carátula aislamiento y evaluación de dos bacterias
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Carátula
Aislamiento y evaluación de dos bacterias entomopatógenas como potenciales agentes de biocontrol
para Tetranychus urticae en cultivos de rosas Rosa spp. de una florícola, Ecuador
Utreras Vinueza, Camila Belén
Departamento de Ciencias de la Vida y de la Agricultura
Carrera de Ingeniería en Biotecnología
Trabajo de titulación, previo a la obtención del título de Ingeniera en Biotecnología
Lic. Koch Kaiser, Alma Rosel, Mgs.
Jueves 26 de Agosto de 2021
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Hoja de resultados de la herramienta Urkund
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Lic. Koch Kaiser, Alma Rosel, Mgs.
DIRECTORA
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Lic. Koch Kaiser, Alma Rosel, Mgs.
C. C.: 1708880792
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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
CERTIFICACIÓN
Certificación Certifico que el trabajo de titulación, “Aislamiento y evaluación de dos bacterias
entomopatógenas como potenciales agentes de biocontrol para Tetranychus urticae en cultivos
de rosas Rosa spp. de una florícola, Ecuador” fue realizado por la señorita Utreras Vinueza,
Camila Belén el cual ha sido revisado y analizado en su totalidad por la herramienta de verificación
de similitud de contenido; por lo tanto, cumple con los requisitos legales, teóricos, científicos,
técnicos y metodológicos establecidos por la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, razón por
la cual me permito acreditar y autorizar para que lo sustente públicamente.
Sangolquí, 6 de agosto de 2021
……………………………
Lic. Koch Kaiser, Alma Rosel, Mgs.
C. C.: 1708880792
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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
RESPONSABILIDAD DE AUTORÍA
Responsabilidad de autoría
Yo, Utreras Vinueza, Camila Belén, con cédula de ciudadanía n°1726065970, declaro que el
contenido, ideas y criterios del trabajo de titulación: “Aislamiento y evaluación de dos bacterias
entomopatógenas como potenciales agentes de biocontrol para Tetranychus urticae en cultivos
de rosas Rosa spp. de una florícola, Ecuador” es de mi autoría y responsabilidad, cumpliendo con
los requisitos legales, teóricos, científicos, técnicos, y metodológicos establecidos por la
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, respetando los derechos intelectuales de terceros y
referenciando las citas bibliográficas.
Sangolquí, 6 de agosto de 2021
.…………………………….
Utreras Vinueza, Camila Belén
C.C.: 1726065970
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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN
Autorización de publicación
Yo Utreras Vinueza, Camila Belén, con cédula de ciudadanía n°1726065970, autorizo a la
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE publicar el trabajo de titulación: “Aislamiento y
evaluación de dos bacterias entomopatógenas como potenciales agentes de biocontrol para
Tetranychus urticae en cultivos de rosas Rosa spp. de una florícola, Ecuador” en el Repositorio
Institucional, cuyo contenido, ideas y criterios son de mi responsabilidad.
Sangolquí, 6 de agosto de 2021
……………………………..
Utreras Vinueza, Camila Belén
C.C.: 1726065970
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Dedicatoria
La presente investigación la dedico a mi padre celestial, quien me acompaña, cuida,
protege y ama incondicionalmente, quien me da la fortaleza diaria para seguir adelante a pesar
de las adversidades, quien guía mi camino en cada paso que doy.
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Agradecimiento
Quiero agradecer sobre todo a Dios por acompañarme y ser mi guía en cada decisión
que he tomado.
A la Universidad de las Fuerzas Armadas, por haberme dado la oportunidad de
desarrollarme profesionalmente y de conocer personas importantes como maestros y amigos.
A mi novio, Jhosep Castillo, quien me brinda su amor y apoyo incondicional, junto con su
familia quienes se han convertido en la mía también.
A mi tutora y admirable persona Lic. Alma Koch, Mgs., quien me ha guiado y apoyado a
lo largo de este proyecto.
A la Mgs. María Esther Cortez por haberme dado la oportunidad de trabajar en su
laboratorio, Microbiolab.
Al Ing. Fabricio Rivadeneira por haberme permitido consolidar este proyecto en su
florícola, AlpaRoses.
Al Mgs. Francisco Flores por haberme permitido realizar parte del trabajo en su
laboratorio, IDgen.
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Índice de Contenidos
Carátula ......................................................................................................................................... 1
Hoja de resultados de la herramienta Urkund ............................................................................. 2
Certificación................................................................................................................................... 3
Responsabilidad de autoría........................................................................................................... 4
Autorización de publicación .......................................................................................................... 5
Dedicatoria .................................................................................................................................... 6
Agradecimiento ............................................................................................................................. 7
Índice de Contenidos ..................................................................................................................... 8
Índice de Tablas ........................................................................................................................... 10
Índice de Figuras .......................................................................................................................... 11
Resumen ...................................................................................................................................... 12
Abstract ....................................................................................................................................... 13
Capítulo I: Introducción ............................................................................................................... 14
Formulación del problema ...................................................................................................... 14
Justificación del problema ...................................................................................................... 15
Objetivos ................................................................................................................................. 17
Objetivo general .................................................................................................................. 17
Objetivos específicos ........................................................................................................... 17
Hipótesis .................................................................................................................................. 17
Capítulo II: Marco teórico ........................................................................................................... 18
Generalidades.......................................................................................................................... 18
Microorganismos entomopatógenos ...................................................................................... 19
Plaga del ácaro Tetranychus urticae ....................................................................................... 19
Bacterias entomopatógenas como agentes de biocontrol ..................................................... 21
Capítulo III: Materiales y métodos .............................................................................................. 23
Participantes del Proyecto ...................................................................................................... 23
Zona de estudio ....................................................................................................................... 23
Condiciones generales ............................................................................................................. 23
Recolección de muestras de suelo .......................................................................................... 24
Aislamiento de cepas bacterianas entomopatógenas ............................................................ 24
9
Identificación de posibles cepas bacterianas entomopatógenas ........................................... 24
Análisis molecular ................................................................................................................... 25
Extracción y cuantificación de ADN genómico .................................................................... 25
Amplificación de ADN mediante PCR .................................................................................. 26
Análisis bioinformático ........................................................................................................ 27
Bioensayos ............................................................................................................................... 27
Confirmación de la especie de la plaga Tetranychus urticae .............................................. 27
Reproducción de Tetranychus urticae ................................................................................. 28
Dilución de los aislados bacterianos ................................................................................... 28
Aplicación de los tratamientos a la plaga Tetranychus urticae.......................................... 29
Diseño experimental ............................................................................................................... 30
Análisis estadístico .................................................................................................................. 31
Capítulo IV: Resultados ............................................................................................................... 32
Aislamiento e identificación de cepas bacterianas ................................................................. 32
Análisis molecular ................................................................................................................... 38
Extracción y cuantificación de ADN ..................................................................................... 38
Amplificación de ADN mediante PCR .................................................................................. 39
Análisis bioinformático ........................................................................................................ 40
Bioensayos ............................................................................................................................... 42
Confirmación de la especie de la plaga Tetranychus urticae .............................................. 42
Reproducción de Tetranychus urticae ................................................................................. 44
Dilución de los aislados bacterianos ................................................................................... 45
Aplicación de los tratamientos a la plaga Tetranychus urticae.......................................... 47
Análisis estadístico .................................................................................................................. 48
Capítulo V: Discusión ................................................................................................................... 52
Capítulo VI: Conclusiones ............................................................................................................ 57
Capítulo VII: Recomendaciones .................................................................................................. 58
Referencias .................................................................................................................................. 59
10
Índice de Tablas
Tabla 1 Secuencia de los primers 27F y 1492R de la región 16S ................................................... 26
Tabla 2 Programa de termociclador correspondiente para amplificar región 16S……………………..27
Tabla 3 Descripción del diseño experimental ............................................................................... 30
Tabla 4 Características morfológicas de los aislados bacterianos ................................................ 32
Tabla 5 Tinciones y prueba bioquímica de la catalasa de los aislados bacterianos ...................... 35
Tabla 6 Concentraciones y absorbancias obtenidas en el espectrofotómetro Nanodrop de los
aislados ........................................................................................................................................ 39
Tabla 7 Secuencias con alta similitud a la del aislado 2R1-3B ...................................................... 41
Tabla 8 Secuencias con alta similitud a la del aislado 1R2-4B ...................................................... 41
Tabla 9 Absorbancias y concentraciones de los aislados en caldo LB ........................................... 45
Tabla 10 Concentraciones de los aislados bacterianos ................................................................ 46
Tabla 11 Porcentajes promedio de mortalidad de la plaga T. urticae .......................................... 48
11
Índice de Figuras
Figura 1 Ciclo de vida de Tetranychus urticae .............................................................................. 20
Figura 2 Aislado bacteriano como posible bacteria entomopatógena (Pseudomonas) ................ 33
Figura 3 Aislado bacteriano como posible bacteria entomopatógena (Bacillus) .......................... 34
Figura 4 Bacterias 2R1-3B teñidas con colorantes Gram y de esporas ......................................... 36
Figura 5 Bacterias 1R2-4B teñidas con colorantes Gram y de esporas ......................................... 37
Figura 6 Prueba de la catalasa en los aislados ............................................................................. 37
Figura 7 Bandas del producto de extracción de ADN de los dos aislados ..................................... 38
Figura 8 Bandas del producto de amplificación de ADN de los aislados ....................................... 39
Figura 9 Ácaro plaga hembra ....................................................................................................... 42
Figura 10 Ácaro plaga macho ...................................................................................................... 43
Figura 11 Edeago del ácaro macho .............................................................................................. 44
Figura 12 Frascos de almacenamiento de los ácaros plaga ......................................................... 45
Figura 13 Ácaros en hojas de rosas en unidades de cría .............................................................. 47
Figura 14 Porcentaje de mortalidad del ácaro por concentración................................................ 49
Figura 15 Porcentaje de mortalidad del ácaro por tipo de bacteria ............................................. 50
Figura 16 Porcentaje de mortalidad del ácaro por tipo de bacteria y concentración ................... 51
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Resumen
El control biológico es un método de restricción de los efectos dañinos de organismos
patógenos mediante el uso de microorganismos útiles que inhiben su crecimiento. Este método
permite tomar ventaja de las interacciones biológicas entre organismos, como el parasitismo,
patogenicidad y competencia, para eliminar plagas de cultivos. Por tanto, su uso en plantaciones
de flores ornamentales a condiciones de invernadero es una opción viable tomando en
consideración las fuertes pérdidas económicas que causan las plagas. En el presente estudio, se
tuvo como objetivo aislar y evaluar dos bacterias entomopatógenas como potenciales agentes
de biocontrol para la plaga del ácaro Tetranychus urticae de cultivos de rosas de una florícola en
Ecuador. Para el aislamiento, se realizaron diluciones con muestras de suelo de donde se
obtuvieron colonias puras empleando cultivos microbiológicos. Se seleccionaron dos posibles
bacterias entomopatógenas mediante su caracterización morfológica y bioquímica. Después,
para el análisis molecular, se realizó su extracción, amplificación y secuenciación de ADN de
donde se identificaron a las bacterias como Pseudomonas spp. del grupo fluorescente y Bacillus
thuringiensis. Para los bioensayos, se transfirieron los ácaros plaga, una vez confirmada la
especie T. urticae, a unidades de cría donde se aplicaron tres diferentes concentraciones de
cada cepa bacteriana y se mantuvo durante siete días registrando el número de población. Por
último, se evaluó la efectividad de los tratamientos mediante el porcentaje de mortalidad de la
plaga donde se determinó que ambas cepas tienen actividad acaricida frente a T. urticae, a nivel
de laboratorio.
Palabras clave:
BIOCONTROL
ENTOMOPATÓGENO
PLAGA
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Abstract
Biological control is a method that consists of restricting the harmful effects of pathogenic
organisms using beneficial microorganisms that inhibit their growth. This method allows taking
advantage of biological interactions between organisms, such as parasitism, pathogenicity, and
competition, to eliminate crop pests. Therefore, its use in ornamental flower plantations under
greenhouse conditions is a viable option taking into consideration the strong economic losses
caused by pests. In the present study, the objective was to isolate and evaluate two
entomopathogenic bacteria as potential biocontrol agents for the Tetranychus urticae mite
plague of rose crops from a floriculture in Ecuador. For isolation, dilutions were made with soil
samples from which pure colonies were obtained using microbiological cultures. Two possible
entomopathogenic bacteria were selected by their morphological and biochemical
characterization. Afterwards, for molecular analysis, DNA extraction, amplification and
sequencing were carried out, from which the bacteria were identified as Pseudomonas spp.
belonging to the fluorescent group and Bacillus thuringiensis. For bioassays, the pest mites were
transferred, once the T. urticae specie had been confirmed, to rearing units where three
different concentrations of each bacterial strain were applied and kept for seven days, recording
the population number. Finally, the effectiveness of the treatments was evaluated by the
percentage of mortality of the plague where it was determined that both strains have acaricidal
activity against T. urticae, at laboratory level.
Keywords:
• BIOCONTROL
• ENTOMOPATHOGEN
• PLAGUE
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Capítulo I: Introducción
Formulación del problema
Las plagas son un problema común dentro del sector agrícola alrededor de todo el
mundo. Estas tienen un diverso origen biótico, pueden ser: virus, bacterias, hongos, nemátodos,
artrópodos, entre algunos otros (Franquesa, 2016). Se destacan por su carácter fitófago y rápida
propagación. Ocasionan la disminución de la producción de las plantaciones, reducen el valor de
la cosecha y pueden llegar a causar la pérdida total de los cultivos (MICEX, 2015).
En el Ecuador, el cultivo de flores ornamentales para su exportación es una de las
fuentes económicas más importantes. Considerando que la floricultura genera empleo para
miles de personas y además representa un porcentaje considerable para el Producto Interno
Bruto del país (Gobierno del Encuentro, 2020). Sin embargo, existen también numerosas plagas
que afectan severamente a los cultivos causando pérdidas graves en el aspecto financiero
(Mundo Flores, 2021; Gordón, 2020).
La plaga del ácaro Tetranychus urticae (araña roja) es considerada una de las causantes
de los daños más graves en cultivos bajo condiciones de invernadero, como las rosas (Brust &
Gotoh, 2018). Esta plaga se ha tratado con varios pesticidas disponibles en el mercado con lo
cual se ha conseguido eliminarla temporalmente. No obstante, el uso de los insecticidas tiene
aspectos negativos como la resistencia de la plaga a los componentes químicos y además el
peligro que representan para la salud. La dosis y porcentaje de compuesto activo aumenta en
función del tiempo generando problemas cada vez más graves (Bielza, 2005).
El uso de enemigos naturales como agentes para el control biológico de plagas ha
crecido exponencialmente. Teniendo entre los agentes controladores a microorganismos
entomopatógenos como bacterias, hongos, virus, etc. Actúan mediante diversos mecanismos
para eliminar plagas objetivo sin crear resistencia y sin ser perjudiciales para el ser humano.
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Tomando en cuenta estas características, su uso para el control de la plaga del ácaro T. urticae
en plantaciones de rosas es una opción prometedora (SENASA, 2017; CABI, 2016).
Justificación del problema
Dentro de la agroindustria ecuatoriana, la producción y exportación de rosas es una de
las actividades económicas más importantes aportando significativamente al Producto Interno
Bruto del país, por lo que, los cultivos afectados con plagas representan una pérdida económica
relevante. Una de las plagas más conocidas por su amplia distribución en una variedad de
especies vegetales, destacando la rosa, es la del ácaro Tetranychus urticae. Este artrópodo
minúsculo se caracteriza por su agresividad y capacidad de infestación debido a su corto ciclo de
vida y alta tasa de reproducción llegando a causar el colapso de los cultivos (Silva, 2020).
Los bioplaguicidas son productos a base de compuestos activos provenientes de un
microorganismo. Las bacterias entomopatógenas más empleadas en la agroindustria son las del
género Bacillus que se caracterizan por ser formadoras de esporas lo cual les permite ingresar al
sistema de la plaga donde deposita sus toxinas. También en los últimos años se han realizado
varias investigaciones sobre Pseudomonas del grupo fluorescente como agente de biocontrol
pues tienen la capacidad de producir una variedad de metabolitos los cuales actúan estimulando
el crecimiento de las plantas y, a la vez, de forma antagónica contra plagas. Dichas
características convierten a ambos géneros en una alternativa segura y eficaz para su uso como
control biológico. Entre las especies más usadas como acaricidas se encuentra B. thuringiensis
cuyas formulaciones ya se venden en el mercado (Arthurs & Bruck, 2017).
El uso de bacterias entomopatógenas permite eliminar plagas, como la del ácaro T.
urticae, con eficacia sin ser nocivo para otras especies ni para la salud humana. Al optar por el
control biológico se evita el uso de agroquímicos reduciéndose así la contaminación ambiental.
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También se logra reducir la adquisición de resistencia a los pesticidas causada por su uso
indiscriminado (Onstad, 2014).
El interés de las florícolas y de los sectores productores de plantas ornamentales en
aislar microorganismos entomopatógenos se debe a los beneficios de la microbiología aplicada a
la agricultura. Los hongos y bacterias pueden favorecer el crecimiento de las plantas, ayudar a
su nutrición, pero sobre todo pueden ser usados para el control de plagas. La capacidad de
adaptación de los microorganismos entomopatógenos a diferentes condiciones ambientales
puede variar ampliamente por lo que la efectividad del biocontrol se puede ver afectada
significativamente (Montaño, Sandoval, Camargo, & Sánchez, 2010). Las florícolas optan por la
implementación de sus propios laboratorios de microbiología para realizar el aislamiento y
reproducción de microorganismos de interés para emplearlos en las mismas plantaciones de
donde fueron obtenidos asegurando su eficacia (Valcárcel Calderón, 2013).
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Objetivos
Objetivo general
Aislar y evaluar dos bacterias entomopatógenas como potenciales agentes de biocontrol
para Tetranychus urticae en cultivos de rosas Rosa spp. de una florícola, Ecuador.
Objetivos específicos
Aislar cepas bacterianas entomopatógenas en medios de cultivos microbiológicos a
partir de cultivos de rosas con la plaga T. urticae, del cantón Quito.
Identificar dos cepas entomopatógenas de los aislados mediante pruebas bioquímicas y
análisis molecular.
Reproducir el ácaro T. urticae en unidades de cría para los bioensayos, a nivel de
laboratorio.
Comprobar la eficacia de las bacterias entomopatógenas aisladas como agentes
biocontroladores de T. urticae en rosas mediante bioensayos duales, a nivel de
laboratorio.
Hipótesis
Las dos cepas entomopatógenas aisladas e identificadas actúan como agentes de
biocontrol para Tetranychus urticae en cultivos de rosas Rosa spp. de una florícola, a nivel de
laboratorio.
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Capítulo II: Marco teórico
Generalidades
Los cultivos comerciales constituyen una fuente importante de la economía mundial, ya
que parte de la base alimentaria de la población, así como actividades económicas dependen de
la producción agrícola (Kang, 2019). Se debe prestar especial atención al control de insectos
plaga y enfermedades de las plantas, puesto que estos causan la destrucción del 18% de la
producción agrícola anual a nivel mundial, suponiendo una pérdida económica de miles de
millones de dólares (Nicholson, 2007).
Ecuador es un país que depende del desarrollo de actividades agrícolas, donde uno de
los productos mayormente comercializados son las flores. El área de cosecha de flores
ornamentales, especialmente la de rosas, incrementa cada año. Expoflores anunció que el
Ecuador tiene una capacidad de cultivo de rosas representando aproximadamente novecientos
millones de dólares, siendo una cifra considerable para el aporte económico al país (Silva, 2020).
Sin embargo, las plagas causan pérdidas considerables de cultivos desembocando en pérdidas
económicas de igual forma.
Para luchar contra las plagas, se ha recurrido al empleo de pesticidas químicos (Mnif &
Ghribi, 2015). El uso de insecticidas está ampliamente extendido por su facilidad de obtención y
rapidez de acción, haciéndolos muy efectivos. También se ven favorecidos por su bajo costo y
disminución de la prevalencia de enfermedades humanas al eliminar los insectos vectores
(Sarwar, 2015). A pesar de sus beneficios, su uso origina problemas como su acumulación y
permanencia en el ambiente, causando la contaminación de suelos y aguas subterráneas, y
representando un peligro para los seres vivos que se encuentran expuestos a los químicos
tóxicos (Mishra, Tewari, Singh, & Arora, 2015). Aunque se han podido controlar ciertas plagas
con insecticidas químicos, otras han desarrollado resistencia a dichos productos causando un
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mayor problema (Shea, Possingham, & Murdoch, 2002). Como alternativa existen otras
estrategias de control de plagas efectivas y amigables con el medio ambiente, como el
biocontrol (Dhaliwal, Jindal, & Dhawan, 2010). Se conforma de organismos vivos y sustancias
derivadas entre los cuales se incluyen los microorganismos, extractos de plantas y pesticidas
(Kachhawa, 2017). Entre las ventajas del biocontrol con respecto a los plaguicidas
convencionales se encuentran: su bajo nivel de contaminación de los ecosistemas, su acción
contra especies plaga específicas, es decir, no representan patogenicidad para el resto de los
organismos vivos no relacionados con la plaga, su biodegradabilidad y su efectividad (Mehrotra,
Kumar, Zahid, & Garg, 2017; Grijalba, Hurst, Ibarra , & Jurat, 2018).
Microorganismos entomopatógenos
Las bacterias, hongos y virus son los microorganismos más comúnmente empleados
como control de insectos y ácaros plaga. En el caso de las bacterias, son las más usadas para
control de plagas de polillas, moscas, mosquitos, mariposas, escarabajos y ácaros ya que
producen toxinas específicas cuya acción causa su mortalidad al ser ingerido por el insecto
(Kachhawa, 2017).
Plaga del ácaro Tetranychus urticae
Los ácaros son arácnidos considerados plaga con mayor afectación en cultivos
ornamentales debido a su alta tasa de reproducción, corto ciclo de vida, tamaño microscópico,
fácil adaptación y resistencia a pesticidas (Guzmán, 2006). Tetranychus urticae es la especie más
representativa de los ácaros plaga en cultivos debido a su amplia distribución, incluida la rosa.
La clasificación taxonómica de Tetranychus urticae es la siguiente (Lozada, 2011):
Reino: Animalia
Filo: Arthropoda
Clase: Arachnida
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Subclase: Acari
Orden: Prostigmata
Familia: Tetranychidae
Género: Tetranychus
Especie: T. urticae Koch (1836)
El ácaro presenta cinco estadíos en su ciclo vital: huevo, larva, primer estadío ninfal,
segundo estadío ninfal y ácaro adulto como se muestra en la Figura 1. En el estadío de larva y
ninfales se puede distinguir un período activo y uno pasivo (Malais & Ravensberg, 1991). En el
estado adulto se da la diferenciación del sexo. La hembra se caracteriza por su forma
redondeada de dimensiones de 0.5 por 0.3 milímetros. Mientras que el macho tiene un menor
tamaño y forma prolongada que termina en punta con las patas alargadas (Lozada, 2011).
Figura 1
Ciclo de vida de Tetranychus urticae
21
Nota. El gráfico representa el ciclo de vida de Tetranychus urticae con una temperatura
promedio de 20 °C y una humedad relativa de 65 %. Tomado de Evaluación de productos
orgánicos para el control de araña roja (Tetranychus urticae Koch) en el cultivo de fresa
(Fragaria vesca) (p. 37), por A. Lozada, 2011, Universidad Técnica de Ambato.
El ácaro puede perjudicar a la planta en todos sus estados, siendo que se ubican en el
reverso de las hojas para absorber el contenido de las células vegetales. Estas áreas afectadas se
tornan amarillentas a simple vista como puntos descoloridos en las hojas, donde han sido
afectadas las zonas fotosintéticas. Dependiendo del nivel de infección, el cultivo puede llegar a
sucumbir (Malais & Ravensberg, 1991; Lozada, 2011).
Bacterias entomopatógenas como agentes de biocontrol
Se han estudiado varias bacterias entomopatógenas capaces de controlar plagas y
enfermedades vegetales gracias a su actividad patogénica, pero inocua para el ser humano.
Dentro de los géneros con más aplicaciones en biocontrol se encuentran las Pseudomonas,
específicamente miembros del grupo fluorescente (Yang & Lijuan, 2016). Las cepas aisladas de la
rizosfera se caracterizan por su capacidad entomopatógena de producir metabolitos tóxicos
para hongos fitófagos, insectos, nemátodos e incluso ácaros. Entre los compuestos activos que
producen se encuentran los sideróforos, antibióticos de tipo fenazina o cianuro de hidrógeno y
principalmente el metabolito secundario 2,4-diacetilfloroglucinol (2,4-DAPG) el cual es
responsable de las propiedades antifitopatogénicas y de control biológico (Krieg, Holt, & Döring,
2021). Se ha demostrado en numerosas investigaciones la actividad insecticida de ciertas cepas
como P. cedrina y P. xylostella para control de Lepidóptera, P. azotoformans para control de
enfermedades fúngicas como Fusarium, P. protegens y P. chlororaphis para control de insectos
en estado de larvas, P. putida para control de ácaros (T. urticae), etc (Fang-Hua, Xiao-Li, & Zhi
Wei, 2019).
22
Otro de los géneros más empleados en la agricultura como controlador biológico de
plagas, al actuar como un potente insecticida, es el género Bacillus. Estudios realizados han
demostrado la eficacia de estas bacterias para eliminar la plaga del ácaro mediante sus
proteínas tóxicas. Como, por ejemplo, una de las mejores estudiadas: Bacillus thuringiensis que
durante su etapa de esporulación produce una inclusión proteica denominada Cry la cual es
tóxica. Actúa paralizando el tracto digestivo del insecto después de ser ingerido dando como
resultado su muerte (Porcar & Juárez-Pérez, 2004). Entre las especies utilizadas con mayor
frecuencia por su alta actividad biológica se encuentran B. thuringiensis, B. popilliae, B.
sphaericus y B. moritai. Estas bacterias son empleadas para controlar plagas Díptera (moscas y
mosquitos) en estado larval, y otras como la del ácaro (Torres Cabra & Hernández Fernández,
2015; Flury, Aelle, & Ruffner, 2016; Aksoy, Ozman-Sullivan, & Ocal, 2008; Olayo Paredes, 1999).
La identificación de género y especie de bacterias, en la actualidad, se lleva a cabo no
solo con características fisiológicas y ensayos bioquímicos sino con análisis molecular el cual se
basa en extraer ADN, amplificar una región especifica como la 16S ribosomal (en el caso de
bacterias) y compararla con una base de datos. Con esto se obtiene una identificación a nivel
molecular. La asociación de todas las técnicas mencionadas se emplea como estrategia para la
identificación en el área de microbiología (Merck KGaA, 2021).
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Capítulo III: Materiales y métodos
Participantes del Proyecto
El proyecto de tesis fue desarrollado por Camila Belén Utreras Vinueza, con la
colaboración de Alma Koch Mgs. Directora del proyecto, Francisco Flores Ph,D. Docente, María
Esther Cortez, Mgs. y Fabricio Rivadeneira, Ing. Se contó con la participación de las empresas:
florícola AlpaRoses, laboratorio Microbiolab y laboratorio IDgen.
Zona de estudio
Las muestras de plantas y suelo fueron recolectadas de la florícola AlpaRoses ubicada en
Conocoto, cantón Quito, provincia de Pichincha con coordenadas Latitud: -0.306507478512033,
Longitud: -78.50183995843771.
Los experimentos de aislamiento de las bacterias entomopatógenas se realizaron en el
laboratorio de microbiología aplicada Microbiolab, cantón Quito, provincia de Pichincha con
coordenadas Latitud: -0.18370403790599452, Longitud: -78.48727334636905.
Mientras que el análisis molecular se realizó en el laboratorio IDgen en cantón Quito,
provincia de Pichincha con coordenadas Latitud: -0.165566743726392, Longitud: -
78.46855797732745.
Condiciones generales
Los experimentos de aislamiento de las cepas entomopatógenas se llevaron a cabo bajo
condiciones de temperatura (25 ± 1 °C), fotoperiodo 16 horas luz: 8 horas oscuridad (16L:8O) y
humedad relativa (55% h.r.) en el laboratorio de microbiología aplicada Microbiolab, cantón
Quito, provincia de Pichincha. Mientras que el análisis molecular se realizó bajo condiciones de
20 ± 1 °C, L16:O8 y 45% h.r. en el Laboratorio IDgen, cantón Quito. Las observaciones se
realizaron con un microscopio óptico regular.
24
Recolección de muestras de suelo
Se recolectó muestras de suelo de plantas que presentaban muestras visibles de daños
causados por la plaga del ácaro, T. urticae, en recipientes estériles de la florícola AlpaRoses
ubicada en Conocoto, cantón Quito, provincia de Pichincha. Estas muestras fueron llevadas al
laboratorio de microbiología aplicada Microbiolab, cantón Quito, provincia de Pichincha.
Aislamiento de cepas bacterianas entomopatógenas
Se realizó una solución con la muestra de suelo y medio Agar Nutritivo (AN) de 1:10. A
partir de la solución madre se realizaron diluciones (10-2 a 10-4) con dos repeticiones por dilución
y se inoculó 100 µL de cada una en cajas Petri.
Transcurridas las 48 horas de incubación, se seleccionaron las colonias que presentaban
la forma, tamaño, textura, color y aspecto característico de cepas entomopatógenas (género
Bacillus y Pseudomonas del grupo fluorescente) según el Manual Sistemático Bacteriológico de
Bergey. Se obtuvieron aislados puros subcultivando, por estriado, una colonia por caja en AN. Se
realizaron dos repeticiones y se tomaron dos diferentes colonias de cada caja rotulando los
nuevos aislados como A y B. Se dejó incubar durante 48 horas y se mantuvieron las cajas Petri
en una funda estéril bien sellada en refrigeración a 3 °C.
Identificación de posibles cepas bacterianas entomopatógenas
Se realizaron las tinciones Gram y de esporas con verde malaquita para los posibles
aislados de Bacillus spp. Se observó al microscopio bajo el objetivo 100X con aceite de inmersión
para comprobar si las bacterias eran Gram positivas o negativas y si eran formadoras de
esporas.
Se realizó la prueba de la catalasa a las posibles cepas entomopatógenas, fijando las
muestras a portaobjetos y añadiendo una gota de peróxido de hidrógeno. Se observó al
microscopio bajo el objetivo 40X para comprobar la presencia de burbujas indicando que las
25
bacterias interactúan con el oxígeno del reactivo. Se seleccionaron dos colonias como
potenciales bacterias entomopatógenas para su respectivo análisis molecular.
Análisis molecular
Extracción y cuantificación de ADN genómico
Se extrajo el ADN de las dos cepas bacterianas seleccionadas mediante métodos
convencionales y se realizaron dos repeticiones. Se tomó aproximadamente 100 mg de pellet
celular bacteriano de los cultivos puros con un asa bacteriológica en un tubo de 1 mL al cual se
le añadió 500 µL de buffer de extracción y 2µL de β-mercaptoetanol. Se agitó vigorosamente
para romper las paredes celulares y liberar el ADN. Se añadió 500 µL de cloroformo y se
homogeneizó seguido de centrifugación a 14,500 xg por 10 min. Se tomó únicamente el
sobrenadante, aproximadamente 400 µL, y se colocó en un tubo nuevo estéril. Se le añadió 400
µL de etanol absoluto, 150 µL de acetato de sodio 3M y 300 µL de etanol al 70% filtrado para
precipitar el ADN, se mantuvo durante toda la noche a -20 °C. Al día siguiente se centrifugaron
las muestras a 14,500 xg por 17 min. En cámara, se eliminó el sobrenadante y se lavó el pellet
con 200 µL de etanol al 70% dejando secar durante 20 min. Se resuspendió el pellet en 25 µL de
agua DEPC, se le añadió 1 µL de RNAsa y se incubó por 30 min a 37 °C. Se almacenaron las
muestras a -20 °C hasta su posterior uso. Para determinar que el ADN no se encuentre
degradado, se corrieron 3 µL de las muestras con 2 µL de Bluejuice en un gel de agarosa al 1% a
90V por 35 min. Posteriormente, se visualizaron las bandas bajo luz UV. También se midió la
calidad del ADN extraído empleando el espectrofotómetro NanoDrop, donde se calibró el
equipo con 2 µL de agua estéril destilada y se realizó la lectura con 2 µL de cada muestra. Los
resultados de la concentración de ADN y las razones de las absorbancias a 260/230 y 260/280 de
las muestras fue reportado por el programa.
26
Amplificación de ADN mediante PCR
Se diluyeron las muestras anteriormente almacenadas hasta obtener aproximadamente
300 ng/µL para evitar que la reacción se inhibiera por exceso de sustrato. Dentro de cámara se
preparó el máster mix en un tubo estéril donde se añadió 25,5 µL de agua, 37,5 µL de
polimerasa Taq, 3 µL de cada primer: forward 27F y reverse 1492R, para amplificar la región 16
S, los primers se encuentran descritos en la Tabla 1 (Chen, Lee, & Lin, 2015). Se repartió en 3
tubos: el blanco, la muestra 1 (Bacteria 1) y la muestra 2 (Bacteria 2). Se añadieron 2 µL de ADN
o agua para el blanco respectivamente a cada tubo y se homogeneizó. Se amplificaron las
muestras en un termociclador de acuerdo con el programa correspondiente a la amplificación
de la región 16S con 35 ciclos, protocolo mostrado en la Tabla 2. Por último, se corrieron las
muestras con el marcador molecular 100pb Opti-DNA (rango 50 bp - 1.5 kb) en un gel de
agarosa al 1% a 90V por 35 min donde se visualizaron las bandas bajo luz UV. Las muestras
fueron enviadas al laboratorio Macrogen, Inc. en Corea del Sur donde fueron secuenciadas por
el método SANGER.
Tabla 1
Secuencia de los primers 27F y 1492R de la región 16S
Gen Primer Secuencia (5’→ 3’)
16S 27F (Forward) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R (Reverse) GGTTACCTTGTTACGACTT
Nota. En la tabla se muestran las secuencias de 5’a 3’ de los primers 27F (forward) y 1492R
(reverse) de la región 16S. Tomado de Obtaining long 16S rDNA sequences using multiple
primers and its application on dioxin-containing samples (p. 4), por Y. Chen, C. Lee & Y. Lin, 2015,
BMC Bioinformatics.
27
Tabla 2
Programa de termociclador correspondiente para amplificar región 16S
Protocolo Temperatura (°C) Tiempo (s)
Desnaturalización inicial 95 300
Desnaturalización 95 30
Annealing 54.5 40
Extensión 72 90
Extensión final 72 420
Nota. En la tabla se describe el proceso de amplificación que se da por ciclo para amplificar la
región 16S de ADN ribosomal de bacterias. Tomado de Mini16 thermal cycler (p. 10), Amplyus
LLC, 2018, Amplyus.
Análisis bioinformático
Las secuencias génicas obtenidas de la Bacteria 1 y Bacteria 2 fueron editadas y
alineadas con el software bioinformático Geneious para tener una buena calidad. Se generó un
archivo con las secuencias editadas en formato fasta. Se subieron las secuencias al programa
BLAST de nucleótidos del NCBI limitando la búsqueda a secuencias del material tipo. El algoritmo
comparó las secuencias subidas con las de la base de datos del GenBank para obtener el
organismo con el que compartió mayor similitud logrando su identificación molecular.
Bioensayos
Confirmación de la especie de la plaga Tetranychus urticae
Se recolectó muestras de hoja de rosas de la florícola AlpaRoses, con síntomas de
ataque del ácaro, en frascos de vidrio con tapa hermética y se llevó al laboratorio. Con la ayuda
de un pincel se transfirieron varios especímenes en un tubo con etanol para preservarlos. Se
28
prepararon placas donde se colocaron los especímenes más una gota de glicerina y se cubrieron
con láminas cubreobjetos para su observación al microscopio. Se observó la morfología general
del arácnido bajo el objetivo 10X y del edeago (órgano copulador intromitente del ácaro macho,
característico de T. urticae) bajo el lente 40X en un microscopio óptico. Se analizó la estructura
morfológica de la plaga basándose en claves taxonómicas de los ácaros del género Tetranychus.
Reproducción de Tetranychus urticae
Se probaron dos diferentes metodologías de reproducción del ácaro. A partir de las
muestras de hojas de rosas recolectadas con síntomas de ataque del ácaro de la florícola
AlpaRoses, se tomaron los ácaros con la ayuda de un pincel fino y se colocaron en frascos de
vidrio (8cm de diámetro y 6cm de alto) con una hoja de papel absorbente en la base para
mantener la humedad. Además, se añadió una hoja de las rosas sin ningún tipo de infección
para que sirviera como alimento. Los frascos se sellaron con film plástico y se realizó
perforaciones con una aguja para que fluyera el aire. Para el primer método se mantuvieron los
frascos en el laboratorio a condiciones de 23 ± 1 °C, L16:O8 y 45% h.r. durante un periodo de 20
días. Mientras que para el otro método se trasladaron los ácaros recién recolectados,
mantenidos bajo las mismas condiciones, directamente a las unidades de cría un par de horas
antes de la aplicación de las diluciones en los bioensayos. Se empleó la metodología con los
mejores resultados midiendo la cantidad de ácaros vivos mediante la reacción ante el sutil toque
con un pincel fino.
Dilución de los aislados bacterianos
Se inoculó cada bacteria, a partir de los cultivos en cajas Petri con medio Agar Nutriente,
en 15 mL de caldo Luria Bertrani (LB), se realizó por repetición en 13 tubos (6 tubos para la
muestra 1 y 6 tubos para la muestra 2, tomando en cuenta tres concentraciones y dos
29
repeticiones cada uno, más un tubo de blanco). Se dejó incubar toda la noche a 150 rpm y a 21
°C.
Al día siguiente se midió la absorbancia del blanco y de las muestras a una longitud de
onda de 600nm para relacionar el OD600 (densidad óptica a 600nm) con concentración
bacteriana UFC/mL (unidades formadoras de colonias por mililitro) asegurándose de la
obtención de un rango de detección. Para calcular las concentraciones celulares, se
correlacionaron los coeficientes de extinción para cultivos bacterianos (E. coli) con los obtenidos
mediante un espectrofotómetro. Se verificó que las suspensiones tengan una concentración
aproximada dentro del rango de 1x108 a 1x109 UFC/mL. Una vez ajustadas las concentraciones,
se pasaron 10 mL de las muestras a tubos plásticos para centrifugar a 4000 rpm durante 5 min
en centrífuga con refrigeración. A partir de aquí, se obtuvo el sedimento con las bacterias vivas,
se eliminó el sobrenadante y se añadió 10 mL de solución tampón de fosfato estéril (PBS) 1X a
cada tubo. Ya que se realizó por repetición, se seleccionaron únicamente tres diferentes
concentraciones por cada bacteria para ser usadas en los bioensayos. Se mantuvieron las
diluciones en refrigeración a 3 °C hasta su aplicación.
Aplicación de los tratamientos a la plaga Tetranychus urticae
Se montaron las unidades de cría que consistieron en colocar una hoja fresca circular de
rosa (4 cm de diámetro) con el envés hacia arriba, rodeada con un anillo de vaselina, para
prevenir el escape de los especímenes, en una caja Petri forrada con algodón (0.5 cm de ancho)
en su base para mantener la turgencia de la hoja. Se realizó el procedimiento para 21 cajas Petri,
donde se tuvieron nueve cajas para cada bacteria tomando en cuenta las tres diferentes
concentraciones y tres repeticiones por cada una, más un control negativo por cada repetición.
Previo a colocar los ácaros, se añadieron 2 mL de agua destilada al algodón en la base de
las cajas. Después, se trasladaron 10 ácaros a partir de la reproducción masiva, a cada unidad de
30
cría previamente preparada. Se añadió aproximadamente 0.3 mL de cada dilución por goteo,
con una micropipeta, a las unidades, mientras que, para los controles negativos, se añadió el
mismo volumen de PBS 1X. Se colocaron todas las cajas preparadas en una caja grande a
condiciones de 30 ± 2 °C, 65 ± 5% h.r. y un fotoperiodo de 16L:8O. Se añadió agua a las cajas, en
caso de ser necesario, para mantener la humedad. Se revisó la efectividad de los tratamientos a
las 72, 120 y 168 horas después de la aplicación contando y registrando el número de individuos
muertos.
Diseño experimental
Se aplicó en la investigación un diseño completamente al azar (DCA) con 21 unidades
experimentales: seis tratamientos (tres concentraciones para cada formulación) con tres
repeticiones cada uno más controles por cada repetición. Dentro de cada unidad experimental,
se incluyeron 10 ácaros plaga y se realizó el conteo de los organismos vivos tres veces en el
lapso de una semana. El diseño experimental se encuentra descrito en la Tabla 3.
Tabla 3
Descripción del diseño experimental
Bacteria 1 Bacteria 2
Control C1 C2 C3 C1 C2 C3
Repetición 1 R1F1C1 R1F1C2 R1F1C3 R1F2C1 R1F2C2 R1F2C3 R1
Repetición 2 R2F1C1 R2F1C2 R2F1C3 R2F2C1 R2F2C2 R2F2C3 R2
Repetición 3 R3F1C1 R3F1C2 R3F1C3 R3F2C1 R3F2C2 R3F2C3 R3
Nota. En la tabla se describen los elementos que conformar el diseño experimental del
proyecto.
31
Análisis estadístico
Los porcentajes de reducción de la densidad poblacional de T. urticae se calcularon
utilizando la ecuación propuesta por (Henderson & Tilton, 1955):
𝑀 = 1 − (𝑛 en C antes del tratamiento × 𝑛 en T después del tratamiento
𝑛 en C después del tratamiento × 𝑛 en T antes del tratamiento) × 100
Donde:
M = porcentaje de mortalidad
n = población de ácaros plaga
T = tratado
C = control
Se probaron las hipótesis de las medias de los diferentes tratamientos aplicados
mediante ANOVA. También se realizó la prueba de Tukey para determinar diferencias
estadísticamente significativas entre promedios de las tasas de mortalidad de la plaga (p ≤ 0.05).
32
Capítulo IV: Resultados
Aislamiento e identificación de cepas bacterianas
A partir de diluciones de muestras de suelo de la florícola, se eligió dos aislados
bacterianos como posibles bacterias entomopatógenas basado en sus características
morfológicas, tinciones y pruebas bioquímicas. Se caracterizó morfológicamente a todos los
aislados como se indica en la Tabla 4. Se comparó la morfología de las colonias con los géneros
Bacillus y Pseudomonas según el Manual Sistemático de Bergey.
Tabla 4
Características morfológicas de los aislados bacterianos
Cepa Forma Elevación Margen Superficie Color
1R1-3A Irregular Elevada Ondulado Rugosa Crema
1R1-3B Puntiforme Elevada Ondulado Lisa Blanco hueso
1R2-3A Irregular Elevada Filamentoso Rugosa Amarillo
verdoso
1R2-3B Irregular Elevada Ondulado Rugosa Amarillo
pálido
1R1-4A Circular Convexa Completo Plegada Crema
1R1-4B Circular Elevada Filamentoso Rugosa Blanco hueso
1R2-4A Irregular Elevada Ondulado Plegada Blanco hueso
1R2-4B Irregular Plana Ondulado Rugosa Crema
2R1-3A Irregular Plana Completo Lisa Amarillo
verdoso
2R1-3B Irregular Convexa Ondulado Lisa Amarillo
pálido
2R2-3A Circular Convexa Ondulado Rugosa Rosa
2R2-3B Circular Plana Ondulado Rugosa Blanco hueso
2R1-4A Irregular Convexa Filamentoso Plegada Blanco hueso
2R1-4B Puntiforme Convexa Ondulado Rugosa Blanco hueso
33
Cepa Forma Elevación Margen Superficie Color
2R2-4A Irregular Elevada Completo Lisa Amarillo
intenso
2R2-4B Irregular Elevada Ondulado Rugosa Amarillo
pálido
Nota. En la tabla se describe la morfología de colonias aisladas, de muestras de suelo, en medio
AN.
En base a la morfología de las colonias, el aislado 2R1-3B (Bacteria 1) presentó aspecto
característico de Pseudomonas del grupo fluorescente donde las colonias eran irregulares y
convexas, con bordes ondulados, de superficie lisa y color amarillento pálido como muestra la
Figura 2. Mientras que el aislado 1R2-4B.1 (Bacteria 2), mostró características del género
Bacillus siendo las colonias regulares y planas con márgenes ondulados, textura matizada y color
blanco crema como se muestra en la Figura 3.
Figura 2
Aislado bacteriano como posible bacteria entomopatógena (Pseudomonas)
Nota. Colonias puras del aislado 2R1-3B como posibles Pseudomonas fluorescentes en medio
AN.
34
Figura 3
Aislado bacteriano como posible bacteria entomopatógena (Bacillus)
Nota. Colonias puras del aislado 1R2-4B como posible Bacillus en medio AN.
En cuanto a las propiedades de composición de la pared celular y metabolismo de los
aislados, se obtuvo la Tabla 5 de resultados. Las bacterias Gram positivas presentaron un color
violeta o morado mientras que las Gram negativas tuvieron una coloración rosa como se
muestra en las Figuras 4 y 5 (A). En cuanto a la tinción con verde malaquita y safranina, para las
bacterias formadoras de esporas los bacilos se tiñeron de rosa y las esporas de color verde
mientras que las no formadoras de esporas no presentaron estas inclusiones teñidas de color
verde como se ve en las Figuras 4 y 5 (B). La prueba de la catalasa mostró resultados positivos al
formarse burbujas una vez que se colocó una gota de peróxido de hidrogeno y se observó bajo
el microscopio como se muestra en la Figura 6.
35
Tabla 5
Tinciones y prueba bioquímica de la catalasa de los aislados bacterianos
Cepa Tinción Gram Tinción de esporas Prueba de la
Catalasa
1R1-3A + – +
1R1-3B – – –
1R2-3A + + –
1R2-3B + – +
1R1-4A – – +
1R1-4B – – –
1R2-4A – + +
1R2-4B + + +
2R1-3A – + +
2R1-3B – – +
2R2-3A – – +
2R2-3B – – +
2R1-4A – + +
2R1-4B + + +
2R2-4A – – +
2R2-4B + – +
Nota. En la tabla se describen los resultados de la tinción Gram, de esporas y de la prueba
bioquímica de la catalasa. Donde, (+) corresponde a bacterias: Gram positivas/formadoras de
esporas/aerobias facultativas y (–) corresponde a Gram negativas/no formadoras de
esporas/anaerobias.
El aislado 2R1-3B es un bacilo Gram negativo no productor de esporas por lo que es
considerado como posible Pseudomonas del grupo fluorescente tomando en cuenta sus demás
características morfológicas y bioquímicas. Mientras que el aislado 1R2-4B es un bacilo Gram
positivo formador de esporas como posible Bacillus. Además, con las tinciones Gram y de verde
36
malaquita se observaron bajo el microscopio las esporas de las bacterias del aislado 1R2-4B
(Figura 5 B). Se distinguió en las endosporas su posición en el centro y su tamaño regular que no
deformó los bacilos. También se observó bajo el microscopio inclusiones proteicas, como
posibles cristales de B. thuringiensis, junto con las esporas en los bacilos. Ambos
microorganismos demostraron ser aerobios facultativos al ser positivos para la prueba de la
catalasa.
Figura 4
Bacterias 2R1-3B teñidas con colorantes Gram y de esporas
Nota. Bacterias del aislado 2R1-3B bajo el objetivo 100X con microscopio óptico. (A) tinción
Gram. (B) tinción con verde malaquita y safranina.
A B
37
Figura 5
Bacterias 1R2-4B teñidas con colorantes Gram y de esporas
Nota. Bacterias del aislado 1R2-4B bajo el objetivo 100X con microscopio óptico. (A) tinción
Gram. (B) tinción con verde malaquita y safranina.
Figura 6
Prueba de la catalasa en los aislados
A B
38
Nota. Prueba catalasa positiva, formación de burbujas, bajo el objetivo 40X con microscopio
óptico.
Análisis molecular
Extracción y cuantificación de ADN
Previo a la fase de amplificación del ADN extraído de los aislados 2R1-3B y 1R2-4B, se
corrió un gel de agarosa para evaluar su integridad. La electroforesis dio como resultado bandas
intensas, como se muestra en la Figura 7.
Figura 7
Bandas del producto de extracción de ADN de los dos aislados
Nota. Gel de agarosa al 1% bajo luz UV donde se visualizan bandas con las muestras (carriles 3 y
4) y controles negativos (carriles 1 y 2).
– –
2R1-3B
1R2-4B
39
La cuantificación del ADN extraído mediante NanoDrop arrojó la Tabla 6 de resultados.
Se indican los valores de absorbancia y concentración para la determinación de su calidad
mediante el valor de contaminación.
Tabla 6
Concentraciones y absorbancias obtenidas en el espectrofotómetro Nanodrop de los aislados
ID de la
Muestra
Fecha y
Hora
Ácido
Nucleico
ng/µl
A260
(Abs)
A280
(Abs) 260/280 260/230
Tipo de
Muestra
Bacteria 1.1
6/14/2021
10:44 3450 69.001 35.292 1.96 1.94
DNA
Bacteria 1.2 6/14/2021
10:45 6617.6 132.353 66.665 1.99 1.96 DNA
Bacteria 2.1 6/14/2021
10:47 1112 22.24 11.469 1.94 1.64 DNA
Bacteria 2.2 6/14/2021
10:48 1506.1 30.122 15.551 1.94 1.75 DNA
Nota. La tabla indica el nombre de la muestra: Bacteria 1.1 y Bacteria 1.2 para al aislado 2R1-3B,
y Bacteria 2.1 y Bacteria 2.2 para al aislado 1R2-4B, ambas por repetición.
Amplificación de ADN mediante PCR
Después de la amplificación por PCR, se corrió la respectiva electroforesis en gel de
agarosa de los aislados: 2R1-3B y 1R2-4B, lo que dio como resultado bandas bien definidas e
intensas en los carriles 2 y 3, como se muestra en la Figura 8.
Figura 8
Bandas del producto de amplificación de ADN de los aislados
40
Nota. Gel de agarosa al 1% bajo luz UV donde se visualizan bandas después de la amplificación
mediante PCR, carril 1 (M, marcador), carriles 2 y 3 (muestras), y carriles 4 y 5 (controles
negativos).
Análisis bioinformático
Las secuencias génicas obtenidas fueron editadas y recortadas para obtener altos
porcentajes de calidad, con lo que se obtuvo secuencias de 1060 pb para la Bacteria 1 (aislado
2R1-3B) y de 1269 pb para la Bacteria 2 (aislado 1R2-4B). El programa BLAST de ácidos nucleicos
indicó que las Bacteria 1 pertenece al género Pseudomonas spp. con un porcentaje de identidad
del 99.72%. También se obtuvo que la cepa aislada tiene un porcentaje de similitud del 99.53%
al 99.62% con Pseudomonas azotoformans, cepa perteneciente al grupo fluorescente, como se
muestra en la Tabla 7.
M 2R1-3B 1R2-4B –
–
1.5 Kb
41
Tabla 7
Secuencias con alta similitud a la del aislado 2R1-3B
Nombre Científico Cobertura
Query
Valor E % de Ident. Accesión
Pseudomonas spp. 100% 0.0 99.72% KP756924.1
Pseudomonas
azotoformans
100% 0.0 99.62% LC130639.1
Pseudomonas
azotoformans
100% 0.0 99.53% KX186937.1
Pseudomonas
azotoformans
100% 0.0 99.53% LT629702.1
Pseudomonas
azotoformans
100% 0.0 99.53% LT629702.1
Nota. El nombre científico corresponde al organismo en la base de datos del GenBank con el
cual comparte mayor similitud la secuencia.
Para la Bacteria 2 se obtuvo que la zona amplificada comparte un 99.84% de identidad
con las secuencias génicas de Bacillus thuringiensis del GenBank con lo que se confirma el
género y especie molecularmente de la Bacteria 2, como se muestra en la Tabla 8.
Tabla 8
Secuencias con alta similitud a la del aislado 1R2-4B
Nombre Científico Puntaje
Max.
Puntaje
Total
Cobertura
Query
Valor
E
% de
Ident.
Accesión
Bacillus thuringiensis 2333 2333 100% 0.0 99.84% MN396730.1
Bacillus thuringiensis 2333 2333 100% 0.0 99.84% MK377087.1
Bacillus thuringiensis 2333 32573 100% 0.0 99.84% CP020754.1
42
Nota. El nombre científico corresponde al organismo en la base de datos del GenBank con el
cual la secuencia comparte mayor similitud.
Bioensayos
Confirmación de la especie de la plaga Tetranychus urticae
Mediante la observación al microscopio de los ácaros plaga se pudo confirmar la especie
T. urticae. En la Figura 9 se aprecia un ácaro en estado adulto dado que su color es amarillento
opaco, presenta manchas oscuras dorsales, cuenta con cuatro pares de patas y tiene sexo
definido. El ácaro se clasificó como hembra por su mayor tamaño, cuerpo voluminoso y mayor
redondez.
Figura 9
Ácaro plaga hembra
Nota. Ácaro plaga después de ser sumergido en etanol, vista lateral, bajo el objetivo 10X con
microscopio óptico.
Se observó la morfología de un ácaro macho en estado adulto que presentó color pálido
amarillento, manchas oscuras dorsales en el tórax y cuatro pares de patas, como se muestra en
43
la Figura 10. El género se diferenció por su tamaño pequeño y estrecho, abdomen puntiagudo y
patas más largas.
Figura 10
Ácaro plaga macho
Nota. Ácaro plaga después de ser sumergido en etanol, vista ventral bajo el objetivo 10X con
microscopio óptico.
La confirmación de la especie se realizó mediante la observación del edeago, aparato
genital masculino distintivo de T. urticae. En la Figura 11 se puede apreciar la parte inferior del
ácaro macho, donde se observa el edeago con un pomo de tamaño pequeño, margen dorsal
convexo y dos proyecciones: la posterior aguda y la anterior redondeada.
44
Figura 11
Edeago del ácaro macho
Nota. El círculo azul indica el edeago del ácaro macho después de ser sumergido en etanol, vista
ventral bajo el objetivo 40X con microscopio óptico.
Reproducción de Tetranychus urticae
De las metodologías probadas la segunda dio los resultados más favorecedores
considerando que se obtuvo la mayor cantidad de especímenes vivos, tras la reacción de los
ácaros al toque con un pincel fino. Se verificó la especie observando que los ácaros presentaran
su color amarillento o rojizo característico y sus manchas oscuras en el dorso. Se mantuvieron a
los ácaros en frascos de vidrio estériles el mismo día de la aplicación de las diluciones en la
etapa de los bioensayos. Estos especímenes fueron mantenidos a temperatura ambiente en
frascos con flujo de aire, como se indica en la Figura 12, hasta su posterior transferencia a las
unidades de cría.
45
Figura 12
Frascos de almacenamiento de los ácaros plaga
Dilución de los aislados bacterianos
Para preparar las diluciones a tres diferentes concentraciones se midieron las
absorbancias de los aislados en caldo LB a una longitud de onda de 600nm, los resultados se
muestran en la Tabla 9.
Tabla 9
Absorbancias y concentraciones de los aislados en caldo LB
Muestra DO600 UFC/mL
Bacteria 1 R1 C1 0.459 3.67 x 108
Bacteria 1 R2 C1 0.096 7.68 x 107
Bacteria 1 R1 C2 0.404 3.23 x 108
Bacteria 1 R2 C2 0.445 3.56 x 108
46
Muestra DO600 UFC/mL
Bacteria 1 R1 C3 0.547 4.38 x 108
Bacteria 1 R2 C3 0.470 3.76 x 108
Bacteria 2 R1 C1 0.609 4.87 x 108
Bacteria 2 R2 C1 0.475 3.8 x 108
Bacteria 2 R1 C2 0.487 3.9 x 108
Bacteria 2 R2 C2 0.523 4.18 x 108
Bacteria 2 R1 C3 0.633 5.06 x 108
Bacteria 2 R2 C3 0.631 5.05 x 108
Nota. Los valores de concentración se calcularon tomando como referencia OD600 de 1.0 = 8 x
108 células/ml. (R) repetición y (C) concentración.
De las dos repeticiones realizadas por concentración, se escogió tres para cada bacteria,
tomando en cuenta que las concentraciones ya se encontraban en el rango de 1x108 a 1x109
UFC/mL por lo que no se realizó ninguna dilución. Las tres diferentes concentraciones
seleccionadas se muestran en la Tabla 10.
Tabla 10
Concentraciones de los aislados bacterianos
Bacteria 1 Bacteria 2
C1 UFC/mL 3.56 x 108 3.8 x 108
C2 UFC/mL 3.67 x 108 3.9 x 108
C3 UFC/mL 4.38 x 108 5.05 x 108
47
Nota. Tres diferentes concentraciones (C1, C2, C3) de menor a mayor seleccionadas para los
bioensayos.
Aplicación de los tratamientos a la plaga Tetranychus urticae
Se montaron las unidades de cría y se colocaron 10 ácaros en las hojas frescas y
desinfectadas en las cajas Petri, como se muestra en la Figura 13 A, después se aplicó el
tratamiento, Figura 13 B.
Figura 13
Ácaros en hojas de rosas en unidades de cría
Nota. (A) Unidad de cría con 10 ácaros sin la aplicación del tratamiento. (B) Unidad de cría con
10 ácaros después de la aplicación del tratamiento.
Después de siete días de la aplicación de los tratamientos, se obtuvieron los porcentajes
de mortalidad de los ácaros empleando la fórmula de Henderson y Tilton, los resultados se
encuentran en la Tabla 11. Se puede observar el valor más alto de mortalidad del 81.48% el cual
se obtuvo con la Bacteria 2 (Bacillus thuringiensis) a la concentración más alta de 5.05 x 108
A B
48
UFC/mL. Mientras que el porcentaje más bajo de 29.63% se obtuvo con la Bacteria 1
(Pseudomonas del grupo fluorescente) a la menor concentración de 3.56 x 108 UFC/mL.
Tabla 11
Porcentajes promedio de mortalidad de la plaga T. urticae
% de Mortalidad
Tiempo
h
Bacteria 1 Bacteria 2
C1 C2 C3 C1 C2 C3
72 29.63 40.74 51.85 48.15 59.26 62.96
120 29.63 40.74 59.26 62.96 62.96 77.78
168 29.63 40.74 59.26 74.07 62.96 81.48
Nota. Los valores tienen unidad de porcentaje, Bacteria 1 (Pseudomonas del grupo
fluorescente), Bacteria 1 (Pseudomonas del grupo fluorescente) y (C) concentración.
Análisis estadístico
Mediante el análisis de la varianza ANOVA se pudo comprobar diferentes hipótesis de
los tratamientos, así como con la prueba de Tukey se pudo realizar un análisis comparativo
entre las variables de concentración, tipo de bacteria y de su interacción.
En la Figura 14 podemos observar que el efecto de la concentración 3 y 2 es similar, ya
que no presentan diferencia significativa, pero estas dos concentraciones sí tienen diferente
resultado con respecto a la concentración 1 (la más baja). Por lo tanto, con un p-valor= 0.0354
se aceptó la hipótesis alterna de que la concentración sí influye en el % Mortalidad, con 95% de
confiabilidad.
49
Figura 14
Porcentaje de mortalidad del ácaro por concentración
Nota. A, B Letras distintas representan medias significativamente diferentes según la prueba de
Tukey (p-valor < 0.05).
En cuanto al tipo de bacteria, en la Figura 15 observamos que con B. thuringiensis se
obtuvo la mayor efectividad para el biocontrol de ácaros con respecto a Pseudomonas del grupo
fluorescente. Esta diferencia significativa queda corroborada aceptándose la hipótesis alterna de
que el tipo de bacteria influye en el % Mortalidad, con un 95% de confiabilidad y un p-valor=
<0.0001.
50
Figura 15
Porcentaje de mortalidad del ácaro por tipo de bacteria
Nota. A, B Letras distintas representan medias significativamente diferentes según la prueba de
Tukey (p-valor < 0.05).
Mediante del análisis de resultados de los seis tratamientos aplicados, se puede
observar que existe una correlación positiva en cuanto al porcentaje de mortalidad y
concentración siendo la mayor letalidad a la mayor concentración de las diluciones de las
bacterias, como se muestra en la Figura 16. Además, mediante la prueba de Tukey se determinó
que no existe diferencia significativa entre los tratamientos de BT a sus tres diferentes
concentraciones y el tratamiento de PF a su mayor concentración, dado que los cuatro muestran
similares resultados. En cuanto a los tratamientos de PF a sus concentraciones 2 y 3, estos dos
tampoco presentan una diferencia significativa entre ambos. Al igual que los tratamientos PF,
concentraciones 1 y 2 que tampoco son significativamente distintos. Por lo tanto, con un p-
51
valor= 0.2323 se rechaza la hipótesis alterna y se acepta la nula siendo que el tipo de bacteria y
la concentración no influyen en el % Mortalidad, con 95% de confiabilidad.
Figura 16
Porcentaje de mortalidad del ácaro por tipo de bacteria y concentración
Nota. A, B, C Letras comunes representan medias no significativamente diferentes según la prueba
de Tukey (p-valor > 0.05).
52
Capítulo V: Discusión
El tipo de muestra y el método de aislamiento de microorganismos son clave para
obtener las bacterias entomopatógenas. El método de aislamiento por dilución de muestras de
suelo resultó efectivo siendo que, en el país y en general Latino América, se tiene una alta
variedad de zonas climáticas que favorecen las condiciones de crecimiento de estos
microorganismos (Ibarra, Del Rincon, Orduz, & Noriega, 2003). También, en el suelo se
encuentran los cadáveres de los insectos plaga de los cultivos en los cuales habitan los hongos o
bacterias entomopatógenas (Sharma, Bohra, & Rajput, 2020). De 16 cepas aisladas, 12 fueron
clasificadas como posibles bacterias entomopatógenas de acuerdo con sus características
morfológicas. Existe una gran variedad de géneros y especies de bacterias con acción insecticida
como lo son B. thuringiensis, especies de Serratia spp., Yersinia entomophaga, Pseudomonas
spp., Burkholderia spp., Streptomyces spp., entre otras, que están siendo investigadas (Ruiu,
2015).
Las bacterias entomopatógenas se pueden clasificar de diversas formas y se les atribuye
su actividad para el control de plagas por su capacidad de producir metabolitos secundarios,
enzimas extracelulares, proteínas o incluso hormonas nocivas para la plaga. Dentro de la
clasificación de bacterias Gram positivas se encuentra la especie más estudiada B. thuringiensis,
conocida por su capacidad de producir inclusiones cristalinas una vez que sus esporas han sido
ingeridas por el insecto, perforando el sistema digestivo y causando su muerte. La tinción Gram
y de esporas con verde malaquita y safranina permitió determinar si las cepas aisladas eran
Gram positivas o negativas y si eran o no formadoras de esporas. El aislado 1R2-4B al ser un
bacilo Gram positivo, formador de esporas y tener inclusiones cristalinas junto a las endosporas,
fue considerado como posible Bacillus thuringiensis; mientras que el aislado 2R1-3B, bacilo
53
Gram negativo no productor de esporas, fue tomado como posible Pseudomonas por el resto de
sus características morfológicas y bioquímicas (Grijalba & Hurst, 2008).
Tras la caracterización fenotípica de los aislados, el análisis molecular permite identificar
los microorganismos de manera confiable y certera. Después de la extracción del ADN una
electroforesis en gel de agarosa permitió determinar la calidad de las muestras. Las bandas
visualizadas bajo luz UV fueron claras y no dispersas indicando que el ADN se encontraba
íntegro. La cuantificación de las muestras de ADN mediante Nanodrop, indicó concentraciones
altas que rondaron los 1000 ng/µL cantidades mayores a 20-100 ng/µL, que es la mínima
concentración de ADN necesaria para la amplificación por PCR (Merck KGaA, 2021). Además, las
razones de absorbancias 260/280 de aproximadamente 2 se encontraron dentro del rango 1.8-
2.1 indicando pureza óptima, ya que no hubo contaminación por proteínas, ácidos nucleicos ni
residuos químicos. Así como la razón 260/230 fue en promedio de 1.8 encontrándose dentro del
rango ≥1.8, siendo de pureza aceptable sin la presencia de sales ni compuestos orgánicos con lo
que se determina que las muestras de ADN fueron de buena calidad y óptimas para la
amplificación (BancoADN, 2020).
Para la valoración de la integridad del ADN después de la PCR, se llevó a cabo una
electroforesis donde se obtuvieron bandas bien definidas en la parte superior del gel teniendo la
puntuación máxima de 3, determinándose que el ADN se mantuvo íntegro para su posterior
secuenciación (BancoADN, 2020).
La identificación molecular, las secuencias génicas editadas y comparadas con las del
GenBank, determinaron que los aislados correspondieron a Pseudomonas del grupo
fluorescente y B. thuringiensis con porcentajes de identidad superiores al 99.5%. Según
estudios, alrededor del 15% de microorganismos aislados de muestras de más de 30 países
fueron identificados como B. thuringiensis (Martin & Travers, 2021). Tanto B. thuringiensis como
54
Pseudomonas del grupo fluorescente son especies proveniente del suelo, altamente distribuidas
y abundantes alrededor del mundo y conocidas por su actividad entomopatógena (Ogier, Pagès,
& Frayssinet, 2020).
T. urticae es una de las plagas más comunes en cultivos a condiciones de invernadero
siendo sensible a los cambios de condiciones ambientales. Su reproducción a nivel de
laboratorio requiere equipos y métodos que permitan simular las condiciones a las cuales se
encuentra en su hábitat natural (Lozada, 2011). Por lo tanto, una metodología adecuada para su
crecimiento en condiciones de laboratorio, según García y Castillo, es mediante una incubadora
a 26° C, 40% de h.r. con un fotoperiodo de 14L:10O y realizando tres observaciones diarias. Se
obtuvo crecimiento poblacional a los 15 días, correspondiente a su ciclo de vida (Reséndiz García
& Castillo Olivas, 2018). Debido al complejo proceso de cría muchos investigadores han
empleado la técnica de Abou-setta & Childers (1987) que consiste en la transferencia directa de
los ácaros con un pincel fino, después de su recolecta, a las unidades donde se realizan los
bioensayos (Abou & Childers, 1987). Se han registrado varios artículos con resultados positivos
(Ruiz Díaz & Herrera, 2018).
Para los bioensayos se escogieron tres diferentes concentraciones entre 1x108 a 1x109
UFC/mL debido a que dentro de este rango varios estudios han demostrado la efectividad de
microorganismos entomopatógenos. Los resultados obtenidos de la aplicación de los
tratamientos con respecto a la concentración vs % Mortalidad indican una diferencia
significativa siendo que se obtuvo la mayor efectividad a la mayor concentración. Esto se ve de
manera similar en un estudio por Senasica donde se evaluaron tres concentraciones de Bacillus
thuringiensis: [2x107, 2x108 y 2x109] UFC/mL para determinar a cuál se daba la mayor
efectividad. Se obtuvo que la mayor concentración dio el efecto más significativo, concordando
con los resultados obtenidos (Senasica, 2018). También en un estudio de Pseudomonas Putida,
55
perteneciente al grupo fluorescente, se probaron concentraciones dentro del rango 1x108 a
1x109 UFC/mL demostrándose la mayor eficacia en la mortalidad de T. urticae a la mayor
concentración (Cazorla, et al., 2007; Murat Aksoy, Sebahat, & Ozman-Sullivan, 2008).
En cuanto al tipo de bacteria, como indican los resultados, B. thuringiensis es
fuertemente más efectiva que Pseudomonas del grupo fluorescente. Desde hace décadas los
investigadores se han concentrado en descubrir el potencial de B. thuringiensis siendo que ha
sido altamente efectivo para el biocontrol de múltiples plagas incluyendo la del ácaro T. urticae
(Liu, Ruan, Peng, & Li, 2014). Los primeros estudios revelaron que esta bacteria, mediante su
mecanismo de acción de producción de proteínas Cry, tiene la capacidad de paralizar el sistema
digestivo de los insectos causando su muerte por lo que resulta muy efectivo como biopesticida
(Frankenhuyzen, 2009). En un experimento llevado a cabo, la aplicación de esta bacteria en T.
urticae alcanzó un porcentaje de mortalidad del 100% en hembras y de un 95% en ninfas y
machos en un periodo de seis días (Neal, Lindquist, Gott, & Casey, 1987), lo cual concuerda con
el máximo porcentaje de efectividad del 81%, pudiendo la diferencia deberse a errores
experimentales y estadísticos durante el estudio. También en otra investigación realizado en el
Ecuador, al evaluar la efectividad del género Bacillus spp. para el control de ácaros T. urticae
provenientes de rosas de invernaderos, se determinó que una de las cepas más eficientes como
efector catalítico fue B. thuringiensis (Larrea, Falconí, & Arcos, 2015).
Aunque Pseudomonas del grupo fluorescente mostró un valor significativamente
diferente comparado con B. thuringiensis, se obtuvieron porcentajes de mortalidad con ambas
cepas revelando su actividad entomopatógena. Investigaciones del grupo de especies
fluorescentes de Pseudomonas han demostrado su aplicación como biopesticidas en los últimos
años (Kupferschmied, Maurhofer, & Keel, 2013). Se han reportado una variedad de especies
dentro del grupo mencionado con capacidad de producir sustancias o metabolitos tóxicos para
56
plagas. Entre las especies más reconocidas se encuentran: P. fluorescens, P. azotoformans, P.
putida, P. protegens y P. syringae (Garrido Sanz, Arrebola, & Martí, 2017). Considerando que el
aislado fue identificado como una Pseudomona perteneciente al grupo fluorescente y que no se
conoce con certeza la especie, no se puede comparar estrictamente su nivel de efectividad
siendo que se desconoce para qué tipo de plaga tiene mayor afinidad (Saati Santamaría, Rivas,
Kolařik, & García Fraile, 2021). La mayoría de las especies mencionadas tienen estudios
validando su actividad insecticida pero muy pocos se han realizado en cuanto a su actividad
acaricida. Entre estas escasas investigaciones, se encuentra un estudio sobre la actividad
acaricida de cepas pertenecientes a Pseudomonas fluorescentes donde se han obtenido
resultados de alrededor de un 85% de efectividad (Al-Sohim & Fouly, 2015). Este valor
comparado con el máximo porcentaje obtenido del 59% puede considerar relativamente similar
en cuestión de eficacia, ya que ambos representan resultados positivos.
57
Capítulo VI: Conclusiones
Se aislaron cepas bacterianas entomopatógenas en medios de cultivo microbiológicos a
partir de diluciones de muestras de suelo de las plantas de rosas infectadas con la plaga T.
urticae.
Se seleccionaron dos cepas como potenciales bacterias entomopatógenas mediante
características morfológicas de las colonias, tinciones microbiológicas, actividad bioquímica y
análisis molecular con herramientas bioinformáticas. Las bacterias fueron identificadas como
Pseudomonas del grupo fluorescente y Bacillus thuringiensis.
Se recolectó la especie T. urticae el mismo día de la aplicación de los tratamientos,
manteniéndolos en frascos de vidrio estériles unas horas previo a los bioensayos, a nivel de
laboratorio.
Se comprobó la eficacia de las bacterias entomopatógenas Pseudomonas del grupo
fluorescente y Bacillus thuringiensis mediante su porcentaje de mortalidad donde ambas
bacterias demostraron ser efectivas para el biocontrol de T. urticae en plantas de rosas, a nivel
de laboratorio.
Se aceptó la hipótesis de investigación siendo que Pseudomonas del grupo fluorescente
y Bacillus thuringiensis, aisladas e identificadas, actúan como agentes de biocontrol para
Tetranychus urticae en cultivos de rosas Rosa spp. de una florícola, a nivel de laboratorio.
B. thuringiensis presentó la mayor efectividad, con un porcentaje de mortalidad del
81.48% y concentración de 4.5x108, para el biocontrol de T. urticae en plantas de rosas, a nivel
de laboratorio.
El rango de concentración donde se tiene la mayor efectividad para el biocontrol de T.
urticae, es entre 3.5x108 y 4.5x108.
58
Capítulo VII: Recomendaciones
Emplear el método alternativo de aislamiento de bacterias entomopatógenas a partir de
cadáveres de insectos plaga tomando en cuenta que estas muestras se encuentran con mayor
frecuencia en zonas más cálidas y húmedas.
Para la identificación de las bacterias, en la etapa de pruebas bioquímicas utilizar un kit
API (Índice analítico de perfil) que corresponda al género determinado a aislar para mayor
facilidad y certeza. También, en el análisis molecular usar primers más específicos o diseñarlos
para obtener la identificación de la especie y no del género.
Para reproducir masivamente la plaga, utilizar los equipos y metodología adecuada
probando diferentes métodos de manera que se logre definir cuál es el más efectivo para la
supervivencia de la especie.
Realizar un diseño experimental con mayor número de unidades experimentales para
obtener resultados más confiables con menos error. También, contabilizar y registrar el número
de individuos vivos, tras la aplicación de los tratamientos, diariamente durante siete días para
obtener mayor número de datos y robustez estadística.
Continuar con bioensayos en campo, en condiciones de invernadero, para extrapolar los
resultados y comprobar la efectividad de las bacterias entomopatógenas. Realizarlo a corto y
largo plazo para obtener mayor cantidad de datos. También, se puede implementar el tiempo
como una variable que influya en la efectividad de los tratamientos.
59
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