收稿日期院2016-09-13曰收到修改稿日期院2016-11-23基金项目院国家 863 课题渊2013AA06A309冤曰苏州农业职业技术学院青年教师科研能力提升计划资助项目渊PPS201304冤作者简介：徐 洁渊1983-冤袁女袁江苏苏州市人袁讲师袁硕士袁主要从事环境保护研究遥通信作者院鲜啟鸣渊1966-冤袁男，江苏金湖市人，教授，博士，主要从事新型有机污染物环境行为研究。

固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定水中5种大环内酯类抗生素

徐 洁 1袁 邓 超 2袁 鲜啟鸣 2（1. 苏州农业职业技术学院环境工程学院，江苏 苏州 215008；

2. 南京大学环境学院 污染控制与资源化研究国家重点实验室，江苏 南京 210023）

摘 要院建立固相萃取渊SPE冤尧高效液相色谱-串联质谱渊HPLC-MS/MS冤同时测定水中 5 种大环内酯类抗生素渊罗红霉

素尧克拉霉素尧阿奇霉素尧螺旋霉素和泰乐菌素冤的分析方法遥 水样中的抗生素通过 Oasis HLB 固相萃取小柱富集

后袁以 C18 反相色谱柱为分析柱袁甲醇和 0.1%甲酸水溶液为流动相袁采用 HPLC-MS/MS 进行定量分析袁检测方式为

多反应监测模式渊MRM冤袁内标法定量遥 5 种大环内酯类抗生素的回收率在 64.8%耀90.8%之间袁仪器检出限为 0.012耀0.085 滋g/L袁定量限为 0.041耀0.285 滋g/L遥 将建立的方法用于检测某化学工业园区周边地表水中 5 种目标分析物的残

留袁均未检测到泰乐菌素袁其余 4 种抗生素均有不同程度检出袁检出浓度在 ng/L 水平遥关键词院大环内酯类抗生素曰固相萃取曰高效液相色谱-串联质谱曰水体

文献标志码院A 文章编号院1674-5124渊2017冤03-0058-05

Simultaneous determination of 5 macrolides antibiotics in natural water samplesusing solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem

mass spectrometry

XU Jie1，DENG Chao2，XIAN Qiming2

（1. School of Environmental Engineering，Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture，Suzhou 215008，China；2. State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse，School of Environment，

Nanjing University，Nanjing 210023，China）

Abstract: A method with solid phase extraction（SPE）and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS） was developed for the determination of five macrolides（roxithromycin， clarithromycin， azithromycin， spiramycin and tylosin） in natural water samples.The macrolides were extracted from water samples using Oasis HLB cartridges and then separatedon a reverse phase column using methanol and 0.1% formic acid as mobile phases. The macrolideswere quantified with the internal standard method under multiple reaction monitoring（MRM）mode.The recoveries of the five macrolides ranged from 64.8% to 90.8% . The instrumental limits ofdetection and quantification are 0.012-0.085 滋g/L and 0.041-0.285 滋g/L respectively. Only Tylosinwas not found by the proposed method in the studied rivers surrounding a Chemical IndustryPark，while the other four macrolides were detected at the ng/L level.Keywords: macrolides antibiotics（MLs）；solid phase extraction （SPE）；high performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）；water

中国测试CHINA MEASUREMENT & TEST Vol.43 No.3March，2017第 43 卷第 3 期2017 年 3 月

doi院10.11857/j.issn.1674-5124.2017.03.012

第 43 卷第 3 期

0 引 言抗生素作为当今重要的一类药物袁被广泛应用

于医药行业以及牲畜尧水产养殖中遥依据其不同的化

学结构袁抗生素主要分为喹诺酮类尧茁-内酰胺类尧氯霉素类尧磺胺类尧大环内酯类尧头孢菌素类尧四环素类尧氨基糖苷类[1]遥 大环内酯类抗生素渊macrolides an鄄tibiotics袁MLs冤对治疗因支原体尧衣原体尧流感嗜血杆

菌以及立克次体等引起的疾病都特别有效袁不仅能用

于对人类的治疗袁也可以应用于畜牧养殖业[2]遥 抗生

素可通过不同的途径进入水环境中[3]袁水体环境是抗

生素最重要的一个汇遥鉴于抗生素对水生态系统和人体健康的潜在危

害性袁非常有必要对水环境中广泛存在的这一类物

质进行检测遥 水环境中大环内酯类抗生素浓度相对

较低袁建立快速尧科学尧高效的预处理方法是前提[4]遥对于水环境样品袁预处理方法包括液液萃取法尧固相

萃取法尧固相微萃取方法等袁其中固相萃取法最常用遥目前大部分研究都是检测分析水中多类抗生素[5-6]袁单独检测大环内酯类抗生素的研究不多 [7]袁这些研

究 [8-11]预处理所用的固相萃取小柱大部分为 OasisHLB 柱袁仪器分析方法均采用高效液相色谱-质谱特

别是串联质谱曰但由于检测物质为不同品种的大环内

酯类抗生素袁样品预处理条件尧仪器工作参数有所不同遥本文在总结文献的基础上袁着重对分析方法进

行了筛选和优化袁建立了固相萃取渊SPE冤尧高效液相

色谱-串联质谱渊HPLC-MS/MS冤同时测定水中罗红

霉素渊roxithromycin袁ROX冤尧克拉霉素渊clarithromycin袁CLAR冤尧阿奇霉素渊azithromycin袁AZI冤尧螺旋霉素渊spir-amycin袁SPM冤和泰乐菌素渊tylosin袁TLS冤5 种大环内酯

类抗生素渊其结构如图 1 所示冤的分析方法袁并应用

于实际地表水中大环内酯类抗生素残留的检测遥1 材料与方法1.1 实验材料

Agilent1260/API4000 高效液相色谱仪/串联

质谱渊Agilent袁ABI/SCIEX冤曰12 管固相萃取装置渊Su鄄pelco冤曰500 mg/6 mL HLB 固相萃取小柱渊Waters冤曰SHZ-D渊III冤循环水式真空泵渊南京科尔仪器有限公

司冤曰1 L 玻璃砂芯过滤装置渊天津市津腾有限公司冤曰0.45 滋m 混纤膜 渊上海新亚净化器件厂冤曰0.45 滋mPTFE 滤头渊天津市津腾实验设备有限公司冤遥

甲醇渊HPLC 级袁Merck冤曰甲酸渊HPLC 级袁ROEScientific冤曰超纯水渊MILLI-QAIO袁Millipore冤曰罗红霉

素渊纯度 97%袁下同冤尧泰乐菌素渊98.9%冤尧螺旋霉素

渊96%冤购自 Dr.Ehrenstorfer 公司曰克拉霉素渊98%冤尧阿奇霉素渊98%冤购自梯希爱渊上海冤化成工业发展有

限公司曰采用西玛通渊Simatone冤为内标物渊100滋g/mL袁AccuStandard冤遥

分别称取 5 种大环内酯类抗生素标准品适量溶

于甲醇中袁配制成各抗生素储备液袁-20益保存遥取各

抗生素储备液适量溶于 10mL 容量瓶中袁加入甲醇定

图 1 大环内酯类抗生素的结构

HO OHO

OOOHOHHO

HO

O

O HO OOO

HO

H

OO O

O

O O

O

OH

N

TLS

NCH3

H3C H3C O OCH3

SPM

O

OO O OOOH3C OH

H3CO HOCH3

N-CH3H3C

OHOH

CH3

CH3

NHOHO

HO

OOAZI

O O

OOH

HON

O ON

OOO O

O

OO

O

O

OHHOHO

HOCLAR

NO

OO

OO

OO

OOO N

HO

OH

OHOH

OHROX

徐 洁等：固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定水中 5 种大环内酯类抗生素 59

中国测试 2017 年 3 月

图 2 大环内酯类抗生素及内标的 MRM 色谱图

0.0

3.1

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0时间/min

10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0

Simatone5.10

0.0

1.9

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0

5.55 SPM1.0

时间/min

0.0

3.2

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0

5.77 AZI

时间/min

0.0

3.9

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0

9.50 TLS

时间/min

0.01.00

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0

10.59 CLAR

时间/min

0.0

3.8

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0

10.88 ROX

时间/min

容袁配制成 100 mg/L 的罗红霉素尧螺旋霉素尧阿奇霉

素尧 克拉霉素和 200mg/L 的泰乐菌素的大环内酯类

抗生素混合溶液袁-20 益保存袁使用时用甲醇稀释至

所需浓度遥1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

1 L 水样经 0.45 滋m 滤膜过滤以除去悬浮物袁后转移至干净瓶子中袁调节水样 pH 至 6耀7遥 水样以

10mL/min的流量通过 Oasis HLB柱子渊6mL袁500mg冤袁HLB 柱使用前需进行活化处理袁预先用 10 mL 的甲

醇分两次淋洗袁然后再使用 10mL 的超纯水淋洗遥 水

样过完柱后袁加入 5mL 超纯水淋洗柱子以去除杂质袁负压下抽 15min 以去除水分遥 最后用 15 mL 甲醇分

3 次洗脱袁收集洗脱液于 50mL 氮吹瓶中遥 洗脱液在

40益的水浴条件下旋转蒸发至 1mL 以下袁加入 1mL甲醇以淋洗氮吹瓶内壁袁后在 40 益的水浴下用微

弱的氮气流浓缩至 0.5mL 以下袁加入 20滋L 200滋g/L的内标物溶液袁溶液最后用甲醇定容至 1 mL袁经0.45 滋m PTFE 滤头过滤后转移至 2 mL 棕色进样小

瓶中袁-20益保存待仪器分析遥

60

第 43 卷第 3 期

抗生素母离子

渊m/z冤子离子

渊m/z冤DP/V CE/V 保留时间/

min罗红霉素 837.7 [M+H]c+ 158.3** 106 46 10.88679.6 99 30克拉霉素 748.5[M+H]+ 158.1** 100 41 10.59590.5 100 22阿奇霉素 375.3[M+2H]2+ 115.0** 63 22 5.77591.7 60 20螺旋霉素 438.4[M+CH3OH+2H]+ 174.1** 60 30 5.55101.1 60 32泰乐菌素 916.6[M+H]+ 174.1** 150 55 9.50772.7 150 42西玛通 * 198.1[M+H]+ 124.1** 74 30 5.10128.1 75 28

表 1 大环内酯类抗生素的相关质谱参数 1冤

注院1冤* 为内标曰** 为定量离子遥

抗生素 线性方程 线性范围/渊滋g窑L-1冤 相关系数 LOD/渊滋g窑L-1冤 LOQ/渊滋g窑L-1冤罗红霉素 y=0.01007x+0.006 61 0.5耀500 0.998 6 0.069 0.230克拉霉素 y=0.00712x-0.004 79 0.5耀500 0.998 9 0.014 0.048阿奇霉素 y=0.01155x+0.023 78 0.5耀500 0.999 4 0.012 0.041螺旋霉素 y=0.00143x 0.5耀500 0.998 9 0.028 0.093泰乐菌素 y=0.00724x+0.001 71 1耀1 000 0.999 8 0.085 0.285

表 2 大环内酯类抗生素的线性方程尧仪器检出限和定量限

1.2.2 仪器工作参数

色谱条件院Waters Xterra C18液相色谱柱渊2.1mm伊100 mm袁3.5 滋m冤袁流动相 A院0.1%甲酸水溶液袁流动

相 B院甲醇遥 流量 350 滋L/min袁进样量 5 滋L袁柱温

35 益遥 梯度洗脱程序院0耀0.5 min袁保持 5%B曰0.5耀1.5 min袁5%B耀30%B曰 1.5耀11.5 min袁30%B耀70%B曰11.5耀12min袁70%B耀100%B曰12耀12.5min袁保持 100%B袁12.5耀13min袁100%B耀5%B曰13耀18min袁保持 5%B遥 样

品需过 0.45滋m 的 PTFE 滤头方可进样遥质谱条件院离子源为电喷雾正电离源渊ESI+冤曰

离子源 I渊ion source gas 1袁GS1冤和 II渊ion source gas2袁GS2冤的气体流量均为 55 mL/min曰碰撞气渊collisiongas袁CAD冤和气帘气渊curtain gas袁CUR冤流量分别为

7 mL/min 和 25 mL/min袁气体均为 N2曰电离电压渊ionspray voltage袁IS冤为 4 500 V曰辅助加热气温度渊TEM冤为450 益遥 检测方式为多反应选择监测 渊multiplereaction monitoring袁MRM冤离子模式遥

2 结果与分析2.1 质谱特征

优化后的去簇电压渊decluster potential袁DP冤尧碰撞能渊collision energy袁CE冤及各抗生素的母离子和子

离子等其他相关质谱参数见表 1遥 结果表明袁5 种大

环内酯类抗生素目标物和内标物均能实现较好的分

离袁目标物和内标物的 MRM 色谱图见图 2遥2.2 线性范围和检出限

采用内标法定量袁用以消除进样体积和仪器信号

下降带来的误差遥仪器的检出限渊LOD冤和定量限渊LOQ冤分别是仪器信噪比 S/N=3 和 S/N=10 时所对应的质量

浓度遥 5种大环内酯类抗生素的线性方程尧仪器检出限

和定量限见表 2遥结果表明袁在 0.5耀500滋g/L范围渊泰乐

菌素为1耀1 000 滋g/L冤内袁5种大环内酯类抗生素对应

的线性方程的线性相关系数均在 0.99以上袁仪器检出

限为 0.012耀0.085滋g/L袁定量限为 0.041耀0.285滋g/L遥2.3 加标回收率实验

采用超纯水加标袁分别于 1 L 超纯水中加入低尧中尧高 3 个水平的大环内酯类抗生素标准物袁配制

成除泰乐菌素的质量浓度为 10袁40袁200ng/L袁其他 4种

抗生素的质量浓度为 5袁20袁100 ng/L 加标溶液袁测定

方法的加标回收率袁加标样品的处理方法和实际样

品的处理方法相同袁每个样品平行测定 3 次遥水样加

标回收率和相对标准偏差渊RSD冤的结果见表 3遥结果表明袁5 种大环内酯类抗生素的加标回收率在

64.8%耀90.8%袁相对标准偏差均低于 12%遥2.4 实际样品检测

采用建立的分析方法检测分析了实际地表水中

的大环内酯类抗生素残留袁地表水水样的采集地点

为南京化工园区附近的几条河流袁包括滁河尧马汊河尧

抗生素

加标量

5ng/L渊n=3冤 20 ng/L渊n=3冤 100 ng/L渊n=3冤回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%

罗红霉素 69.6 11.2 77.2 1.49 71.7 4.03克拉霉素 70.4 1.14 83.6 2.27 85.5 1.29阿奇霉素 77.7 11.7 85.1 8.32 87.0 1.36螺旋霉素 72.5 4.28 88.3 4.81 82.6 4.51泰乐菌素 64.8 11.4 90.8 8.54 90.8 1.81

表 3 大环内酯类抗生素的加标回收率和相对标准偏差 1冤

注院1冤泰乐菌素对应的加标浓度分别为 10袁40袁200 ng/L遥

徐 洁等：固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定水中 5 种大环内酯类抗生素 61

中国测试 2017 年 3 月

岳子河和皇厂河遥由表 4 可见袁在南京化工园区附近

4 条河流中袁5 种大环内酯类抗生素中除泰乐菌素外

均有不同程度检出遥从浓度范围和分布范围来看袁克拉

霉素只在滁河的 1个采样点中检出袁检出频率最低袁但检

出浓度达 25 ng/L 以上袁这可能是由于突发事件造成

的袁罗红霉素检出频率最高袁检出质量浓度在1.92耀35.2 ng/L袁阿奇霉素在各个点位上质量浓度差异最大袁检测到的最小值为 0.01 ng/L袁而最大值为106 ng/L遥

徐维海等 [12]测得珠江广州河段春季枯水期和

夏季丰水期表层水中的罗红霉素平均含量分别为

32袁18 ng/L曰陆克祥等[13]在黄浦江水样品中测得大环

内酯类抗生素的质量浓度为 53.8耀84.8 ng/L曰Zhang等[14-15]在莱州湾水体中测得罗红霉素的质量浓度为

ND耀227 ng/L袁阿奇霉素的质量浓度为 ND耀88 ng/L袁克拉霉素的质量浓度为ND耀32.9 ng/L袁在黄河和渤海

湾水体中测得的大环内酯类抗生素浓度均较低袁其中

克拉霉素测得质量浓度最高袁为 8.1 ng/L遥 本文实际地

表水样品中大环内酯类抗生素的检出浓度均在 ng/L级别袁与国内其他地表水检出的浓度相当遥3 结束语

本文建立了采用 HLB 柱进行富集萃取尧HPLC-MS/MS 同时测定水中 5 种大环内酯类抗生素的分

析方法袁在 0.5耀500 滋g/L 质量浓度范围渊泰乐菌素

为 1耀1 000 滋g/L冤内袁5 种大环内酯类抗生素对应的

线性方程的线性相关系数均在 0.99 以上袁且其加标

回收率在 64.8%耀90.8%之间袁仪器检出限为 0.012耀0.085滋g/L袁定量限为 0.041耀0.285滋g/L遥

采用建立的分析方法袁对实际地表水进行了检

测分析袁均未检出泰乐菌素袁其余 4 种大环内酯类抗

生素的检出浓度均在 ng/L 级别袁与国内其他地表水

检出的浓度相当遥参考文献

[1] K譈MMERER K. Antibiotics in the aquatic environment-A review-Part I[J]. Chemosphere袁2009袁75渊4冤院417-434.

[2] KANFER I袁 SKINNER M F袁 WALKER R B. Analysisof macrolide antibiotics[J]. Journal of ChromatographyA袁1998袁812渊1-2冤院255-286.

[3] HIRSCH R袁 TERNES T袁 HABERER K袁 et al. Occur鄄rence of antibiotics in the aquatic environment[J]. Scienceof the Total Environment袁1999袁225渊1-2冤院109-118.

[4] 章琴琴袁汪昆平袁杨林袁等. 基于液相色谱法分析水环境中

大环内酯类抗生素污染的研究进展 [ J ] . 环境化学袁2012袁31渊11冤院1787-1796.

[5] XU W H袁 ZHANG G袁 ZOU S C袁 et al. Determination ofselected antibiotics in the victoria harbour and the pearlriver袁 south China using high-performance liquid chro鄄matography -electrospray ionization tandem mass spec鄄trometry[J]. Environmental Pollution袁2007袁145渊3冤院672-679.

[6] YE Z袁WEINBERG H S袁 MEYER M T. Trace Analysis ofTrimethoprim and sulfonamide袁 macrolide袁 quinolone袁 andtetracycline antibiotics in chlorinated drinking water usingliquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry袁2007袁79渊3冤院1135-1144.

[7] SEIFRTOV魣 M袁 NOV魣KOV魣 L袁 LINO C袁 et al. Anoverview of analytical methodologies for the determina鄄tion of antibiotics in environmental waters[J]. AnalyticaChimica Acta袁2009袁649渊2冤院158-179.

[8] MCARDELL C S袁 MOLNAR E袁 SUTER M J袁 et al.Occurrence and fate of macrolide antibiotics in wastewa鄄ter treatment plants and in the glatt valley watershed袁switzerland[J]. Environ Sci Technol袁2003袁37渊24冤院5479-5486.

[9] YANG S W袁 CHA J M袁 CARLSON K. Trace analysisand occurrence of anhydroerythromycin and tylosin ininfluent and effluent wastewater by liquid chromatogra鄄phy combined with electrospray tandem mass spectrome鄄try[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry袁2006袁385渊3冤院623-636.

[10] ABUIN S袁 CODONY R袁 COMPA譙譫 R袁 et al. Analysis ofmacrolide antibiotics in river water by solid-phase ex鄄traction and liquid chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A袁2006袁1114渊1冤院73-81.

[11] YANG S袁 CARLSON K H. Solid-phase extraction-high-performance liquid chromatography-ion trap mass spec鄄trometry for analysis of trace concentrations of macrolideantibiotics in natural and waste water matrices[J]. Journalof Chromatography A袁2004袁1038渊1-2冤院141-155.

[12] 徐维海袁张干袁邹世春袁等. 固相萃取-液相色谱/串联质谱

法分析水体中痕量抗生素[J]. 环境化学袁2006袁25渊2冤院232-233.

[13] 陆克祥袁隋铭皓袁高乃云. 固相萃取-超高压液相色谱-串联质谱测定水中 19 种抗生素[J]. 分析测试学报袁2010袁29渊12冤院1209-1214.

[14] ZHANG R袁 ZHANG G袁 ZHENG Q袁 et al. Occurrenceand risks of antibiotics in the Laizhou Bay袁 China院 Im鄄pacts of river discharge [J]. Ecotoxicology and Envi鄄ronmental Safety袁2012袁80渊2冤院208-215.

[15] ZHANG R袁 TANG J袁 LI J袁 et al. Antibiotics in theoffshore waters of the bohai sea and the yellow sea inChina院 Occurrence袁 distribution and ecological risks [J].Environmental Pollution袁2013渊174冤院71-77.

渊编辑院莫婕冤

河流大环内酯类抗生素检出质量浓度/渊ng窑L-1冤

罗红霉素 克拉霉素 阿奇霉素 螺旋霉素 泰乐菌素滁河 2.46耀35.2 ND耀27.4 0.01耀106 11.5耀59.6 ND

马汊河 6.54耀15.9 ND 1.30耀27.8 ND耀12.9 ND岳子河 ND耀4.85 ND 11.2耀40.9 2.92耀14.1 ND皇厂河 1.92耀4.58 ND 2.34耀25.2 10.7耀13.3 ND

表 4 实际样品检测结果

62