今日のスライドは下記にPDFファイルとして置いてあります： http://ohzawa-lab.bpe.es.osaka-u.ac.jp/classes/keisoku2015/

共焦点顕微鏡・２光子顕微鏡 Confocal Microscope and Two-Photon Microscope

光とは何か？？

新潟県立大　生活環境化学

粒子である光量子、波の性質をもつ電磁波の2つを用いて説明されるもの

レーザー光と普通の光

レーザー光（コヒーレントな光）光の波⻑⾧長や位相がそろっている。

普通の光（インコヒーレントな光）光の波⻑⾧長や位相がそろっていない。

普通の光（インコヒーレントな光）光の波⻑⾧長や位相がそろっていないことよりプリズムに光を通すと、各波⻑⾧長ごとに屈折率率率が異異なる。よって光は各波⻑⾧長ごとに散乱する。（のちに出てくるレンズでの集光で問題となる）

レーザー光（コヒーレントな光）光の波⻑⾧長や位相がそろっている。そのためプリズムに通し光が屈折しても散乱することがない。（レンズで集光すると焦点⾯面で1点に集光する。）

レーザーの特徴

① 　単⾊色性が良良い。波⻑⾧長幅が狭いためラマン散乱等のスペクトル計測に威⼒力力を発揮する。蛍光イメージングにおいても励起のフィルターが狭く設計でき、蛍光を広く取得することが可能となる。

② 　コヒーレンスが良良い。可⼲干渉性があるため、光を強めあったり、また逆に弱めあったりすることが可能となる。インコヒーレンスな光（蛍光灯、⽔水銀灯、他）では⼲干渉性がないため、上記の性質は持たない。また①、②の性質のため指向性が⾼高く、遠⽅方までビームの広がりが起こらない。

③ 　強度度が⼤大きいレーザー光の強度度は⾮非常に⼤大きい。実際、レーザー光で鉄板の切切断を⾏行行ったり、レーザー光で核融合を起こそうとする研究もある。パルス化をすることで、瞬間的な出⼒力力は1014  Wにも達する。（太陽エネルギーよりもはるかに⼤大きいレベル）

レーザー発振

レーザー媒質

レーザーミラー 　（全反射）

レーザーミラー 　（反射）

光ポンプ 　フラッシュランプ等(エネルギーを媒質に加える。)

励起された媒質から⾃自然放出が起こる。

ミラー間隔:ｄ

ミラー間隔に波の周期が完全に⼀一致した波が発⽣生。

この波を種として誘導放出を繰り返し、ミラー間隔と⼀一致した波が選択的に増幅されていく。

増幅された波が出⼒力力ミラーを透過して、出⼒力力される。これによりレーザー発振がおこなわれる。

Fluorescence　蛍光

Ground state

Excited state E = hνc = νλ

λ = hc/E

400 500 600 700 Wavelength λ

(nm)

low energy → ← high energy

(Einstein 1905)

蛍光ってなに？？

蛍光タンパク質 　（フルーツシリーズ）

励起波⻑⾧長 蛍光波⻑⾧長

励起

蛍光 リン光

励起状態

基底状態

Shaner NC, et.al, Nat Biotechnol. 2004 ;22(12):1567-72.

 　 　物質のエネルギー準位図(ヤンブロンスキーダイアグラム)

蛍光は、⾮非常に速い応答性を持つ。また⾊色素を選んで、さらに励起光を選択すると様々な組み合わせの蛍光を誘導できる。

Stokes shift UV to Blue to Green to Red to

Ir

蛍光顕微鏡の計測原理:

信号は蛍光源に限定される

Confocal microscope（共焦点顕微鏡） US patent by Marvin Minsky (1957) – AI (artificial Intelligence研究）で有名, MIT

Minsky, 2008

共焦点顕微鏡の原理

Lance Ladic, “Simplified optics of a LSCM,” http://www.cs.ubc.ca/spider/ladic/images/ optics.gif.

Confocal fluorescent microscopy

Emission filter

Dichroic mirror

Objective lens

Sample Laser

Photo-detector

Confocal lens

Pin hole

X-Y scanner

Fluorescent microscopy

Emission filter

Dichroic mirror

Objective lens

Sample

Mercury lamp

CCD Rat cortex

Exitation filter

２次元イメージセンサー

Raster  Scan

レーザー走査型顕微鏡の画像生成法

ブラウン管テレビと同じ⽅方式

Galvanometer Scanner

Harmonic Drive Systems,Inc

Raster Scan Step Scan

(Mao et al, 2001) Scanning rate: 1-25 frame/sec ~ 4000 lines/sec

GSI  Group,  Inc.

Galvanometer Scanner

走査型顕微鏡

KEVIN  F.  CARRSource:  SCANLAB's  PC  Interface  Board  RTC3  Manual  

PMT: Photomultiplier Tube （光電子増倍管）

浜松ホトニクス, http://jp.hamamatsu.com/resources/products/etd/jpn/html/pmt_003.html

Kamiokande PMT

Spinning disc confocal system

(Stephens and Allan, 2003)

横河電機 CSU22

Scanning rate: ~ 1000 frames/sec

Comparison of widefield and confocal fluorescent microscopy

(Stephens and Allan 2003) 2µm

A mitotic spindle

A: confocal microscopy B: widefield microscopy C: B, deconvoluted

多光子レーザースキャン顕微鏡

Multiphoton absorption

Ground state

Excited state

400 500 600 700 Wavelength λ

(nm)

low energy → ← high energy

400nm 800nm 1200nm

E = hc/λ

1光子 ２光子 ３光子

Fluorescence emission

Fluorescence emission

1-photon excitation

2-photon excitation

exci

tat

ion

Two-photon excitation •  Simultaneous absorption of 2 photons for excitation of a fluorophore with the half energy

Single photon •  1 photon is absorbed by a fluorophore •  From fundamental state to excited state

Leica

単光子励起と2光子励起

2光⼦子励起は蛍光分⼦子に光⼦子2個のエネルギーを同時に吸収させることで、分⼦子を励起する現象である。また光⼦子のエネルギーは波⻑⾧長に反⽐比例例しているため、通常単光⼦子励起（⼀一般的な共焦点レーザー⾛走査顕微鏡等）の2倍の波⻑⾧長の励起光を⽤用いて2光⼦子吸収を⽣生じさせる。

多光子レーザースキャン顕微鏡

１光子蛍光

励起波長: 488nm

２光子蛍光

励起波長: 800nm

● 組織中の観察したい１点のみが光る（見たくない部分は蛍光を発しない） 　　　（この光点をスキャンして画像にする） ● 近赤外励起なので散乱が少なく、600µm程度の組織深部まで観察可能 ● 組織への光損傷がすくない（長時間の経時観察, in-vivo記録） ● 組織切片観察から小動物in-vivo記録まで可能なステージ

Continuous laser

t

P

Mean Power 1W

Continuous mode

10W

Pulsed laser

Pulsed mode t

P 100kW

CWレーザーとPulse レーザー

Soeller  C,  Cannell  MB.  :  Microsc  Res  Tech.  1999;47:182–195

2光子励起の局所励起

2光⼦子吸収が起こる効率率率は、光⼦子密度度の⼆二乗に⽐比例例して増加する。したがって2光⼦子励起顕微鏡では、励起光が絞り込まれた対物レンズの焦点位置のみで2光⼦子吸収が起こるために、蛍光の発⽣生も焦点位置のみに⽣生じる

F.- Helmchen, W. Denk Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods 2, 932-940

ls ~ 50-100 µm (@ 630 nm)

ls ~ 200 µm (@ 800 nm) §  Somata 10-30 µm §  Dendrites 1-5 µm §  Spines ~0.5 µm §  Axons 1-2 µm

赤外光の高い組織透過性 （in vivo imaging に適している）

励起光源に近⾚赤外光を⽤用いるため、可視光に⽐比べ⽣生物試料料による吸収・散乱を受けることが少なく、より標本深部への到達が可能となる。(in  vivo観察に適している)

蛍光退⾊色回復復法(FRAP)、光活性化(PAF)、あるいは、Caged化合物を光反応で活性化したり解離離を誘導したりする場合、2光⼦子励起法を⽤用いれば厚みのある試料料でも、任意の場所に1mm3の空間のみで反応を起こすことが可能である。

局所励起による光化学反応

Photoactivatable GFP (PA-GFP)

710 nm

Two photon microscopy

Leica TCS SP2 Spectra Physics Tsunami

Confocal microscopy system Femto-second laser +

(Nikolenko et al, 2003) 3000万円　~2007

Two-photon confocal system for consumer-use?

（リコー中央研究所）

（（株）同仁化学研究所）

fura-2 AM fura-2

AM: acetoxymethyl ester　（膜を通過できる）

Monitoring [Ca2+]i

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca Ca

Ca

Ca

Ca Ca

Ca

Ca Ca

Ca Ca

Ca ATP

Ca

VSCC

Ca

Ca

Ca Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

F F

Ca Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

F

F F

F F

F F

F F

F

Ca

Ca Ca

Ca

Ca Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

Ca

est

Fluorescence

Ca pump Ca

IP3 Ca

Emission spectra of two calcium indicators at various concentrations

Fluo-3 Indo-1

Detecting action potentials by calcium imaging

(Smetters et al. 1999)

Time [ms]

1000 2000 3000 4000

20

40

0

0

-60

mV

Δ

F/F

[%]

4Hz current pulses Slice of rat cortex

fura-2 AM

25 µm

Oregon-BAPTA Green 1-AM