................................................... 13

2.2 Piretróides e Deltametrina ................................................................................ 16

2.3 Doença de Parkinson e exposição a agrotóxicos............................................. 19

2.4 Modelos animais da Doença de Parkinson ...................................................... 22

3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 25

3.1 Objetivo geral ................................................................................................... 25

3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 25

4. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 26

5. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 27

5.1 Animais ............................................................................................................ 27

5.2 Drogas ............................................................................................................. 27

5.3 Procedimentos gerais ...................................................................................... 28

5.4 Desenho experimental ..................................................................................... 28

5.4.1 Experimento 1: administração intranasal de DM ....................................... 28

5.4.2 Experimento 2: administração intracerebroventricular de DM ................... 30

5.5. Cirurgia ........................................................................................................... 30

5.6 Testes comportamentais .................................................................................. 31

5.6.1 Catalepsia .................................................................................................. 31

5.6.2 Campo aberto ............................................................................................ 32

5.6.3 Reconhecimento de objetos novos ............................................................ 33

5.6.4 Alternação Espontânea (Tarefa de Memória Operacional) ........................ 35

5.6.5 Medo Condicionado ao Contexto ............................................................... 36

5.7 Perfusão e processamento do cérebro ............................................................ 37

5.8 Imunohistoquímica para TH ............................................................................. 37

5.9 Contagem de células TH+ ................................................................................ 38

5.10 Avaliação da Densitometria Óptica Relativa – DOR ...................................... 39

5.11 Análise dos dados .......................................................................................... 39

xi

6. RESULTADOS ...................................................................................................... 41

6.1 Experimento 1: administração intranasal de DM ............................................ 41

6.1.1 Comportamento de Catalepsia .................................................................. 41

6.1.2 Campo aberto ............................................................................................ 42

6.1.3 Teste de Reconhecimento de Objeto Novo ............................................... 44

6.1.4 Medo Condicionado ao Contexto ............................................................... 45

6.1.5 Alternação espontânea .............................................................................. 47

6.1.6 Contagem de células ................................................................................. 48

6.1.7 Densitometria óptica relativa - DOR ........................................................... 49

6.2 Experimento 2: administração intracerebroventricular de DM .................. 51

6.2.1 Comportamento de Catalepsia .................................................................. 51

6.2.2 Campo aberto ............................................................................................ 52

6.2.3 Alternação espontânea .............................................................................. 54

6.2.4 Contagem de células ................................................................................. 55

6.2.5 Densitometria óptica relativa - DOR ........................................................... 56

7. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 588

8. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 655

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 666

12

1. INTRODUÇÃO

Tem sido crescente o número de estudos que apontam para uma possível

correlação entre exposição a toxinas ambientais e casos de parkinsonismo,

principalmente em populações de idosos que vivem em áreas rurais e que trabalharam

com a administração de agrotóxicos em lavouras. Muitas vezes, a administração

dessas drogas ocorre sem o uso dos equipamentos de proteção individual ou coletivo,

podendo atingir o organismo humano e, a longo prazo, causar danos fisiopatológicos.

Esse é o caso, principalmente, das toxinas paraquate, rotenona e manebe, drogas

utilizadas em cultivos e que, nos humanos expostos a elas, atuam destruindo o

sistema dopaminérgico, resultando em parkinsonismo.

Hoje essas drogas são utilizadas em modelos animais para o estudo da Doença

de Parkinson (DP) e tem contribuído largamente para o avanço no conhecimento da

sua fisiopatologia, já que facilitam as pesquisas invasivas sobre o tema. Entretanto,

pouco se sabe sobre dezenas de outras toxinas que são utilizadas como pesticidas,

não só nas lavouras, mas também em residências urbanas.

Uma droga que merece atenção é a deltmetrina (DM), um piretróide do tipo II

utilizado na agricultura, nas residências e na saúde pública com o objetivo de controlar

algumas pragas. Apesar de ser utilizada indiscriminadamente, estudos mostram

efeitos neurotóxicos dessa droga, inclusive sobre o sistema dopaminérgico, principal

alvo de ação das toxinas que causam parkinsonismo em humanos e em modelos

animais.

No presente estudo escolhemos a DM como toxina para estudar sua ação

sobre o sistema nervoso central, com ênfase nas alterações motoras, cognitivas e nas

vias dopaminérgicas. O trabalho apresenta também uma comparação entre os efeitos

da DM por duas vias de administração diferentes: intranasal (i.n.) e

intracerebroventricular (i.c.v.). A via i.n., simulando o que ocorre nas lavouras e em

ambientes onde ocorre exposição à droga; a via i.c.v., para investigar mecanismos

específicos que ocorrem no sistema nervoso central de animais tratados

repetidamente com esse pesticida.

13

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Agrotóxicos

Agrotóxicos, pesticidas, praguicidas, defensivos agrícolas, remédio de plantas

ou veneno são alguns dos vários nomes que se dão a um grupo de produtos químicos

utilizados para o controle de pragas e doenças de plantas (BRAIBANTE; ZAPPE,

2012). Moragas e Schneider (2003) denominam os agrotóxicos de biocidas, que

surgem para tentar facilitar o manejo agrícola e tem finalidade de eliminar organismos

que representam obstáculos à produção. De acordo com a Organização da Agricultura

e Alimentos (FAO - do inglês Food and Agriculture Organization), são considerados

agrotóxicos toda substância ou mistura utilizada para prevenir, destruir ou controlar

qualquer praga. Essas drogas possuem função de controle de pragas, doenças e

ervas daninhas, garantindo elevação na produtividade; no entanto, podem ser

altamente tóxicos aos organismos não-alvo, incluindo os seres humanos (SCORZA

JUNIOR et al., 2010). Alguns estudiosos sobre o tema ainda ampliam o conceito e

englobam também produtos químicos utilizados em ambiente doméstico e nas

atividades de acabamento de construção, pintura, limpeza e desinfecção, como

solvente, tinta e lubrificantes (SOUZA; FAVARO, 2007 apud CAVALCANTI, 2010).

O termo agrotóxico inclui inseticidas (combate a insetos), fungicidas (controle

de fungos), herbicidas (controle de plantas invasoras), fumigantes (combate a

bactérias no solo), algicidas (controle de algas), avicidas (combate a aves),

nematicidas (combate a nematoides), moluscicidas (controle de moluscos) e

acaricidas (controle de ácaros). Além destes, existe ainda os reguladores de

crescimento, desfoliantes (combate a folhas indesejáveis) e dissecantes (PERES,

2009).

O desenvolvimento destes produtos foi incentivado pelo homem com o objetivo

de melhorar sua condição de vida, aumentando a produção de alimentos. Há cerca

de 10.000 anos, com o desenvolvimento da agricultura e o aumento da densidade

populacional, o homem começou a estocar alimentos para sustentar suas famílias e

animais domésticos. Os campos então tornaram-se fonte de alimento para insetos e

roedores, atacados também por fungos e bactérias. Por serem rapidamente

14

disseminadas, foram denominadas de pragas e para combatê-las, o homem utilizava

desde rituais religiosos até o desenvolvimento de agrotóxico (MAZOYER; ROUDART,

2010).

Alguns registros relatam que há milhares de anos, as pragas devastavam

plantações e eram consideradas um castigo divino em resposta ao comportamento do

homem. Durante o período clássico, encontram-se registros sobre métodos de

controle de pragas e poucos avanços, nesse sentido, ocorrem durante a idade Média.

Com o passar do tempo, por meio de observações e experimentos baseados na

tentativa e erro, identificou-se compostos químicos eficazes no combate de insetos e

fungos, como o enxofre e o piretro. Esse último, encontrado em flores secas de plantas

de crisântemo (gênero Chrysanthemum), era utilizado no combate a piolhos. No

século XIV, os chineses utilizavam arsênio para controle de insetos; desenvolveram

também outros métodos de controle de pragas como uso de ervas, óleos e cinzas,

bem como compostos à base de mercúrio para combater piolhos e outros seres

(BRAIBANTE; ZAPPE, 2012).

No século XVIII, após a revolução industrial e com o desenvolvimento da

agricultura, houve o uso de fertilizantes em larga escala e máquinas que ajudavam no

plantio e na colheita. No século XIX, os problemas nas lavouras se agravavam

surgindo assim, os primeiros estudos científicos sobre o uso de compostos químicos.

No final do século XIX, vários compostos foram sintetizados com finalidade de controle

de pragas, além de misturas como enxofre e cal, sulfato de cobre e cal e arsenito de

cobre (VEIGA et al., 2007).

Compostos orgânicos vegetais também foram muito utilizados no combate às

pestes. Um exemplo é o piretro, ou pó da Pérsia, originária de flores secas de

Chrysanthemum cinerariaefolim e Chrysanthemum coccineu, em que possui

constituintes químicos chamados piretrinas, responsáveis pelo efeito inseticida.

Outros exemplos são a nicotina e rotenona. A primeira é utilizada até hoje em jardins

para controle de artrópodes, e a segunda causa efeito tóxico nos músculos e nervos

cessando a alimentação dos insetos e causando morte rápida após exposição

(MOREIRA et al., 2006).

15

No final do século XIX e início do século XX, desenvolveram-se os inseticidas

orgânicos sintéticos. Estes foram utilizados em grande escala na Segunda Guerra

Mundial para proteger o exército contra os transmissores de doenças, como a doença

do sono e malária. Em 1939, houve a descoberta do 1,1,1-tricloro-2,2-di (ρ-clorofenil)

etano (DDT), inseticida organoclorado utilizado no combate a piolhos na Segunda

Guerra Mundial pelas tropas americanas na Europa (VEIGA et al., 2006). Outros

exemplos de compostos desenvolvidos para o combate de pragas na época, são o

aldrin, dieldrin, heptacloro e toxafeno. Com o passar do tempo, houve a necessidade

de desenvolvimento de novos compostos, sendo produzidos os organofosforados e

carbamatos (BRAIBANTE; ZAPPE, 2012).

Em 1950, iniciou nos Estados Unidos uma mudança severa no processo de

produção agrícola chamada “Revolução Verde”, com objetivo de aumentar a produção

agrícola através do uso de maquinaria no campo, desenvolvimento de pesquisas em

fertilização do solo, de sementes modificadas e desenvolvidas em laboratórios (SILVA

et al., 2005). Junto com a modernização estavam também o uso de agroquímicos e

outros insumos de origem industrial. No Brasil, a “Revolução Verde” ocorreu na

década de 1960 e tomou impulso na década de 1970 com a criação do Programa

Nacional de Defensivos Agrícolas (PNDA). Esse, tinha como meta, principalmente,

estimular a produção e o consumo nacional de agrotóxicos na medida em que

condicionava a concessão do crédito rural à utilização obrigatória de uma parte deste

recurso com a compra de agrotóxicos. Entretanto, as políticas de incentivo ao uso de

agrotóxicos foram implantadas num momento de carência estrutural e vulnerabilidade

social, marcada pela baixa escolaridade dos trabalhadores rurais, que não foram

acompanhadas por uma qualificação dos agricultores envolvidos no processo

(MOREIRA et al., 2002; SOARES et al., 2005).

O aumento da produção agrícola dependia da alta resistência das plantas a

diferentes tipos de pragas e doenças, do uso de máquinas e insumos agrícolas, como

fertilizantes, herbicidas e inseticidas, dentre eles o 1,1,1-tricloro-2,2-di (ρ-clorofenil)

etano (DDT). Em 1985, as campanhas de saúde pública alertavam sobre os males

causados pelo seu uso e em 2009, foi proibida a fabricação, importação, exportação,

manutenção, comercialização e uso de DDT no Brasil (MASCARENHA; PESSOA,

16

2013). A indústria agroquímica vem trabalhando na síntese e formulação de moléculas

que sofram degradação e desapareçam do ambiente em pouco tempo.

O uso indiscriminado dos pesticidas é um grave problema para saúde, para o

ambiente e para as pessoas nele inseridas. Sua toxicidade tem sido claramente

demonstrada por alterar algumas funções fisiológicas. Além disso, há evidências que

a exposição a agrotóxicos aumenta o risco de câncer e doenças degenerativas. Atuam

também como desreguladores endócrinos, contribuindo para vários efeitos adversos

ligados à reprodução e desenvolvimento de toxicidade (JONES; MILLER, 2008).

Estudos em laboratório têm mostrado o mecanismo pelo qual os pesticidas conduzem

à doenças, dentre elas a Doença de Parkinson (DP) como disfunção mitocondrial,

estresse oxidativo, agregação de proteínas e níveis alterados de dopamina (DICK,

2006).

2.2 Piretróides e Deltametrina

Piretróides são derivados sintéticos ativos de piretrinas naturais, que são

toxinas encontradas em extrato de flores de Chrysanthemum cinerariaefolium. A

maioria dos piretróides possuem radicais de ácido ciclopropano carboxílico ou outro

grupo equivalente ligado a um álcool aromático por meio de um éter ou éster central

(WOLANSKY; HARRILL, 2008). Para Soderlund et al. (2002), o governo e laboratórios

particulares investiram décadas de pesquisas no desenvolvimento de uma gama de

estruturas de piretróides com múltiplos usos na agricultura, veterinária, controle

médico e pragas domésticas. O desenvolvimento de piretróides sintéticos envolve

processos de modificação estrutural e biológica, de modo que a matriz da versão

comercial e os inseticidas identificados como “piretróides” incluem compostos que são

várias fases de remoção de piretrinas (SODERLUND et al., 2002).

Os inseticidas piretróides são classificados em dois diferentes grupos de acordo

com a estrutura química e nos sinais de toxicidade aguda: tipo I, como a permetrina,

que não contém um grupo ciano na posição alfa; e tipo II, como a deltametrina, que

contém um grupo ciano na posição alfa (MIYAMOTO et al., 1995). Os dois tipos

apresentam síndromes tóxicas diferentes: os piretróides sintéticos do tipo I

17

apresentam síndrome do tremor que é caracterizada por hiperexcitação,

incoordenação e tremor em todo corpo (HOSSAIN et al., 2006); enquanto o tipo II,

causa principalmente a síndrome da salivação caracterizada por salivação, seguido

de tremor progressivo e paralisia. Esse último grupo causa alta toxicidade seletiva

sem deixar resíduos, por isso tem sido utilizado como pesticidas (MORIKAWA;

FURUHAMA, 2009).

A deltametrina, (S)-alfaciano-3-fenoxibenzil-(1R,3R)-3-(2,2-dibromovinil)-2,2-

dimetilciclopropanocarboxilato (Figura 1), comercialmente conhecida como Decis, K-

Othrine, Ambush, Fuminset, Decametrina, Kobiol e Scabin, pertence ao grupo dos

piretróides, é empregada nas lavouras, medicina veterinária, no controle de pestes

domésticas e na saúde pública, principalmente no controle de vetores (PIMPÃO et al.,

2005). É um dos mais potentes piretróides e produz a síndrome neurológica do tipo II,

caracterizada por salivação sem lacrimação, movimentos involuntários e convulsão. A

exposição aguda em humanos a essa substância pode causar problemas no sistema

nervoso central, gastrointestinal, cardiovascular e respiratório, podendo levar a morte

(TAYEBATI et al., 2009).

Segundo Soderlund et al. (2002), nos mamíferos a deltametrina produz

neurotoxicidade que depende da dose e da via de administração, implicando em

múltiplos efeitos neuronais. Um mecanismo fisiológico do funcionamento da

deltametrina é o fechamento dos canais de sódio, causando influxo lento de sódio

durante a despolarização neuronal (RICCI et al., 2013). Recentemente, tem sido

Figura 1: estrutura química de Deltametrina. Fonte: Takasaki et al. (2013).

18

mostrado que a deltametrina estimula o receptor de glutamato ou bloqueia o receptor

do ácido aminobutírico (GABA A), levando à convulsão (MORIKAWA; FURUHAMA,

2009) e age ainda sobre os receptores nicotínicos da acetilcolina (SODERLUND et

al., 2002). O tratamento com DM resultou na redução nos níveis de acetilcolina no

cerebelo (HOSSAIN et al., 2006). Além disso, a sustância tem efeito sobre a fertilidade

masculina e durante seu metabolismo, espécies reativas de oxigênio são geradas e

resultam em estresse oxidativo nos animais intoxicados (KALE et al., 1999).

Li et al. (2007) citam que a deltametrina inibe a biossíntese da dopamina pela

redução do RNAm da tirosina hidroxilase, que é uma enzima que está envolvida na

biossíntese da dopamina e é o principal marcador das vias dopaminérgicas. Pode

ocorrer também estresse oxidativo e redução os níveis de proteínas nas células PC12.

Entretanto, os resultados apresentados na literatura sobre o tema são controversos,

pois alguns estudos apresentam um aumento ou não observaram redução dos níveis

de dopamina associado ao tratamento com DM. Tayebati et al., (2009), demonstraram

que a exposição a DM não alterou os níveis de dopamina no córtex frontal, mas

reduziu as concentrações de catecolaminas no hipocampo e no estriado. Já Hossain

et al., (2006) demonstraram que os níveis de dopamina aumentaram no estriado de

ratos que moviam-se livremente, após o tratamento com a DM. Esses resultados

divergentes podem estar relacionados ao tempo de análise após a exposição à DM, o

regime de tratamento e/ou dose administrada. Estudos controlados precisam ser

realizados para melhor esclarecer esses achados.

Estudos já citam a relação do uso da deltametrina com autismo, déficit no

desenvolvimento, aprendizagem e doenças degenerativas como Doença de

Parkinson (MANI et al., 2013). Com isso, é importante investigar se a DM pode ser

relacionada com possíveis mecanismos fisiopatológicos na DP, já que a droga tem

envolvimento com o sistema dopaminérgico e pode gerar alterações motoras

semelhantes à doença.

19

2.3 Doença de Parkinson e exposição a agrotóxicos

A DP é a segunda doença neurodegenerativa mais comum depois da doença

de Alzheimer e é uma desordem crônica e progressiva caracterizada por frequentes

distúrbios de movimentos e cognitivos (WIRDEFELDT et al., 2011), que acomete 0,3%

da população e 1% das pessoas com idade acima de 60 anos (MAYEUX, 2003). O

diagnóstico da doença é realizado através da observação dos sinais motores:

fraqueza muscular, rigidez, instabilidade postural, tremor em repouso e bradicinesia

(SHULMAN, 2007). Além destes, observam-se prejuízos cognitivos, que incluem a

perda progressiva da memória e demência, déficit de memória espacial e de atenção,

aprendizagem e memória de reconhecimento (VOON; FOX, 2007).

Em relação a fisiopatologia, a DP está diretamente relacionada a progressiva

morte de neurônios dopaminérgicos da substância negra parte compacta (SNpc), o

que resulta na depleção de níveis de dopamina na via dopaminérgica nigroestriatal. A

perda de 50 a 60% dos neurônios dopaminérgicos na SNpc, com as possíveis

disfunções nos neurônios dopaminérgicos remanescentes, acarretam na redução de

70 a 80% nos níveis de DA no estriado (CAMPÊLO, 2013; ZIGMOND, 1997). Essa

diminuição expressiva de níveis de dopamina na via nigroestriatal é a responsável

pelo surgimento dos sinais motores.

A dopamina (DA) tem afinidade por cinco subtipos de receptores

metabotrópicos distribuídos em duas famílias: D1 (subtipos D1 e D5) e D2 (subtipos

D2, D3 e D4). As duas famílias de receptores dopaminérgicos possuem grande

distribuição no estriado e possuem efeitos contrários sobre a excitabilidade neuronal

e atuam sobre o controle motor. Os receptores da família D1 estão ligados à proteína

G excitatória e possuem ação estimulante sobre a enzima adenil-ciclase, levando a

um aumento da produção de AMP-cíclico e abertura dos canais de cálcio. Os

receptores da família D2 estão ligados a proteína G inibitória e quando estimulados,

causam inibição da enzima adenil-ciclase, diminuindo a produção de AMP-cíclico e

diminuição da entrada de cálcio, limitando a excitabilidade celular (BEDIN; FERRAZ,

2003).

20

Em condições normais, a aferência dopaminérgica nigral modula os efeitos

glutamatérgicos dos impulsos corticestriais por meio da ativação da via direta, por

estímulo dos receptores D1 e a simultânea inibição da via indireta, por estímulo dos

receptores do tipo D2 (BEDIN; FERRAZ, 2003; PONZONI; GARCIA-CAIRASCO,

1995). A via direta, há ativação dos receptores D1 no estriado, levando a excitação de

neurônios gabaérgicos, resultando na inibição dos núcleos de saída (globo pálido

interno – Gpi) e consequentemente, desinibição do tálamo e estimulação do córtex

motor. Na via indireta, há estimulação dos receptores D2, permite a ação inibitória dos

neurônios do globo pálido externo – Gpe sobre o núcleo subtalâmico – NST, reduz a

estimulação sobre os núcleos de saída GPi, reduzindo a atividade inibitória sobre o

tálamo. Na DP, a depleção de dopamina leva a redução da via direta e um aumento

da ativação da via indireta, resultando na ativação excessiva dos núcleos de saída e

excessiva ativação do tálamo, diminuindo a atividade das aferências para o córtex

motor e gerando os sintomas motores (CAMPÊLO, 2013). Ver esquema ilustrativo na

Figura 2.

Figura 2: Representação esquemática do circuito dos núcleos da base. O esquema a esquerda mostra a transmissão normal e o da direita, representa o desequilíbrio na transmissão em pacientes com a Doença de Parkinson. Setas em vermelho representam projeções inibitórias e as azuis, projeções excitatórias. Figura adaptada de Santos (2012). Abreviaturas: GPi-Globo Pálido interno; GPe-Globo Pálido externo; SNpc-Substância Negra.parte compacta; NST-Núcleo Subtalâmico; D1-receptor dopaminérgico excitatório; D2-receptor dopaminérgico inibitório; GABA-via gabaérgica inibitória.

21

Apesar do diagnóstico da DP ser baseado em sinais motores, é cada vez mais

evidente que a patologia é acompanhada de sinais e sintomas não-motores. Essas,

não estão completamente esclarecidas, porém sabe-se que alterações nas vias

dopaminérgicas mesolímbica, mesocortical e tuberoinfundibular contribuem para os

distúrbios emocionais e cognitivos. Nas duas primeiras vias citadas, os corpos

celulares dos neurônios dopaminérgicos estão localizados na área tegmental ventral

(VTA) e projetam respectivamente para áreas límbicas e corticais, enquanto na via

tuberoinfundibular, os corpos neuronais estão situados no núcleo arqueado do

hipotálamo e projetam para o infundíbulo (BLONDER; SLEVIN, 2011). Entretanto,

estudos tem sugerido o envolvimento de outros sistemas no desenvolvimento da DP,

como o sistema serotoninérgico (degeneração dos núcleos da rafe), noradrenérgico

(degeneração do locus coeruleus) e colinérgico (degeneração do núcleo basal de

Meynert) (SUZUKI et al., 2010).

Apesar de ser considerada como uma patologia idiopática, acredita-se que a

fatores genéticos e ambientais estejam associados ao aumento do risco de

desenvolver a doença (PEREIRA; GARRETT, 2010). Entre os fatores genéticos,

destaca-se os relacionados a mutações nos genes PINK1, parkin (PARK2), DJ1, alfa-

sinucleína (SNCA) e LRRK2 (SCHAPIRA, 2011). Essas mutações são capazes de

causar danos sobre a função mitocondrial, um dos principais eventos que ocorrem na

DP. Outra característica da doença é o surgimento dos corpos de Lewy. Esses corpos

são inclusões citoplasmáticas formadas por deposição proteica e ricos em proteínas

alfa sinucleína e ubiquitina. Estas inclusões parecem se acumular em neurônios

dopaminérgicos do SNpc, e por esta razão são utilizadas como marcador da DP

(HAGAN et al., 1997). A alfa sinucleína é expressa em todo sistema nervoso central e

é abundante nos terminais pré-sinápticos, com ação inibitória sobre a enzima tirosina

hidroxilase (TH), reduzindo a síntese de catecolaminas (PEREZ et al., 2002).

Fatores ambientais não são bem compreendidos, mas sabe-se que devem

estar relacionados com aumento do estresse oxidativo, principalmente dos neurônios

dopaminérgicos, acarretando em sua morte. Esse estresse oxidativo pode estar

relacionado à exposição aos pesticidas, herbicidas e metais pesados, principalmente

por trabalhadores em áreas rurais (HANCOCK et al., 2008). Segundo Costa et al.

22

(2003), anos de exposição a variados fatores de risco, como toxinas ambientais e a

diminuição de reservas funcionais tornam os indivíduos susceptíveis a desenvolverem

a DP.

A etiologia da Doença de Parkinson ainda não é bem compreendida, mas há

evidências científicas de que seja uma doença multifatorial que provavelmente

envolve fatores de risco genético e exposição ao ambiente, inclusive a pesticidas.

Dentre os pesticidas, destacam-se os piretróides que são muito utilizados no cotidiano

da população e são mais seguros que os organofosforados. Alguns piretróides, como

a DM, possuem ação sobre o sistema dopaminérgico e resultam em alterações

comportamentais semelhantes às observadas em modelos animais de parkinsonismo.

(ROSS; SMITH, 2007).

Um grande número de estudos epidemiológicos tem citado a associação entre

a DP e a exposição aos pesticidas (FRANCO et al., 2010). Segundo Kanavouras et

al. (2011), estudos epidemiológicos em humanos tem apontado os pesticidas como

fatores de risco para desenvolvimento da doença e neurodegeneração, embora a

associação seja controversa. Vários estudos caso-controle assim como estudos

prospectivos tem mostrado uma relação positiva entre exposição e aumento do risco

de DP (ASCHERIO et al., 2006), enquanto outros estudos não conseguiram

demonstrar esta ligação (BEHARI et al., 2005). Para Dardiotis et al. (2013), uma

possível razão para discrepância observada pode estar relacionada às diferentes

suscetibilidades das populações à exposição ambiental baseado na sua variabilidade

genética.

2.4 Modelos animais da Doença de Parkinson

Modelos animais para o estudo da DP têm sido largamente utilizados para um

melhor esclarecimento da fisiopatologia dessa doença. Estes modelos, associados à

aplicação de diversas drogas que levem a morte de neurônios dopaminérgicos, podem

ser um importante mecanismo para melhor entender os processos biológicos

23

envolvidos na DP, e podem ser uma ferramenta importante para desenvolver

tratamentos em humanos (SONSALLA et al., 2008; SANTOS, 2012).

Os modelos animais atuais para DP são baseados, principalmente, no uso de

agentes farmacológicos, como reserpina e haloperidol, e em neurotoxinas, como

MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina), 6-OHDA (6-hidroxidopamina) e

rotenona, que são capazes de causar disfunção na via dopaminérgica nigroestriatal,

mimetizando alguns sintomas da doença.

O MPTP é o modelo animal mais específico para indução da DP. A intoxicação

com essa substância, faz com que ela atravesse facilmente a barreira

hematoencefálica, pois é altamente lipofílica. Uma vez no sistema nervoso ela é então

metabolizada nos astrócitos e gera o metabólito MPP+ (1-metilfenilpiridina), que é

transportado para neurônios dopaminérgicos pelo DAT (transportados de dopamina)

(PREDIGER et al., 2012). O acúmulo de MPP+ nos neurônios interfere no

metabolismo mitocondrial, pela inibição do complexo I da cadeia transportadora de

elétrons (BEZARD et al., 2012), além de morte celular e produção de superóxidos

(BOVÉ; PERIER, 2012). Entretanto, um fator limitante para o uso deste modelo é o

alto grau de toxicidade da droga aos pesquisadores.

A reserpina, utilizada como modelo, causa depleção de monoaminas, que

desencadeia déficit motores semelhantes aos apresentados na DP (SKALISY et al.,

2002). Bloqueia a proteína VMAT (transportadora vesicular) nos terminais pré-

sinápticos monoaminérgicos (VERHEIJ; COOLS, 2007). Isso reduz a disponibilidade

de monoaminas nos terminais nervosos causando redução de neurotransmissores no

sistema nervoso, gerando sintomas como diminuição da mobilidade, da temperatura,

catalepsia, tremor e rigidez muscular (COLPAERT, 1987). Entretanto, a reserpina

possui efeito reversível, o que não corresponde a etiologia da DP em humanos.

A 6-OHDA, também utilizada para induzir sintomas parkinsoniano, não

atravessa a barreira hematoencefálica e necessita ser injetada diretamente no cérebro

(SANTOS, 2012). A administração local de 6-OHDA, resulta na inibição do complexo

I da cadeia respiratória, porém atua sobre neurônios dopaminérgicos quanto

noradrenérgicos. A inibição do complexo I da cadeia respiratória reduz a função

24

mitocondrial, a geração de ATP, contribuindo para produção de espécies reativas de

oxigênio e levando a um estresse oxidativo (SCHAPIRA, 2011). O modelo animal

baseado na administração da 6-OHDA parece ser uma ferramenta adequada para

compreensão das alterações (cognitivas, motoras e emocionalidade) que ocorrem na

DP e apresenta menor risco de contaminação dos pesquisadores quando comparados

ao MPTP (SANTOS, 2012).

A rotenona é um inseticida de ocorrência natural, bem caracterizada, inibidor

específico de alta afinidade do complexo I (NADH-deidrogenase). É extremamente

hidrofóbico e atravessa as membranas biológicas com facilidade. Ao contrário da

MPTP, a rotenona não requer um transportador de dopamina para ter acesso ao

citoplasma (BETARBET et al., 2000). Ainda esses autores, em estudos com ratos,

observaram que os animais tratados com rotenona desenvolveram deficiências

motoras e posturais característico de DP. Em cultura de células neurogliais de ratos e

camundongos, uma concentração não-tóxica ou minimamente tóxica de rotenona e o

agente inflamatório lipopolissacarídico induzem a degeneração dopaminérgica (GAO

et al., 2003). Entretanto, nesse modelo ocorre grande variabilidade dos resultados, o

que dificulta sua aplicabilidade.

Ainda não é possível mimetizar todos os sintomas da DP em animais, pois tanto

os modelos animais baseados em substâncias tóxicas quanto transgênicas possuem

suas especificidades e limitações; portanto, nenhum modelo único é adequado a todos

estudos sobre a DP. A escolha do melhor modelo a ser utilizado deve ser guiado pelos

objetivos do trabalho proposto (BLANDINI; ARMENTERO, 2012).

25

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar as alterações motoras, cognitivas e neuroquímicas causadas pela

administração repetida da deltametrina (DM) por diferentes vias em ratos.

3.2 Objetivos específicos

Investigar possíveis alterações motoras nos animais após a administração

repetida da DM;

Avaliar as possíveis alterações cognitivas causadas pela administração

repetida da DM;

Analisar as alterações neuroquímicas para tirosina hidroxilase - TH em

diferentes áreas cerebrais de animais tratados com DM.

26

4. JUSTIFICATIVA

Estudos tem mostrado que a exposição a pesticidas é um fator de risco para o

desenvolvimento da Doença de Parkinson, principalmente em áreas rurais. Entre os

pesticidas mais utilizados, destaca-se a deltametrina (DM) que é utilizada no controle

de vetores na lavoura, na medicina veterinária e controle de pestes domésticas.

Pesquisas tem demonstrado efeitos desse composto sobre a via dopaminérgica em

modelos animais; no entanto, os dados encontrados na literatura ainda são incipientes

e controversos, sendo necessária uma padronização de doses, vias de administração

e regime de tratamento, afim de elucidar melhor os possíveis efeitos dessa droga

sobre o Sistema Nervoso Central. Sendo assim, nesse estudo propomos avaliar o

efeito dessa droga através de duas vias diferentes (intranasal – i.n e

intracerebroventricular – i.c.v.) sobre o desenvolvimento de sintomas de

parkinsonismo em ratos de meia idade. A primeira via, baseia-se na principal porta de

entrada da DM em indivíduos que trabalham em ambientes domésticos e nas lavouras

com a droga, onde os mesmos, quando sem proteção, inalam grandes quantidades

do inseticida. Já a via i.c.v., possibilita uma melhor dispersão da droga no sistema

nervoso central, sem a influência de barreiras como o trato respiratório e barreira

hematoencefálica.

27

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Animais

Foram utilizados 38 ratos Wistar machos (400-550 g), com idade de 9-10

meses, provenientes do Biotério setorial do Departamento de Fisiologia da UFS e

mantidos no biotério do Laboratório de Neurofisiologia da UFS em número de 4-5 por

caixa plástica (33 x 40 x 17 cm) com grade em aço inoxidável, sob ventilação e

temperatura controlada (22 ± 2º C), ciclo claro-escuro de 12/12 horas e livre acesso a

água e comida. Todos os procedimentos realizados no presente estudo foram

conduzidos cuidadosamente de acordo com a lei brasileira para o uso de animais em

pesquisas (Lei nº 11.794) e aprovada pelo comitê de ética e pesquisa animal (CEPA)

da Universidade Federal de Sergipe (Protocolo nº 35/2014).

5.2 Drogas

Deltametrina (S) – alfaciano – 3 – fenoxibenzil - (1R,3R) – 3 - (2,2 - dibromovinil)

- 2,2 - dimetilciclopropanocarboxilato, com nome comercial K-Othrine® SC 25

(25g/l), possui fórmula bruta C22H19Br2NO3 e produzida pela Bayer;

Cloridrato de cetamina 100mg/ml (Ketamina®, Agener União);

Cloridrato de xilazina 20mg/ml (Calmiun®, Agener União);

Benzilpenicilina benzatina (Penicilina G Benzatina®, Ariston/120000 UI em 0,2

ml);

Solução salina (NaCl 0,9%).

Diclofenaco (Voltaren®, Novartis), 10mg/kg;

28

5.3 Procedimentos gerais

Antes do início dos experimentos, os animais passaram por 5 dias de

manipulação durante 5 minutos cada, com a finalidade de habituar os animais às

manipulações e ao experimentador. Todos os testes realizados, exceto catalepsia,

foram gravados com o auxílio de uma câmera de vídeo posicionada acima dos

aparatos. As imagens foram posteriormente analisadas e quantificadas por programa

de rastreamento de animais (ANY-maze, Stoelting, USA). Todos os testes e

gravações foram analisados pelo mesmo experimentador, sem ter informações do

tratamento dado a cada um dos animais. As tarefas foram realizadas sempre no

mesmo horário, entre 8 e 14 horas e os aparatos foram limpos com solução de etanol

10% entre um animal e outro para evitar possíveis pistas de odores deixados por outro

animal.

5.4 Desenho experimental

O trabalho foi dividido em 2 experimentos: experimento 1, com administração

intranasal (i.n.) de DM e experimento 2, com administração intracerebroventricular

(i.c.v.) de DM. Em ambas as etapas os animais foram distribuídos aleatoriamente entre

os grupos.

5.4.1 Experimento 1: administração intranasal de DM

Nesse experimento os animais foram divididos em 2 grupos: controle (CTR,

solução salina 0,9%, n=9) e DM 0,5 (tratados com DM 0,5 mg, n = 10). A dose foi

selecionada em experimentos pilotos prévios. Os animais receberam injeções

bilaterais de veículo ou DM a cada 7 dias, em um total de 3 injeções. A administração

i.n. da DM em ratos foi realizada seguindo o procedimento descrito por Dluzen e

Kefalas (1996) e adaptado por Prediger et al. (2006). Após a anestesia com solução

cloridrato de cetamina (Ketamina®, Agener União, concentração 100mg/ml e dose de

29

100mg/kg) e cloridrato de xilazina (Calmiun®, Agener União, concentração 20mg/ml

e dose se 10mg/kg) intramuscular, um tubo de polietileno (PE-10) foi inserido nas

narinas dos ratos. O tubo foi conectado a uma micro-seringa de Hamilton (Hamilton,

USA), e a substância administrada na razão de 50 µL por narina na velocidade de 10

µL/min, com intervalo de 30 segundos entre cada narina, com o auxílio de uma bomba

de microinfusão.

Ao longo do tratamento, os ratos foram avaliados em diversos testes: (1)

catalepsia (diariamente), (2) campo aberto (semanalmente), (3) reconhecimento de

objetos novos (treino e teste no 3º dia), (4) alternação espontânea (9º dia) e (5) medo

condicionado ao contexto (treino – 12º dia e teste – 13º dia). Ao final do experimento,

os animais foram anestesiados, perfundidos, decapitados e os cérebros removidos e

processados para análise imunohistoquímica para tirosina hidroxilase – TH (enzima

envolvida na síntese de dopamina). A Ilustração do delineamento experimental está

representada na Figura 3.

Figura 3: Ilustração esquemática do delineamento experimental da etapa intranasal.

30

5.4.2 Experimento 2: administração intracerebroventricular de DM

Nesse experimento, os animais foram divididos em três grupos: controle (CTR,

solução salina 0,9%, n=7), DM 0,5 (tratados com DM 0,5 µg, diluídos em 2 µL de

solução salina, n=7) e DM 5 (tratados com DM 5 µg, diluídos em 2 µL de solução

salina, n=5). Nessa etapa, os animais receberam 3 injeções i.c.v. (2 µL por injeção),

uma a cada 48h. Ao longo do tratamento, os ratos foram avaliados em diversos testes

comportamentais: (1) catalepsia (diariamente), (2) campo aberto (24 h após a 3ª

injeção) e (3) alternação espontânea (48h após a 2ª injeção). Após 24 h da 3ª injeção,

os animais foram anestesiados, perfundidos, decapitados e os cérebros removidos e

processados para análise imunohistoquímica para tirosina hidroxilase – TH (enzima

envolvida na síntese de dopamina). A Ilustração do delineamento experimental está

representada na Figura 4.

Figura 4: Ilustração esquemática do delineamento experimental da etapa intracerebroventricular.

5.5. Cirurgia

Para a cirurgia, foram utilizadas as coordenadas do Atlas Paxinos e Watson

(2007) permitindo maior precisão na localização das injeções de DM. O grupo CTR foi

submetido ao mesmo procedimento cirúrgico, porém foi injetada solução salina 0,9%.

Antes da etapa cirúrgica, os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina

e cloridrato de xilazina, i.p, nas doses 100 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente. Após

31

a tricotomia, o crânio foi fixado no estereotáxico (Insight, Brasil). A desinfecção do

local foi feita com solução iodada. Após injeção subcutânea de lidocaína 2%,

músculos e outros tecidos foram afastados e retirados para exposição dos ossos da

caixa craniana, com auxílio de bisturi. As coordenadas foram determinadas utilizando

o bregma como referência: anteroposterior (AP) – 0,96 mm; médio-lateral (ML), ± 1,8

mm e dorsoventral (DV), + 3,0 mm. Em seguida, o crânio foi perfurado com uma broca

odontológica, a cânula de 10 mm inserida no ventrículo lateral (direito ou esquerdo),

fixada ao crânio com acrílico odontológico e 2 parafusos de aço inoxidável. Ao término

da cirurgia, os animais receberam pentabiótico veterinário Penicilina G Benzatina®,

Ariston / 120000 UI em 0,2 ml) via i.m., seguido de injeção de anti-inflamatório e

analgésico diclofenaco (Voltaren®, Novartis). Depois os animais foram colocados nas

gaiolas e permaneceram sob observação pós-cirúrgica pelas primeiras 24 horas.

As microinjeções das drogas foram realizadas no ventrículo lateral esquerdo ou

direito, com auxílio de uma micro-seringa de Hamilton (Hamilton, EUA) acoplada com

um tubo de polietilieno PE-10 conectado a uma agulha gengival. A substância foi

administrada i.c.v. com velocidade de 1 µL/min. Após o término das microinjeções, a

agulha foi mantida por 60 segundos para evitar refluxo de DM.

5.6 Testes comportamentais

5.6.1 Catalepsia

O comportamento de catalepsia é utilizado para avaliar o comportamento

motor dos animais. Foi realizado colocando-se o animal com ambas as patas

dianteiras sobre uma barra horizontal de vidro elevada 9 cm da superfície de apoio

das patas traseiras. Foi medida a latência para o animal realizar um movimento, ou

seja, sair da posição inicial. Os animais foram submetidos três vezes consecutivas ao

aparato até um limite de 180 segundos. Para cada dia foi realizada uma média do

tempo das três tentativas (Figura 5) (SANTOS, 2012).

32

Figura 5: Animal no teste da catalepsia.

5.6.2 Campo aberto

O campo aberto é um teste que avalia o comportamento locomotor e

exploratório dos animais e foi realizado em um aparato circular (raio = 84 cm, altura =

35 cm) sem o teto (Figura 6). Uma câmera foi posicionada sobre o campo aberto a

uma altura de 230 cm. A câmera era conectada a um computador e foi utilizado um

programa de rastreamento de animais (Anymaze, Stoelting, USA) para registro dos

parâmetros comportamentais. A parte interna do campo aberto foi pintada de preto

para aumentar o contraste e favorecer o reconhecimento do animal pelo programa

(SANTOS et al., 2013).

Uma hora antes do teste de reconhecimento de objetos novos, os animais

foram submetidos a uma seção de habituação no campo aberto com duração de 5

minutos. Os animais foram posicionados no meio do aparato e os parâmetros

observados foram: distância percorrida em toda a arena, tempo de permanência no

centro e número de comportamentos de levantar (rearing).

33

Figura 6: Animal no teste do campo aberto.

5.6.3 Reconhecimento de objetos novos

Essa tarefa foi utilizada para avaliar a memória de reconhecimento a curto

prazo dos animais. Quando os ratos são colocados diante de objetos novos, eles

passam a maior parte do tempo explorando esse novo objeto (CRUZ et al., 2010).

Este comportamento comum tem sido utilizado para desenhar um paradigma

comportamental designado como tarefa de reconhecimento de objeto novo

(ENNACEUR e DELACOUR, 1988). A tarefa foi realizada na mesma arena em que foi

realizado o campo aberto, uma hora após a seção de habituação. Foram utilizados

objetos como garrafas e cantis, sendo cada um com duas cópias, confeccionadas do

mesmo material, cor, forma e tamanho. Os objetos eram pesados e seus pesos

deviam ser o suficiente para não serem deslocados pelos animais ou, caso contrário

foram fixados no campo aberto. Após cada série os objetos, assim como o campo

aberto, foram limpos com álcool a 10 % para evitar a presença de dicas olfativas.

Todos os objetos utilizados não apresentavam significado etológico.

34

Experimentos piloto foram realizados para avaliar se os animais já

apresentavam alguma preferência pelos objetos selecionados, e se eles eram

capazes de discriminá-los. No dia do experimento as caixas dos animais foram

colocadas na sala de comportamento 1 hora antes de começar o teste para que se

habituassem ao ambiente. No treino, os animais foram colocados no aparato na

presença de dois objetos idênticos uma hora após, na seção de teste, um dos objetos

foi substituído por um objeto novo (Figura 7). Treino e teste tiveram duração de 5

minutos cada.

O tempo de exploração dos objetos foi contabilizado nas duas sessões (treino

e teste), sendo este considerado quando o animal tocasse o objeto com as vibrissas,

patas ou focinho. Os animais que exploraram os objetos por menos de 1,5 segundos

nas duas sessões foram excluídos do estudo. Os resultados das sessões de treino e

de teste foram expressos em índice de reconhecimento calculado da seguinte forma:

Tempo de exploração do objeto novo x 100

Tempo total de exploração dos dois objetos

Figura 7: Esquema ilustrativo do teste de Reconhecimento de objeto novo.

Treino Teste

1h1h após

35

5.6.4 Alternação Espontânea (Tarefa de Memória Operacional)

Essa tarefa teve como objetivo avaliar a memória operacional de dos animais

e foi realizada no mesmo aparato em que se se realiza o Teste do Labirinto em Cruz

Elevado, com todos os braços fechados lateralmente, nomeados com as letras A, B,

C e D. O aparato teve elevação de 50 cm do solo. Antes da realização do teste, os

ratos foram ambientados durante uma hora na sala em que ocorreram os

experimentos. Os ratos foram colocados no centro do labirinto apontados para o lado

A para livre exploração durante 10 minutos. Durante esse tempo, eles alternaram

espontaneamente entre os quatro braços utilizando pistas espaciais distribuídas pelas

paredes da sala.

A sequência de entrada nos braços foi registrada manualmente (Exemplo:

ABCBADC). Posteriormente os registros foram analisados determinando a

porcentagem de alternação e entrada nos braços. Dessa forma, o número máximo de

alternações possíveis foi o total de entradas nos braços menos três, e o percentual de

alternações, calculado através do (total de alternações/máximo de alternações) x 100,

ver Figura 8. Foram excluídos animais que não alternaram no aparato (CAMPÊLO,

2013).

Figura 8: Esquema do aparato da alternação espontânea.

36

5.6.5 Medo Condicionado ao Contexto

O teste do Medo Condicionado ao Contexto foi utilizado para avaliar a memória

aversiva (a longo prazo) (Figura 9). O teste foi dividido em 2 fases: treino e teste. No

treino, os animais foram colocados em uma caixa e após 2,5 min receberam um

choque elétrico nas patas, com intensidade de 0,3 mA e duração de 2 segundos.

Foram aplicados 5 choques intercalados por 30 segundos. O tempo total de

permanência do animal no aparato foi de 5 minutos. Após 24 horas (teste), os animais

foram reintroduzidos na caixa de medo sem o choque elétrico onde permaneceram

por mais 5 minutos. Os comportamentos de congelamento (freezing) e tentativa de

fuga foram quantificados nas seções de treino (150 segundos antes e 150 segundo

após o choque) e teste (tempo total e minuto a minuto) (MACHADO et al., 2012).

Figura 9: Animal no teste do medo condicionado ao contexto. Imagem da câmera de gravação

do aparato.

37

5.7 Perfusão e processamento do cérebro

Ao final dos testes comportamentais, os animais foram anestesiados com

cetamina e cloridrato de xilazina, i.p, nas doses 100 mg/kg e 10 mg/kg,

respectivamente. Os sinais dos animais foram avaliados após a injeção e quando

completamente anestesiados, realizou-se um acesso a cavidade torácica

seccionando-se a pele e partes moles, expondo a cavidade abdominal e feito uma

incisão no diafragma para exposição do coração. Os animais foram perfundidos

intracardicamente com Tampão Fosfato Salina (TFS, pH 7,4) para lavar os vasos

durante 5 minutos e posteriormente, com Paraformaldeído (PFA) 4% em Tampão

Fosfato (TF, pH 7,4), por 10 minutos para fixação do tecido. Após esse procedimento,

os cérebros foram removidos e conservados em PFA por 24 horas. A solução foi

trocada por uma solução de sacarose 30% a cada 10 dias. Os cérebros foram

congelados e as secções foram obtidas por congelamento em criostato de

deslizamento (Leica, USA), através de cortes frontais de 50 µm, que foram distribuídas

em 5 compartimentos contendo solução anticongelante. Cada um desses

compartimentos correspondeu a 1 de 5 secções, de maneira que a distância entre

elas foi de 250 µm. Estes cortes foram armazenados em solução anticongelante à

base de etilenoglicol e tampão fosfato e posteriormente conservados a 4ºC até as

reações de imunohistoquímica, seguindo o protocolo realizado por Santos et al.

(2013).

5.8 Imunohistoquímica para TH

O procedimento foi realizado em temperatura ambiente (25ºC) e as secções

foram lavadas 4 vezes por 5 minutos sob agitação automática em uma solução de

Tampão Fosfato (TF). As secções foram tratadas com peróxido de hidrogênio a 0,03%

em TF por 20 minutos para inativação da peroxidase endógena e posteriormente

lavados mais 4 vezes em TF. Posteriormente, os cortes foram colocados em contato

com anticorpo primário policlonal anti-TH produzidos em coelhos (1:10000; cat #

AB152 Chemicon, USA), diluído em TF contendo Triton-X 100 (ICN Biomedicals) 0,4%

38

e soro normal de cabra (Sigma Chemical Company) a 2% durante o período de 18 a

24 horas. Após esse procedimento, as secções foram lavadas novamente (4 vezes de

5 minutos em TF) e posteriormente incubadas com anticorpo secundário biotinilado

(1:1000; cat # S-1000 Vector Labs, USA) diluído em TF Triton-X a 0,4%. Transcorridas

2 horas, os tecidos foram lavados (4 vezes de 5 minutos) e incubados com solução

de avidina-biotina-peroxidase (ABC Elite kit, Vector Labs, Burlingame, USA) 1% por

120 minutos. Novamente os tecidos foram lavados (4 vezes de 5 minutos) e para

visualizar a reação, os cortes foram colocados em contato com cromógeno

(diamminobenzina-DAB- Sigma, St Louis, MO, USA) a 2,5% diluída em TF (0,1M/pH

7,4) e 0,03% de H2O2.

Após as reações, os cortes foram lavados (4 vezes de 5 minutos) e

posteriormente montados em lâminas gelatinizadas. Cinco dias após a montagem elas

foram desidratadas através da exposição a concentrações crescentes de etanol,

clareadas com xilol e as lamínulas fixadas com Entellan (Merck). Uma série adjacente

foi corada com tionina e feita referência para localização das áreas. As secções foram

examinadas por iluminação de campo claro (Olympus Microscope, BX-41) e as

imagens foram capturadas com uma câmera digital (Nikon, DXM-1200) acoplada ao

microscópio. A localização das áreas foi determinada usando o atlas Paxinos e

Watson (2007).

5.9 Contagem de células TH+

Para cada animal analisado foram feitas imagens em aumento de 10x para ver

com mais detalhes a presença ou ausência de células marcadas nos tecidos. A

contagem de células foi realizada em 6 secções de cada animal e o número de células

para cada uma delas correspondeu à média entre as 6 secções analisadas. Para a

Tirosina Hidroxilase (TH), as áreas analisadas foram a Substância Negra parte

compacta (SNpc) e Área Tegmental Ventral (VTA). Nas 6 secções foram contadas

todas as células TH+ das áreas de interesse através do programa ImageJ e a

delimitação da área foi realizada com base no atlas Paxinos e Watson (2007). Os

valores para cada animal foram normalizados pela média dos valores obtidos dos

39

animais pertencentes ao grupo controle de cada etapa. Todas as contagens foram

feitas às cegas.

5.10 Avaliação da Densitometria Óptica Relativa – DOR

Para análise da Densidade Óptica Relativa (DOR), as imagens foram obtidas

em um mesmo momento, submetidas a mesma intensidade de luz, sem passar por

modificação de brilho e contraste, uma vez que os valores em pixels de cada imagem

correspondem a uma intensidade maior ou menor de marcação da substância no

tecido. Cada animal foi representado por 6 imagens para cada área. Utilizando o

programa ImageJ, foram selecionadas as áreas do estriado dorsal. Na mesma

imagem, também foi selecionado um campo de igual tamanho em uma área controle,

com pouca ou quase nenhuma marcação de TH no tecido. O número médio de pixels

calculados no campo de interesse foi subtraído do número de pixels da área controle

no mesmo tecido. Assim como na contagem de células, os valores para cada animal

foram normalizados pela média dos valores obtidos dos animais pertencentes ao

grupo controle de cada etapa.

5.11 Análise dos dados

Inicialmente os dados foram submetidos ao teste de Kolmogorov – Smirnov

para verificar a normalidade dos dados e podermos aplicar o teste recomendado,

baseado na distribuição dos dados. No experimento i.n, a catalepsia foi analisada ao

longo do tempo utilizando uma ANOVA fatorial de medidas repetidas. Para análise do

reconhecimento de objeto novo, foi utilizado o teste-t para amostras pareadas. Para

as tarefas de campo aberto, medo condicionado ao contexto, alternação espontânea,

contagem de células e densitometria óptica relativa foi feito o teste-t simples. No

experimento i.c.v., a catalepsia foi analisada utilizando a ANOVA de medidas

repetidas e pós-teste de Tukey. O campo aberto, alternação espontânea, contagem

40

de células e densidade óptica relativa foram avaliadas através da ANOVA de uma via

seguida do pós-teste de Tukey. Os dados foram expressos em média ± erro padrão

E.P.M. e nível de significância de p < 0,05 para diferenças estatisticamente

significativas. Para realização das análises foram utilizados o software Statistica 8.0 e

o Graphpad Prism 6.0.

41

6. RESULTADOS

6.1 Experimento 1: administração intranasal de DM

6.1.1 Comportamento de Catalepsia

A ANOVA de medidas repetidas não revelou efeito do tempo (dias do tratamento)

[F(20,340) = 2,28, p = 0,302], efeito do tratamento (CTR e DM 0,5 mg) [F(1,17) = 1,10,

p = 0,308] e interação tempo x tratamento [F(20,340) = 1,162, p = 0,285] no

comportamento de catalepsia (Figura 10).

Figura 10: Efeito da administração intranasal repetida de DM (0,5 mg, n=10) ou veículo (CTR, n=9) no comportamento de catalepsia. A ANOVA de medidas repetidas não revelou efeito do tempo (dias do tratamento), não mostrou diferença significativa em relação ao tratamento (CTR e DM) e interação tempo x tratamento. Os dados são expressos como média ± EPM.

42

6.1.2 Campo aberto

O teste do campo aberto foi realizado nos dias 2 e 18 (48 horas após a 1ª e 72

horas após a 3ª administração intranasal repetida de DM 0,5 mg, respectivamente).

Para distância total percorrida no campo, nenhuma diferença foi encontrada entre os

grupos CTR e DM 0,5 mg na 1ª semana [t (17) = 1,71, p = 0,105] e na 3ª semana [t

(17) = 0,46, p = 0,649] (Figura 11 A). Para o tempo de permanência na zona interna,

não houve diferença significativa entre os grupos na 1ª semana [t(17) = 0,50, p =

0,623] e na 3ª semana [t(17) = 1,19, p = 0,252] (Figura 11 B). Em relação ao número

de rearing, não houve diferença significativa entre os grupos CTR e DM 0,5 mg na 1ª

semana de experimento [t (17) = 1,15, p = 0,2658] porém houve um aumento do

número de vezes que o comportamento foi realizado pelo grupo DM quando

comparado ao grupo CTR na 3ª semana de realização do teste, [t (17) = 2,65, p =

0,017 (Figura 11 C).

43

Figura 11: Efeito da administração intranasal repetida com DM (0,5 mg, n=10) ou veículo (CTR, n=9) na (A) distância total percorrida; (B) tempo de permanência na zona interna e (C) número de rearing. Foi observado alteração apenas um aumento no número de rearing do grupo tratado com DM na 3ª semana de experimento, quando comparado ao CTR. Os dados são expressos como média ± EPM. *p < 0,05 comparado ao CTR (Teste-t para amostras não pareadas).

44

6.1.3 Teste de Reconhecimento de Objeto Novo

O teste do reconhecimento de objeto novo foi realizado somente uma vez, no

dia 3 (72 horas após a 1ª administração intranasal de DM 0,5 mg). O grupo CTR

mostrou um aumento na porcentagem de exploração do objeto novo quando

comparado ao objeto antigo através do teste t pareado [t (5) = 2,83, p = 0,037],

indicando um bom desempenho da tarefa. O grupo DM 0,5 mg não mostrou diferença

significativa na porcentagem de exploração do objeto novo quando comparado ao

objeto antigo [t (6) = 1,12, p = 0,305] (Figura 12).

Figura 12: Efeito da administração intranasal repetida com DM (0,5 mg, n=7) ou veículo (CTR, n=6) na tarefa de reconhecimento de objeto novo. O grupo DM não apresentou preferência pelo objeto novo na sessão de teste, indicando uma possível perda cognitiva causada pelo tratamento com a DM. Os dados são expressos como média ± EPM. *p < 0,05 comparado ao objeto antigo (Teste-t para amostras pareadas).

45

6.1.4 Medo Condicionado ao Contexto

Na tarefa de medo condicionado ao contexto, realizada no dia 12 (5º dia após

a 2ª administração intranasal), as variáveis consideradas foram o tempo de freezing e

número de tentativa de fuga do treino (150 segundos antes e 150 segundos após o

início do primeiro choque) e teste (minuto a minuto).

No treino, quando os dados foram analisados 150 segundos antes e depois do

choque, observou-se que ambos os grupos apresentaram aumento significativo em

relação ao tempo de freezing CTR [t (8) = 4,16, p=0,032] e DM [t (9) = 6,16, p<0,001]

após os choques (Figura 13 A). No número de tentativa de fuga, os grupos CTR e

DM apresentaram aumento significativo após os choques [t(8)=3,31, p=0,005] e

[t(9)=2,39, p=0,020], respectivamente (Figura 13 B).

Figura 13: Efeito da administração intranasal repetida com DM (0,5 mg, n=10) ou veículo (CTR, n=9) no treino da tarefa de medo condicionado ao contexto realizado 150 segundos antes e após o choque. A figura (A) mostra o tempo de freezing e (B) o número de tentativas de fuga dos animais dos dois grupos. Os grupos CTR e DM apresentam comportamento semelhantes, aumentando o comportamento de freezing e tentativa de fuga depois dos choques. Os dados são expressos como média ± EPM. *p < 0,05; **p < 0,01 e ***p<0,001 comparado ao grupo CTR antes dos choques (Teste-t para amostras pareadas).

46

No teste, quando os dados foram avaliados minuto a minuto, foi observado que

houve diferença significativa no tempo de congelamento [t (17) =1,85, p=0,040] e no

número de tentativa de fuga [t (17) = 1,94, p=0,035] no segundo minuto do teste,

mostrando que os animais do grupo CTR apesentaram um comportamento de

antecipação do choque quando comparados aos animais do grupo DM nesse mesmo

minuto (Figura 14 A e 14 B).

Figura 14: Efeito da administração intranasal repetida de DM (0,5 mg n=10) ou veículo (CTR,

n=9) no teste da tarefa de medo condicionado ao contexto. A figura (A) mostra o tempo de

freezing dos animais e (B) o número de tentativas de fuga a cada minuto do teste. Houve uma

redução da duração de freezing dos animais tratados com DM e essa redução ocorreu no 2º

minuto do teste. Foi observado também que os animais tratados com DM aumentaram o

número de tentativas de fuga no 2º minuto do teste. Os dados são expressos como média ±

EPM. *p < 0,05 comparado ao CTR (Teste-t para amostras não pareadas).

47

6.1.5 Alternação espontânea

No teste de alternação espontânea (memória operacional), realizado 48 horas

após a 2ª administração intranasal de DM 0,5 mg, não houve diferença significativa

quanto a porcentagem de exploração [t (12) = 0,59, p = 0,566] e no número de braços

visitados [t (12) = 0,02, p = 0,981] entre os grupos CTR e DM 0,5 mg (Figura 15 A e

15 B).

Figura 15: Efeito da administração intranasal repetida de DM (0,5 mg, n=6) ou veículo (CTR, n=8) no teste de alternação espontânea. A figura (A) representa a porcentagem de alternação e (B) o número de braços visitados. Os dados são expressos como média ± EPM. (Teste-t para amostras não pareadas).

48

6.1.6 Contagem de células

Para o número de neurônios TH+ na SNpc, o teste-t simples revelou diminuição

do número de células no grupo DM 0,5 mg quando comparado ao grupo CTR [t (14)

= 5,16, p < 0,001] (Figura 16 e 17). Quando os números de neurônios TH+ no VTA

foram analisados, o teste-t simples mostrou que houve uma diminuição do número de

neurônios TH+ no grupo DM 0,5 mg quando comparado ao CTR [t (13) = 5,80 p <

0,001] (Figura 16 e 17).

Figura 16: Efeito da administração intranasal repetida de DM (0,5 mg, n=8-9) ou veículo (CTR, n=6-8) no número de TH+ na SNpc e VTA. Diminuição no número de células foi observada para o grupo DM nas duas áreas analisadas. Os valores foram normalizados pelo grupo CTR e expressos como média e EPM. ***p<0,001 comparando o grupo DM 0,5 mg ao grupo CTR (Teste-t para amostras não pareadas).

49

Figura 17: Imagens representativas da SNpc e de VTA dos animais tratados com DM 0,5 mg ou veículo intranasal (CTR). Barra de escala: 500 μm.

6.1.7 Densitometria óptica relativa - DOR

Para análise da Densidade Óptica Relativa (DOR) no estriado dorsal, o teste-t

simples revelou um aumento da DOR no grupo DM 0,5 mg quando comparado ao

grupo CTR [t (13) = 2,52, p = 0,025], mostrando um possível aumento do TH no

estriado após o tratamento repetido com a DM (Figura 18 e 19).

Figura 18: Efeito da administração intranasal repetida de DM (0,5 mg, n=7) ou veículo (CTR,

n=8) na densitometria óptica relativa (DOR) do estriado dorsal. O grupo tratado com DM mostrou um aumento na DOR quando comparado ao grupo CTR. Os valores foram normalizados pelo grupo CTR e expressos como média ± EPM. *p < 0,05 comparando o grupo DM 0,5 mg ao grupo CTR (Teste-t para amostras não pareadas).

50

Figura 19: Imagens representativas do estriado dorsal dos animais tratados com DM 0,5 mg veículo intranasal (CTR). Barra de escala: 1000 µm.

51

6.2 Experimento 2: administração intracerebroventricular de DM

6.2.1 Comportamento de Catalepsia

A ANOVA de medidas repetidas não revelou efeito do tempo (dias do

tratamento) [F (5,80) = 10,56, p = 0,605], efeito do tratamento (CTR, DM 0,5 e DM 5

µg) [F (2,16) = 0,36, p = 0,705], e interação tempo x tratamento [F (10,80) = 1,14, p =

0,34] (Figura 20).

Figura 20: Efeito da administração i.c.v. repetida com veículo (CTR, n=7), DM 0,5 (DM 0,5 µg, n=7) ou DM 5 (DM 5 µg, n=5) no comportamento de catalepsia. A ANOVA de medidas repetidas não revelou efeito do tempo (dias do tratamento), não mostrou diferença significativa em relação ao tratamento (CTR e DM) e interação tempo x tratamento. Os dados são expressos como média ± EPM.

52

6.2.2 Campo aberto

O teste do campo aberto foi feito no dia 15 (24h após a 3ª injeção

intracerebroventricular de DM). A ANOVA de uma via mostrou que houve efeito do

tratamento (CTR, DM 0,5 µg e DM 5 µg) na distância percorrida no campo [F (2,16) =

6,78, p < 0,01]. O pós-teste de Tukey mostrou que os animais tratados com DM 5 µg

percorreram maior distância quando comparados aos animais do grupo CTR (p =

0,014) e aos animais tratados com DM 0,5 µg (p = 0,011) (Figura 21 A). Para o tempo

de permanência no centro, a ANOVA de uma via não revelou diferenças significativas

entre os grupos [F (2,16) = 0,35, p = 0,710] (Figura 21 B).

Em relação ao número de rearing, a ANOVA de uma via mostrou que houve

efeito do tratamento (CTR, DM 0,5 µg e DM 5 µg) [F(2,16) = 9,34, p = 0,002] e o pós-

teste de Tukey revelou que o grupo tratado com DM 5 µg fez maior quantidade de

movimento de rearing quando comparado ao grupo CTR ( p=0,015) e aos animais

tratados com DM 0,5 µg (p = 0,022) (Figura 21 C).

53

Figura 21: Efeito da administração i.c.v. repetida com veículo (CTR, n=7), DM 0,5 (DM 0,5 µg, n=7) ou DM 5 (DM 5 µg, n=5) na (A) distância total percorrida; (B) tempo de permanência na zona interna e (C) número de rearing. Os animais do grupo DM 5 mostraram aumento na distância percorrida e no número de rearing quando comparados aos grupos CTR e DM 0,5. Os dados são expressos como média ± EPM. * p < 0,05 comparando o grupo DM 5 µg ao CTR e # p < 0,05 quando o grupo DM 5 µg foi comparado ao grupo DM 0,5 µg (ANOVA de medidas repetidas e pós-teste de Tukey).

54

6.2.3 Alternação espontânea

O teste da alternação espontânea (memória operacional) foi realizado no 14º

dia, 48 horas após a 2ª administração i.c.v. de DM. A ANOVA de uma via revelou

efeito do tratamento (CTR, DM 0,5 µg e DM 5 µg) [F (2,13) = 4,69, p = 0,029]. O pós-

teste de Tukey mostrou que os animais do grupo DM 5 µg reduziram a porcentagem

de exploração quando comparados aos animais do grupo CTR (p = 0,031), mostrando

um possível prejuízo cognitivo na tarefa (Figura 22 A).

Em relação ao número de braços visitados, a ANOVA de uma via mostrou efeito

significativo do tratamento [F (2,16) = 5,42, p = 0,016]. Através do pós-teste de Tukey,

foi observado que houve um aumento significativo do número de braços visitados

quando comparado o grupo DM 5 µg com o CTR (p = 0,019) e com o grupo DM 0,5

µg (p = 0,035) (Figura 22 B).

Figura 22: Efeito da administração i.c.v. repetida com veículo (CTR, n = 6 - 7), DM 0,5 (DM 0,5 µg, n = 6 - 7) ou DM 5 (DM 5 µg, n = 4 - 5) no teste de alternação espontânea. A figura (A) representa a porcentagem de alternação e (B) o número de braços visitados. O grupo DM 5 mostrou diminuição na % de alternações quando comparado ao grupo CTR e aumento no número de entradas nos braços, quando comparado aos grupos CTR e DM 0,5. Os dados são expressos como média ± EPM. * p < 0,05 comparando o DM 5 µg ao grupo CTR e # p < 0,05 quando o grupo DM 5 µg foi comparado ao grupo DM 0,5 µg (ANOVA de uma via e pós-teste de Tukey).

55

6.2.4 Contagem de células

Para o número de neurônios TH+ na SNpc, a ANOVA de uma via revelou que

o tratamento repetido com DM i.c.v. causou alteração no número de células [F (2,16)

= 12,74, p < 0,001]. O pós-teste de Tukey mostra que houve uma redução do número

de células TH+ quando o grupo tratado com DM 5 µg foi comparado aos grupos CTR

(p < 0,01) e DM 0,5 µg (p < 0,001). Resultado semelhante foi encontrado para o

número de células no VTA, em que a ANOVA de uma via mostrou efeito do tratamento

[F (2,16) = 22,06, p < 0,001] e que houve redução do número de células TH+ quando

o grupo tratado com DM 5 µg foi comparado aos grupos CTR (p < 0,001) e DM 0,5 µg

(p < 0,001) (Figura 23).

Figura 23: Efeito da administração i.c.v. repetida com veículo (CTR, n = 7), DM 0,5 (DM 0,5 µg, n=7) ou DM 5 (DM 5 µg, n=5) no número de células TH+ na SNpc (A) e VTA (B). O grupo DM 5 apresentou diminuição do número de células quando comprados aos grupos CTR e ao DM 0,5 na SNpc e no VTA. Os valores foram normalizados pelo grupo CTR e expressos como média ± EPM. ** p < 0,01, *** p < 0,001 comparando o DM 5 µg ao grupo CTR e # p < 0,001 quando o grupo DM 5 µg foi comparado ao grupo DM 0,5 µg (ANOVA de uma via e pós-teste de Tukey).

56

Figura 24: Imagens representativas da SNpc e de VTA dos animais tratados com veículo (CTR), DM 0,5 µg ou DM 5 µg intracerebroventricular. Barra de escala: 500 µm.

6.2.5 Densitometria óptica relativa - DOR

A ANOVA de uma via mostrou que houve efeito do tratamento sobre a DOR no

estriado dorsal [F (2,16) = 18,28, p < 0,001]. O pós-teste de Tukey revelou que houve

redução da DOR para os grupos DM 0,5 µg (p < 0,01) e DM 5 µg (p < 0,001) quando

comparados ao grupo CTR, mostrando uma possível redução dos níveis de TH no

estriado dorsal dos animais tratados com DM (Figura 25).

Figura 25: Efeito da administração i.c.v. repetida com veículo (CTR, n = 7), DM 0,5 (DM 0,5 µg, n=7) ou DM 5 (DM 5 µg, n=5) na densitometria óptica (DOR) no estriado dorsal. O tratamento com DM causou uma redução na DOR do estriado dorsal dos animais, quando comparados aos do grupo controle. Os valores foram normalizados pelo grupo CTR e expressos como média ± EPM. **p < 0,01 comparando o DM 0,5 µg e *** p < 0,001 quando comparados ao grupo CTR. (ANOVA de uma via e pós-teste de Tukey).

57

Figura 26: Imagens representativas do estriado dorsal dos animais tratados com DM 0,5 µg, DM 5 µg e veículo (CTR) intracerebroventricular. Barra de escala: 1000 µm.

58

7. DISCUSSÃO

No presente estudo nós investigamos as alterações motoras, cognitivas e

neuroquímicas causadas pela administração repetida da deltametrina (DM) em ratos

por duas vias de administração: intranasal (i.n.) e intracerebroventricular (i.c.v.). No

experimento i.n., observamos que houve alterações motoras, com aumento no

número de rearing no campo aberto na última semana de realização do teste;

alterações cognitivas no teste de reconhecimento de objeto novo na primeira semana

de experimento e no medo condicionado ao contexto na terceira semana de

experimento. As alterações motoras e cognitivas foram acompanhadas por mudanças

neuroquímicas, com diminuição de células TH+ na SNpc, VTA e aumento de seus

níveis no estriado dorsal. Já no experimento i.c.v., observamos que houve alterações

motoras no campo aberto, com aumento da distância percorrida e número de rearing

dos animais tratados com a maior concentração de DM e alterações cognitivas na

alternação espontânea, com redução da porcentagem de alternação e aumento do

número de entrada nos braços dos animais que receberam a DM 5. Essas alterações

também foram acompanhadas por prejuízos neuroquímicos, com redução de células

TH+ na SNpc, VTA e de seus níveis no estriado dorsal.

A deltametrina (DM) é um dos piretróides sintéticos mais potentes do tipo II,

amplamente utilizado para controlar insetos na agricultura, ambiente doméstico e

usado também no controle de vetores na saúde pública. Age atrasando o fechamento

de canais de sódio, causando a despolarização persistente da membrana, podendo

levar a convulsão, paralisia e morte (RICCI et al., 2013). Recentemente, a literatura

mostra que o pesticida estimula o receptor glutamatérgico ou bloqueia o receptor

GABA (MORIKAWA; FURUHAMA, 2009) e tem ação dopaminérgica. A exposição aos

piretróides podem induzir prejuízos neurocomportamentais em roedores e humanos,

que incluem aspectos motores, ansiedade, comportamento condicionado e

comportamento agressivo (WOLANSKY; HARRIL, 2008).

No presente trabalho analisamos o comportamento motor de ratos tratados com

DM por duas diferentes vias de administração (i.n. e i.c.v.), através do teste de

59

catalepsia. Esse teste é baseado na latência para o animal sair da posição inicial,

através da retirada da pata e é usado para avaliar alterações motoras em modelos

animais da DP (SANTOS et al., 2013). Esse retardo em iniciar movimentos é comum

por pacientes que possuem a DP (SMULDERS et al., 2015) e já foi demonstrado por

outros pesquisadores em modelos animais (FERNANDES et al., 2012). No

experimento I e II do presente estudo não foram observadas alterações significativas

no tempo na barra dos animais que receberam DM, quando comparados com o

controle (figura 10 e 20). No experimento I, os animais do grupo DM apresentaram

uma grande variabilidade quanto ao comportamento na barra, o que pode ter

dificultado uma possível diferença entre os dois grupos analisados.

Um outro teste realizado para avaliar as alterações motoras foi o campo aberto,

em que foi analisada a atividade locomotora espontânea e foram observados

parâmetros como distância total percorrida pelo animal no aparato, tempo de

permanência no centro e comportamento de rearing. Observamos que a

administração i.n. de DM não causou alterações na distância total percorrida;

enquanto que a administração i.c.v. de DM 5 µg causou um aumento da atividade

motora (Figura 21), mostrando uma hiperexcitação dos animais. É citado na literatura

que os piretróides podem causar excitação excessiva em animais tratados com doses

moderadas de DM (NIERADKO-IWANICKA; BORZECKI, 2015). Já o comportamento

de rearing foi aumentado após a terceira injeção i..n. (Figura 11) e também no

experimento i.c.v. Habr et al. (2014) observou que a administração de DM 10 mg/kg

via oral reduziu a frequência de rearing, mas não afetou a locomoção na distância

percorrida e tempo de imobilidade no campo aberto. Lazarani et al. (2001) mostram

que ratos machos e fêmeas com 21 dias de vida, tratados com DM, não apresentaram

diferença significativa quanto ao número de rearing e ao comportamento locomotor no

campo aberto. Segundo os mesmos autores, o tempo de imobilidade, que reflete

alterações motoras no campo aberto, não foi modificado pela exposição à DM pré-

natal. Já Ricci et al. (2013), mostra que a DM 3 mg/kg administrada por gavagem,

aumenta o tempo de duração da imobilidade comparando ao controle.

Segundo Habr et al. (2014) a redução da frequência de rearing ocorreu devido

a diminuição da atividade dopaminérgica estriatal. No presente trabalho, através da

60

contagem de células, observamos uma redução do número de neurônios TH+ em VTA

e SNpc nos dois experimentos (Figuras 16 e 23). Entretanto, através da análise da

Densidade Óptica Relativa (DOR), observamos um aumento da atividade

dopaminérgica estriatal na administração de DM i.n. (Figura 18) e uma diminuição

dessa atividade quando a DM foi administrada por via i.c.v. (Figura 25). Uma hipótese

para explicar o efeito apresentado no experimento I seria um mecanismo

compensatório da via dopaminérgica. No experimento i.n. houve repetida depleção de

dopamina e a administração da DM ocorreu a cada 7 dias, ou seja, as células

remanescentes na SNpc enviaram mais projeções para o estriado, afim de manter as

funções fisiológicas normais da via nigroestriatal, por isso houve um aumento dos

níveis de TH no estriado dorsal. Já no experimento i.c.v., as administrações da DM

foram realizadas a cada 48 horas, ou seja, em menor intervalo de tempo. Com isso, o

mecanismo compensatório das projeções dopaminérgicas estriatais possivelmente

foram dificultados, apresentando então uma redução da DOR no estriado dorsal.

Na literatura é bem conhecido que a dopamina é o um dos principais

neurotransmissores envolvidos no controle do sistema motor (PREDIGER et al., 2010;

NIERADKO-IWANICKA; BORZECKI, 2015; TRISTÃO et al., 2014). Na Doença de

Parkinson, a perda de 50-60% de neurônios dopaminérgicos na SNpc, acarreta na

diminuição dos níveis de dopamina no estriado. Essa diminuição de dopamina na via

nigroestriatal é responsável pelos sintomas motores que são os sinais cardinais

utilizados no diagnóstico da doença. Embora as causas da DP sejam desconhecidas,

alguns estudos epidemiológicos e experimentais sugerem que a exposição a agentes,

incluindo agrotóxicos, podem contribuir para essa patogenia (GORELL et al., 1998).

Esses agentes podem entrar no cérebro via neuroepitélio olfatório, uma concepção

chamada hipótese do vetor olfatório (DOTY, 2008; PREDIGER et al., 2010). De acordo

com essa hipótese, estudos mostram que a infusão intranasal de neurotoxinas das

vias dopaminérgicas, como 6-OHDA e MPTP podem resultar na invasão desses

agentes em estruturas cerebrais de roedores, podendo até causar danos severos nas

estruturas cerebrais. A via intranasal de inoculação de substâncias, tem contribuído

para melhor entendimento das características da DP, incluindo a avaliação de risco

causada por neurotoxinas ambientais.

61

Alguns modelos já são bem estabelecidos na literatura, porém substâncias

rotineiras, como a deltametrina, ainda são pouco estudadas. O foco desses modelos

animais já existentes, é a habilidade de induzir dano na via nigroestriatal e alterações

motoras associadas às fases da doença. Já foi citado que a DP possui estágios pré-

clínicos que são acompanhados de alterações em várias funções, como emocional,

olfatório e cognitivo. A doença de Parkinson parece produzir também déficit na

memória de reconhecimento, disfunções que envolvem memória de trabalho e déficit

de atenção (BRONNICK et al., 2006; HIGGISON et al., 2003; LEWIS et al., 2003;

PREDIGER et al., 2010).

Nesse contexto, avaliamos nesse trabalho, memória de reconhecimento a curto

prazo, no teste de reconhecimento de objeto novo, memória aversiva a longo prazo,

na tarefa de medo condicionado ao contexto e memória operacional no teste de

alternação espontânea, esse último em ambos experimentos. Nós avaliamos a

memória a curto prazo no teste de reconhecimento de objeto novo no dia 3 do

experimento I e observamos que o grupo tratado com DM apresentou um déficit em

reconhecer objetos novos (Figura 12). A tarefa de reconhecimento de objeto novo

consiste em avaliar a memória de reconhecimento através do paradigma

reconhecimento (VANN; ALBASSER, 2011), em que é o animal é apresentado a dois

objetos idênticos, distribuídos em pontos fixos de um campo aberto, durante a sessão

de treino. Uma hora depois, são apresentados ao mesmo animal um dos objetos já

conhecidos e um objeto novo. No presente estudo, o déficit cognitivo ocorreu antes

dos prejuízos motores causados pela administração i.n. de DM, como ocorre na DP

(PREDIGER et al., 2010; PREDIGER et al., 2006; DALAKER et al., 2011). Já foi

mostrado na literatura que variações nos níveis de monoaminas induzido por algumas

substâncias, como a reserpina, pode promover déficit cognitivo na ausência de

prejuízo motor (CARVALHO et al., 2006; FERNANDES et al., 2008; SANTOS et al.,

2013). Alguns estudos sugerem que a degeneração parcial dopaminérgica no

estriado, e em pararelo, alterações noradrenérgica e serotonérgica no estriado e no

córtex pré-frontal, podem causar déficit emocional e cognitivo, observados em

modelos com ratos na fase precoce da DP (TADAIESKY et al., 2008). Outros

experimentos que avaliam memória de curto prazo, como reconhecimento social, em

62

animais tratados com MPTP, também mostram danos nesse tipo de memória

(PREDIGER et al., 2010).

A memória a longo prazo foi avaliada através do teste de medo condicionado

ao contexto realizado nos dias 12 (treino) e dia 13 (teste). Essa tarefa é baseada em

um procedimento clássico utilizado para avaliar a memória de longo prazo. Nós

observamos déficit nesse tipo de memória induzido pela administração intranasal de

DM. No treino, os grupos CTR e DM apresentam comportamento semelhantes,

aumentando os comportamentos de freezing e tentativa de fuga antes e após o

choque (Figura 13). No teste, houve redução do tempo de freezing nos animais

tratados, e essa diferença ocorreu no segundo minuto do teste (Figura 14). Em relação

a tentativa de fuga, os animais DM aumentam o parâmetro no segundo minuto de

teste. É importante destacar que os animais controle entram em freezing mais rápido

que os animais tratados com a DM, demostrando melhor desempenho na tarefa.

Podemos observar também que os animais utilizam estratégias diferentes em relação

ao medo: os animais controle tentam entram em freezing, enquanto que os tratados

com DM tentam fugir. Esses resultados corroboram com trabalhos prévios feitos com

reserpina, em que os animais tratados com essa substância apresentaram prejuízo

nesse tipo de memória. Esse tipo de memória parece estar relacionado ao

processamento emocional e esse tipo de alteração também é observada na DP

(BOWERS et al., 2006). Caetano (2012) mostrou que os receptores da família D2, e

não D1, estão envolvidos na expressão do medo condicionado ao contexto. Além

disso, observou que uma diminuição na expressão do congelamento condicionado

(freezing) e os efeitos obtidos com a administração sistêmica deve-se a sua ação no

VTA. Com isso, o VTA parece atuar na modulação das respostas de medo

condicionado e a ativação desta estrutura deve ser importante para recuperação da

aprendizagem aversiva ocorrida no dia do condicionamento. Como já mostrado

anteriormente, na nossa pesquisa, houve redução das células TH+ em VTA em ambos

experimentos, podendo ser esse um dos fatores causadores desse prejuízo cognitivo.

A memória operacional foi avaliada através da tarefa de alternação espontânea.

Essa tarefa é baseada na tendência que o animal apresenta de explorar de forma

abrangente o lugar, quando é exposto a um novo ambiente, dessa forma passa a

63

alternar entre os braços do labirinto. No experimento i.n. foi observado que a

porcentagem de alternações e o número de entrada nos braços não se diferenciaram

entre os grupos, mostrando ausência do efeito da DM no teste (Figura 15). Em um

trabalho em que foi realizada a infusão intranasal de MPTP, os animais não

apresentaram alteração no teste do labirinto aquático, teste que também avalia

memória operacional (CASTRO et al., 2013). Em um estudo baseado na

administração de reserpina, foi observado que a porcentagem de alternações não se

diferenciou entre os grupos, mostrando ausência do efeito da reserpina nessa tarefa

(SOUZA, 2008). Entretanto, no experimento i.c.v. realizado nesse estudo, (Figura 22),

houve uma redução da porcentagem de alternação no grupo com dose mais alta de

DM e um aumento do número de entrada nos braços quando comparado aos outros

grupos. Esse resultado mostrou mais uma vez, uma possível hiperexcitação dos

animais tratados com DM 5 µg no experimento i.c.v. e também menor atenção, já que

o número de entrada nos braços foi maior, porém a porcentagem de alternação foi

menor. Provavelmente, o tamanho da lesão na via dopaminérgica pode ser um dos

fatores que influenciaram nesse último experimento. Tem sido sugerido prejuízos

cognitivos em estágios precoces da DP, assemelhando-se aqueles que ocorrem no

lobo frontal, que incluem prejuízos em funções executivas, como planejamento e

memória operacional (LEWIS et al., 2003). Muitas dessas funções cognitivas são

prejudicadas em doenças mentais (transtorno do déficit de atenção, hiperatividade e

esquizofrenia) e a DP. Estudos realizados com primatas humanos e não-humanos

mostra o envolvimento do desequilíbrio de catecolaminas pré-frontais no controle

dessas funções (CLARK e NOUDOOST, 2014).

Tendo em vista a importância econômica dos piretróides, dentre eles a DM, que

é o foco do estudo, é interessante citar que são poucos os trabalhos que relacionam

os efeitos dos piretróides com os mecanismos dopaminérgicos. A DM pode causar

aumento da dopamina extracelular e há indícios que a TH é o alvo molecular da DM

no metabolismo dopaminérgico na via nigroestriatal (HOSSAIN et al., 2006; LIU et al.,

2006). A atividade da neurotransmissão estriatal é modulada diferentemente em

piretróides variados. Parece que os piretróides alteram a dopamina estriatal

extracelular em cérebro de ratos afetando canais de sódio e cálcio nos terminais

nigroestriatais dopaminérgicos ou interneurônios GABAérgicos (HOSSAIN et al.,

64

2006). Pesquisadores observaram que a DM produz maiores prejuízos

dopaminérgicos no estriado, quando comparados à SNpc, sugerindo que as

inervações dopaminérgicas do estriado são mais suscetíveis ao pesticida quando

comparados aos corpos celulares nigrais (LIU et al., 2006).

Nós mostramos no presente estudo que o tratamento com DM por via intranasal

não foi capaz de causar alterações motoras significativas para o comportamento de

catalepsia analisada diariamente. Esse tratamento foi capaz de causar aumento no

número de rearing na atividade de campo aberto; alterações cognitivas, como

memória de curto prazo no teste de reconhecimento de objeto novo e memória de

longo prazo no teste do medo condicionado ao contexto. No experimento i.n. as

alterações cognitivas precederam as alterações motoras. É interessante notar que

essas mudanças foram acompanhadas da redução do número de células TH+ em

VTA e na SNpc, porém, houve um aumento no nível de TH estriatal. Já com tratamento

com DM por via intracerebroventricular, ocorrerem alterações motores no campo

aberto e cognitivos na alternação espontânea. Esses danos foram acompanhados

pela redução no número de células TH+ na SNpc e VTA e da redução da DOR no

estriado dorsal.

Novos estudos deverão ser realizados para esclarecer aspectos ainda pouco

compreendidos acerca das alterações motoras, cognitivas e neuroquímicas causadas

pela DM. Entretanto, o tratamento com DM por duas vias de administração obteve

resultados semelhantes a modelos que propõem estudar estágios iniciais da DP,

mimetizando, em vários aspectos, a natureza progressiva da DP em outros modelos

e em humanos.

65

8. CONCLUSÃO

Nesse estudo nós mostramos que os tratamentos com injeções repetidas de

DM i.n. ou i.c.v. foram capazes de causar alterações cognitivas e emocionais, na

ausência de alterações motoras. Essas alterações foram acompanhadas da redução

de neurônios TH+ na SNpc e VTA, mostrando o envolvimento da via dopaminérgica.

O curso temporal das alterações motoras e cognitivas, associados à redução de

neurônios dopaminérgicos, podem ser relacionados com diferentes estágios da DP,

em humanos e em modelos animais progressivos da doença, sugerindo que esse seja

um possível modelo animal para se compreender melhor possíveis alterações

envolvidas na natureza progressiva da DP. Porém, outros estudos deverão ser

realizados para se conhecer melhor os efeitos causados por esse pesticida sobre os

mecanismos comportamentais e neuroquímicos.

66

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