carcinogÊnese mamÁria experimental induzida pelo 7… · título em inglês: breast cancer...
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PHILIPI COUTINHO DE SOUZA
CARCINOGÊNESE MAMÁRIA EXPERIMENTAL INDUZIDA
PELO 7,12,DIMETILBENZ(A)ANTRACENO (DMBA):
CARACTERIZAÇÃO HISTOPATOLÓGICA COMPARADA E
IDENTIFICAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE CÉLULAS-
TRONCO NEOPLÁSICAS (CTNs)
CAMPINAS
2013
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
PHILIPI COUTINHO DE SOUZA
CARCINOGÊNESE MAMÁRIA EXPERIMENTAL INDUZIDA PELO 7,12,DIMETILBENZ(A)ANTRACENO (DMBA): CARACTERIZAÇÃO
HISTOPATOLÓGICA COMPARADA E IDENTIFICAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE CÉLULAS-TRONCO NEOPLÁSICAS (CTN)
ORIENTAÇÃO: Prof. Dr. ANDRE ALMEIDA SCHENKA
Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-Graduação da Faculdade de
Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP para obtenção de título de Mestre em Farmacologia.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR PHILIPI COUTINHO DE SOUZA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. ANDRE ALMEIDA SCHENKA. _______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2013
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA POR
MARISTELLA SOARES DOS SANTOS – CRB8/8402
BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
UNICAMP
Souza, Philipi Coutinho de, 1987-
So89c Carcinogênese mamária experimental induzida pelo
7, 12, dimetilbenz (A) antraceno (DMBA) : caracterização
histopatológica comparada e identificação
imunoistoquímica de células-tronco neoplásicas (CTNs) /
Philipi Coutinho de Souza. -- Campinas, SP : [s.n.], 2013.
Orientador : André Almeida Schenka.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de
Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
1. Neoplasias da mama. 2. Células-tronco
neoplásicas. 3. Histologia comparada. 4. Ratos Sprague
Dawley. 5. 9,10-Dimetil-1,2-benzantraceno. I. Schenka,
André Almeida, 1976-. II. Universidade Estadual de
Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título
Informações para Biblioteca Digital
Título em inglês: Breast cancer neoplastic stem cells histology compared Sprague
Dawley rats 7, 12 dimetilbenz (A) antracene.
Palavras-chave em inglês:
Breast neoplasms
Neoplastic stem cells
Histology, Comparative
Sprague Dawley rats
9,10-Dimethyl-1,2-benzanthracene
Área de concentração: Farmacologia
Titulação: Mestre em Farmacologia
Banca examinadora:
André Almeida Schenka [Orientador]
Maria Salete Costa Gurgel
Maria Cristina Costa Resck.
Data da defesa: 18/01/2013
Programa de Pós-Graduação: Farmacologia
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Dedicatória
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Aos animais
Foste um instrumento de nosso aprendizado?
Foste apenas um objeto de experiência?
Não!
Foste para nós, vítimas solicitadas pela ciência, para beneficio da
humanidade, porém, apesar do teu olhar mudo e de não teres a permissão
da palavra, isso não nos impedirá de dizer-te sempre: muito obrigado.”
(Autor desconhecido)
Dedico este trabalho...
...a toda minha família pelo apoio incondicional, o carinho, a torcida e por
sempre acreditarem em mim...
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Agradecimentos
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À DEUS, inteligência suprema e causa primeira de todas as coisas.
Ao Professor André Almeida Schenka pelo exemplo de trabalho, pesquisa e ética, pelo
brilhante ensinamento da patologia mamária e excelente orientação.
À Professora Dra. Liliana A. Lucci de Ângelo Andrade pela sua experiente contribuição
nos dados anatomopatológicos do exame de qualificação.
À Professora Dra. Maria Salete Costa Gurgel pela discussão do aspecto clínico do trabalho.
Ao Professor Dr. Edson Antunes, pelo apoio como representante da comissão de pós-
graduação.
À toda equipe do Laboratório de Patologia investigativa do Hospital AC Camargo e a
Fundação Antônio Prudente em especial ao Dr. Rafael Malagoli Rocha e ao Dr. José
Vassallo por disponibilizarem inúmeras vezes os recursos metodológicos para realização
deste trabalho.
À amiga Valéria Barbosa de Souza pela ajuda incondicional neste trabalho, sem a sua
colaboração não chegaríamos até aqui.
Ao Professor Dr. Luiz Alberto Magna pelo auxílio e interpretação estatística de nossos
resultados.
Aos amigos da CEVEL em especial a Ricardo Coutinho e Michele Bione pela reconhecida
confiança em mim depositada e por entender os meus momentos de ausência.
Aos colegas do LHIAP pelas trocas de idéias, ensinamentos e discussões.
À Professora Dra. Maria Cristina Costa Resck pelo constante incentivo e apoio desde os
tempos da graduação.
Ao amigo Gilberto C Franchi Jr. pelo apoio inestimável.
À Jacqueline pelas estimáveis e valiosas dicas de imunoistoquímica.
Finalmente agradeço a todos aqueles que, longe ou perto, sempre me desejaram sorte e
sucesso e tornaram os caminhos mais alegres durante a eterna caminhada...obrigado!
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Sumário
xi
PÁG
SÍMBOLOS, SIGLAS ABREVIATURAS................................................................ xvii
RESUMO................................................................................................................... ... xix
ABSTRACT.................................................................................................................. xxi
1- 1- INTRODUÇÃO........................................................................................................ 23
1.1- Câncer de mama......................................................................................... 23
1.2- Células tronco neoplásicas........................................................................ 38
1.3- Dimetilbenz-(a)-antraceno (DMBA) como modelo de carcinogênese mamária................................................................................................................
47
2- JUSTIFICATIVA.................................................................................................... 51
3- OBJETIVOS............................................................................................................ 53
4- MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 55
4.1- Aspectos éticos............................................................................................ 55
4.2- Locais de realização do experimento........................................................... 55
4.3- Animais........................................................................................................ 55
4.4- Indução tumoral e obtenção dos espécimes anatomopatológicos................ 55
4.5- Tissue microarray........................................................................................ 56
4.6- Colorações histológicas................................................................................ 57
4.7- Variáveis de análise morfológica.................................................................. 59
4.7.1- Formação ou diferenciação tubular glandular (acinar).................... 59
4.7.2- Pleomorfismo ou grau nuclear........................................................ 59
4.7.3- Índice mitótico................................................................................ 60
-
Sumário
xii
4.7.4.Grau histológico final............................................................... 60
4.8 – Variáveis de análise imunoistoquímica................................................ 60
4.8.1.Positividade para receptores hormonais (RE/RP)..................... 60
4.8.2.Positividade para C-erbB-2...................................................... 62
4.8.3. Critérios para a classificação alternativa em subtipos moleculares baseada no perfil molecular..............................
62
4.8.4. Positividade para marcadores de CTNs................................ 63
4.9- Análise estatística................................................................................ 63
5- RESULTADOS.................................................................................................. 65
6- DISCUSSÃO...................................................................................................... 105
7- CONCLUSÃO................................................................................................... 109
8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 111
9- ANEXOS........................................................................................................... 119
-
Lista de figuras
xiii
PÁG Figura 1. Incidência e mortalidade relacionadas ao câncer................................. 24
Figura 2. Principais neoplasias malignas da mama humana .............................. 27
Figura 3. Esquema ilustrativo do desenvolvimento de neoplasias mamárias
epiteliais a partir de UDLTs.................................................................................. 31
Figura 4. Padrão de expressão gênica do câncer de mama.................................. 34
Figura 5. Aspectos macroscópicos das neoplasias induzidas pelo DMBA......... 66
Figura 6. Aspectos macroscópicos das neoplasias induzidas pelo DMBA
(ulceração)............................................................................................................. 67
Figura 7. Superfície de corte das neoplasias induzidas pelo DMBA................... 68
Figura 8. Fotomicrografias ilustrativas de focos de carcinoma ductal in situ..... 71
Figura 9. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma ductal invasivo................ 72
Figura 10. Fotomicrografias ilustrativas de tumor filóide................................... 73
Figura 11. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma papilífero invasivo........ 74
Figura 12. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma mioepitelial invasivo..... 75
Figura 13. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma lobular invasivo............. 76 Figura 14. Frequência dos principais tipos histológicos encontrados na
amostra.................................................................................................................. 77
Figura 15. Composição histológica dos tumores mistos...................................... 78
Figura 16. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma ductal invasivo grau 1 e
grau 2.................................................................................................................... 82
Figura 17. Fotomicrografias ilustrando a variação na extensão da necrose........ 83 Figura 18. Fotomicrografias ilustrativas da expressão de RE, RP e C-erbB-2.... 87
Figura 19. Diagrama de classificação de subtipos moleculares........................... 88 Figura 20. Fotomicrografias ilustrativas do subtipo molecular triplo
negativo/basal símile............................................................................................. 89
Figura 21. Freqüência de casos expressando cada um dos marcadores de
CT/CP...................................................................................................................
91
-
Lista de figuras
xiv
Figura 22. Número de células tumorais expressando cada um dos
marcadores de CT/CP....................................................................................... 92
Figura 23. Frequência de células positivas para marcadores de CT em tecidos neoplásicos e tecidos normais...............................................................
93
Figura 24. Fotomicrografias ilustrativas da expressão de CD24, CD44 e ALDH1..............................................................................................................
95
Figura 25. Fotomicrografias ilustrativas da expressão de CD133, CD34 e
CD117................................................................................................................ 96
Figura 26. Fotomicrografias ilustrativas da expressão de Oct-4, EGFR e
p63..................................................................................................................... 97
Figura 27. Fotomicrografias ilustrativas da expressão de CK14 e EpCAM... 98 Figura 28. Correlações significantes entre marcadores de CT/CP em
amostras de tumores......................................................................................... 103
-
Lista de tabelas
xv
PÁG
Tabela 1. Neoplasias malignas primárias da mama............................................ 25
Tabela 2. Sumário das características histológicas das principais neoplasias
mamárias............................................................................................................... 29
Tabela 3. Principais diferenças entre os constituintes celulares da UDLT.........
32
Tabela 4. Subtipos moleculares determinados pelo perfil de expressão gênica.. 36
Tabela 5. Classificação molecular substitutiva de neoplasias da mama humana 37
Tabela 6. Principais marcadores imunofenotípicos de CTNs.............................. 46
Tabela 7. Monomarcadores de CTNs, prognósticos e preditivos........................ 58
Tabela 8. Principais características diagnósticas dos tipos histológicos
encontrados e principais diferenças em relação ao correspondente humano....... 79
Tabela 9. Graduação histológica aplicada as neoplasias induzidas pelo DMBA 81
Tabela 10. Positividade para receptores hormonais (RE e RP)........................... 85
Tabela 11. Positividade para o produto do oncogene HER2/neu na amostra de
tumores induzidos pelo DMBA............................................................................ 86
Tabela 12. Correlação entre marcadores de CT/CP e fatores preditivos de
comportamento biológico dos tumores................................................................ 101
Tabela 13. Correlação entre marcadores de CT/CP entre si................................ 102
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xvi
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Símbolos, siglas e abreviaturas
xvii
INCA – Instituto nacional do Câncer
RE – Receptor de estrógeno
RP – Receptor de progesterona
CAAF – Citologia aspirativa por agulha fina
AFIP- Instituto de Patologia das Forças Armadas (Armed Forces Institute of Pathology)
OMS – Organização mundial de Saúde
CLI – Carcinoma lobular invasor
HER 2 – Fator de crescimento epidermal humano (Human Epidermal growth factor
Receptor)
CT – Célula-tronco
CTs – Células-tronco
CTN – Célula-tronco neoplásica
CTNs – Células-tronco neoplásicas
Pgp – Glicoproteína P
MDR1 – Fator de resistência a múltiplas drogas (Multidrug resistance gene1)
ALDH1 – Aldeído desidrogenase 1 (Aldehydedehydrogenase 1)
ESA – Antígeno epitelial específico (Epithelial specific antigen)
Oct-4 – Octâmero de ligação do fator de transcrição 4 (octamer-binding transcription
factor 4)
Sca-1 – Antígeno de célula tronco 1 (stem cell antigen-1)
HOECHST – Corante para identificação de DNA (ácido desoxirribonucléico )
-
Símbolos, siglas e abreviaturas
xviii
DMBA –Dimetilbenz(a)antraceno (Dimethylbenz(a)anthracene)
ASCO – Associação Americana de Oncologia Clínica
CAP – Colégio Americano de Patologistas
-
Resumo
xix
O câncer de mama é a neoplasia maligna mais prevalente e a principal causa de óbito entre
mulheres, no mundo. A despeito de avanços substanciais no entendimento da biologia da
doença, nos métodos de detecção precoce, e em sua farmacoterapia, a sobrevida geral não
se modificou significantemente nas últimas décadas. Portanto, pode se dizer que um dos
deveres primordiais das Universidades Públicas engajadas com pesquisa básica e aplicadas
consiste em contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento sistêmico
desta neoplasia. Nesse contexto, um dos alvos estratégicos mais promissores no
desenvolvimento de novos fármacos antineoplásicos é representado pela célula-tronco
neoplásica (CTN). As CTNs tem sido associadas em inúmeros estudos à capacidade de
algumas neoplasias malignas de resistir às principais modalidades terapêuticas anti-
neoplásicas, especialmente à: radio-, quimio-, hormônio- e imunoterapias. Em resumo, na
atualidade, a detecção de CTNs constitui uma ferramenta clínica bastante promissora
enquanto alvo terapêutico, fator prognóstico e preditivo de resposta terapêutica. O objetivo
deste trabalho foi descrever e discutir as potencialidades e limitações do modelo de
carcinogênese mamária pelo DMBA, após reclassificação das neoplasias mamárias segundo
os critérios diagnósticos da OMS (2003, 2012), subtipagem molecular e quantificação de
imunomarcadores prognósticos, preditivos e de CTN. Após a aplicação do protocolo
experimental de indução química pelo DMBA e a eutanásia dos animais controle e
experimental, suas linhas mamárias (contendo ou não tumores) foram ressecadas e
avaliadas quanto a morfologia e a imunoexpressão para marcadores de CTNs. Após 13
semanas, 100% dos animais desenvolveram neoplasias macroscópicas e histologicamente
compatíveis com os critérios de avaliação indicados pela OMS. Os tumores foram
classificados em carcinoma ductal, carcinoma papilífero, carcinoma lobular, carcinoma
mioepitelial e tumor filóide, sendo o tipo mais frequente, o ductal. Poucos marcadores
imunoistoquímicos mostraram correlação com variáveis de comportamento biológico.
Mesmo assim, o grau de correlação não foi elevado. A grande heterogeneidade morfológica
intratumoral e interanimal, associada à presença de subtipos histológicos bifásicos (tumor
filoide), tumores com diferenciação mioepitelial/basal e à grande positividade para
marcadores CTN clássicos (tanto em termos de frequência na amostra como em termos de
-
Resumo
xx
distribuição média nas neoplasias) demonstram a participação clara de CTNs no modelo, o
que o torna um importante referencial como modelo in vivo para o teste de drogas anti-CTN
específicas. O modelo reproduz os principais subtipos histológicos e moleculares de câncer
mamário, o que significa que poderá ser utilizado no estudo pormenorizado de drogas
indicadas especificamente para cada subcategoria molecular (e.g., agentes hormonais que
são indicados especificamente para os tipos luminais e trastuzumab, indicado nos tumores
do subtipo HER2), bem como no desenvolvimento de novas drogas com maior
especificidade para a classe molecular de interesse.
Palavras-chave: câncer de mama, células-tronco neoplásicas, imunoistoquímica, Sprague-
dawley, DMBA.
-
Abstract
xxi
Breast cancer is the most common malignancy and the leading cause of death from cancer
among females worldwide. Despite all the research and all the progress, methods of early
detection, and its pharmacotherapy, overall survival has not changed significantly in recent
decades. Therefore, the Public University has been engaged in basic and applied research is
to contributed to the development of new strategies for systemic treatment of this
malignancy. In this context, one of the most promising strategic target in the development
of the anticancer drugs is represented by neoplastic stem cell (NSC). Neoplastic stem cell
has been linked in various studies to the capacity of some malignancies to resist major anti-
neoplastic therapeutic modalities, especially: radio-, chemo-, hormone- and
immunotherapies. In summary, the detection of NSCs is a clinical tool very promising
while therapeutic target and prognostic factor predictive of therapeutic response. The aim
of this study was to describe and discuss the strengths and limitations of the model of
mammary carcinogenesis by DMBA, after reclassification of breast cancer according to the
diagnostic criteria of the WHO (2003, 2012), and quantification of molecular subtyping
prognostic immunomarkers, predictive and NSC. After application of the experimental
protocol of chemical induction by DMBA and euthanasia of experimental and control
animals, the mammary lines (with or without tumors) were resected and evaluated the
morphology and immunostaining for markers of NSCs. After 13 weeks, 100% of the
animals developed macroscopic neoplasms and histologically consistent with the evaluation
criteria of evaluation indicated by WHO. Tumors were classified as ductal carcinoma,
papillary carcinoma, lobular carcinoma, myoepithelial carcinoma and phyllodes tumor,
being the most common type, the ductal. Few immunohistochemical markers correlated
with variable behavior biological. Nevertheless, the degree of correlation was not high. The
morphological intratumoral heterogeneity and interanimal associated with the presence of
histological biphasic subtypes (phyllodes tumor), tumors with myoepithelial/basal
differentiation and the positivity for NSCs classic markers (both in terms of frequency in
the sample and in terms of the average distribution neoplasias) demonstrate a clear
involvement of NSCs in the model, making it an important reference as a model for in vivo
testing of anti-specific NSC. The model reproduces the main molecular and histological
-
Abstract
xxii
subtypes of breast cancer, which means that could be used in detailed study drug indicated
specifically for each subcategory molecular (eg, hormonal agents that are suitable
specifically for the luminal type and trastuzumab indicated in tumors HER2 subtype), as
well as to develop new drugs with higher specificity for the class of molecular interest.
Keywords: breast cancer, neoplastic stem cell, immunohistochemistry, Sprague-dawley,
DMBA.
-
1. Introdução
23
1. Câncer de mama
O câncer de mama é a neoplasia maligna mais prevalente e a principal causa de
óbito por neoplasia na população feminina, no mundo (1, 2) (Figura 1). A despeito de
avanços substanciais no entendimento da biologia da doença, nos métodos de detecção
precoce e em sua farmacoterapia (principalmente com a incorporação de anticorpos
monoclonais e nanomoléculas inibitórias de tirosina quinase), a sobrevida geral não se
modificou significantemente nas últimas décadas (3). No Brasil e em outros países em
desenvolvimento, espera-se não apenas um aumento importante na prevalência do câncer
de mama (em grande parte devido ao envelhecimento da população feminina), como
também no gasto com o financiamento da Saúde Pública, em função dos custos crescentes
com as novas modalidades terapêuticas (4, 5) e tratamentos de casos avançados, a maioria
não diagnosticados precocemente. Portanto, pode-se dizer que um dos deveres primordiais
das Universidades Públicas engajadas com a pesquisa básica e aplicada, consiste em
contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento sistêmico desta
neoplasia.
As neoplasias malignas da mama constituem um grupo bastante heterogêneo de
doenças, seja do ponto de vista clínico ou anatomopatológico. A Organização Mundial da
Saúde (OMS) contabiliza um pouco mais de 50 tipos histológicos diferentes (Tabela 1), o
que coloca o câncer mamário entre os de maior variabilidade morfológica intra- e
intertumoral do organismo humano. Tradicionalmente, a classificação histopatológica dos
tumores malignos da mama baseia-se no componente celular e/ou padrão arquitetural
predominante da neoplasia e na semelhança deste componente com constituintes normais
da mama (tais como células epiteliais, mioepiteliais, basais, bem como vários tipos de
células estromais, isto é, de origem mesenquimal). Desse modo, as malignidades primárias
da mama podem ser divididas em quatro grupos principais: os carcinomas (i.e., neoplasias
que se semelham a células epiteliais e/ou mioepiteliais), os sarcomas (semelhantes a células
mesenquimais), os tumores bifásicos com potencial maligno (tumores filóides e
carcinossarcomas) e as neoplasias de natureza linfóide e hemopoiética (6) (Figura 2).
-
1. Introdução
24
Figura 1. Incidência e mortalidade relacionadas ao câncer, por sítio primário, no mundo,
em ambos os sexos. Adaptado de: Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C and
Parkin DM. GLOBOCAN 2008 v2.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC
CancerBase No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer;
2010. Disponível em: http://globocan.iarc.fr, último acesso em 04/01/2013.
-
1. Introdução
25
Tabela 1. Neoplasias malignas primárias da mama: principais entidades clínicopatológicas (e genéticas) reconhecidas pela
Organização Mundial da Saúde (6).
Tumores epiteliais malignos
Carcinomas Invasivos
Carcinoma ductal invasivo, sem outras especificações (SOE) e variantes Carcinoma de células acinares
Carcinoma lobular invasivo, clássicos e variantes Carcinoma mucoepidermóide (veja se tem acento no o)
Carcinoma tubular Carcinoma polimórfico
Carcinoma cribriforme Carcinoma oncocítico
Carcinoma mucinoso Carcinoma rico em lipídios
Carcinoma medular Carcinoma de células claras rico em glicogênio
Carcinoma apócrino Carcinoma sebáceo
Carcinoma com células em anel de sinete
Carcinoma micropapilífero invasivo Tumores epiteliais-mtioepiteliais malignos
Carcinoma metaplásico, SOE e variantes* Adenomioepitelioma com carcinoma
Tumores neuroendócrinos Carcinoma adenóide cístico
Carcinoma secretor
Carcinoma papilífero invasivo
*Inclui o carcinoma mioepitelial.
-
1. Introdução
26
(continuação da Tabela 1)
Tumores mesenquimais malignos Neoplasias linfoides e hemopoiéticas
Lipossarcoma Linfoma difuso de grandes células B
Angiossarcoma Linfoma de Burkitt
Rabdomiossarcoma Linfoma de células T (inclui o linfoma anaplásico ALK-negativo)
Osteossarcoma Linfoma B da zona marginal extranodal do tipo MALT
Leiomiossarcoma Linfoma Folicular
Tumores fibroepitelias malignos
Tumor filóide maligno
Tumor periductal estromal de baixo grau
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1. Introdução
27
Figura 2. Principais neoplasias malignas da mama humana.
-
1. Introdução
28
Em geral, as neoplasias malignas da mama são graduadas quanto à semelhança com
o correlato celular/histológico (hipotético) normal, através de diferentes sistemas (6,7).
Esses sistemas de graduação histológica podem variar de acordo com o tipo histológico de
neoplasia em questão. Fala-se em correlato histológico “hipotético”, pois inicialmente
pensava-se que as neoplasias conservavam algumas características fenotípicas de sua célula
origem (i.e., a célula normal, alvo de sucessivas mutações carcinogênicas). Contudo, como
será discutido adiante, é possível que a maioria das neoplasias malignas não tenha origem
em células diferenciadas que sofreram mutação, e sim em células indiferenciadas, com
capacidade de diferenciação para múltiplas linhagens, chamadas variavelmente de células-
tronco ou células progenitoras. Nesse caso, a semelhança com estruturas tissulares normais
não apontaria para a origem da neoplasia, mas indicaria a capacidade da neoplasia em
“mimetizar” células ou estruturas teciduais normais (8).
Cumpre lembrar que tanto a subtipagem histológica (classificação diagnóstica
principal) como a graduação histológica são de grande importância na conduta clínica,
definindo vários aspectos da (1) propedêutica complementar (i.e., que exames
complementares devem ser solicitados), da (2) terapêutica (i.e., se algum tipo de
farmacoterapia será associado ao tratamento cirúrgico e em que momento da terapêutica
isso ocorrerá, etc.), bem como da (3) estratificação prognóstica (6). As características
histopatológicas mais típicas dos principais subtipos morfológicos reconhecidos pela OMS
(e pela maioria dos especialistas na área) encontram-se resumidas na Tabela 2 (6, 7, 9).
-
1. Introdução
29
Tabela 2. Sumário das características histológicas típicas das principais neoplasias mamárias, segundo a OMS (6).
Tipo histológico Principais características microscópicas
Carcinoma ductal invasivo
Estruturas tubulocinares infiltrativas
Citoplasma abundante e eosinófilo
Pleomorfismo nuclear variável
Estroma pouco celular
Índice mitótico variável
Carcinoma lobular invasivo (clássico) Células descoesas com núcleos homogêneos
Dispostas isoladamente ou em filas indianas
Invasão concêntrica, circundando ductos (aspecto em alvo)
Baixo grau nuclear
Carcinoma papilífero Estruturas papilares complexas revestindo estruturas císticas
Papilas delicadas revestidas por duas ou mais camadas de células neoplásicas
Citoplasma anfofílico
Pleomorfismo nuclear variável
Carcinoma mioepitelial Componente epitelial + componente mioepitelial (ambos malignos)
Depende de confirmação imunoistoquímica
Tumor filóide maligno Tumor bifásico (componente epitelial geralmente benigno + mesenquimal maligno)
Aspecto foliáceo
Estroma hipercelular, atípico e mixóide
-
1. Introdução
30
Divergências e controvérsias diagnósticas existem no estudo dos tumores mamários,
como em qualquer outro campo da Patologia; contudo, pode se dizer que as características
enumeradas na Tabela 2 constituem, na atualidade, verdadeiros critérios diagnósticos
através dos quais as malignidades mamárias humanas podem ser classificadas de forma
racional e reprodutível.
Dentre as neoplasias malignas da mama, cumpre destacar os carcinomas (neoplasias
malignas de natureza epitelial e/ou mioepitelial), uma vez que representam a grande
maioria dos tumores primários (6, 7) . Dentre os carcinomas, os subtipos histológicos mais
comuns são: o carcinoma mamário invasivo sem outras especificações (SOE) ou carcinoma
ductal invasivo (40-75% dos carcinomas) e o carcinoma lobular (5-15%) (6, 7, 9). Apesar
dos nomes (“ductal” e “lobular”), acredita-se que ambos se originem nas unidades
ductolobulares terminais (UDLTs) – as unidades funcionais da mama localizadas nas
extremidades distais da ramificação do sistema ductal mamário. No tecido mamário maduro
e funcional, as UDLTs são constituídas por três tipos celulares principais: (1) as células
epiteliais luminais, (2) as células mioepiteliais e (3) a células basais (Figura 3) (9, 10). Os
dois primeiros tipos celulares são considerados como células “diferenciadas”, isto é, no
extremo da maturidade funcional e com mínima capacidade de autorreplicação. A célula
basal, por outro lado, apresenta algumas características fenotípicas, funcionais e
topográficas que as tornam fortes candidatas ao título de célula-tronco ou célula progenitora
da mama. Um sumário das principais diferenças morfológicas, topográficas,
imunofenotípicas e funcionais pode ser observado na Tabela 3
Embora seja consenso que a maioria dos carcinomas mamários se origine nas
UDLTs, não se pode precisar qual dos três tipos celulares é o alvo das mutações sucessivas
que levam ao desenvolvimento do câncer. Isso porque as características típicas das células
epiteliais, mioepiteliais e basais se manifestam de forma variada e imprevisível nas
neoplasias malignas da mama (ou seja, ora encontram-se evidências de diferenciação para
um tipo único de célula [e.g., epitelial] ora observam-se fenótipos combinados [e.g.,
epitelial + mioepitelial]).
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1. Introdução
31
Figura 3. Esquema ilustrativo do desenvolvimento de neoplasias mamárias epiteliais a
partir de UDLTs (10).
Expansão inicial de UDLTs por
CDIS
Unidade ductolobular terminal (UDLT)
Ducto segmentar
Papila
Seio lactífero
Expansão completa de UDLTs por CDIS
GLD não lactante GLD lactante
UDTL normal
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1. Introdução
32
Tabela 3. Resumo das principais diferenças entre os constituintes celulares da unidade
ductolobular terminal (9).
Célula
Luminal
Células
Mioepitelial
Célula
Basal/ Tronco/
Progenitora
Topografia
Revestimento mais interno
(luminal)
Revestimento mais externo
(interface ácino-estroma)
Interface ácino-etroma
Morfologia Colunar/cuboidal,
citoplasma eosinófilo
Variável (desde
semelhante a linfócito até
epitelióide)
Indiferenciada (semelhante
a linfócito)
Imunofenótipo Citoqueratinas 7, 8, 18 e
19
S-100, actina muscular,
calponina, CD10, p63,
citoqueratinas 5/6, 14, 17
Citoqueratinas, 5/6, 14 e
vários marcadores
clássicos de célula-tronco
tecido-inespecíficos (vide
adiante).
-
1. Introdução
33
Além da tradicional classificação morfológica, recentemente, uma nova maneira de
subtipar as neoplasias mamárias vem ganhando importância clínica, particularmente,
devido ao seu valor preditivo de resposta terapêutica. Essa classificação, chamada
“classificação molecular dos carcinomas mamários”, baseia-se em estudos de perfil de
expressão gênica (isto é, trabalhos focados no uso de microarranjos de cDNA) e preconiza
a divisão dos casos em 4 subtipos principais: luminal A, luminal B, HER2 e basal-símile
(ou basal-like) (9, 11, 13, 14, 15). Esses novos tipos diferenciam-se não apenas em relação
ao padrão de expressão gênica (Figura 4), como também no que diz respeito a
características clínicas, prognósticas e de resposta ao tratamento farmacológico (9, 11, 13,
14, 15) (Tabela 4) .
Uma vez que a subtipagem molecular através do perfil de expressão gênica envolve
metodologia laboriosa, de alto custo e, portanto, ainda indisponível na maioria dos serviços
de saúde, tem se recorrido com frequência ao uso de uma subtipagem molecular
“alternativa”, que se baseia no uso de um painel imunoistoquímico bastante simples. Esse
método alternativo é apresentado na Tabela 5 (9, 13, 14, 15, 16). O método alternativo ou
aproximado de subtipagem molecular das neoplasias mamárias vem ganhando bastante
crédito entre mastologistas e patologistas especialistas na área, especialmente após o último
Consenso de St. Gallen que propõe esta classificação como base para a indicação dos
diferentes regimes de farmacoterapia disponíveis para o tratamento do câncer mamário
(16). É provável que muito em breve este sistema de subtipagem deverá ser incorporado à
padronização do laudo anatomopatológico do câncer de mama como item obrigatório,
devido à importância crescente do subtipo molecular no estabelecimento do prognóstico e
da conduta terapêutica frente a um carcinoma mamário.
-
1. Introdução
34
-
1. Introdução
35
Figura 4. Padrão de expressão gênica de 85 amostras experimentais representando 78
carcinomas, 3 tumores benignos e quatro tecidos normais, analisados por agrupamento
hierárquico utilizando um conjunto de 476 clones de cDNA intrínseco. (A) As amostras de
tumores foram divididas em cinco (ou seis) subtipos com base nas diferenças da expressão
dos genes. O dendograma mostra os cinco (seis) subtipos de tumores (coloridos) que são:
subtipo luminal A, azul escuro; subtipo luminal B, amarelo; subtipo luminal C, azul claro;
mama normal, verde; tipo basal, vermelho e ERBB2+, rosa. (B) As barras coloridas à
direita representam as inserções apresentadas no C-G. (C) Amplificação do ERBB2. (D)
Conjunto desconhecido. (E) Células epiteliais basais. (F) Mama normal. (G) Luminal
contendo receptor de estrógeno (15).
-
1. Introdução
36
Tabela 4. Subtipos moleculares do câncer de mama determinados pelo perfil de expressão
gênica: sumário das principais diferenças em termos de perfil de expressão gênica,
características clínicas e resposta ao tratamento (1).
Luminal HER2 Basal
Padrão de
expressão gênica
Elevada expressão de RE e
RP e genes associados
(luminal A>luminal B)
Elevada expressão de
HER2;
Baixa expressão de RE
Elevada expressão de genes
epiteliais basais,
citoqueratinas basais;
Baixa expressão de RE e
HER2.
Características
clínicas
~ 70% dos carcinomas
invasivos, RE/RP positivos.
Grau histológico: luminal B >
luminal A;
Alguns superexpressam
HER2 (luminal B2).
~15% dos carcinomas
invasivos;
RE/RP negativos
~15% dos carcinomas
invasivos;
A maioria triplo negativo
Resposta ao
tratamento
Responde ao tamoxifeno e
inibidores da aromatase, pode
ser diferente para luminal A e
luminal B;
Resposta variável a
quimioterapia (luminal
B>luminal A);
Prognostico luminal A>
luminal B.
Responde ao Trastuzumab
(Herceptina) e a
antraciclinas
Geralmente pior
prognóstico
Não responde ao
Trastuzumab (Herceptina);
Pode ser sensível as
platinas e inibidores da
enzima poli (ADP-ribose)
polimerase-1(PARP);
Geralmente pior
prognóstico
-
1. Introdução
37
Tabela 5. Classificação molecular substitutiva (alternativa aos métodos moleculares
validados: Mammaprint® e Oncotype Dx®) de neoplasias malignas da mama humana (9).
Luminal A Luminal B1 Luminal B2 HER2 Triplo
negativo/basal-
símile
RE/RP
+
+
+
-
-
C-erbB-2
-
-
+
+
-
Ki67
14%
Variável
Variável
Variável
-
1. Introdução
38
2. Células-tronco neoplásicas
As células-tronco (CT) podem ser definidas através de duas propriedades
fundamentais: a capacidade de (1) autorrenovação e de (2) diferenciação em múltiplas
linhagens celulares (17). Em geral, são classificadas segundo sua origem em: embrionárias,
fetais, umbilicais e adultas (18). Os três primeiros subtipos são representados por CTs mais
primitivas e com expressivo potencial de diferenciação, podendo originar qualquer tipo
celular de um organismo desenvolvido.
As CT adultas constituem uma pequena parcela de órgãos sistêmicos maduros, onde
podem originar alguns tipos celulares específicos como os que caracterizam a pele, a
glândula mamária, a próstata, o trato gastrintestinal e o sistema nervoso central (19). As
CTs adultas são células de vida longa, em geral, quiescentes ou de baixo índice
proliferativo. São capazes de gerar, através de divisões simétricas ou assimétricas, novas
células tronco (preservando assim o pool de reserva destas células) ou células
comprometidas com um fenótipo morfofuncional (que deverão proliferar, constituindo
desse modo a maior parte de um determinado órgão/tecido) (3, 20, 21).
O crescimento e a diferenciação da CT adulta mais primitiva (a CT toti- ou
pluripotente) e sua progênie mais imediata (as células precursoras imaturas ou
multipotentes) são modulados por sinais encontrados no microambiente local – o chamado
“nicho da célula tronco”. Essa sinalização inclui interações homotípicas de caderinas (do
nicho e das CTs), bem como interações entre integrinas das CTs e a matriz extracelular.
Em conjunto, a capacidade de autorrenovação e o potencial multilinhagem conferem
às CTs um papel fundamental tanto em processos fisiológicos quanto patológicos. Nos
-
1. Introdução
39
processos fisiológicos, incluem-se: a organogênese intra-útero, a renovação natural de
epitélios e outros tecidos com capacidade de proliferação, bem como processos de
reparação/cicatrização de tecidos lesados. Dentre os processos patológicos, destacam-se as
neoplasias malignas, onde as propriedades fundamentais das CTs parecem estar
desreguladas (17). Em várias neoplasias malignas (incluindo leucemias e a maioria dos
tumores sólidos), evidências recentes indicam que a célula alvo de mutações cumulativas
responsáveis pelo desenvolvimento e manutenção do fenótipo canceroso seja uma célula
normal com características fenotípicas de CT adulta (21). Neste contexto, as CTs seriam
responsáveis pela origem, manutenção (autorrenovação) e heterogeneidade morfológica das
neoplasias.
Cumpre ressaltar que essas hipóteses configuram um novo paradigma de
carcinogênese, que vem ganhando credibilidade na última década por meio de evidências
cumulativas, e que se contrapõe ao modelo clássico de carcinogênese no qual as neoplasias
se originariam a partir de mutações sucessivas em qualquer célula de um tecido
(independente do seu status de maturação/diferenciação) (22).
Independentemente da origem da neoplasia (seja em célula madura/diferenciada ou
em CT), é possível constatar in vitro e in vivo, em um grande número de tumores malignos,
uma subpopulação de células indiferenciadas, com características biológicas e fenotípicas
de célula tronco, que em geral corresponde a menos de 1% do total de células de uma
neoplasia (17). Essas células são designadas na maioria dos estudos como “células-tronco
cancerosas, tumorais ou neoplásicas (CTNs)”. Nesses estudos, demonstra-se que as CTNs
-
1. Introdução
40
são responsáveis pela variabilidade citoarquitetural e molecular de inúmeras neoplasias
malignas (tais como carcinomas mamários e ovarianos) (3, 21).
Embora representem, geralmente, uma pequena parcela da neoplasia total, as CTNs
têm sido associadas em vários estudos à capacidade de algumas malignidades de resistir às
principais modalidades terapêuticas anti-neoplásicas – especialmente, a quimio-, radio- e
imunoterapias (3, 17). Essas abordagens terapêuticas parecem atuar de forma eficaz apenas
sobre as células mais diferenciadas da neoplasia (principalmente, as que apresentam
elevados índices de proliferação), reduzindo essa subpopulação, sem comprometer
significantemente as CTNs. A preservação, mesmo que parcial, de CTNs, por sua vez,
poderia contribuir de forma decisiva para recidivas neoplásicas locais e à distância, em
médio ou longo prazo (3, 21, 22).
Os fatores que tornam as CTNs mais resistentes à terapêutica antineoplásica não
estão totalmente elucidados, mas parecem estar relacionados ao fato das CTNs (1) estarem
na maior parte do tempo em estado quiescente (sendo que a maioria das estratégias
terapêuticas são mais efetivas em células em ciclo) e (2) expressarem moléculas
transportadoras de xenobióticos (transportadores de efluxo), que impedem o acúmulo
citosólico de fármacos anti-neoplásicos (17). Dentre esses transportadores de efluxo, que
constituem o substrato molecular para o fenômeno de resistência a múltiplas drogas,
destacam-se a glicoproteína P (Pgp) - produto do gene MDR1 (“multidrug resistance
gene1” ou ABCG1) -, bem como a proteína codificada pelo gene ABCG2 (ATP-binding
cassette sub-family G member 2). A proliferação lenta das CTNs também explicaria porque
as recidivas de alguns tumores (como os carcinomas mamários, os osteossarcomas e os
-
1. Introdução
41
sinoviossarcomas) podem demorar mais de 10 anos para tornarem-se detectáveis pelos
métodos imagenológicos e laboratoriais disponíveis (23).
Além de estarem implicadas em resistência terapêutica, as CTNs parecem estar
associadas a outras variáveis biológicas relacionadas à agressividade dos processos
neoplásicos, influenciando negativamente, através de diferentes vias, o prognóstico das
neoplasias malignas (3, 24). Dentre as variáveis biológicas de agressividade onde a
presença e o número de CTNs podem ter papel significante, destacam-se: (a) a capacidade
de migração celular (deslocamento de células neoplásicas após separação espontânea do
tumor parental); (b) a invasividade em tecido conjuntivo (capacidade de se deslocar no
tecido conjuntivo, dissolvendo ou destruindo barreiras naturais, como fibras colágenas,
células estromais e células imunes, em geral através da produção de enzimas e/ou
substâncias citotóxicas); (c) a atividade pró-angiogênica (capacidade de estimular a
proliferação de novos vasos a partir de um leito capilar pré-existente, facilitando a nutrição
do tumor primário e o acesso de células invasoras ao sistema circulatório); e (d) a
tumorigenicidade (capacidade de estabelecer-se e de dar origem a um novo tecido
neoplásico, em um novo sítio anatômico do organismo de origem ou em um novo
organismo vivo, relacionada à expressão de moléculas de adesão, homing e à resistência a
mecanismos de defesa inatos e imunológicos locais) (3, 24). Essas características biológicas
estão diretamente associadas à capacidade metastatização, um evento que caracteriza o
estádio mais avançado de uma neoplasia maligna, onde a probabilidade de cura ou
sobrevivência com qualidade de vida é muito pequena. Desse modo, a presença e proporção
de CTNs em uma neoplasia maligna parecem estar associadas a comportamento biológico
-
1. Introdução
42
mais agressivo (i.e., maior capacidade de invasão local e metastatização) e, por
conseguinte, pior prognóstico (3, 24).
A prova definitiva de que uma determinada célula é de fato uma CT consiste na
demonstração da capacidade desta célula em reconstituir o seu tecido de origem (seja ele
normal ou neoplásico), quando implantada em uma nova topografia anatômica ou em um
novo organismo (19, 25, 26). Esse tipo de demonstração impõe algumas limitações éticas e
técnicas à realização de estudos sobre CTN, em particular, quando envolvem tecidos
humanos e geração de dados em larga escala, respectivamente. Por esses motivos,
historicamente, uma série de técnicas menos laboriosas/complexas e mais factíveis vem
sendo desenvolvidas com o intuito de substituir o método de demonstração considerado
como padrão ouro (17, 26).
No câncer de mama, a presença de CTNs foi estabelecida em linhagens celulares,
modelos experimentais murinos de carcinogênese induzida e em tecido humano, através de
diferentes técnicas como a formação de mamosferas em cultura, o teste de efluxo do
corante Hoechst, a imunofenotipagem por imunoistoquímica e por citometria de fluxo (26).
Na imunofenotipagem, as CTs e CTNs apresentam um perfil de expressão de moléculas, as
quais são representadas especialmente por proteínas e glicoproteínas encontradas na
superfície, no citoplasma ou no núcleo dessas células.
Esse perfil molecular pode ser definido tanto pela expressão típica de algumas
moléculas (CD34, CD133, CD44, ALDH, ESA, Sca-1, dentre outras) quanto pela ausência
de outras (17, 27). Assim, algumas moléculas como o ALDH1 (um marcador alternativo ao
teste do ALDEFLUOR), CD133, ESA/EPCAM e a combinação CD44/CD24 (sendo o perfil
-
1. Introdução
43
CD44+/CD24- indicativo de CTN) são consideradas os marcadores mais utilizados em
pesquisas científicas e os mais descritos na literatura para o estudo de CTNs (Tabela 6) (27,
28).
O perfil imunofenotípico típico de uma CTN pode variar de neoplasia para neoplasia,
entre espécies animais e modelos experimentais distintos, com a técnica de
imunofenotipagem utilizada (citometria de fluxo vs. imunoistoquímica), com a abordagem
experimental (in vitro vs. in vivo) e dentro de um mesmo tumor, sugerindo a coexistência
de clones diferentes de CTNs (17). Além disso, nem sempre o perfil imunofenotípico de
determinada CTN coincide perfeitamente com o perfil da CT normal correspondente, o que
pode indicar que algumas destas moléculas possam desempenhar uma função importante
para a manutenção do próprio fenótipo neoplásico ou maligno (3, 17).
Sugere-se que grande parte da variabilidade imunofenotípica acima possa estar
relacionada ao fato destes marcadores serem moléculas envolvidas na interação da CT
(normal ou neoplásica) com o seu nicho podendo esta ser uma interação dinâmica.
Portanto, se houver variação no microambiente celular ou no momento da dinâmica de
interação, padrões imunofenotípicos diferentes poderão ser encontrados. Da mesma forma,
as diferenças técnicas inerentes a cada método de imunofenotipagem podem favorecer ou
não a detecção de alguns marcadores.
É importante ressaltar que, independente dessa variabilidade imunofenotípica, a
existência de perfis imunofenotípicos específicos para CTs e CTNs permite a detecção
dessas células em diferentes contextos experimentais, o que por sua vez favorece e agiliza
muito a realização de estudos sobre essas células, voltados para o entendimento de aspectos
-
1. Introdução
44
fisiopatológicos e para o desenvolvimento de aplicações clínicas (testes diagnósticos,
ferramentas de avaliação prognóstica/preditiva de resposta terapêutica e estratégias de
tratamento, como as farmacológicas) (17, 29).
Nos últimos anos, o estudo da biologia de células tronco de tumores sólidos tornou-se
crescente na prática clínica oncológica devido, principalmente, a identificação de novos
marcadores de células progenitoras e/ou CTNs (3, 19). A identificação de CTNs mamárias
através das técnicas imunólogicas como a imunoistoquímica tem sido importante nas
pesquisas com o objetivo de estabelecer uma melhor conduta diagnóstica e avaliar fármacos
que atuem principalmente sobre as CTNs, sem causar danos às células tronco normais ou
mesmo as células normais diferenciadas do organismo. Esta abordagem baseia-se na
premissa de que as CTNs devem conservar pelo menos parcialmente a expressão de
antígenos característicos da célula de origem que pode ser uma CT ou progenitoras
primitivas normais, o que já foi demonstrado em estudos mais recentes (30, 31).
Assim, a técnica imunoistoquímica apresentaria ainda a vantagem de permitir o
estudo das CTN in situ, com correlação morfológica e topográfica, onde as células são
observadas em seu contexto histológico real. Nenhum marcador ainda é absolutamente
específico para o fenótipo CTN, portanto, essa correlação citomorfológica/topográfica
poderia não só reduzir as chances de falsos positivos, como poderia fornecer insights a
respeito do papel biológico específico das CTN em várias neoplasias (25). Além disso, o
recente advento dos scanners de lâminas histológicas que permitem a digitalização e a
análise automatizada de toda a superfície de um corte histológico, com agilidade e precisão
-
1. Introdução
45
e das técnicas aprimoradas de imunomarcação múltipla em material cito e histológico
também favorece a utilização da técnica de imunoistoquímica para detecção das CTNs.
-
1. Introdução
46
Tabela 6. Principais marcadores imunofenotípicos de CTN, em diferentes neoplasias malignas (17).
Marcador Sinonímia Órgão/tecido
CD24 Heat stable antigen Mama (CT e CTN)
CD29 Integrina beta-1 Mama (CT e CTN)
ESA/EPCAM Antígeno epitelial-específico Mama e pâncreas (CTN)
CD44 - Mama e próstata (CTN)
CD133 Prominina-1 Mama e próstata (CTN)
p63 - Mama e próstata (CT e CTN)
Stem cell antigen Sca-1 Mama, próstata, músculo, MO (CT e CTN)
CD34 - Intestino (CTN); fígado e pâncreas (CT)
c-Kit CD117 Intestino (CTN); fígado e pâncreas (CT)
Abrev.: CT= célula tronco normal, CTN= célula tronco neoplásica, MO= medula óssea (séries hemopoiéticas).
-
1. Introdução
47
3. Dimetilbenz-(a)-antraceno (DMBA) como modelo de carcinogênese mamária
Os modelos animais são utilizados em todos os campos da pesquisa biológica. Tais
modelos, obrigatoriamente, devem permitir a observação de fenômenos biológicos naturais,
induzidos ou comportamentais, que possam ser comparados aos fenômenos humanos
estudados (32, 33).
Um dos modelos mais utilizados para o estudo do câncer de mama baseia-se no uso
de 7,12-dimetilbenz-(a)-antraceno (DMBA) como indutor químico em ratas Sprague-
Dawley (SD). Para a obtenção de neoplasias mamárias, Russo e Russo (2000) e Barros et al
(2004) utilizaram o DMBA diluído em óleo de soja na dose de 20 mg por animal,
administrado por gavagem intragástrica, e após 13 semanas da indução 100% dos animais
apresentaram de 1 a 3 nódulos palpáveis. Os tumores assim obtidos parecem apresentar
certa similaridade histomorfológica e molecular com tumores humanos (34). A
suscetibilidade da glândula mamária destes roedores a este protocolo torna este órgão um
alvo importante para testar o potencial carcinogênico de compostos específicos. Os tumores
induzidos pela administração de produtos químicos cancerígenos como o DMBA
constituem uma ferramenta útil para investigar as várias etapas da carcinogênese que inclui
a iniciação, promoção e progressão da doença (35, 36, 37).
Dentre os mecanismos que explicam a carcinogênese pelo DMBA, a principal teoria
é a ativação do receptor/fator de transcrição AhR (aryl hidrocarbon receptor/transcription
fator), membro da família Per-ARNT-Sim (PAS) de fatores de transcrição, o que
influenciam no desenvolvimento, no ciclo circadiano e nas respostas da hipóxia (38).
De modo geral, a administração de DMBA leva ao aumento na atividade do AhR,
por intermediação da indução da CYP1A1, CYP1A2 e outras enzimas que também
participam no metabolismo de xenobióticos (38, 39). São estas enzimas que convertem o
DMBA em intermediários epóxido mutagênicos - o 7-hidroximetil-12-
dimetilbenzantraceno (7-HDMBA), o 12-hidroximetil-7-metilbenzantraceno (12-HMBA) e
o 7,12-dimetilbenzantraceno, que formam adutos de DNA (40). Estes metabólitos ativam
principalmente o AhR que se complexa com a proteína Heat-Shock 90 (hps90) e
provavelmente ainda com outras proteínas ainda não evidenciadas. Quando por algum
-
1. Introdução
48
motivo estas proteínas se dissociam, a AhR está livre para se translocar para o núcleo e se
dimerizar com o cofator ARNT (aryl hidrocarbon receptor nuclear translocator),
associando-se a sequencias regulatórias de transcrições específicas no DNA. Um vez no
núcleo induzem a expressão de genes que codificam para fatores de crescimento e proto-
oncogenes (38, 40).
Estudos em animais indicaram que o DMBA é rapidamente absorvido no trato
intestinal e tende a se acumular no tecido adiposo. Como a glândula mamária tem por
característica fisiológica o acúmulo de tecido adiposo isso a torna um importante local de
tropismo para o DMBA (40, 41).
A incidência de tumores induzidos quimicamente, o número de tumores por animal
e as características patológicas podem ser influenciadas pela idade do hospedeiro, no
momento da exposição cancerígena, o status hormonal, a dosagem do agente de indução e a
via de administração, dentre outros fatores (35, 36, 37, 42, 43, 44). As ratas SD são muito
sensíveis a carcinogênese pelo DMBA entre 35 e 55 dias de idade devido à intensa
atividade proliferativa do tecido mamário neste período (44, 45, 46). Além disso, há grande
sucesso na taxa de indução, sendo obtidos tumores macroscopicamente visíveis após 13
semanas em mais de 90% dos animais (45). Embora não totalmente demonstrado, é
possível que os tumores obtidos a partir deste modelo expressem receptores hormonais e
marcadores preditivo-prognósticos (e.g., C-erbB-2), o que o tornaria um modelo ainda mais
robusto, principalmente frente ao desenvolvimento da chamada medicina personalizada.
Apesar do DMBA ser um indutor dos modelos de carcinogênese mamária mais
utilizado na literatura, ou seja, tanto em estudos de fisiopatogênese como em estudos
farmacológicos, são raros os trabalhos focados na descrição histopatológica pormenorizada
das neoplasias induzidas pelo DMBA, na caracterização imunoistoquímica de marcadores
prognósticos/preditivos de resposta terapêutica e na correlação minuciosa com as
neoplasias humanas.
-
1. Introdução
49
Finalmente, até o momento, não foram relatados trabalhos voltados para a detecção da
expressão de marcadores de células-tronco neoplásicas neste modelo de carcinogênese.
-
50
-
2. Justificativa
51
A classificação das lesões induzidas pelo DMBA segundo os critérios diagnósticos da OMS
(2003; 2012) para neoplasias humanas e em subtipos moleculares, bem como a
caracterização imunoistoquímica dessas lesões quanto à expressão de marcadores
prognósticos, preditivos terapêuticos e de CTNs, além de inéditas, deverão contribuir
significantemente para definir as potencialidades e limitações do modelo. Em outras
palavras, é importante identificar que subgrupo de neoplasias mamárias o modelo de fato
mimetiza, e se o modelo é robusto o suficiente para o teste de drogas anti-CTN ou
direcionadas contra alvos moleculares específicos. Além disso, os marcadores avaliados
poderão ser investigados futuramente como possíveis alvos farmacológicos (i.e., para o
desenvolvimento de novos fármacos, em particular anticorpos monoclonais e
nanomoléculas).
-
52
-
3. Objetivos
53
3.1- Objetivo Geral
Descrever e discutir as potencialidades e limitações do modelo de carcinogênese mamária
pelo DMBA após classificação das neoplasias mamárias segundo os critérios da OMS
(2012), subtipagem molecular e quantificação de imunomarcadores prognósticos, preditivos
e de CTN.
3.2- Objetivos específicos
1. Reclassificar os tumores induzidos por DMBA, segundo os critérios da OMS
(2012). Determinar a frequência dos subtipos histológicos na amostra avaliada e a
composição histológica média dos tumores induzidos.
2. Descrever e quantificar as características histomorfológicas indicativas de
comportamento biológico (tais como graduação histológica, necrose e índice
proliferativo).
3. Quantificar a expressão imunoistoquímica de marcadores prognósticos/preditivos e
de CTN.
4. Classificar os tumores induzidos pelo DMBA segundo os principais tipos
moleculares estabelecidos (luminais, HER2 e triplo negativo/basal-símile).
5. Estabelecer o grau de correlação entre os marcadores imunoistoquímicos e as
características morfológicas avaliadas.
6. Estabelecer o grau de correlação entre diferentes marcadores de CTN.
7. Discutir as principais potencialidades e limitações do modelo.
-
54
-
4. Material e métodos
55
4.1- Aspectos éticos
O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética no uso de animais da
Universidade Estadual de Campinas (CEUA-IB-UNICAMP), protocolo nº 2390-1.
4.2- Locais de realização
A pesquisa foi realizada no Laboratório de Histomorfometria e Patologia Molecular
Aplicadas do Departamento de Farmacologia (LHIAP)/FCM (UNICAMP), em colaboração
como Laboratório de Patologia Experimental (LAPE)/CAISM (UNICAMP), o Centro de
Investigações em Pediatria (CIPED)/FCM (UNICAMP) e o Laboratório de Patologia
Experimental e Molecular do Hospital do Câncer A. C. Camargo/Fundação Antônio Prudente.
4.3- Animais
Para o experimento, quarenta (40) ratas Sprague-Dawley virgens, entre 45-55 dias de idade,
pesando entre 150-200 g, provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica-
CEMIB-Unicamp, foram adaptadas ao Biotério do Departamento de Farmacologia - Unicamp e
divididas em 2 grupos:
• Experimental (GE, n=20): ratas submetidas a protocolo de indução química de
neoplasias mamárias.
• Controle (GC, n= 20): animais não induzidos quimicamente.
4.4- Indução tumoral e obtenção dos espécimes anatomopatológicos
A neoplasia mamária foi induzido através de uma única dose de 7,12-
dimetilbenz(a)antraceno(DMBA) (100mg/Kg de peso vivo, diluída em 1mL de óleo de soja)
administrada intragastricamente por gavagem. Os animais foram eutanasiados 90 dias após a
indução química (grupo experimental). Foram também eutanasiados os animais que receberam
apenas dose única de 1 ml de óleo de soja (grupo controle).
Ao fim do protocolo de indução, as ratas experimentais e seus controles
correspondentes foram anestesiadas com diazepam (2 mg/kg), ketamina (60 mg/kg) e
-
4. Material e métodos
56
fentanila (0,04 mg/kg), em seguida, submetidas a aprofundamento anestésico em câmara de
isoflurano e deslocamento cervical (sendo todo o procedimento acompanhado por um
médico veterinário). Foram ressecadas ambas as linhas mamárias das ratas controle e
experimental. Todos os animais foram submetidos à necropsia completa para avaliação macro e
microscópica de doença metastática e neoplasias primárias sincrônicas (em sítios não mamários).
O produto das ressecções mamárias e da necropsia foi encaminhado para exame macroscópico
(com especial atenção à determinação das dimensões e alterações à superfície de corte das peças),
fixação em formalina 10% tamponada e processamento histológico automático para inclusão em
parafina.
4.5- Tissue microarray (TMA)
Os casos foram analisados e as áreas de interesse do corte foram marcadas com caneta
permanente sobre a lâmina, e sobrepostas aos seus respectivos blocos que também foram
marcados nos pontos a serem doados os cilindros de tecido. As identificações das lâminas foram
transferidas para planilha Excel® que foi utilizada como guia para a confecção do microarranjo.
Após a confecção do bloco receptor com o auxílio do aparelho de construção de array (Manual
Tissue Arrayer, MTA-1, Beecher Instruments Inc.) com agulha de 1mm, foram retirados
cilindros de tecido de cada bloco e sepultados no bloco receptor, tendo aí a matriz formada. Em
um micrótomo rotativo, o bloco foi cortado na espessura de 5µm em fita adesiva e aplicada em
lâminas especiais (Instrumedics Inc.); a fita adesiva foi retirada por exposição a luz ultravioleta
por 30 minutos, e após esse passo, as lâminas foram mergulhadas em solvente (TPC) e secas a
temperatura ambiente (validação metodológica: De Brot et. al., 2012 (49)).
-
4. Material e métodos
57
4.6- Colorações histológicas
Cortes histológicos entre 4-5 µm foram corados em hematoxilina-eosina (HE) com a
finalidade de avaliar os órgãos removidos durante a necropsia e as características morfológicas
dos tumores; quantificar necrose tumoral, índice mitótico e graduação histológica final. Para esta
análise foram excluídas as neoplasias bifásicas (tumor filoide).
Para a imunoistoquímica foram selecionados alguns marcadores para CTNs disponíveis
comercialmente e marcadores prognósticos/preditivos de resposta farmacológica de rotina, com
reatividade comprovada em tecidos murinos (Tabela 7). Resumidamente, após desparafinização e
hidratação, os cortes histológicos foram submetidos ao bloqueio da peroxidase endógena (três
banhos de H2O23%, de 5 minutos cada), recuperação antigênica por calor úmido (imersão em
solução tampão citrato de sódio pH 6.0, por 30 min, em panela de vapor, a 95ºC) e incubação
com o anticorpo primário “overnight”. Como método de detecção foi utilizado o Advance™
HRP Link (Dako cód. K4068, Carpinteria, CA, EUA) e para a revelação da reação foi
utilizado o substrato cromogênico (DAB-tetraidrocloreto de 3-3'-diaminobenzidina, Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, Estados Unidos da América). Os cortes foram então
contracorados com hematoxilina de Harris, desidratados e montados em lamínulas e resina
Entellan® (Merck, Dermstad, Alemanha).
A digitalização das lâminas foi realizada de modo automático em equipamento
constituído pelo scanner de lâminas Pannoramic MIDI (3DHistech), equipado com o
software dedicado Pannoramic Viewer para obtenção da lâmina virtual e das imagens TIFF
de análise (após seleção manual dos campos de interesse). Para determinação da frequência
de células neoplásicas positivas para marcadores de CTN foi utilizado o programa Image J
(programa de domínio público, fornecido pelo NIH, EUA, através do site:
http/imagej.nih.gov/ij/download). Os resultados de positividade foram expressos em
número de células positivas para cada marcador. Para as análises morfológicas dependentes
do exame direto da lâmina (e.g., graduação histológica), foi utilizado o fotomicroscópio de
co-observação (Nikon 50i + Moticam 5Mpx). Neste caso, as análises foram realizadas
levando-se em consideração toda a superfície de corte.
-
4. Material e métodos
58
Tabela 7. Monomarcadores (single markers) de CTNs, prognósticos e preditivos (de resposta ou
resistência terapêutica).
Marcador Fabricante Diluição Função
CD34 Santa Cruz 1:2000 Marcador CTN
p63 Dako 1:300 Marcador CTN
C-kit (CD 117) Dako 1:200 Marcador CTN
Oct-4 Abcam Pronto para uso
Marcador CTN
CD 44 Leica/Novocastra 1:40 Marcador CTN
CD 24 Neomarkers 1:50 Marcador CTN
CD 133 Abcam 1:100 Marcador CTN
EPCAM (Esa) Cell Marque 1:200 Marcador CTN
Ck14 Thermoscientific 1:500 Marcador CTN
EGFR Leica 1:50 Marcador CTN
ALDH 1A1 Abcam 1:250 Marcador CTN e preditivo de resistência terapêutica
RE Neomarkers 1:100 Marcador de bom prognóstico e preditivo de resposta terapêutica para agentes hormonais (e.g., Tamoxifeno).
RP Dako 1:400 Marcador de bom prognóstico e preditivo de resposta terapêutica para agentes hormonais (e.g., Tamoxifeno).
C-erbB-2 (HER2/neu) Dako 1:1000 Marcador de mau prognóstico e preditivo de resposta terapêutica para Trastuzumab
-
4. Material e métodos
59
4.7. Variáveis de análise morfológica
O tipo histológico foi estabelecido seguindo os critérios recomendados pela
Organização Mundial de Saúde (2012). A graduação histológica foi baseada no Sistema de
Nottingham (SBR modificado), o qual avalia: o grau de formação tubular, o grau de
pleomorfismo nuclear e o índice mitótico. Cada parâmetro recebe uma pontuação que varia
de 1 a 3 (vide itens 4.7.1 3). O somatório dos escores parciais permite o estabelecimento do
“grau histológico final” (vide subtópico 4.7.4) A porcentagem de necrose espontânea foi
estimada após exame de toda a superfície de corte ao microscópio.
4.7.1. Formação ou diferenciação tubular/glandular (acinar)
Percentual de formação tubular Pontuação >75 1
10-75 2
-
4. Material e métodos
60
4.7.3. Índice mitótico
Foram contadas apenas as figuras de mitose bem definidas (ignorando-se núcleos
hipercromáticos ou picnóticos), em 10 campos de maior aumento (objetiva de 40X) na
periferia do tumor, onde a atividade proliferativa foi mais intensa (hotspots). Dentro dos
hotspots, a seleção do campo foi aleatória:
¡ Os pontos de corte para atribuição de valores de pontuação para o fotomicroscópio
Nikon 50i foram:
▪ 0-8 figuras de mitose= 1 ponto;
▪ 8-11 FM= 2 pontos;
▪ > 11 FM= 3 pontos;
4.7.4. Grau histológico final
Os escores de cada parâmetro foram somados, resultando em um escore final de 3 a 9
pontos. A graduação final foi expressa da seguinte forma para os carcinomas:
1. 3-5 pontos: grau 1, bem diferenciado ou baixo grau
2. 6-7 pontos: grau 2, moderadamente diferenciado ou grau intermediário
3. 8-9 pontos: grau 3, pouco diferenciado ou alto grau.
4.8. Variáveis de análise IHQ
4.8.1. Positividade para receptores hormonais (RE/RP): Método Allred (1990)
Foram quantificadas (1) a distribuição de células positivas e a (2) intensidade de coloração
(vide atribuição de pontuação abaixo); posteriormente, foi realizada a soma dos escores
parciais obtidos, sendo que, valores acima de 3 foram considerados positivos.
-
4. Material e métodos
61
Distribuição
Proporção de células positivas Pontuação (escore)
1/100 0-1
1/10 2
1/3 3
2/3 4
>2/3 até 1 5
Intensidade
Intensidade Pontuação (escore)
Negativo 0
Fraco 1
Moderado 2
Forte/intenso 3
Fonte: Allred, 1990 (50).
-
4. Material e métodos
62
4.8.2. Positividade para C-erbB-2
Para avaliar a positividade para C-erbB-2 seguimos as recomendações da ASCO/CAP.
Escore de
positividade Característica Resultado
0 Ausência completa de marcação de membrana citoplasmática negativo
+1 Escassas marcações incompletas e sem continuidade da
membrana negativo
+2 Marcações fortes em menos de 10% das células neoplásicas indeterminado/equívoco
+3 Marcação forte e completa em todo o contorno da membrana
citoplasmática em mais de 10% das células neoplásicas positivo
4.8.3. Critérios para a classificação alternativa em subtipos moleculares baseada no
perfil molecular
Subtipo molecular Perfil de biomarcadores
Luminal A ER+ e/ou PR+
Luminal B
B1
B2
ER+ e/ou PR+,
Ki67>14% ou GHF 2/3
HER2+
HER2 ER- e/ou PR-, HER2+
Triplo negativo/basal símile ER-, PR- e HER2-, e CK14 ou EGFR+
Schnitt SJ, 2010 (50); Consenso de St. Gallen, 2011 (16).
-
4. Material e métodos
63
4.8.4.Positividade para marcadores de CTNs
Foram contadas as células com pelo menos marcação leve em 5 imagens TIFF obtidas das
lâminas virtuais, em campos aleatórios correspondentes a campos de grande aumento
(objetiva virtual de 40X).
4.9. Análise estatística
Este estudo foi experimental descritivo e exploratório. As comparações entre os grupos
(variáveis quantitativas contínuas) foram realizadas por meio do teste t de Student (para
amostras não pareadas). Na avaliação do grau de correlação entre as variáveis biológicas e
marcadores imunoistoquímicos, e diferentes marcadores de CTNs (marcadores entre si)
foram feitos gráficos de dispersão com curva ajustada e regressão linear com o cálculo do r
de Spearman.
-
64
-
5. Resultados
65
Aspectos macroscópicos
Noventa dias após a indução química com o DMBA, todos os animais do grupo
experimental desenvolveram entre 1 a 4 nódulos tumorais, macroscopicamente visíveis, com
diâmetro médio de 2,2 cm (mínimo:0,5 cm; máximo: 3,5 cm). Observou-se bilateralidade e
multicentricidade em 60% e 20% dos animais, respectivamente (Figura 5).
Ao exame macroscópico clínico, as neoplasias mamárias induzidas pelo DMBA neste
protocolo apresentaram evidências de ulceração cutânea (Figura 6) em 30% dos animais. Nem
sempre o fenômeno de ulceração estava associado ao atrito da neoplasia com o solo durante a
deambulação. Na maioria dos casos, erosão/ulceração foram detectadas no primeiro tumor de
cada animal (i.e., na neoplasia de maior velocidade de crescimento). Durante o desenvolvimento
das neoplasias, observou-se em todos os animais algum sinal de síndrome consumptiva (como
por exemplo, consumo de tecido adiposo periférico), por vezes acompanhado de perda do
comportamento de busca ativa de alimentos. Esse quadro foi mais perceptível nos animais com
tumores multicêntricos/ulcerados.
Apesar dos contornos arredondados/ovalados e dos limites precisos (boa delimitação em
relação aos tecidos normais adjacentes), as neoplasias apresentavam-se firmemente aderidas a
esses (i.e., não era possível a enucleação das neoplasias seja durante a remoção necroscópica,
seja durante o exame macroscópico da peça). Não foram observados sinais macroscópicos de
cápsula verdadeira ou pseudocápsula tumoral. Aos cortes, todos os tumores apresentaram
coloração creme/rosada, com áreas necro-hemorrágicas centrais e consistência friável (Figura 7).
Após a realização da necropsia dos animais avaliando cada órgão individualizado, bem
como na análise histológica, não fora detectada nenhuma evidência macro e/ou microscópica de
metástases.
-
5. Resultados
66
Figura 5. Aspectos macroscópicos das neoplasias induzidas pelo DMBA no D90 da indução:
multicentricidade e bilateralidade (vide círculos).
-
5. Resultados
67
Figura 6. Aspectos macroscópicos das neoplasias induzidas pelo DMBA no D90 da indução:
ulceração (seta).
-
5. Resultados
68
Figura 7. Superfície de corte das neoplasias induzidas pelo DMBA no D90 da indução: áreas
necro-hemorrágicas centrais (linha tracejada).
A
-
5. Resultados
69
Achados histomorfológicos (I): características indicativas de comportamento biológico e
tipos histológicos
Do ponto de vista histológico, todas as neoplasias obtidas com o presente protocolo
apresentaram simultaneamente pelo menos 2 características indicativas de malignidade (segundo
os critérios estabelecidos em “Material e Métodos”). Não foram observadas lesões benignas, seja
de natureza hiperplásica (e.g., adenose esclerosante) ou neoplásica (e.g., fibroadenoma). Em
apenas um único caso, foi detectada lesão precursora/pré-maligna (concomitante a lesão maligna,
perifericamente), classificado com um carcinoma ductal in situ dos tipos sólido e cribriforme,
com necrose, grau nuclear 2 (OMS, 2012) (Figura 8).
Quanto ao tipo histológico, foi observado que 68 % das neoplasias induzidas pelo DMBA
eram compostas por mais de uma variante histológica, sendo denominadas “tumores mistos” (de
acordo com os critérios da OMS, 2012). As neoplasias mistas eram caracterizadas por
combinações variadas dos seguintes tipos histológicos: (1) carcinoma ductal invasivo (CDI) sem
outras especificações, (2) tumor filoide (TF), (3) carcinoma papilífero invasivo (CPAP), (4)
carcinoma mioepitelial (CMIO) e (5) carcinoma lobular (CLI) (Figuras 9-13). As Figuras 14 e 15
representam, respectivamente, a frequência desses subtipos histológicos entre os animais do
grupo experimental (ou seja, em que percentagem dos animais cada um dos tipos histológicos
enumerados esteve presente) e a participação percentual de cada variante na composição da
maior neoplasia (i.e., que fração percentual da neoplasia em questão estava comprometida com
determinado tipo histológico). O subtipo histológico mais frequente na amostra foi o CDI.
Dentro dos tumores mistos, o componente predominante também foi representado por
CDI, com uma contribuição média de 70% do tumor misto principal. Cumpre relatar que a
delimitação entre subtipos histológicos de um mesmo tumor misto era quase sempre difícil (i.e.,
a mistura dos componentes histológicos era bastante intrincada, por vezes incluindo zonas
híbridas ou transicionais) e que, em geral, a composição histológica do tumor principal (maior
neoplasia) não diferia significantemente da composição das neoplasias secundárias. Portanto, o
que se descreve para a formação tumoral principal (tumor maior e mais precoce) vale também
para a carga tumoral total (somatório de todos os tumores induzidos).
-
5. Resultados
70
Cerca de 32% da amostra era representada por tumores constituídos de apenas um tipo
histológico (i.e., um componente histológico bem definido ocupando mais de 90% da neoplasia
principal), sendo designados de “tumores puros”. Neste estudo, duas formas principais de
tumores puros foram encontradas: (1) uma representada quase exclusivamente por CDI e (2)
constituída por um tumor bifásico, epitelial-estromal (sendo a porção estromal hipercelular,
atípica e por vezes dotada de focos de necrose). Em função das características do componente
estromal e da má delimitação da lesão, este segundo tipo histológico, foi classificado com um
tumor filóide, histologicamente borderline (Figura 10).
A Tabela 8 apresenta de forma sintética as principais características que permitiram o
diagnóstico das neoplasias dentro dos tipos preconizados pela OMS (2012), bem como os
principais achados que distinguem essas neoplasias murinas de seus correspondentes humanos.
-
5. Resultados
71
Figura 8. Fotomicrografias ilustrativas de focos de carcinoma ductal in situ, grau nuclear 1 (a e b). Hematoxilina-eosina, barras de
escala= 100μm.
-
5. Resultados
72
Figura 9. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma ductal invasivo (a e b). Hematoxilina-eosina, barras de escala= 100μm.
-
5. Resultados
73
Figura 10. Fotomicrografias ilustrativas de tumor filoide (a e b). Hematoxilina-eosina, barras de escala= 100μm..
-
5. Resultados
74
Figura 11. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma papilífero invasivo (a e b). Hematoxilina-eosina, barras de escala= 100μm.
-
5. Resultados
75
Figura 12. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma mioepitelial invasivo (a e b); (a): aspectos morfológicos, (b) imunocoloração
anti-CK14. Hematoxilina-eosina (a) e imunoperoxidase (b), barras de escala= 100μm.
-
5. Resultados
76
Figura 13. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma lobular invasivo (a e b). Hematoxilina-eosina, barras de escala= 100μm.
-
5. Resultados
77
Figura 14. Frequência dos principais tipos histológicos nesta série de tumores induzidos pelo DMBA.
-
5. Resultados
78
Figura 15. Contribuição relativa dos principais tipos histológicos constituintes dos tumores mistos em sua composição histológica.
*Outros: tumor filoide, carcinoma mioepitelial e carcinoma lobular.
-
5. Resultados
79
Tabela 8. Principais características diagnósticas dos tipos histológicos encontrados e principais diferenças em relação ao
correspondente humano.
Tipo histológico Características diagnósticas essenciais Diferenças em relação ao correspondente
humano
Carcinoma ductal invasivo
Estruturas tubuloacinares de aspecto infiltrativo
com atipia citológica variável.
Em áreas, os tumores induzidos pelo DMBA
apresentam justaposição de estruturas tubulares,
resultando em aspecto cribriforme.
Tumor filoide Tumor bifásico, epitelial-estromal, no qual as
principais características atípicas/indicativas de malignidade se concentram no componente
estromal. Estroma hipercelular e mixoide. Aspecto
foliáceo.
Nesta série, foram evidenciados apenas tumores
com características limítrofes de malignidade (tumores borderline). O componente estromal não
apresenta diferenciação heteróloga.
Carcinoma papilífero invasivo Lesões císticas, revestidas internamente por papilas
constituídas por hastes fibrovasculares delgadas e 2
ou mais camadas de células epiteliais atípicas; associadas a componente invasivo papilífero ou do
tipo carcinoma ductal.
-
Carcinoma mioepitelial invasivo Tumor contendo dois componentes principais: um epitelial e um mioepitelial, ambos exibindo
características de malignidade. O componente
mioepitelial como confirmado através da realização de marcadores imunoistoquímicos.
Lesão muito rara na glândula mamária humana (mais frequentemente relatada em glândulas
salivares).
Carcinoma lobular invasivo Neoplasia maligna epitelial constituída por células pequenas, com leve atipia nuclear, exibindo
descoesividade (com células infiltrando de forma
isolada, por vezes, simulando um infiltrado
linfocítico). Presença de infiltração em padrão de fila indiana.
-
-
5. Resultados
80
Após a caracterização dos tipos histológicos, os carcinomas ductais (puros e os
constituintes de tumores mistos) foram graduados de acordo com sistema Nottingham. O sistema
de Nottingham (também referido como sistema de Bloom-Richardson modificado por Elston-
Ellis) visa definir de forma mais objetiva o grau de semelhança histológica entre a neoplasia e
seu correspondente histológico normal - o tecido mamário normal. Os dados referentes à
graduação histológica dos carcinomas ductais invasivos (CDI) induzidos pelo DMBA
encontram-se resumidos na Tabela 9 e ilustrados na Figura 16. De acordo com essa tabela, nota-
se que a grande maioria dos CDIs (83%) são representados por tumores de grau histológico final
1, isto é, neoplasias de bem diferenciadas ou de baixo grau histológico. Esta constatação associa-
se ao fato de que a maioria dos tumores recebeu pontuação baixa (escore 1-2) nos 3 critérios que
definem a graduação: formação tubular, pleomorfismo nuclear e índice mitótico.Assim, observa-
se que a maioria dos carcinomas apresenta-se constituído em mais de 75% de sua extensão por
estruturas tubulo-acinares (78%), apresenta núcleos com pleomorfismo moderado (61%) e baixo
índice mitótico (72%).
Os tumores ainda apresentaram em média 14% de necrose espontânea, conforme ilustrada
na Figura 17.
-
5. Resultados
81
Tabela 9. Graduação histológica aplicada às neoplasias mamárias induzidas pelo DMBA: escores
parciais e grau histológico final.
-
5. Resultados
82
Figura 16. Fotomicrografias ilustrativas de carcinoma ductal invasivo bem diferenciado/grau histológico final 1 (a) e
moderadamente diferenciados/grau histológico final 2 (b). Hematoxilina-eosina, barras de escala= 100μm (a) ou 25 μm (b).
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5. Resultados
83
Figura 17. Fotomicrografias ilustrando a variação na extensão da necrose em neoplasias induzidas pelo DMBA: (a) necrose restrita;
(b) necrose extensa. HE, barra de escala= 500 μm.
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5. Resultados
84
Marcadores prognósticos/preditivos e subtipagem molecular substitutiva
Em relação aos marcadores prognósticos/preditivos (classsicamente utilizados na rotina
diagóstica humana), foram quantificados os seguintes: (1) receptor de estrógeno (RE), receptor
de progesterona (RP) (ambos quantificados segundo a normatização estabelecida p