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Cellules souches et cellules proliférantes.
Régulation de la différenciation cellulaire
Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre 2010 L.Mauvieux
Concept de la cellule souche
• Cellule à longue durée de vie• Capable d’auto-renouvellement (duplication sans perte des
capacités de développement)• Pouvant donner naissance à de multiples types cellulaires
(différenciation)• Dans les conditions adéquates, peuvent se différencier en
cellules originaires normalement des 3 couches embryonnaires: endoderme, mésoderme ectodermes
• Capables de Prolifération• De régénérer des tissus après blessure• De plasticité dans ces différentes options
Hierarchie des cellules souches
Epiderme
Jargon des cellules souches
Potence définit la capacité à se différencier en différents types cellulaires
Pluripotent pouvant donner naissance à tous les types cellulaires adultes Les cellules souches embryonnaires sont pluri-potentes
Multipotent pouvant se différencier en de multiples types de cellules spécialisées, mais pas toutes
les cellules souches tissulaires (adultes) sont multipotentes
Cellules souches embryonnaires:
– 1) Cellules ES• Dérivées du blastocyste en culture• Par transfert nucléaire d’une cellule somatique dans
un œuf énucléé
– 2) Cellules somatiques « reprogrammées »• « induced pluripotent stem cells » (iPS)
– TFs, Oct4, Sox2, cMyc and Klf4– Sox2 et Hox4
Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines
J0 J1 J2
J3J4J5
compactionblastocyste
Feeder de fibroblastes murins
Colonie de cellules ES
Critères pour caractériser le caractère de cellule souche
(« stemness ») • Auto-renouvellement:
– Potentiel de renouvellement illimité in vitro– Expression de facteurs de transcription
caractérisant la cellule souche (nanoG, oct4, SOX2, TERT…)
• Pluripotence in vitro:– Formation de tératomes dans la souris
imunocompétente (potentiel tumoral)– Pluripotence in vitro
Formation de Tératome
• Tumeur hétérogène composée de cellules issues des trois feuillets embryonnaires– Ectoderme (peau, poils, dents…)– Mésoderme (os, cartilage, muscle…)– Endoderme (épithélium gastro-intestinal, bronchique…)
Pluripotence des cellules ES in vitro
Cellules souches embryonnaires:
– 1) Cellules ES• Dérivées du blastocyste en culture• Par transfert nucléaire d’une cellule somatique
dans un œuf énucléé
– 2) Cellules somatiques « reprogrammées »• « induced pluripotent stem cells » (iPS)
– TFs, Oct4, Sox2, cMyc and Klf4– Sox2 et Hox4
Chez l’homme
Cellules souches « adultes »
Tissus à renouvellement rapide=cellules souches
cheveux Épithélium digestif
Moelle osseuse
Cellules souches adultes• Les cellules souches adultes sont cruciales pour le
renouvellement tissulaire• Ces cellules sont capables d’auto-renouvellement
et de différenciation• L’homéostasie d’un organisme adulte résulte de
l’équilibre entre:– l’état quiescent de ces cellules souches (pool de réserve) – et leur mise en cycle (amplification cellulaire pour le
renouvellement tissulaire)• Modèle des cellules souches hématopoïétiques
(CSH)
Modèle CSH
• Durent toute la vie…
• Hématopoïèse
• À la base des greffes de moelle allogéniques: thérapie cellulaire de loin la plus utilisée
Expérience princeps: Till et Mc Culloch, 1961
Irradiation sub-léthale1000Gy
+ Greffe de moelle (IV)
CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUESTRANSFERT ADOPTIF=>GREFFE DE MOELLE
J10: colonies de cellules hématopoïétiques clonales, multi-linéales, dans la rate (CFU-S)
CARACTERISATION DES CSH : reconstitution de l’hématopoïèse à long terme
Suda et coll, Trends in immunology Vol.26 August 2005
Traitement par le 5-fluoro-uracileAnti-métabolite incorporé dans l’ADN et l’ARN
Tri des cellules par cytomètre en flux
• Identification d’une fraction cellulaire capable de reconstituer l’hématopoïèse : contient les cellules souches
– Cellules quiescentes
– Très rares: ~1/10.000 cellules
– Indifférenciées: « lineage negatives » (Lin-)
– Capables d’effluer des colorants (Rhodamine, Hoechst)
par des transporteurs ABC: ABSG2 et MDR1
– Expriment (CD34+), CD133, c-kit
Caractéristiques des CSH• Dans la M.O , le nombre de CSH reste relativement constant en l’absence de perte de sang ou d’autres traumatismes
• L’état de quiescence corrèle avec leur caractère multipotent
• 2 modèles pour expliquer l’homéostasie de l’hématopoïèse
Modèle A:• Dans des conditions normales, ces CSH sont
quiescentes (G0 du cycle cellulaire), mais se divisent régulièrement,– pour assurer la maintenance du pool de CSH– Permet d’éviter d’acquérir des mutations conduisant à
leur transformation maligne– Division asymétrique:
• 1CSH => 1CSH + 1 cellule qui va s’engager dans la différencation
Linheng
– 1 pool de CSH
« dormantes », qui gardent
la capacité de d’activité de
cellule souche
multipotentes
– réagissant aux besoins
suscités par l’organisme
– revenant à l’état dormant
une fois les lésions
réparées
Linheng
Modèle B:
Wilson cell 2008
Population capable de reconstituer l’hématopoïèse: Différents sous types, plus ou moins en cycle
Wilson, Cell décembre 2008
-Injection de BrdU dans les souris à un instant donné-Le BrdU s’intercale dans l’ADN qui devient fluorescent-Suivi du contenu en BrdU par cytométrie en flux
Modèle B: synthèse
Linheng
Organisation de la moelle hématopoïétique
À l’interface os/moelle: Les ostéoblastes:
-fabriquent la trame osseuse
-supportent le développement des CSH:
*Un déficit ostéoblastique entraîne une
diminution importante de l’hématopoïèse (Visnjic, 2004)
*La co-transplantation de d’ostéoblastes avec les cellules souches augmente la prise de greffe (Tachman, Hematology 2000)
Cellules souches Lin- :-marquées à la fluorescéine- Injectée à une souris témoin-analyse 15h après
Localisation des cellules souches au niveau de l’endostéum, au contact des ostéoblastes=> Interactions préférentielles
Nilsson, S. K. et al. Blood 2001
Niche ostéoblastique
La niche hématopoiétique « adulte »-contacts physiques-
La niche hématopoiétique « adulte »-contacts physiques-
La niche hématopoiétique « adulte »
Ang1
La niche hématopoiétique « adulte »
La niche hématopoiétique « adulte »
La niche hématopoiétique « adulte »
CXCL12
CXCL12
SYSTEME NERVEUX SYMPATHIQUE
Noradrénaline
pleraxifor
« Synapse » ostéoblaste - CSH
Synthèse• Les CSH intègrent des signaux qui
proviennent de l’interaction avec:– les ostéoblastes, les cellules réticulaires
(mésenchymateuses)– mais aussi du micro-environnement médullaire
qui est ouvert notamment en raison de la riche vascularisation de la moelle osseuse
– Les cellules en cours de différenciation
• comment peut s’opérer la différenciation et l’expansion des cellules hématopoïétiques?
Etapes de la régulation de l’hématopoïèse
CSH indifférenciéemultipotente
QuiescenceAuto-renouvellement
Engagement
DifférenciationMaturation
Cellules hématopoïétiques différenciées
Hierarchie de l’hématopoïèse
Cultures à long termeCultures à long terme
(5 semaines)
Formation de coloniesFormation de colonies
(10-21 jours)
in vitroin vitro
in vivoin vivo
Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches
Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés
ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures
MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes
in vitroin vitro
Le système hématopoïétique
≥ (4 mois)
CD
34C
D34
++
Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement
99%99%
0,5 à 1%0,5 à 1%
0,01%0,01%
0,0001%0,0001%
*: Facteurs decroissance
*
*
SCID-RC
LTC-IC
CFC
Cultures à long termeCultures à long terme
(5 semaines)
Formation de coloniesFormation de colonies
(10-21 jours)
in vitroin vitro
in vivoin vivo
Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches
Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés
ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures
MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes
in vitroin vitro
Le système hématopoïétique
≥ (4 mois)
CD
34C
D34
++
Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement
99%99%
0,5 à 1%0,5 à 1%
0,01%0,01%
0,0001%0,0001%
*: Facteurs decroissance
*
*
SCID-RC
LTC-IC
CFC
Cultures à long termeCultures à long terme
(5 semaines)
Formation de coloniesFormation de colonies
(10-21 jours)
in vitroin vitro
in vivoin vivo
Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches
Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés
ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures
MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes
in vitroin vitro
Le système hématopoïétique
≥ (4 mois)
CD
34C
D34
++
Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement
99%99%
0,5 à 1%0,5 à 1%
0,01%0,01%
0,0001%0,0001%
*: Facteurs decroissance
*
*
SCID-RC
LTC-IC
CFC
Cultures à long termeCultures à long terme
(5 semaines)
Formation de coloniesFormation de colonies
(10-21 jours)
in vitroin vitro
in vivoin vivo
Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches
Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés
ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures
MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes
in vitroin vitro
Le système hématopoïétique
≥ (4 mois)
CD
34C
D34
++
Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement
99%99%
0,5 à 1%0,5 à 1%
0,01%0,01%
0,0001%0,0001%
*: Facteurs decroissance
*
*
SCID-RC
LTC-IC
CFC
Comment ces mécanismes se mettent-ils en place?
• Régulation simultanée:– Auto-renouvellement de la CSH– Engagement dans la différenciation– Spécification de la lignée– Homéostasie
• Mécanismes:– Machinerie transcriptionnelle (intrinsèque)– Signaux extrinsèques: cytokines, facteurs de
croissance
INDUCTION ET MISE EN ROUTE DU PROGRAMME
DE DIFFERENTIATION
microRNAs
Engagement cellulaire
Contrôle intra-cellulaire: facteurs de transcriptionContrôle extra-cellulaire: facteurs de croissance, cytokines
CSH
CLPCMP
NOTCH-1, Bmi-1 GATA-2, HOX-B4
PU-1, GATA-1
Régulation transcriptionnelle au cours des premiers stades de l’hématopoïèse.
Progéniteur myéloidecommun
Progéniteur lymphoïdecommun
Facteurs de transcription et cytokines
• PU.1: facteur de transcription myéloïde
• PU.1 réprimé par MafB
• La fixation de M-CSF induit l’expression de PU-1, sous l’influence de nombreux événements:– Intinsèques
– Épigénétiques
– externesSarrazin et al., Cell, 2009
Rôle prépondérant de certains facteurs de transcription
De la cellule souche à la cellule différenciée
Kaushansky, NEJM, 2006, 2034-45
De la cellules souche
De la cellule souche
à la cellule différenciée
Rôle prépondérant de certains facteurs de croissance
Facteurs de croissance hématopoïétiques• glycoprotéines monomères (sauf IL-5 et M-CSF, dimères)
• synthèse par un grand nombre de cellules (sauf l'érythropoïétine ou EPO, qui n'est élaborée que par le rein): Lymphocytes, fibroblastes, monocytes, cellules endothéliales, lymphocytes T et B, d' ou leur nom « cytokines »
• Redondance
• Synergies : – Nécessité de plusieurs signaux différents pour la mise en cycle des
progéniteurs
– Réponses prolifératives additives
– Effets distincts et multiples d'une cytokines sur des cibles cellulaires différentes.
• action locale ( hormone): endocrine, paracrine, autocrine.
• Agissent sur un récepteur spécifique: – Niveau d'expression des récepteurs régulé (+ ou -).
– dimérisation du récepteur
– transduction d ’un signal via la phosphorylation du récepteur et des protéines associées vers le noyau
– activation de la transcription de gènes donnés
• Facteurs de promotion et de survie cellulaire, ex:– Stem cell factor (SCF) = kit ligand:
– Viabilité des progéniteurs immatures et myéloïdes– Croissance des progéniteurs immatures myéloides
et erythroblastiques avec d’autres cytokines– Indispensable à l’erythropoièse fœtale (foie)
– FLT-3 ligand:– Croissance des progéniteurs immatures myéloides
et mégacaryocytaires
Facteurs de croissance Hématopoïétiques (1)
• Facteurs de prolifération et de différenciation, ex:– Non spécifiques de lignée:
– Interleukine -3 (IL-3) : action sur toute la myélopoïèse– Interleukine 6 sur tous les progéniteurs
– Spécifiques de lignée:– Granuleux/macrophagiques: GM-CSF, G-CSF, M-CSF– lignée éosinophile : IL-5– lignée érythroïde : érythropoïétine (Epo)– lignée méga : thrombopoïétine (Tpo)– lignée lymphocytaire :
– maturation : IL-2, IL-4,– croissance : IL-7 – différenciation plasmocytaire : IL-6
Facteurs de croissance Hématopoïétiques (2)
Kaushansky, NEJM, 2006, 2034-45
Modèle de l’hématopoïèse
De la cellules souche
De la cellule souche
à la cellule différenciée
Régulation négative de l’hématopoièse
• TGF b (Transforming Growth Factor b ): un inhibiteur de l'entrée en cycle cellulaire des progéniteurs primitifs
• TNF a (Tumour Necrosis Factor a ) agit en fait de manière différente (action inhibitrice ou stimulante) suivant les facteurs de croissance
• MIP 1a (Macrophage-Inflammatory Protein 1a ) ne limite pas son action au tissu hématopoïétique et se trouve impliqué dans de nombreux processus inflammatoires.
• Protéines SOCS (Suppressors Of Cytokine Signaling: SOCS 1-3, CIS)– La synthèse des SOCS est induite très rapidement in vivo et in vitro
(apparition de mRNA) en réponse à la stimulation des cellules cibles par les cytokines comme IL2, IL-3, IL-4, IL-6, interferon-, EPO, G-CSF, GM-CSF, Prolactine, Hormone de croissance.
Mode d’action des protéines SOCS
Synthèse de la différenciation des CSH
• CSPH médullaires qui vont se différentier vers– polynucléaires PNN ou PNE ou PNB,– Globules rouges (GR)– Mégacaryocytes (plaquettes)– Lymphocytes (B,T, NK)
• action intriquée de nombreux facteurs– Facteurs de croissance, interleukines– Molécules d’adhésion– Facteurs de transcription
• 2 modèles d’étude:– Par les gènes spécifiques de la lignée– Par les déficits
• Pathologies• Souris KO