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CENTRIFUGACIN DE DNA POR CSCL

La centrifugacin con CsCl (cloruro de cesio) es un mtodo para separar ADNpor densidad.

Para separar al ADN separado con base en densidad, EL ADN se mecla con

CsCl ! es centrifugado a mu! alta "elocidad (p. e#., $%,%%% rpm) en unaultracentrifuga por muc&as &oras. Como los tubos giran, las fueras opuestasde sedimentacin ! difusin producen un gradiente lineal estable de CsCl conla m's ba#a densidad arriba ! la densidad m's pesada en el fondo. Al formarseel gradiente de CsCl, el ADN se euilibra en el gradiente donde su densidadiguala la densidad del circundante CsCl. i el ADN de una densidad est'presente, el resultado ser' una sola banda de ADN. i dos ADN est'n presentescon densidades diferentes, el resultado ser' dos bandas de ADN.

Experimento de Meselson y St!l

*eselson ! col. (+$-) desarrollaron una tcnica de centrifugacin engradiente de densidad. Cuando se centrifuga a alta "elocidad un solucindensa (saturada) de un soluto de ba#o peso molecular (ClCs -,- *,sucrosa, etc.) se produce un euilibrio entre dos fueras opuestas, la dedifusin del soluto ! la fuera de sedimentacin, como consecuencia seproduce un gradiente de densidad ue aumenta en la direccin de lafuera centrfuga (aumenta a medida ue a"anamos &acia el fondo deltubo de centrifuga). i a/adimos al centrifugar una molcula de ADN, est'migrar' &acia el fondo del tubo &asta llegar al punto en ue la densidaddel soluto de ba#o peso molecular (la densidad del ClCs) coincide con ladensidad del ADN centrifugado (densidad de 0otacin). Posteriormente, esposible aislar las molculas de ADN de diferente densidad practicando unori1cio en el fondo del tubo ! sacando "arias fracciones diferentes.

2ambin es posible pinc&ar el tubo con una #eringa, #usto en la posicin dela banda ! e3traer el ADN contenido de esa ona del tubo.

T"CNICAS DE PATC# CLAMP

Cell tt$!ed

La pipeta se posiciona sobre la membrana celular donde se consigue unamu! buena cone3in generando un sello de alta resistencia (del orden delgiga o&m). eg4n el tama/o de la pipeta, esta puede lograr la cone3incon un canal (canal 4nico) o con "arios canales (macro parc&e). Estacon1guracin permite la manipulacin de la clula intacta, lo ue impidela posibilidad de cambiar f'cilmente la composicin del medio interno

(intracelular). Por otra parte, !a ue la pipeta se comporta como el medioe3tracelular, la composicin de sta puede ser modi1cada seg4n lasnecesidades del in"estigador.

%!ole $ell

Para lle"ar a cabo esta tcnica es necesario lograr primero lacon1guracin cell attac&ed. 5na "e conseguido el gigasello (resistenciadel orden del giga o&m), es necesario romper la membrana ue est' por

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deba#o del ori1cio de la pipeta pro"ocando con esto, el contacto elctricodirecto con el citoplasma, de tal modo, ue la solucin de registro ubicadaen el interior de la pipeta ueda en contacto con el medio interno de laclula. 5n mtodo com4n para romper la membrana es aplicarle unapeue/a succin al parc&e.

6a ue el "olumen de una clula es peue/o comparado con la pipeta deparc&e, la composicin del 0uido intracelular puede ser considerado igualal de la solucin de registro ue llena la pipeta. i lo ue se desea esemular una situacin 1siolgica, entonces la pipeta deber' ser llenada conuna solucin de composicin inica ue se acerue lo m's posible a lacomposicin interna de la clula.

En muc&os casos es posible aplicar parc&e perforado, donde el contactoelctrico con el citosol es establecido por la adicin a la pipeta de agentesperforadores de membrana. Agentes perforadores como la nistatina o laamfotericina 7 perforan la membrana, por lo ue solamente molculaspeue/as como los iones pueden pasar a tra"s de los agu#erosproducidos, manteniendo de este modo la composicin citoplasm'ticaintacta, en cuanto a su composicin org'nica.

O&tside o&t

Esta tcnica pro"ee al in"estigador un control total del ambiente delparc&e ! de los canales inicos ue se encuentran en ste, tanto elctricacomo umicamente.

8utside out, se re1ere a ue la cara e3terna de la membrana celularueda orientada &acia el ba/o, mientras ue por el contrario, la

con1guracin inside out utilia la cara intracelular orientada &acia el ba/o.

La con1guracin outside out es obtenida simplemente tirando la pipeta dela membrana celular, una "e obtenida la con1guracin9&ole cell. De estemodo, la membrana se rompe ! seg4n las propiedades de los fosfolpidos,estos se "uel"en a #untar formando nue"amente un parc&e en la pipeta.A&ora entonces, la solucin inica contenida en la pipeta ser' como elinterior de la clula. Los parc&es outside out pueden ser utiliados paraestudiar el efecto de factores e3tracelulares en el canal, !a ue lacomposicin del ba/o puede ser f'cilmente alterada durante el registro.

Inside o&t

La con1guracin inside out es obtenida desde la con1guracin cellattac&ed. 5na "e en esta con1guracin, a tra"s de un sua"e tirn lapipeta es separada de la membrana form'ndose una "sicula alrededorde la boca de la pipeta. La "escula puede ser rota al sacar la pipeta delba/o ! e3poner la "escula al aire. Esto produce un parc&e donde la carainterna de la membrana celular ueda e3puesta &acia el e3terior (ba/o) !la cara e3terna ueda e3puesta al interior de la pipeta. Los parc&es inside

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out son ideales para estudiar el efecto de factores citoslicos en loscanales.