cat: flowcytometrische analyse van het tcr-vß - uz leuven
TRANSCRIPT
Klinisch/diagnostisch scenarioVraagstellingCritical appraisal
Analytische performantieDiagnostische performantieKlinische impactKostprijs: binnen en buiten labo
Studie GasthuisbergTo Do
Overzicht
Klinisch/diagnostisch scenariotoepassing = aantonen (opvolgen) van monoclonaliteitbij patiënten met een verdachte T-cel proliferatie
mature (= post-thymus) T-cel maligniteit
indeling cfr WHO classificatie= heterogene groep !
Uit: Van Dongen JJM et al. Leukemia 2003; 17: 2254-2317
Leukaemic / disseminated
T-cell prolymphocytic leukemia
T-cell large granular lymphocytic leukaemia
Aggressive NK cell leukemia
Adult T-cell leukemia
Cutaneous
Mycosis fungoides
Sézary syndrome
Primary cutaneous anaplastic
large cell lymphoma
Lymphomatoid papulosis
Other extranodal
Extranodal NK/T cell lymphoma, nasal type
Enteropathy-type T-cell lymphoma
Hepatosplenic T-cell lymphoma
Subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma
Nodal
Angioimmunoblastic T-cell lymphoma
Peripheral T-cell lymphoma, unspecified
Anaplastic large cell lymphoma
Neoplasm of uncertain lineage/differentiation
Blastic NK cell lymphoma
WHO histological classification of mature T-cell and NK-cell neoplasms
Uit: Jaffe ES and Ralfkiaer E. Mature T-cell and NK-cell neoplasms. Pathology & Genetics. Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. WHO Classification of Tumours. IARCPress 2001
lymfoomcellen in perifeer bloed / beenmerg
=> T-PLL, T-LGL, AILD, T-NHL
diagnose = multidisciplinair
labo hematologie
aantonen monoclonaliteit = essentieel
principe: alle cellen uit 1 ontaarde cel
zelfde TCR genherschikking
expressie zelfde Vβ domein
meerderheid TCRαβ (2-15% TCRγδ)
herschikkingen specifieke sequentie (TCRD/G/B/A)
moleculaire diagnostiek
immuun fenotypering
herschikkingen binnen TCRB
> 98% TCR genherschikking aanwezig
Uit: Van Dongen JJM et al. Leukemia 2003; 17: 2254-2317
Klinisch/diagnostisch scenarioVraagstellingCritical appraisal
Analytische performantieDiagnostische performantieKlinische impactKostprijs: binnen en buiten labo
Studie GasthuisbergTo Do
Overzicht
Vraagstelling
Aanvraagpatroon?Correlatie resultaten moleculaire technieken? Voordelen? Meerwaarde?
? Flow van het Vβ repertoire behouden of niet ?
reagentiaprobleem, parallele analyse op CME, ….
Overzicht
Klinisch/diagnostisch scenarioVraagstellingCritical appraisal
Analytische performantieDiagnostische performantieKlinische impactKostprijs: binnen en buiten labo
Studie GasthuisbergTo Do
Analytische performantie
Testprincipe= flowcytometrische analyse
21 MoAb tegen variabele domeinen van de TCRβ ketendetectie ± 70% humane TCR-Vβ repertoireFITC- of RPE fluorescente labelingpooling in 7 reactietubes telkens 10-15% reactiviteit+ CD3-PerCP => T-lymfocyten subpopulatie
directe versus indirecte detectieopvolging (indien mogelijk): specifieke Vβ MoAb + CD3-PerCP
Interpretatie TCR-V-beta mix analyses
1° stap 2° stap (eventuele 3° stap)
totaal % reactieveCD3+ T-cellen type distributiepatroon actie type distributiepatroon
>75% sterk verhoogde positiviteit met 1 mix
uitsplitsen van de mix positiviteit met 1 MoAb passend bij een onderliggend
monoclonaal T-cel proces
normale positiviteit met alle mixen (*) X X
polyclonaal reactiepatroon: een onderliggend
monoclonaal T-cel proces is weinig waarschijnlijk
sterk verhoogde positiviteit met 1 mix
uitsplitsen van de mix positiviteit met 1 MoAb
verdacht voor een onderliggend monoclonaal T-
cel proces
<50%sterk verlaagde
positiviteit met alle mixen
X X
verdacht voor een onderliggende T-cel
pathologie, die echter niet reageert met de gebruikte
MoAb
50-75%
interpretatie
Uit: Kwaliteitshandboek, SOP-090-Flowcytometrie
Preanalytische aspecten
Collectiemateriaal diagnose: PBopvolging / staging: PB, BM, LVEDTA / heparine
Staalstabiliteit idealiter binnen 48u (aspecifieke binding ↑)
Patiëntvariabelen andere pathologieën met “geskewed” repertoire- auto-immuunziekten- 1° immuundeficiënties- immuunreactie microbiologische / tumor antigenen
leeftijd (TCUS?)
Testaanvraag in sequentie met “routine” immuunfenotypering
Analytische aspecten
weinig gegevens !
detectielimiet ?
afhankelijk van grootte T-cel expansiepolyclonale achtergrondreactiviteit Vβ MoAb
T-cel expansie > 20% (of 40%) CD3+ cellen of > 2.0x10*9 cellen/L
combinatie met andere (aberrante) markers (tot 5%?)
TATmaximaal 72u (of 96u met inbegrip van routine immuunfenotypering)
Referentiewaardenvan den Beemd et al.
reactiviteit 21 Vβ MoAb in gezonde donorenneonataal navelstrengbloed tot PB > 70jCD3+ cellen (CD4 en CD8 subpopulaties)
variabele cut-off (2-3 SD, > 20%, # x ULN)
Vβ MoAbselectie (literatuur) of commerciële kit (IOTest® Beta Mark)
Moleculaire diagnostiek
Southern blotting PCR
gen TCRG, TCRB, TCRD TCRG, TCRB, TCRD
analytische sensitiviteit 5 – 10% ANCTCRD: 0.5-10% ANCTCRB: 1–10% ANC TCRG: 1-10% ANC
Genescanning: 0.5-5% ANCHeteroduplex: 1-10% ANC
arbeidsintensief ja (meerdere digesties, hybridisaties) minder
TAT 1-2 maanden 1 (-2) weken
staal veel, hoog kwalitatief DNA veel minder DNA (ook vriescoupes, klein biopt)
Southern blotting = gouden standaard ?TCR genherschikking => ∆ restrictiefragmentlengteoptimale keuze probes / restrictie-enzymes
PCR amplificatie van alle herschikte VDJ-segmentenonderscheid clonaal versus polyclonaal met aanvullende technieken (o.a. heteroduplex, GeneScan analyse)
Standaardisatie: BIOMED-2 multiplex PCR-protocol (TCRG/D/B)
op CME: diagnose (PCR TCRG + ev SB)
opvolging (PCR TCRG)
protocol cfr Theodorou (denaturing gradient gel electrophoresis)
Uit: Van Dongen JJM et al. Leukemia 2003; 17: 2254-2317
Diagnostische performantie
beperkt aantal studies !kleine patiëntengroepen, heterogeen, zeldzamere pathologie
# pathologie PCR SB Vβ MoAb
TCRB TCRG TCRB
van den Beemd 2000 5 T-LGL, T-CLL 1(/1) 4(/4) 4 + 1
Langerak 2001 47 T-LGL, T-CLL, T-PLL, T-NHL, SS, T-AILD 42(/42) 47 31+16
Morice 2004 27 nl 4 0(/17) 1
9 reactief 2 2 0
29 CTCL, T-LGL, PTCL, T-PLL, TCLPD 26 13(/13) 26
Beck 2003 14 T-LGL 12(/12) 14
13 SS, T-PLL, T-NHL 12 13
16 reactief 9 2(/13)
Lima 2001 98 mono/poly/oligo LGL 58/11/29 58/11/29 71/23/4
Sensitiviteit (direct + indirecte detectie) 93-100%Specificiteit (voor maximale sensitiviteit) 80-88%
Moleculaire diagnostiek
studies BIOMED-2 multiplex PCR-protocolsensitiviteit
vals-negatieven = zeer beperkt (slechte primer annealing)specificiteit / vals-positieven ??? (pseudo-clonaliteit)
# PCR SB
TCRB TCRG TCRB+TCRG TCRB/G/D
van Dongen 2003 18 94% 89% 100% 100%
Sandberg 2005 150 87% 86% 100% 89%
Klinische impact
Diagnose: ≠ “klassieke” diagnostische test
andere argumenten voor een maligniteit?
maligniteit versus polyclonale/oligoclonale expansiemonoclonale, reactieve expansieocculte maligniteit
monoclonaliteit ≠ maligniteit, maar wel een noodzakelijk voorwaarde !
“diagnostische challenge”dwz zoveel mogelijk argumenten verzamelen
??
Behandeling/Follow-up:
juiste diagnosestelling maar dit impliceert niet rechtstreeks een behandeling
“verdachte” patiënt opvolgen met betrekking tot verdere evolutie
opvolging met flowcytometrie beperkt tot case-reportsinterpretatie? implicatie?
Prognose/Health outcome:
juiste diagnosestelling maar verder ????
! gebrek aan studies !
Kostprijs: binnen en buiten laboActuele kost:Diagnose: 312€ - 393€ (afhankelijk van hoeveel Vβ MoAb in mix)Opvolging: 43€
Nomenclatuur:RIZIVnummer 555730-555741 (1e antigen): B500 (13.99€)RIZIVnummer 556474-556485 (volgende antigenen met max.12):
B400 (11.20 € x 12 = 134.4 €)
Financiële impact elders: geen kosten-batenanalyses
CME: aparte nomenclatuur ongeveer 300€ voor alle moleculaire testen op een bepaald staal versus 40-80€/PCR
Klinisch/diagnostisch scenarioVraagstellingCritical appraisal
Analytische performantieDiagnostische performantieKlinische impactKostprijs: binnen en buiten labo
Studie GasthuisbergTo Do
Overzicht
Studie Gasthuisberg
Flow Vβ repertoire januari 2001 – oktober 2005 (retrospectief):
131 analyses / 61 patiëntenCME (zelfde patiënten): 78 analyses / 26 patiëntenvergelijkbare data: 46 stalen / 26 patiënten
=> geen echte systematiek in de aanvraag
correlatie voor 43 stalen (3 extractieproblemen / 2 LV)diagnose (16 stalen) en opvolging (27 stalen / 16 patiënten)
Diagnose stalenpatiënt staal Immunfenotype Vbeta MoAb % ANC SB delta SB gamma SB beta PCR gamma Diagnose
1 DL85 bloed CD2/5/7/8/57/ab/16neg/56neg 5.1 (48%) 27% - ?
2 PF39 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16neg/56neg 5.1 (80%) 34% g r r + T-LGL
3 LH68 bloed CD2/5/78//57neg/ab/16neg/56neg 5.1 (37%) 22% + T-LGL
4 ML30 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16neg/56 5.1 (90%) 60% g r r + T-LGL
5 AS94 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16/56 3 (55%) 15% g g g - T-LGL
6 DM47 beenmerg CD2/5/7/8/57neg/ab/16neg/56neg 14 (34%) 26% g r r - T-LGL
7 HW48 beenmerg CD2/5/7/8/57neg/ab/16neg/56neg 13.1/3 (86%) 62% r g r + T-PLL
8 JA29 beenmerg CD2/5/7/4/ab/16neg/56 1 (70%) 46% g r r + T-PLL
9 TM31 bloed CD2/5/7/4/8/57/ab/16neg/56 28% g g r + T-LGL
10 WM15 bloed CD2/5/7neg/8/57/ab/16neg/56neg 49% g r r + T-LGL
11 MJ30 beenmerg CD2/5/7/8/ab/16neg/56neg - g g g + asep. lymf.mening.
12 VHT24 beenmerg CD2/5/7/4/57neg/ab/16neg/56neg - g g g - AML
13 VMA37 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16neg/56 - - T-LGL
14 LE64 beenmerg CD2/5/7/8/57/ab/16/56 36% + T-LGL
15 HN42 beenmerg CD2/5/7/4/57/ab/16neg/56neg - g g g - anaplastisch T-NHL
16 VDPJ39 bloed CD2/5/7/8/57neg/ab/16neg/56neg - g g g - CLL
VG: sarcoïdose (IS)
klinisch verdacht, APO suggestief?, therapie met goede respons
? cfr Boeckx et al.
vals negatieve PCR en SB
vals negatieve PCR
vermoeden cerebraal lymfoom (parese); géén vermelding in verslag?
vals positieve PCR
n = 16 PCR + PCR -
Flow + 8 3
Flow - 1 4
n = 12 SB + SB -
Flow + 7 1
Flow - 0 4
Diagnostische stalen
Follow-up stalen (1)patiënt staal Vbeta MoAb % ANC SB delta SB gamma SB beta PCR gamma Diagnose
1 PF39 CSF 5.1 (32%) 27% extractie T-LGL
2 LH68 bloed 5.1 (43%) 22% + T-LGL
3 MA58 bloed 5.1 (79%) 39% + T-NHL
4 MA58 bloed 5.1 (77%) 37% g r g + T-NHL
5 MA58 beenmerg 5.1 (56%) 9% g g g - ?
6 VCA31 bloed 5.1 (49%) 8% + T-LGL
7 PF43 beenmerg 1 (26%) 12% ip ip ip - M.Kahler
8 PF43 beenmerg 1 (16%) 4% g g g M.Kahler
9 VRP42 bloed 8.1/8.2 (19%) 6% g r r + T-LGL
10 RR33 bloed 8.1/8.2 (30%) 15% + T-NHL
11 RR33 bloed 8.1/8.2 (30%) 8% - T-NHL
12 RR33 bloed 8.1/8.2 (45%) 25% - T-NHL
13 TS34 bloed 5.2/5.3 (64%) 38% g r r + T-LGL
14 AS94 beenmerg 3 (7%) <1% - T-LGL
15 AS94 beenmerg 3 (7%) <1% - T-LGL
vermoedelijk indolent T-NHL, PB PCR en SB+, uiteindelijk behandeld
vals positieve flowgeassocieerde T-LGL ?
vroegere en latere PB PCR en SB +
afwachtende houding
vals negatieve PCR
16 AS94 beenmerg 3 (12%) 7% - T-LGL
17 AS94 beenmerg 3 (65%) 38% + T-LGL
18 AS94 Beenmerg 3 (54%) 15% + T-LGL
19 AS94 Beenmerg 3 (75%) 40% + T-LGL
20 TE37 Beenmerg 5.1(14%) 6% - MGUS/CLL
21 DM47 CSF 14 (47%) 39% extractie T-LGL
22 DM47 beenmerg 14 (19%) 10% extractie T-LGL
23 DM47 beenmerg 14 (41%) 27% g r r - T-LGL
24 HW48 beenmerg 13.1/3 (39%) 1.5% + T-PLL
25 HW48 beenmerg 13.1/3 (91%) 87% + T-PLL
26 VNM43 bloed mix 4 (71%) 46% + T-LGL
27 FI43 beenmerg - + ?
28 JA29 beenmerg 1 (91%) 88% + T-PLL
29 VHT24 beenmerg - - AML
30 CJ39 beenmerg 17 (98%) 96% + T-NHL
Follow-up stalen (2)
geassocieerde T-LGL?
PB: PCR-, SB ip
?
vals negatieve PCRVG: mammaca eerder eerder PCR + op bloed en BM; behandeling gestopt wegens geen effect, nu opvolging
?
n = 16 PCR + PCR -
Flow + 8 3
Flow - 1 4
n = 12 SB + SB -
Flow + 7 1
Flow - 0 4
n = 26 PCR + PCR -
Flow + 15 6
Flow - 1 4
Diagnostische stalen
Follow-up stalen
n = 6 SB + SB -
Flow + 4 2
vals positieve PCR
?
⇒ goede diagnostische sensititviteit (hoge NPV)
⇒ meeste discordanties op beenmerg
Vraagstelling …….
Andere centra?UZ Gent, UZA, ….: enkel moleculaire diagnostiek
Erasmus MC Rotterdam: moleculaire diagnostiek én flowmomenteel nog in onderzoeksfase doel = sequentieel testen
flow negatief: stopflow positief: stopflow twijfelachtig: moleculaire diagnostiek
geen opvolging dmv flow
toegepast op onze data ……????
Samenvattend …….
VOORgoede diagnostische sensitiviteit => eerste screeningrelatief beperkte TAT (snel uitsluiten)diagnostische challengecomplementaire infogeen optimale moleculaire diagnostiek (enkel PCR TCRG)minder expertise nodigkwantificering mogelijk (opvolging onder therapie)
TEGENgroot aantal Vβ MoAbDNA versus eiwit niveauenkel Vβ (geen TCRγδ) indirecte detectie (70% repertoire)nog steeds moleculaire bevestiging nodig?hogere analytische gevoeligheid (quidopvolging?)ook op biopsie (klier, ander weefsel)betere terugbetaling?
To Do …….Overleg met hematologen over al dan niet afschaffen van
flowcytometrische analyse Vβ repertoire
Indien behoud, intern aandacht voor gebruik van perifeer bloed bij diagnose
Indien behoud, overleg omtrent rationalisering van de aanvraag met hematologen en CME
Indien behoud, alternatieve reagentia (IOTest® Beta Mark) evalueren (intern)