cellular and cytoskeletal dynamics within organ cultures of porcine neuroretina

12
Cellular and Cytoskeletal Dynamics Within Organ Cultures of Porcine Neuroretina JO È RG WINKLER ab *, SEBASTIAN HAGELSTEIN a , MANFRED ROHDE b AND HORST LAQUA a a Department of Experimental Ophthalmology, Medical University of Lu Èbeck, D-23538, Lu Èbeck, Germany and b Department of Microbiology, GBF, German Research Center for Biotechnology, D-38124, Rnaunschweia, Germany Received St. Louis 11 September 2001 and accepted in revised form 5 February 2002) The aim of this study was to establish a retinal organ culture and to follow the cellular and cytoskeletal changes. For this purpose the authors detached porcine neuroretinas from the underlying pigment epithelium, and incubated them for 2 weeks under standardized conditions. After 3, 6, 10, and 13 days in culture the retinal tissues were ®xed, embedded in LR-White resin or paraf®n wax and processed for electron-, light-, immuno¯uorescence- and confocal laser scanning microscopy. Antibodies directed against a-tubulin, actin, glial ®brillary acidic protein GFAP), vimentin, neuro®lament 200 and b-catenin were used to investigate the cytoskeletal changes over a certain period of time. After experimental detachment Mu Èller cells quickly started to hypertrophy showing increased levels of intermediate ®laments i.e. vimentin and GFAP). The actin labelling of photoreceptor cells decreased concomitantly with a rapid degeneration of the outer segments. After 1 week of detachment the Mu È ller cell cytoplasm revealed increasing amounts of actin and tubulin staining. Actin ®laments appeared frequently organized in thick bundles across the full width of the retina, whereas increasing levels of tubulin shifted into the outer nuclear region especially concentrated near the outer limiting membrane. A prolonged time of explant culturing resulted in a discontinuous staining of b-catenin along the adherent junctions of the outer limiting membrane, followed by an outgrowth of Mu È ller cell extensions into the subretinal space. Double staining of tubulin and cones showed that this outgrowth predominantly occurred between cone inner segments. The outer limiting membrane was penetrated by stalk-like structures, highly enriched with tubulin and associated with swollen tips, reaching into the subretina. Electron microscopy demonstrated in detail the focal disruption of the outer limiting membrane by Mu È ller cell extensions and subsequent subretinal gliosis. The cytoskeletal reactions described here were compared with degenerative changes observed after induced retinal detachments. # 2002 Elsevier Science Ltd. Key words: actin; confocal microscopy; cytoskeleton; electron microscopy; glial ®brillary acidic protein GFAP); immunocytochemistry; organ culture; retinal detachment; tubulin; vimentin. 1. Introduction Mammalian retinal organ cultures have been used in numerous studies to describe the in vitro differentiation of pre- and early post-natal retina under controllable conditions Caffe  et al., 1989; Caffe  et al., 1993; Feigenspan et al., 1993; Hoff et al., 1999). On the other hand, experimental data obtained from organ cultures of adult retina are limited and report predominantly on morphologic aspects Forrester et al., 1990; Allamby et al., 1997). General alterations occuring during in vitro culturing of retina include the early development of edema Ogilvie et al., 1999), Mu È ller cell proliferation, hypertrophy and migration Caffe  et al., 1993), the rapid deterioration of the photoreceptor outer seg- ments OS), and the thinning of explants Caffe  et al., 1989; Ogilvie et al., 1999). Because many of these reactions involve changes in cell shape and position, it is conceivable that the cytoskeleton of individual cell types plays a key role in their response to in vitro culture conditions. However, detailed information concerning subcellular reactions, which occur during in vitro culturing of adult retina, are missing. Thus, the authors studied the cellular and cytoskeletal changes in explant cultures of the neural retina detached from the retinal pigment epithelium RPE). The experiments were performed with porcine retina because its basic structure appears to have a typical primate-like architecture, with the exception that the retina has no fovea and a rather homogenous distribution of rods and cones. Bloodworth et al., 1965; Rootman, 1971; Beauchemin, 1974). The authors used antibodies against main cytoskeletal components i.e. actin, tubulin and IFs) to characterize major structural changes in retinal explants during culturing. An antibody directed against b-catenin was applied to follow the structural changes of the intercellular junctions of the outer limiting membrane. The cytoskeletal changes observed in retinal explants were discussed in terms of similarities observed after induced retinal detachment Lewis et al., 1995). Exp. Eye Res. 2002) 74, 777±788 doi:10.1006/exer.2002.1188, available online at http://www.idealibrary.com on 0014-4835/02/ $35.00/0 # 2002 Elsevier Science Ltd. * Address correspondence to: Jo Èrg Winkler, Department of Oph- thalmology, Medical University of Lu È beck, Ratzeburger Allee 160, D-23538 Lu Èbeck, Germany. E-mail: [email protected]

Upload: joerg-winkler

Post on 15-Oct-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

�������� ��� ��� ����� ������� ����� ����� ������� �� �����������������

��� �� ������ �� ��������� ����������� ������� ����� ��� ����� �����

����������� ����� ������ ������������ ��� ��� �� ���� �� �������� �� !"!#� �������� $��������� ���������� � ��� ���� $%&� $����� '������� (����� � % ��������� ��!#) *�

'�������+� �� $������

�'��� ��� ,�- �� � )) ,�������� ..) ��� �������� � ��� ��� �� " &������� .. �

��� ��� � ��� �� � ��� � �������� � ������ ����� ������ �� � ����� �� �������� �� ������������������ ��� ��� ������� �� ������ ����� ������� ����������� ��� �� �� ������� ���������������� �� ������� ��� �� � ����� �� �� ��� �� ��� ��� ������ ��� �� �� !� �� � ��� �������� �� ������ ������ ���� "#� � ���� � �� $%&'��� ����� �� ����"� ��# �� �������� �� �������&� ����&� ������(����������& �� ������� ����� �������� ����������� ����� ��� ����� ������ �&������� ����� ����� "�������� ��� �� ������ )*��+,� -������� �����"������!! �� �&������ ���� ��� � ��-������ �� ���������� ������� �-�� � ������ ����� � ���� ����#��������� ������� .�/ ���� ����� 0������ ���� � ���������� ������� �������� ��-��� ������� ��� "������ )���� -������ �� *��+,� ��� ���� ��������� � ����������� ����� ������� ����������� ��� � ���� ���������� � �� ���� �������� ��� ���� � ������� �� .�/ �������� �������� ��-���� ���������� ������ � ���� �� ������ �������� ���� "������ ������� ��0����� �������� �� ���� ��� ��� ������ �� ��� �� � � �� ������ ������� ���������� ��-��� ������� ���� ��� �� ���� ������� ������ ���������� ��������� ���� �� ���� ������� ��������� ��������� ��� � �#���� �������� ������ �� � ����������� ������� � �&������ ����� �� � �����1������� � �� ���� ������� ��������� ������ �� �� ������� � .�/ ���� ���� �#������� ��� ����������� ������ 2����� ������� � ������ �� ����� ����� �� ��� ������� ��� ��������������� ������ ���� ����� �������� ��� ���� ������� �������� ��� ������� �� ����&������������� ������ ������� ��� ������ �� �������� ��� ������� ���� �������� ��� �� ���������3������ ���������� �������� �� ���� �� ���� �������� � �� ���� ������� �������� �� .�/ �������� �#������� �� �����0��� ��������� �������� ��� ���������� �������� ������� ���� ���� ������� ��� ��������-� ������� �����-� ��� �� ��� ������ ��������� � �!!� 3���-��� 4������ $ ���� ����� ����5 ������� ����������5 ����������5 ������� ����������5 ����� "�������� ��� �� ������

)*��+,5 �����������������5 ����� ������5 ������ �������5 ������5 -�������

�� ����������

.�������� ������ ����� ������� ��-� ���� ��� ���������� �� ��� � ������� �� �� -��� ����������� ���& �� ����� ���&���� ����� �� �� �������������� ����� )6��7 � ���� 8985 6��7 � ���� 88�5���������� � ���� 88�5 :� � ���� 888,� ;� �� ������� � �#��������� �� ������ ��� ����� �������� � �� ����� ��� ����� �� ����� ��� �������� ������������� ������ )�������� � ���� 88!5 �������� ���� 88<,� *������ ��������� �������� ����� ��-��� �������� � ����� ����� � �� ����� �-�������� � ��� );���-�� � ���� 888,� .�/ ���� ���� ���������������������� �� �������� )6��7 � ���� 88�,� ������ ���������� � �� ����������� ���� ���&���� );4,� �� �� ������� � �#����� )6��7 � ���� 8985 ;���-�� � ���� 888,� =������ ���� � ������������ ��-��-� ������� �� ���� ����� �� �������� ��� ������-���� �� �� ���������� � �� �-� ��� �������� ����� � ��� ���� �� ���� �������� � �� -���

������ ��� ������ :���-��� ����� ������������������� ����������� ��������� ����� ����� ������� -��� �������� � � �� ������ ��� �������� ����� �������� �� �� �� �������� �� ���������� ��������� �#���� ������� � �� ������ ����� ����� ����� ������ ������ ��������� )%+3,� ��� �#������������ ������� ��� ������� ����� ������� �� ������������ ������� � ��-� � ������ ������&��������������� ��� �� �#������ �� �� ����� ����� �-�� �� � ����� ���������� ��������� � �� ��� ������ )=��� ���� � ���� 8�>5 %������ 8< 5=���������� 8<?,� ��� ������ ��� ����� ��������� ���� ���������� ��������� )���� ����������� �� @��, � ����������� ��1�� ��������������� �� ������ �#����� ����� ��������� ������� � ����� ������ �&������ ��� ������ ������ �� �������� ������� � �� ������������1������� � �� ���� ������� ���������

��� ���������� ������� �����-� �� �������#����� ���� ������� �� ���� � ����������������-� ��� �� ��� ������ ������� )$����� ���� 88>,�

�� �� ��� )�!!�, � � <<<A<99 ��B !� !!�C�#����!!�� 99� �-������� ������ � ��BCC����� ������������� ��

!! ?&?9�>C!�CD�>�!!C! � �!!� 3���-��� 4������ $ �

� � ���� ��������� ���� �B E�/�� '������� 2������� � ;��&���������� .� ���� F��-����� � $�/����� %��������� ����� �!�2&��>�9 $�/����� *������� 3&����B 1����G���������

�� ��������� ��� �������

����������� ��� ����� ������� �� ������ �������

3��� � ? ���� �� ������ ���� ���� ������ ��� � ����� �������� ����� �� ��� �� ������ +=4)��������&����� ������, ������� � H�6� �<�.�I6� ��< �.� H��:+;? � <:�; ?�� �.� I:�+;? �? �.� )�: <��,� �� ���� %���� �#����� ����������� ����� A� �� ��� �������� �� �� ��������� ������ 3��� ��� ��� ����(� ������� ��� <!J������� ����� �� ������ +=4 �� ������ ��� ������ ��� � ��� �� ������� �� �������� ������� ���-������ ��� ����-� ��� �� �������� ������������ �� � ��������� ��1����� � ���� !�> �� �������K� �9 )+������� F�I�, ���� ������ �� ���� ������ ���� ���-�� ��� �������� ��� � �� ���������������� ��� ��� ������� ��� �� ������ ������������� ������ ��� �� ��� �0����� � �����#������> � > ���� ������� �� � ������ � >A9 �� ����� ������ ���-�� ��� �#����� ���� ����� ����� ��� � .��������&:�� ).��������� =� �� � F�4���,�������� ����� � ������� ����� � ���� ��������&����� "��� ������ ����� ������ �� "��� ���������� �� ��� � ������ �� � ��������� ������ � �������� ���� ���� ����� �� �������� ����� � ������� ������ ��� ����� ��� �� �"� ��� �������� ��� ) 88<,� ������K� �9 ��� ��� �� � ����� �� ������������� ��� 8J ��� ��� ������ �! �.:3+34�!�> �. ��������� !! �� �� ���������� �� !!�� �� ����������� ��� ������� �� *���� )+�������F�I�,� 4��������� � �� �#����� ��� �� ���� �������� ������ �-��� ��� ��� ��� �-�� � � ����#����� ���� ����-�� �� ��# ���� ������ ����� ��<�6 �� >J 6;� � � ���� �"� ���������� ������������ �� ���� ���� ���� ������� � ��� �� �� !��� �� 3��� �#���� ��� �� �� �� ���-�� �� �������� �� ����� ����"� �� $%&'��� ���� ������������ �#��������� ������ ��� ������ ��� �����

����� ��� ����������������� ���������

��� ��������� ���� "#� �-������ �� =������������ ��������� 8J ����� ��� �� H�����������

���� ����� "#� ��� ����������� ���� ��� ���������� ��� ��������� ���� ��� ��� �� ��� � ������ �� ���� � �� ����"� ��# ����� ��� �� ��������� ����� ����� +���"� ������� )?A> ��, ���� �����"���� �� #������ ������� �� ������� �� ����� ��� +=4 � �: <��� ��� ������ ������������#��������� �� ������� ���� ����� ��� �����#&����&����� �� �-����� ��� � ���� ����������)L���� �#������� ;���������� *������,� ��� ������&����������� ������� �� ������� ���� ����� ������������&���� ��� �� �� ����� �� � �������� "��� ��� ����� ���� )!� .� �: �,� ��� 1�� ��� ���� ��� �� � �������-� �-�� �� � ��� � ��! '� ���� �����&��-� ��������� � ������� �����-� �� ������&����������� ������ � ���������� �������� ������� ���&�����"� ��� ��� � ����� ���� �� ����������� ������� �� �� � ���� ��������� �� �!J������ ������� ����� )2�I;� *������� 2������,���� ��� �� ���� �#���� �� � �� � ���� �� ��������������� ��� ������ ���� )����� �6?!,� �&������ )�����=> �,� �����"������!! )����� H>�,� -������ )�����M8, �� �&������ )����������, ��� ���� B !! �� +=4�� ���-� � �� 4���� )4� $����� .;� F�4���,�� ���������� ����� � ����� ������ *��+ ���� ���� B !! ��� �������� ��� 2�I; )*�������2������,� =�������� ����� ��������� )+H�,)4����� 4� $����� .;� F�4���,� ���� B�!! �� +=4���� ��� � ����� �� ������ ������� ��� �� ���� ;4)6;4,� ��� ��� �� ���� ����� ����� �� +=4 �� �#���� �� �� � � B<> ������ � ���#� ������

?99&���1���� ).�������� +������ ;%� F�4���, ��6��&���1���� ��� ���&����� @�* ����� ���)2����-�� :������� *������, � �!�6� +������������� ���� ���� ��� ����� ��� ��� ���&���������� ���� ����� ���1���� ��� ���#� ������ ?99).�������� +������ ;%� F�4���, �� 6�� )2����-��:������� *������,� 4����-� ��&���1���� 6��)4����� 4� $����� .;� F�4���, ��� ���� B�!! ������ �� ��������� +H�� @� ������ �#�������� ��������� ����� � ��� ������� �� +=4 �� �� �������"������ �� @�����(���������� ���������� ��� ���&���� ��� � L���� �#������ ���������� �0����� �� ���(���������� )E���� *������,�

�������� ����� !������� ���������

6������ �������� ��� ������ �� ��� �����"&���� �������� ����� � L���� ��-��� ����������)E���� *������, �� � ����� �������� �������������� ����� ).%6& !�?FM, )=��&%� � :����:������ � F�I�,� �0����� ��� � > �' ������C����� ����� )?99� >�9� � ? ��,� @������������ ����������� ������� ��� ������ �� �� ������� ���-�� ��� ������ � ���#� ������ ?99 �� �� 6���� "��� ��� � C3� ���� ��� � =�� (���������� ������� ���� ������������� ����� $����4���� ����������

�@*� � 4������� -��� � �� ����� ������ ��� )�� ������,� %���� �#����� ��� ����� �� � �������� �� ����� ��� � ���� ������������� "��� ����� �� ������� ��� �� ���� ������ �� ���� � ���� ��� � ��� �� � ������� �� ����� ��� � ����� ����� ���������� ���#����� �� � ������ ������ ��� �� ���� � � ��#&���������� ������ ��� ��-�� � �� ��� �� � 1��� � �� �� ��� "��� ������

��� �� ����� �� ��

"����������� ������� ���������

%���� �#����� � ������ � "��� ��������� ����������� �� 9 �� �� ��� ��� "#��-� ��������� �J��������� ��� � �� �J ������� ��� � �� !� .

���� ���� ���� )�: <��,� ��� ��������� ��������� �� ���"#� �-������ �� !�>J ���������#� � � ?�6� 4������ ���� ����� �� ���� �������� ����� � ��� ����� �� � ��� � ������ � ������)�!A !!J,� @�"������ � �� �#����� ��� $%&'�������� )+����� '������ *������, �� ������ ��� ���&���� ����� ��� � �� ���������� � �� ������&������ F������ ����������� ����������� ��� �J)�C-, ������ ����� �� !�>J )�C-, ��� ������3#�������� � �� ������� ��� ������� ��� � L����3.8 ����������� ������� ���������� );����������*������, ����� �� ����������� -����� � �! �M�

�� ������

����� ���������

+������ ����� ��-���� � ����������� ��������������� �� ������� � �� � �� ����� �����)���� �)�,,� ��� �-����� ���������� � �� ������&����� ����� ��� �� ������ ������� � ���������������� �� ���� �������� ��� ���� ������-� ����#��������� �������� ��� � ��� � ���������

��� �#����� ��-���� ������ � ��� ��� ��-���� ���� ���-� "��� ����� �� �� ���� ������� �����)���� �)=,,� � ���������� � �� �������� ���� �������� ���� �-� ��� ��� ����������� ;4 ���� �� �������� � ������� ���� ����� ������� )6@4,������� ����� ������� ��� � ��� �� ������� ������������ -����������� ��� �����"����� �� ��� �� �� �-����� ������ � �� �#����� ����������� )���� �)6,,� ��� ����� ������� )@4, � ��������� ��������� ������� ���� ������-� � ����������� ��� ;4 ���� ��� �� ����������� 3#����� ����&-�� �� ! ��� ���� � ������������ �����������4��� � ��� ����� ���������� ������� ��������&����� �� ������� �� ��������� ������� �� � ����;��� �#����� ��-���� � �������� ���������� ��� ����� �� ���� ������� ������ ����� ��������������� �� � ����� � ���������� .�/ ���� ���� �����&����� )���� �)2,,� +������� ����-���� � �#����������� �� � ��-��� ����������� � ��� ������ ������)���� �)3,,� =�� ������� ������ ���� ��� �� ������������ � ����������� ������ ������������ ����� ������� �� �� ��������� ������

����������������� ���������

#����� ���&���� ������� �� ������ ������ ����&��� � ��� �� �#������ � �� ���� ������� ������

�@*� �� +���"� ������� � ������� ���������� ����� ��� �����#����&������ )�, 6����� ����� "#� �� ���� � ���� ����� ��� ����������� ��� ����"����� � �� ����� �� ���� ������-� � ����� ��� �� ������ ������� � �� �� 6;4�)=, %���� �#���� ��� � ��� � ��������� @���� ������ �������� �� ��� ��-���� �� �� ���-� "��� ����� )�(, �� �� ����������� ����� )���,� 6@4 ��� ������� ���������� )�������� �, �� ������� � �� ;4 ������ )6, %���� ��� � ��� �� �������������� �� �#���� ��� ����� � �� �� �-� ��� ������ ������ ��� ���� -������� 6@4 )�������� �, ��� ������� � �� ��� ���� ������� � ;4� )2, %���� �#���� ��� ! ��� � ��������� ��� ���� ������� ����� ������� ���������� )3, ��� � ��� ���������� ��� ������� ������ ��� ��� �� ����������� � ������������ ����� ��� ���� �� �� �������� )�������� �,���� � ����� ���#���� �����5 ��� � ����� ���#���� ������ =��� � �> ���

��������� �������� �� ������ � !���� ��"

�� ��� ������ ������ ��� �� ���-��� ��������� �������� �� ����������� @4 �� �� ������� �������� ��� ���� ���#���� ����� )���� �)�,,� ��� � ��� ��������� �� ���� ��������� �� �� ���� ���#���� ����������� ���������� �� �� ������� ����&������� ;4 ����� �� �������� ������� �������) �� �� �����,� � �A ! ��� � �#���� �������������������� .�/ ���� ������ ����� ��� ���� �� ��� ������� � �����"��� �������� � ���� �������)���� �)=,,� ��� ���� ���#���� ����� �� ��� �� ������-� ���� ��������� �� �� ������ ������ ��� �� ����������� ����� �� ���� ������� �� ������� ���� ����� ������� ���� ��� ���� �:����� �����"������ ����� ����� � ������� ���� ��� ��� ������� ��� �� ���� ������ �� �#�� � ����� .�/ ���� ���� ��������� )���� �)6,,���� � ��� � �#���� ��������� �� ���� ������������� ������������ ����-� �� ���� ��� ����&������� ����� ��� ������ ����� �� ����� ���� ��������� ����� )���� �)2,,�

"�$����� @� ������ ������� ������������������������ � ������ ��� ������ �� ��� ������ ������� ������������ �������� �� �������� ���� �#���� ��������������� �� ���� ���#���� ����� �� �� �����������

����� �� ���� ������� )���� ?)�,,� ��� � ��� ��������� �� ����� � ������ �� �� ���-� "��� �������� ���������� �� ��� � ��� �������� ����� ������ �#���� )���� ?)=,,� :���������� .�/ ��������� ���� � �#����� ���� ��-��� � ������� ����-� �� �� �� ����� ������� ����� �� �� ���������#�������� ����� ���1�� ��� �� ���� ������� ��������� ���� ���#���� ����� ������� ���-��� ������� �������� �� �������� ��������� � �� ��������� �������-� ��� ���� ������-� ������ �������� � � ��� ��#���� ��������� �� �#���� ������ ������� �� �����-� "��� ����� ��� �� ��� � .�/ ���� ���� ����������#�� ��� ���� � �� ����� ������� �������� �� �� ���� ������� ����� ��-���� �������� ��-��� �������� ��� ��������� � �� ���� ���#���� ����� ������� �� ������ ���� �� ���� ���������� ) �� �� �����,� ��� ! ��� �� ������ ������� ���� .�/ ���� �� �� ������ ������� � �������� �� �� ���� ������� ������ ����� ������ ������������� � � ��-���� � �����-� ����������� � ���������� �� ���� ������� �������� )���� ?)6,,� :����������"������ ���-� � �-� ���� �� �� ���� ����&��� �������� ��� ������� �� ����&���� ��������������� ������� ��� ������ �� ��� ������� ����������� ��� �� �������� )���� ?)2,,� � � ��� �

�@*� �� ���� �������� )�, ���� ��������� � ������ ����� ������ ���������� �� �� ����������� ����� �� ���� �������)������,� �� ���� ���#���� ����� )�������� �, �� �� ����� ���#���� ����� )���,� )=, 3#���� ������ �� � ���� @������� ���� ��������� �� ������ �� ����������� .�/ ���� ���� �#�������� �������� ��� �� ���� ������� ����� )���� �������� �, ����� .�/ ���� ���� �� �� )������,� �������� ����� �� ���� ������� � ������������ ��-��� �� �������� ������� ��������)6, :����� �����"����� � �� ����� )���, �� ���� ������� ����� )���, � � ����� ������ �� � ���� ���� ������� ����������� �� ������� ��� ��� )�������� �, ����� �#�� ����� .�/ ���� ���� ���������� )2, ��� � ���� �� ���� ����������� �-���� ������� �� ��� �������� � �� ���������� �#����� %������ � ����������� @4 )�������� �,� ������� ������� ��������� ����� )������� ��,� ������ �����-��� ������� � �( � ���-� "��� ������ =��� �� )�,A)2, � �> ��� =�� ��)6, � ! ���

��# �� ����� �� ��

��������� �� ������&�����"� .�/ ���� ���� ��������� ������� � ���� ������� )���� ?)3,,� 2�� � � ������� ����� ������-� ������ ������� �� ������ ������� �.�/ ���� ����� ��-��� ����� ����� �� ��� ������� �� -������ ��������� �������� �� �#������ @�������� �� .�/ ���� ���� �� �� ������ �� ����������� ����� ��� ������ �� ����0���� ������������� ������ ������ "�������

%����&������'((� @� ������ ������� � ����� ���&��"������!! )H��!!, ������������� ��� ��� ���#��� � �� ���-� "��� ����� �� �� ��������� ������������� � �� ���� ���#���� ����� )���� >)�,,� ���� ��� � ��������� �� ������� � �� ���-� "��� ����������"����� ������� �� ������ �������������) �� �� �����,� =� � �� ! ��� � ����������� ������� � �� ���-� "��� ����� �� ����

�@*� ?� ������� ���������� )�, @� ������� ������ ������� �� ��� �������� �� �#��� � �� ���-� "��� ����� )�(,� �� ������� ���#���� ����� �� �� ����������� ����� �� ���� �������� $���� ��������� ����� ��� ������� ���������� )������,�)=, ��� � ��� � ��������� �� ������ ������� � �� ���-� "��� ����� �� �����"����� �� ��� �� .�/ ���� ���� �����������#�� ��� ��� �� ���� ������� ����� )���,� ��� � �#����� ���� ������ � ������ )������,� )6, ��� ! ���� ������� .�/ ���� ���� ��������� ��� ������� �� �#�� ����������� ��� �� �� �� ������ )�������� �,� ��� ���-��� ��������� �������� �� ���� ������� ����� ���� �� ���� ������� ��������� )2, @� � ������ �����"����� �� ���� ������� ��������������� � �� ������� �� ����&���� �������� )�������� �,� � ����� ������ �������� ���� �������� ��� � ������� ��)������,� )3, %����� �#���� ��� � ��� � ��������� �������� .�/ ���� ���� �#������� ��� ������� �� -������ ����������� �� ����� � �� ����� )������,� ��� �#���� ����������� ��� ������ �� ��������� ��������� )�������� �� �������,���� � ����� ���#���� �����5 ��� � ����� ������� ������ =��� �� )�,A)6, �� )3, � �> ��� =�� �� )2, � ! ���

�@*� >� H��!! �������� )�, @� ������ ������ �� ��������� � H��!! �� ������ �� �� ���-� "��� ����� )�������� �� �(,� ������ ���#���� ����� �� �� �������� ��������� � �������� ����� )�������,� )=, @� �#����� ������ �� � ��� �� ��������� ��� ���-� "��� ����� �� ���������� �� ��� )�������� �, �� �� �� ���� ���#���� ����� ������� ������� )������,� )6, ��� � ���� H��!! �� ������ ����������� ��� �-�� �� �#����� @� �-� ��� �������� ����� � �� ����� ����� ��� ������� ����� )�������� ,� ��� � ����� ���#���� �����5 ��� � ����� ������� �����5 ��� � ���� ������� ������ =��� � �> ���

��������� �������� �� ������ � !���� ��$

���#���� ����� ����������� ������� � ��� ��-���)���� >)=,,� 3#����� ����� ���� ����-�� �� � �����-���� � ������ ����-� ��������� �� H��!!)���� >)6,,� ;��� �� �-� ��� �������� ����� ��������� ��� ���� ������ �� �� ����� ����� ������� ������� �����-� �� ���&H��!!�

�&�������� ��� ����������� ��������� � �&��������� � ������ � � ������ 1������ �������� ��-���� �������� ����� � ������-� ����������� ����� �� ����������� �������� �� � ���� ���� ����������� �� ���� �� ����� ���#���� ����� )���� �)�,,�:����� �����"������ � �� ���� ������� ������������� �� �� ������� ��� ��������� �� �� �-� &��� ������� ����� ���0���� ����� ��������� ������������� ������ � ������&���� 1������� �������� .�/ ���� ����� �� ������������ )���� �)�,� ����,���� � �� � ��� � ��������� �� ��������� ��&������ ��� ������� � ������� ) �� �� �����,� � ! ���� �� �&������ ������� � �� ���� ��������������� ������ ����������� )���� �)=,,� .�/ �������� �#������� ���� � ���1�� ��� �� �������������� �� �� ���� �� ������������� �� �� ���� ������������� ��� � ��� � ��������� �� �&������ �����&���� ������ ����������� ��� �-�� �� �#���� ������)���� �)6,,�

�������� ����� !������� ���������

)��$�� ��$������ �� *+#� ��� ,�������� ��� ����&����� � *��+ )�����,� -������ )�� , �� �� ����&��������� � ��� @�� )������, ���� ��-������ �6������ ����� �� �-����� � ��� @�� �� .�/ ���� ������������� �#�� ��� ��� �� ���-� "��� ����� ��� ������ ������� ����� )���� <)�,,� ;��� *��+ ������������ �� ������� ��������� � �� ���-� "�������� �� �� ��������� ��������� � �� ���� ���#���������� � ������� ������� ����� ������� ��� � ���� �#���� ���������� �� .�/ ���� ���� ���������������� ����� � ������� ������� ) �� �� �����,�

=� � �� ! ��� � ��������� ������&����� .�/ �������� ��������� ������� �� ������� ��� ��� ���� ���� �� ������ �� �� �� ����� ������� ����� �#�� ������ �� ���� ������� ����� )���� <)=,,� @� �-� ���*��+ ������� � �� ���-� "��� ����� �� � �� �������#���� ����� ������� � ��� ������� ��� � ���� �� ������������� � *��+ �� -��������� �-� �� �� ������� .�/ ���� ���� ���������� �#�� &��� ������ �� ����� �#���� )���� <)6,,� ������������ ����� ��� ������ �� ������������������ ������&����� "������� �� ������ ���#����-� �-����� � ��� @���

#��������� ������$����� �� ��$���� ��� ������������&�������� ������� )�����, �� *��+ )�� , ���� ����� �� �� �#���� ������ �� ! ��� � ���������� �������� ��������� � ��� ���� � "������)���� <)2,,� ��� ������ ������� ��� ���������� ���&����� �� �� ���� ������� ����� ����� � �� ����������� ��������� ������� *��+ ��� ���-���������� ���� �� ����� ������� ��������� ���-����� � ��� ���������� ��������� ��� �-� ���� ������&����� .�/ ���� ���� �#������� � �� ������������ ����� �������� ��� �� ���� ������� ������@� �-� ��� .�/ ���� ����� ��-���� � ��� ��� � �� ������� �� ����� ��������� �� ������ ������-������������� � *��+ �� ������ ����� ��� �����

�-���� ���� ���������� � ����� ������� � .�/ �������� �#�������� ������� ��� ���&������ )�����, �� ������ ����� ��� ��������� +H�&����� )�� ,� ���������� � �������� �� ���� � .�/ ���� ���� ������&��� ������ �� ���� ������� ��������� =������+H� ������ ���� �� ������ ������� ��� �� 6;4� ��@4 ���� �� ������ -�������� �� � ������� ������������ <)3, ����� � ���� �����"����� ���� ��� ������ ������� �������� � �#����� ������ ��� ���� .�/ ���� ���� ������� ������� ��� �������������� �� 6@4� ��� ! ��� � ��������� ����������� ������ ��� ��� �� ��������� �����

�@*� �� $�������� � �&������� )�, � ������ ����� ��-���� � �� ���� ��������� � �&������ �� �� ���� )������, �� ������� ���#���� ����� )���,� ��� ��������� � �� ���� ������� �������� )�������� �, �� ������� � �� �-� ��� ���� � �����(����������� �������� ���� ������&��&�&����� )����� ������,� )=, ��� ! ��� � ��������� �� �&������ ������� � �� �������#���� ����� �������� �� ������� ���� ���� )������,� ��� ���� ������� �������� ��-���� ���������� ����� ���� �� ���� �� ������� � .�/ ���� ���� �#������� )�������� �,� )6, =� � ��� � ��������� �&������ ��������� ��� ������ ����������� ��� �-�� �� �#����� ��� � ����� ������� �����5 ��� � ���� ������� ������ =��� �� )�,A)6, � �> ��� =�� ��)�� ����, � ! ���

��% �� ����� �� ��

)���� <)�,,� � ������ ������� � �� �-� ��� ��������� ����� � ����� ���������� � .�/ ���� ���� �#��������� ���� ������ )���� <)�,� �������� ,�

"����������� ������� ���������

��� ���� �������� � �� �� 6;4 � ��������� ������������ ������ � ��������� ������� ������-������ �� ���� ����� ����������� �������

����������� ���� 9 ����� �� ������ ���������� �

���� ����� �� ���� �������� ��� �������� � ��

@4 �� "��� ��� �������� ������� ��� � ������������ ��� ����������� � �� ��������� ������ ���

������� -������ �� �#�� ��� �� ;4� ��� � ��� ��

������� �� 6;4 ������� ������ -������� �� ������ � �� ���� ������� � ���� ������� �����

N���� 9)=,O� ��� @4 ��������� �������� ���� ������

���������� �� ���� ! ���� %� ;4 ������� �

�@*� <� 6������ ����� �������� ���������� �� ���1������ ��� ����� ����������� )�A6,� 2����� ��������� � *��+ )�����,�� -������ )�� ,� ��� ������ ������� ��������� �� �#����-� �-����� � ��� @��� )�, @� ������ ����� �� �������������� *��+ �� -������ �� ��� �������� �� ��� .�/ ���� ���� �#������� )�������� �,� ����� ����� ��� �� ����� ��������������� )�������,� ������ �� ����� ���#���� ����� )���,� ��� �� ���� ������� ����� )���,� ������� ��������� � �� ���-�"��� ����� )�(, �� ���� � �� ���� ���#���� ����� ��-��� �� �-� ��� *��+ ������� )������,� )=, ��� ! ��� � ����������� .�/ ���� ���� �������� �� "��� ��� ����� ��� ��� � ������&����� @�� �������� ��� �� ���� ������� ����� �� �#�� ����������� �� �� ���-� "��� ����� )�������� �,� ������� ��������� ������ ��� ������ � *��+ ��������� )������,� )6, =� � ��� � ��������� ���� ��� ��� � @�� �#�� ������ �� ����� �#���� )�������� �,� �� ������ �-����� � ��� @�� �� �����-� �� �� ������� "������ � �� ��������� ����� )������,� )2, 2����� ��������� � �� �#���� ������ �� ! ���� *��+)�� , �� ��� �������� �������� ���� �� ����� ������� �������� )�������� �, �� �� �� ����� ������� ����� )���,� ������������� )�����, �� ��������� �� �� ���� ������� ����� )������,� 4����� .�/ ���� ���� �#������ ����� � ��� ��� � ������������� ��������� �� ���� �� �� � ������ �� ����� ������� )�������,� )3��, :����� �����"������ � �#����� ������ �� � �� ! ��� �� ������� ��� ���&������ )�����, �� +H� )�� ,� )3, ��� � ���� .�/ ���� ���� �#������� )�������� �,��� � ������ ������ �� 6@4 )������, ��� �� ��������� ������ )�, =� ! ��� � ��������� .�/ ���� ���� �#������� ��-�������� �� ;$.� �#�� ��� ��� �� �������� )������,� ;��� ����� ����� ������� ������ ����� � �� ������ �������������� � .�/ ���� ���� �#������� �� ������ � ����������� @4 )�������� ,� =��� �� )�,A)6, � >! ��� =��� ��)2,A)�, � �> ���

��������� �������� �� ������ � !���� ��&

������� ����� � ������ ����� ���� ����� � ������� ����� ��-����� �������� ��� � ��� ��#���� �������� )���� 9)2,,� ��� ����� ��� � ������ ������� �������� �� �� ��������� � ���&������ ����������� ���� ������� �� �3. ��� ! ��� � ������ ��������� ���� 8)�, ����� � ���-��-��� � �� ���� ������� �������� ��� � .�/ ���� ������-� ��� �� ��������� ������ ���� �� �� ��������� �������� ��� @4 ����� ������ ������� �� ���� ���� ����� ��������� ��� ���� ��������������� �� ����������� �� �������� �����-��� �� � ������ 1������� � ���� ������� ��� ���� ����&������ � �� ���� ������� �������� �� "��� ������������ .�/ ���� ���� ��������� )���� 8)�,� ���� ������,� ��� .�/ ���� ���� �������� � �� ���� ����� �� ������ ����� ��� �������� ������ "����� ��� � ������ � �����#������ ! ��� �������� ��� ��@�� )���� 8)=,,� $���� �����"������ ����� ����&������� ������� ����� ������� � �� ����� ��� ����������� ����� )���� 8)6,, �� ����� �� .�/ ���� �����#������� )���� 8)2,,� ��� � ��� � ���������

��-���� �#����� �-����� � ��������� ������ �������� ������� � ������� ������ � ���� ��&����� ������� .�/ ���� ���� ��������� �������� ��� �� ������������������ )���� !)�,,� 6@4 �� ���� ������� �����-���� �����"��� �������� �� ���� �� ������������ ������� � @4� ����� ���� ���� ����� � �� ����������� ��������� ������� � �� ������� ��.�/ ���� ���� �#�������� ��-� ��� �� ��������� �����N���� !)=,O�

� ��������

� ������ �-������� � �� �������� �� ����������������� �� ������ �#����� ������� �� ��� �� ����-���� � ������ � ����������� ��� �� -�-� ������ ��������� ����������� �������� �� �� ���������� �� ���� �� �������� ����������� � ������� ������ ����� ���� ������ � �#�����%����� �������� �� ��� �� ����� ������� ��-����� �� ���1�� � ������-� ��-�������� ����� ����� ���� ��� �� )I���� �� .�������� 8�9� 8�85.�������� 8�95 .������� �� I����� 8< 5@������� 8<�5 $�0�� �� .�������� 8<>5 E�������� ���� �� 8<<5 .����� � ���� 89!5 �� ������ ���� 89�5 3������� � ���� 89�5 $���� � ���� 89853������� � ���� 88�5 $���� � ���� 88?,� %�������$���� � ��� ) 88>, ��-� ������� �� ���� �� ������ �����&������� ������� � �� ����������)���� ������� ����� *��+ �� -������, �����-� ����� ��� �������� � �� ������ @� ��� ��������#����� ��� � �� "�� ������� ��������� ��� ��-�-� ������� �� �� ����� �������� �� ��������� ����������� ;4 )���� �� 8��5 ������� �� �� +��� 8��5 I���� �� .�������� 8�95 .�������� 8�95 �� ����� � ���� 89�5 ������ �� �� ������ 898,� @� ���� ���� ����������� ������� ����� � ���������� -����������� � �� ����������� ;4 �� � ��������� ���� "����� ������� �� ���1������ ���� �������� ��������� � �� ����������� ��� ���� �&�� ���������� � �� ;4 )���� 9)6, �� )2,,� �� ������ �� ����� ���������� � 6@4 )���� 9)�, �� )=,,���� �� �������� ��� ����� �� -�-� ��� ���� ��� � �� -��� ��������� �� ���� ��������� � ������ ���#���� ����� ������ ���������� �� ����&��� � H��!!� ����� �� �����"� �� ��������� ���������)6��7-�� �� ���� 88�5 =���� � ���� 88<,� ������� � ��� ������ )���� >)=,,� ����� �� ���� � ������&���� � �������� ����� � �� ����� ������� �����)���� ������� �� ��������� �����,� 4��� ��������-���������� ���� �������� �� -�-� ��� �� �������� ��� ����������� ������� �������� ���� � ���� ������ ���� ����� ���� ��-����� ������� ��� �� ������ -����� �-�� ��� ��������� ��������� �������)3������� � ���� 89�,����&������ ������� ��-���� ��1�� ������������

��������� ����� �� "�� ��� � ��������� ��� ���� ������� ��������� �� �� ���-� "��� ����� �� �� �������#���� ����� )���� ?,� �� ���������� ��� �� ���� ���������� � �� �������� ���� ����� )���� �,� ���

�@*� 9� ������������ ������� ���������� � ����&������� ����� �� ���� �������� )�, .��������� � ������ ����� )���, �� ���� ������� )���, ������ �������� ������ ��� ����� ������ �� "��� ��� ��������������� ��� )�, �� �� �������� -�� �� ��������������� )��, ��� �� ���� ������� )=, ��� � ��� ���������� �� ���������� � �� ����� ������ ������� ����� ������� ������� �� ���� ������ �� ������ �� ������� ��� �������� -������� )�������� �,�)6, .��������� � �� �� ;4 )���, � ������ ������ )2, =�� ��� � ��������� �� ;4 ������ ����� �� ��������� ��������� ������� � �� ������ �� ��� ���� ��� ���� ��������� )������,� =��� � ���

��' �� ����� �� ��

������ �� �#������ �� � ������� ����� ������������ ������� �#���� ������� ����� �� �#���������� ���� ������� � �� ����� ����� ���� ������� ����� ��� �#��������� �� ������ ����� ��� �� -�-� ��������� ;� �� ���� ��� ������ ��� ��&��������� � ������ �#�� ��� ��� ��.�/ ���� ���� ������ ��� �� ���� ������� ������ �� ���� ���� ���� ��� �� .�/ ���� ���� �� ��� ��� �������-���� )���� ?)6,,� 2�� ������ �� (���������� �� 6$4&���������� ����� �� ����������� �������������� ��������� �� ����&���� ��������� ������������ �� ���� ������� �������� ��� �������������� �� 6@4 )���� ?)2,� <)3, �� )�,,� @� ������ �

���� ��� ����� �� -�-� �� ��� ��-� ��������� �� ��������� � ����������� @�� �� ��-� ��� ���������� )$���� �� ������� �!!!,� @� ��� ����# �� �"��� ���� � ����������� �� @�� �� �� ��������������� ��-����� ������� � �� ������� ���� �������� �#�������� � @�� )���� -�������

*��+, �� �� ��� .�/ ���� ���� �� � ������������ ���������� ��1��� ���� �� ������ ������� )3�������� ���� 89<5 $���� � ���� 8985 *��7��� � ���� 88!,���������� ���� � )=������ �� 2���� 8<8,���������� )I�-���/ � ���� 89�, �� ���� �����)3������ � ���� 89?,� ��� 0����"����� � �%H� �������� � "-�&�� �������� � *��+ ��� � ���

�@*� 8� ������������ ������� ���������� � �� �#���� ������ �� ! ���� )�, 4��-�� -��� � � .�/ ���� ���� )��,� ���� ���� ����������� ������ �#�� ��� �� ��������� ������ � ���� ���������� � �� ���� ������� �������� )���, ��� ����������� ����� )��,� )=, :����� �����"����� � � ������ ���� �� )�,� ��� .�/ ���� ���� �#������ )���,� �������� ������ ������ ������� ��������� �� ������ ������� ��� @�&���� "������ )6, $�� �����"����� -��� � �� ���� ������ ����� �� )�, ���� �� � ����� ������ � ����������� ������� )�, �� ���� �� .�/ ���� ���� �#�������� ����� ���������� ����� �� ���������� �� ��������� ������ )2, � ����������� ������� )�, ������� � �� ��-����� ����� �� � .�/ ���� ����� �� � ���� �������5��� � ���� ����� �������5 � � ������� ����5 �� � .�/ ���� ���� �������� �- � �����-����� =�� �� )�, � � ��� =�� ��)=, � !�> ��� =�� �� )6, � ��> ��� =�� �� )2, � ���

��������� �������� �� ������ � !���� ��(

� ������� )3������� � ���� 88�, ��� ������������������ � *��+ �� -������ ��� �� .�/ �������� �� �� )$���� � ���� 88>,� F� �� �� -������ ����� ����� ����� ��-���� � ������ �������� ��� � ������� ������� ������ 3#����-� ����������&��� � *��+ �� -������ ��� ��� �������� ����� ���� ��� ��� �� �� ����� ������� ����� �� ��� .�/ ���� ���� �� �� )���� <)�,A)6,,� @� ��������� ����� � @�� ��� �� �� ���� ������� ��������� �� ���� ������� �������� ��� ����� ������ ������ � ����� ���� � @�� �� �� ������ ��������� �� ���� ������� �������� )���� <)2,,� :���-����� ���� �� �� .�/ ���� ���� �#������� �#�� � ����� ��������� ����� �� ���� ��� �� ������������ � @�� ������� )���� <)6,,� =������ � �������� �� ��1�� ���������� � ���������� ����������� ��&��������� � @�� ���� �� �������� � ������������� ������� � ����� �� ���� �#������� ����������� �� � �� �� ���� ������� � �������� ������� ����� ��� ����� ���� ��������� ������ �����0������� � ����� �� �#���� �������� �� ��� �� ���������� � ��-������ �����"� ����� ����������� �������� � @�� ��� ������ �������� :���-���� �� ���� ������ �� �� �� �� -�-� ��� ����� �������������� ��� �� ���������� �� �� ���������������� � ����� ������ ����� ��� �� ��1�������� ��� ������ ����������� �� �� ��&��������� �@�� )%����� �� =������� 89<,���� ��� ������� ������� �� ����� �����

��������� ���� ������� ��-��-� �� ����� ��� ��� ���� ������� ��������� �� � �������������������� �� ���� ������� �������� ���-� �� ��

����������� �������� �� ������� �� ����&�������� �� ������� �� ������� � �������������

������� )=��&.���� � ���� 89>5 '������� � ����

88!5 +������� � ���� 888,� ��� ������ ��� �&������ ����� �� ��� � �� ��������� ����������

������ �� .�/ ���� ����� �� �� ������������� �� ������"� ������ � �������� �� ���������� �

�� ���� ������� ��������� �� ����� �� ���� �� ��������� ����� � � ������ 1������� �������� �����

�� ;$. ���� � ��������� ��� ! ��� ���������� ����� �������� ��� .�/ ���� ���� ��-�����

��� �� ��������� ������ ��� ������� � �������

������ � ���� �� ��� �� ��������� �� �� �������������� ������� �� �����#������ ?!J � �#����� ���

� ����� � ��������� ����� �� ���� ������� ������������ ������� ������� �� -�-� )3������� � ����

89�,� :���-��� �� ����� �� ���� <)6, �� ! ����������� ������ ������� � ���� ��&����� ����� ��

����������� ����� ��� .�/ ���� ���� ��������� ������� ������ � *��+ �� -������� ������� ������

������� ������������� � �� -�-� ��������� ��������)3������� � ���� 89�� 89<5 $���� � ���� 898, �� �

���� �������� ����� � �� ������ ���-��� �����

)I�� �� 6����� 8<<5 I��� 89!,�

��� ������ ������� �� �������� �� ����������������� ����� �� -��� �������� � ������� ������

'�� ����� �-�������� ��� ����� ������ ��������� ���-� � �� ��������� � �� � �� ���������

�� ����� �������� �-��� �� ������ ����������

�� ��� �� ��������� � �� ������ ����� ��� ���������-� %+3 �� �� �������� ��� ������

�@*� !� ������������ ������� ���������� � ��������� ������� ��� � ��� � �#���� ��������� )�, � ���� ������������������ ������� � ���� ��&����� ����� �� .�/ ���� ���� �#������� ��� ���� ������ �� ���� ����� ������� )���,� )=, $��������� � 6@4 ������ � �� ������� �� .�/ ���� ���� �#������� )���,� ��� ���� ���� ������ )���, ��� ���� � ����������� � �� ����� ������� ��� � ���� ������� ��������� =��� � �> ���

��) �� ����� �� ��

���������������

��� ������ ��� ������ � M������ ����� �� *� ���.�/ ���� ).� ���� F��-����� � $�/����, �� ���� �#�������������� ���������� ���� ���� ��� ������� �� � ������������ E C<89 )� E� '�, �F$ �����������/� ����� ��.� ���������� F��-�����/ �� $�/�����

���������

�������� 2�� �������� 2�� 6��������� $�� .�$�� � 2� �� =������ .� ) 88<,� 6��� ������� �� �� ����������� �� ����� �� -���� ��,��� ���������� .�� !�� ����!�?A<��

�� ������ 2� :�� 4���� '� :�� ������� 4� I�� 3�������� +� ���� =������� *� �� ) 89�,� %����� ������� �� ����B �� ������ ���������A����������� ����������,��� ���������� .�� !�� � � 8!�A���

=���������� .� $� ) 8<?,� ��� "�� ������� � �� ���K������� #�$����� , *������ #��� ���� �� ���������� �� � �<A?>�

=������� �� �� 2���� 2� ) 8<8,� ��� �� ��� ���� � .�/ ���� ���� �� ����� �� ���� �������� � ��1���B ��������(���������� �� � ��� ����� ��� � �� �����"�������� ��� �� )*��, ������� �� �� ��� ��� ��A8�

=����� :�&.�� .�/ ����� =� �� I��� :�&'� ) 88<,� 6������&�-� ��-��������� � �� �������� �������� �� �������� ����� �� ����� � �� ������� ���B ������&����������� ���������� � �����"����� �!!&�2��� ��������� � P� �� ������ ��� 2��� ���� "�������� ���� ? <A�>�

=��� ����� E� .� =�� *�������� :� +� �� 3�������� %� $�) 8�>,� %����� -��������� � �� ��� ���� �� ����������������� �� ���� �� �� ��� � <?A9�

=��&.����� �� :�� 4����� E� 6�� I����� @� =� �� *������ *� *�) 89>,� L������ � ������� ���� ���� �� �� �#������������ �������� � �� ����� ������ ��,��� �������/��� .�� !�� �!� �<<A9!�

6��7� �� %�� 4�/ ������� �� �� -�� M���� �� ) 88�,�+����������&�����"� ������ �#�������� � ���������� �� ����� ������ �� ���� ���� � � ������&���� �� -��� �� � ���������� � ����� "������� �� ���-� ����� ������ ���� �� ��� ��� < 8A���

6��7� �� %�� M������ :�� E������ :� *� �� 4������ 4� ) 898,�:������� ���������� � ������� ����� ����� ������� ������� ���� �� ��� �� !9�A8��

6��7-��� +� �� ���� %� $� ) 88�,� +������� ����������� ����� ����� ��� ��������� �� ����� ������ 0����� 0���������� �� ?�<A?��

3������ � ��� =��&.����� �� �� 4����� +� M� ) 89?,�.�/ ���� ���� �#�������� � ����� "�������� ��� �� ��������� ������ �� �#��������� ����������� ������&���� �� �� �� ������ ��,��� ���������� .�� !�� �"� �� A9�

3�������� +� ��� ��������� 4� 6�� $����� *� +� �� ������� 4� I�) 88�,� *���� "�������� ��� �� ������ �� �� �%H�B������������ ������ �� ���������� � ���������� 6H4 ��1���� 1 !����� 2��� � �� ?9A� �

3�������� +� ��� ������� 4� I�� �� ������ 2� :�� 4���� '� :��� =������� *� �� ) 89�,� %����� ������� �� ����B �� ���� ������� �� ���� ���#���� ������� ��,��� ���������� .�� !�� � � 8�<A?��

3�������� +� ��� ������� 4� I�� *������ 6� E�� �� ������ 2� :��� I����� 2� 2� ) 89<,� *���� "�������� ��� �� ��������������� �� .�/ ���� ����� ��� ������ ���������� �� ��� � �<A?9�

����������� ��� =������� E� �� '�/����� :� ) 88�,�;��������� ����� ������ � �� ��������� ������.�� %������� � � �!�A <�

������� 4� I� �� �� ������ 2� :� ) 898,� 6������� ���� � ������� �� �� ������ ����� �� �� ������������ ���������� @�B ������ M��� �� )*������ =� .��� .������� %� *�� 3 ��,� +�� �>A8!� 6M .����B4� $����� .;� F�4���

��������� E� M�� 6������� ��� I���� 6�� %������ E�� $��� '� %��� $������ E� .� ) 88!,� =�-��� ������ �#����������� �� �������� ����� � �� �� ����� �� ���� � � ���������-� ���������� #��� ���������� � �� ? >A�!�

���� �� '� 4� ) 8��,� 3#��������� ������ ��������"���� ���������� !�� 3 � ��� >�A8�

������� ��� �� �� �� +��� �� .� ) 8��,� �� �#����������� � � ������ ��������� #� 1 ���������� !��>� A<�

*��7���� 6� E�� �� ������ 2� :� �� ������� 4� I� ) 88!,�6������ �� ������ ��� "����� ������������������� �� �������� � ������ ������� �� ������&��� �� �������� ��,��� ���������� .�� !�� ��� ?<?A9��

:�� ��� :�/������� :� �� 4������������ =� ) 888,�;��������� ������ ����� � ������� ������ 2������� ������ � ��<A?9�

@������� .� ) 8<�,� 4� ��� �� �� "�� ������� ��#��������� ������ �������� %����� *��4� *�44��5����� ��� !!�A�<�

E������� H� �� �� ���� �� '� 4� ) 8<<,� ;����-����� ���� ������ ������ ��������� �� ������ ������������� �#��������� ������ �������� 2� 1 ���������� !�� >�?A<��

I��� 6� 6� ) 89!,� 4����� ��� ��-����� ��� ��1���� @�B"�� !����� ���� ��� ��� �������� �� "�������� ��6����)'�� ��� '� ��� 3 �,� +�� �?8A<!� .����� 2�����B H��P����

I��� 6� 6� �� 6����� $� '� ) 8<<,� ��� ��������� ������� ��� ��-����� �������� ������ ��� ����������@� � �������� ������������ �� �� 1 %�������� !� 8<A�!8�

I�-���/� ��� ���������� �� �� M������� @� ) 89�,� @���&�� ��� "������ �� �� ����� ����� �� ���������&���� ��,��� ���������� .�� !�� ��� !<>A9?�

I����� �� E� �� .�������� %� ) 8�9,� 3#��������� ������ ������� �� �� ��� ������� @@@� 3������ ����������� �� ����� �� ������ ���������� #� 1 ���������� !!� ? !A8�

I����� �� E� �� .�������� %� ) 8�8,� 3#��������� ������ ������� �� ��������� �� �� ������ �������3������ ����������� ���������� � �� � �� ������ #� 1 ���������� !�� >9A<<�

$�0��� :� �� .�������� %� ) 8<>,� *���� ���� ������������� ������ ������� )�����-� ���������� �����������,�#� 1 ���������� � � �!�A 9�

$����� *� +�� 3�������� +� ��� *������ 6� E�� �� ������ 2� :��� ������� 4� I� ) 898,� 6������ �� �� �#�������� ������"� .�/ ���� ���� ������� ����� ����&��� ������ �������� �� �� ��� �� 8�A �

$����� *� +� �� ������� 4� I� )�!!!,� .�/ ���� ���� ���������� ������ �������B ���������� ��� ���� ����&��������� ��,��� ���������� .�� !�� �� >?�A>�

$����� *� +�� *������ 6� E�� �� ������ 2� :�� .������� =��� ������� 4� I� ) 88?,� %��� ������� �� ���#�������� � ����� ���� ������� ����� �� �#��������������� �������� #� 1 ���������� ���� ��9A<��

$����� *� +�� .������� =� �� ������� 4� I� ) 88>,�6������ �� �� ����������� �� �#�������� � ���&������� ������� ����� ������ ���������� �� ��� �� ������ �������� ��,��� ���������� .�� !�� �!��?!?A ��

��������� �������� �� ������ � !���� ���

.�������� %� ) 8�9,� 3#��������� ������ ������� ���� ��� ������� @@� :������� � �� ����� �� ���������������� #� 1 ���������� !!� �8�A?!��

.�������� %� �� I����� �� E� ) 8< ,� 3#��������� ������ ������� �� �� ��� ������� M@@� +���������������� ������� �� ������ �� ����� ������ #� 1 ���������� ��� �8!A>�

.������ .� ��� .����� $� E� �� ������� 4� ) 89!,�;��������� �� ��� ������ ������� �� �� ������� ������5 ������� ���������� � �� ���������������� ��,��� ���������� .�� !�� ��� ! �A�8�

;���-��� E� .�� 4����� E� 2�� $�� E� .� �� �������� �� ��) 888,� � �������� ���� �� ����� ������ � ������������ ����� ��� ����&��� ���-�-��� 1 %������� ������ ��� ><A�>�

+�������� %�� I���� 6�� *��� � 6�� 4���� 4� �� �������'� '� ) 888,� ��� ���&����� ������ H+%�+ )�����&1�����, �� � �������� � �� ���0��� � �� ����������� ���� �� �� ������ �"���� � ��-�� ��� �� ������ 1������� �� ���� ��� �" � ?>�A�?�

%������ 4� %� �� =������� %� ) 89<,� ��������� ���������� ����� ���� ��������� � �� ����� -�������������� �� ���� 2��� �� �8!9A >�

%������ E� ) 8< ,� M������� ����� � �� ���� ���-� ��� �� ����� �� �� ���� 2� 1 ���������� ""� 9!9A 8�

'�������� 2� 4�� �������� I� �� +���������� �� ) 88!,�6��������� ��������� � �� � ������ 1������������� �� ������������ �� �� �������-� .�/ ���������� 1 ���� %����� ��"� >>A�?�

��� �� ����� �� ��