CONTENIDO Seleccione con una X la modalidad en que va a participar: __X__ Modalidad 1. Proyectos que solicitan recursos hasta por $40.000.000 _____ Modalidad 2. Proyectos que solicitan recursos hasta por $30.000.000 _____ Modalidad 3. Proyectos que solicitan recursos hasta por $20.000.000 _____ Modalidad 4. Proyectos que solicitan recursos hasta por $10.000.000

1. Información general

Título del proyecto: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS AISLAMIENTOS DE Streptococcus agalactiae PROVENIENTES DE LECHERÍAS DEL DEPARTAMENTO DE CALDAS Nombre de la convocatoria en la cual presenta el proyecto: “Convocatoria general para la financiación de proyectos de Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2013” Nombre de los Grupos de Investigación: (registre la información de los grupos que participan) Biología de la Producción Pecuaria Grupo de investigación CERES Nombre del Grupo: Biología de la producción pecuaria Facultad/Instituto/Departamento: Ciencias agropecuarias/Instituto de Biotecnología/ Producción agropecuaria

Clasificación _ reconocido COLCIENCIAS

Tipo de proyecto de I&D: Investigación Básica1: Investigación Aplicable2: Aplicación en curso3: Creación: Innovación Tecnológica4:

Tipo de innovación: Innovación tecnológica de producto Innovación tecnológica de proceso Innovación organizacional Área Estrátegica del Plan de Desarrollo Biotecnología

Artes, Cultura y Humanidades Problemática Social

Salud

Ambiental

No corresponde a ninguna de las áreas estratégicas

INTEGRANTES DEL EQUIPO DE INVESTIGACIÓN (indicar cuál es el investigador responsable con un asterisco)

NOMBRE/TIPO DE VINCULACIÓN EN LA UNIVERSIDAD DE CALDAS

DEPARTAMENTO o PROGRAMA

ÁREA DE CONOCIMIENTO (según anexo 1)

Sandra Bibiana Aguilar Marín*/Docente de planta

Departamento de Producción Agropecuaria

Agronomía, veterinaria y afines

Departamento de Producción Agronomía, veterinaria y

Alejandro Ceballos Márquez/ Docente de planta

Agropecuaria afines

Claudia Gisela Cobo Ángel/Joven investigadora/ Estudiante

Departamento de producción agropecuaria

Agronomía, veterinaria y afines

Estudiante de postgrado Departamento de Producción Agropecuaria

Agronomía, veterinaria y afines

Marcos Muñoz Domon/Externo

Universidad de Concepción (Chile)

Agronomía, veterinaria y afines

Juan Carlos Rodríguez-Lecompte/Externo University of Prince Edward Island

Agronomía, veterinaria y afines

Lugar de Ejecución del Proyecto: Ciudad: Manizales. Departamento: Caldas Presupuesto Valor total del proyecto: $ 124,142,000 Fuentes de financiación: Universidad de Caldas, Universidad de Concepción (Chile), Universidad de la Isla del Principe Eduardo.

Valor solicitado en metálico a la VIP en esta convocatoria: $ 39,800,000

Duración total (meses): 18

2. Resumen ejecutivo

El S. agalactiae es una bacteria Gram positiva, aerobia, clasificada en el grupo B de

Lancefield (GBS), que ocasiona problemas serios en la producción lechera y en la salud

humana. En vacas, esta bacteria es responsable de mastitis clínicas y subclínicas

crónicas que causan altas pérdidas económicas; en cambio en humanos, este patógeno

es responsable de la enfermedad conocida como “sepsis neonatal”, además puede causar

meningitis, abscesos, infecciones urinarias y artritis, causando mortalidades del 15%.

Sin embargo a pesar de la importancia de este patógeno en la medicina humana y

veterinaria, muchos aspectos de la epidemiología de este microorganismo son aún

inciertos, como el interrogante de si existe transmisión interespecies (humanos y

bovinos) y cuál de las especies actúa como reservorio para la otra. El objetivo del

presente proyecto consiste en Caracterizar molecularmente los aislamientos de S.

agalactiae en leche de ganaderías lecheras del departamento de Caldas mediante MLST,

lo que permitirá estandarizar y validar la técnica para la genotipificación de aislamientos

de S. agalactiae en el laboratorio de calidad de leche de la Universidad de Caldas; así

como establecer el origen intrapredial de las cepas de S. agalactiae aisladas en lecherías

de Caldas; determinar las eventuales diferencias genotípicas en las cepas de S.

agalactiae aisladas con patrones positivos de mujeres; establecer la asociación entre el

recuento de células somáticas y los eventuales genotipos de S. agalactiae aislados de las

vacas provenientes de las lecherías seleccionadas para el estudio, y evaluar la asociación

entre la presencia de las diferentes cepas de S. agalactiae con los diferentes factores de

riesgo para la infección por este patógeno. Para esto, se utilizarán 150 aislados de S.

agalactiae, provenientes de 50 vacas de fincas previamente diagnosticadas con esta

bacteria, y se cultivará la leche de estos animales para aislar el patógeno. Estos asilados

serán sometidos a la prueba de MLST, la cual se hará mediante PCR múltiple con siete

genes Housekeeping y posteriormente se realizará secuenciación en Cornell Uneversity.

El patrón positivo humano, será obtenido por un centro médico de la ciudad quien

enviará el aislado al laboratorio de calidad de leche de la Universidad de Caldas para

someterlo al MLST. De otra parte, se medirá en leche el recuento de células somáticas y

se realizará una encuesta de factores de riesgo en cada finca seleccionada para el

estudio. Los datos serán analizados mediante un modelo de regresión múltiple, fijando

como significativo un valor de p<0,05. Los resultados de esta investigación aportarán al

conocimiento de la epidemiología molecular del S. agalactiae, permitirá identificar las

cepas prevalentes de este microorganismo en algunas lecherías de Caldas, así como el

origen de las mismas (bovino o humano), los factores de riesgo y la relación entre las

diferentes cepas con el recuento de células somáticas. Lo que se traducirá en mejor

calidad de leche, mejor productividad y competitividad del sector lácteo de la región,

disminuyendo el riesgo potencial para la salud pública.

Conformación y trayectoria del equipo de investigadores

Sandra Bibiana Aguilar Marín: M.Sc., en Biotecnología Vegetal de la Universidad

Tecnológica de Pereira, 2006. Desde su vinculación a la Facultad de Ciencias

Agropecuarias en el 2009, ha liderado y ejecutado proyectos de investigación enfocados

al desarrollo de protocolos de micropropagación y embriogénesis somática en varias

especies vegetales. En el área de Biología molecular, ha realizado estudios de diversidad

genética en plantas de Rubus spp. (moras), Cacao spp. (cacao) y Tomate cherry, y ha

desarrollado métodos de diagnóstico viral en Solanum tuberosum (papa) y Fasciola

hepática a partir de técnicas moleculares y serológicas, así como de sexaje molecular en

Psitácidos. Los resultados de estas investigaciones han sido publicados en revistas

internacionales homologadas y nacionales indexadas en Colciencias.

Publicaciones:

Sandra Bibiana Aguilar Marín, German Ariel Lopez Gartner, Fredy Arvey Rivera Paez,

“Caracterización molecular de clones de Theobroma cacao L., por medio de marcadores

moleculares Microsatélites.” Revista Luna Azul ISSN: 0122-5391 ed: v.32 fasc. P.52 –

60 ,2011.

Sandra Bibiana Aguilar Marín, Marta Leonor Marulanda, Ana Maria Lopez, “Genetic

diversity of wild and cultivated Rubus species in Colombia using AFLP and SSR

markers”. Crop Breeding And Applied Biotechnology ISSN: 1518-7853 ed: v.7 fasc.

P.242 – 252 ,2007.

Sandra Bibiana Aguilar Marín, “Caracterización molecular de Rubus spp., en el Eje

Cafetero. Colombia.”. Actualidades Biológicas. ISSN: 0304-3584. ed: Universidad De

Antioquia. V. 29 fasc.1 p.111 – 111, 2007.

Alejandro Ceballos Márquez: M.V.Z. Universidad de Caldas; Magister en salud

animal de la Universidad Austral de Chile; PhD en Atlantic Veterinary College;

Postdoctorado en Cornell Uneversity. Ha participado en diversos proyectos de

investigación y extensión relacionados con la mastitis y la calidad de la leche. Además

ha liderado el montaje del laboratorio de calidad de leche de la Universidad de Caldas.

Publicaciones:

Ceballos Márquez, A.; Kruze, J. Barkema, H.; Dohoo, I.; Sanchez, J. Uribe, D.;

Wichtel, J.J.; Wittwer, F. “Barium selenite supplementation and its effect on

intramammary infection in pasture-based dairy cows”. Journal Of Dairy Science ISSN:

0022-0302. V.93. p.1468-1477, 2010.

Ceballos Márquez, A.; Barkema, H.; Stryhn, H.; Dohoo, I.; Keefe, G.; Wichtel, J.J.

“Milk Selenium Concentration and its Association with Udder Health in Atlantic

Canadian Dairy Herds”. Journal Of Dairy Science ISSN: 0022-0302. V.93. p.4700-

4709, 2010.

Ceballos Márquez, A.; Barkema, H.; Stryhn, H.; Wichtel, J.J. Neumann, J.; Mella, A.

Kruze, J.; Espindola, S.; Wittwer, F. “The effect of selenium supplementation before

calving on early-lactation udder health in pastured dairy heifers”. Journal Of Dairy

Science ISSN: 0022-0302 v.93 p.4602-4612, 2010.

En Libro: Ceballos Márquez, A.; López benavides, M.; Rauch, B.J.; Schukken, Y.H.

“Efficacy of Teat Dips Based on Naturally Occurring New Intramammary Infections

and Somatic Cell Count” Udder Health And Communication. ISBN: 9789086861859.

P.337-342, 2011.

En Libro: Gutiérrez Solano, C.; Ceballos Márquez, A.; Schukken, Y.H. “Bilingual

Trainings for Milkers in New York State: A Success for Quality Milk” Udder Health

And Communication. ISBN: 9789086861859. P.191-196, 2011.

Claudia Gisela Cobo Ángel M. V.Z. Magíster en ciencias veterinarias, con énfasis en

salud pública y epidemiología, actualmente se desempeña como joven investigadora e

innovadora de Colciencias en el grupo de investigación en biología de la producción

pecuaria.

Publicaciones:

Romero Peñuela, M.; González Gordon, L.M.; Cobo Ángel, C.G. “evaluación del

bienestar animal por medio de indicadores conductuales durante el sacrificio de

bovinos”. Revista Luna Azul issn: 1909-2474 centro editorial universidad de caldas

V.35 p.48 – 59, 2012.

Cobo Ángel, C.G. “Indicadores conductuales de bienestar animal durante el

presacrificio bovino”. Veterinaria Y Zootecnia ISSN: 2011-5415 Centro Editorial

Universidad De Caldas, V.6 fasc.2 p.112 – 124, 2012.

Cobo Ángel, C.G.; Romero Peñuela, M. “importancia de la interacción hombre-animal

durante el presacrificio bovino: revisión”. Biosalud: Revista De Ciencias Básicas ISSN:

1657-9550 Centro Editorial De La Universidad De Caldas v.11 fasc.2 p.79 – 91, 2012.

Juan Carlos Rodríguez-Lecompte: MVZ de la Universidad de Caldas; magíster en

microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana; PhD virología molecular,

University Of Prince Edward Island. Postdoctorado McMaster University. Actualmente

trabaja en proyectos relacionados con la respuesta inmune de la glándula mamaria.

Publicaciones:

Rey MR, Undi M, Rodríguez-Lecompte J.C, Joseph T, Morrison J, Yitbarek A,

Wittenberg KM, Tremblay R, and Ominski KH. 2013. A study of the effectiveness of a

needle-free injection device compared with a needle and syringe used to vaccinate

calves against bovine viral diarrhea and infectious bovine rhinotracheitis viruses. The

Veterinary Journal, on line Sep.4/2013 (In press). 2013.

Rodríguez-Lecompte J.C, Romero-Perez G.A, Ramírez-Yañez G, Ask K, and Gauldie

J. Adenoviral-mediated gene transfer into bone marrow: an effective surgical technique

in rat. European Surgical Research. 50 (2-4):282-291. 2013.

A Yitbarek, J C Rodríguez-Lecompte, H M Echeverry, P Munyaka, N Barjesteh, S

Sharif, G Camelo-Jaimes. Performance, histomorphology, and Toll-like receptor,

chemokine, and cytokine profile locally and systemically in broiler chickens fed diets

supplemented with yeast-derived macromolecules. Poultry Science. 92(9): 2299-310.

2013.

Marcos Muñoz Domon: Médico Veterinario, PHD en Animal Science (Cornell

University, USA, 2008. Es responsable de la docencia en Producción de Leche y

Tecnología y Calidad de Leche para estudiantes de pregrado de la carrera de Medicina

Veterinaria. Participa también en la docencia de postgrado en los programas de

Magíster en Ciencias Veterinarias mención Inocuidad de Alimentos y en el Programa de

Doctorado en Ciencias Veterinarias. Ha participado en investigaciones relacionadas con

la epidemiología molecular de varios patógenos mamarios.

Publicaciones:

R. N. Zadoks, H. M. Griffiths, M. A. Munoz, C. Ahlstrom, G. J. Bennett, E. Thomas,

and Y. H. Schukken. 2011. Sources of Klebsiella and Raoultella species on dairy farms:

Be careful where you walk. J. Dairy Sci. 92: 1045-1051.

Munoz, M. A., G. Bennett, C. Ahlstrom, H. Griffiths, Y. H. Schukken, and R. N.

Zadoks. 2008. Cleanliness scores as indicator of Klebsiella exposure in dairy cows. J.

Dairy Sci. 91: 3908-3916.

Dopfer, D., W. Buist, Y. Soyer, M. A. Munoz, R. N. Zadoks, L. Geue, and B. Engel.

2008. Assessing genetic heterogeneity within bacterial species isolated from

gastrointestinal and environmental samples: how many isolates does it take? Appl.

Environ. Microbiol. 74: 3490-3496.

Munoz, M. A., F. L. Welcome, Y. H. Schukken, and R. N. Zadoks. 2007. Molecular

epidemiology of two Klebsiella pneumoniae mastitis outbreaks on a dairy farm in New

York State. J. Clin. Microbiol. 45:3964-3971.

4. Descripción del proyecto

4.1 Planteamiento de la pregunta o problema de investigación y su justificación

La mastitis bovina constituye una de las enfermedades que afecta la calidad y la

cantidad de leche alrededor del mundo (Ceballos-Márquez et al., 2010). Esta

enfermedad es causante de pérdidas económicas significativas, debido a la disminución

en la producción, los descartes de leche, las asesorías y los tratamientos veterinarios, los

descartes tempranos de las vacas y el aumento del recuento de células somáticas (RCS)

(Keefe, 1997). Se ha señalado que el costo de un caso de mastitis varía entre 164€ y

235€ por vaca al año (Huijps et al., 2008; Huijps et al., 2009). Así mismo, la mastitis

clínica y subclínica, producen cambios composicionales en la leche que se traducen en

un menor valor nutricional, dificultad en el procesamiento, menor vida útil y cambios en

el sabor (Keefe, 1997).

Actualmente, el S. agalactiae, constituye uno de los patógenos de mayor prevalencia en

los tanques de enfriamiento lechero de Colombia. Estudios previos han reportado que

más del 40% de los tanques evaluados en el país son positivos para la presencia de esta

bacteria (Keefe et al., 2010; Calderón et al., 2011). Sin embargo la elevada prevalencia

de S. agalactiae no solo acarrea problemas en la industria lechera, sino que también

afecta la salud pública desde varios aspectos, ya que este agente es la principal causa de

severas infecciones y muertes neonatales debido a la enfermedad conocida como “sepsis

neonatal” (Spratt, 2011). De igual manera, este patógeno afecta a las personas adultas

con enfermedades tales como meningitis, septicemia, abscesos subcutáneos e

infecciones del tracto urinario y artritis (Chaiwarith et al., 2011), llegando a causar tasas

de mortalidad aproximadas del 15% en países desarrollados (Lamberten et al., 2004;

Phares et al., 2005; Pereira et al., 2010).

Pese a los riesgos en la salud pública que puede acarrear el consumo de leche cruda, en

Colombia el 51% de la leche se comercializa de esta manera en mercados informales

(Conpes, 3576). Previas investigaciones han reportado prevalencias de S. agalactiae

entre el 20 y el 50% en tanques de enfriamiento lechero. Sin embargo, no se ha

establecido la tipificación de estos aislamientos, la fuente del patógeno, los factores de

riesgo para su presencia, la trasmisión o el reservorio principal de este patógeno en las

producciones lecheras (Keefe et al., 2010b). Esto es debido a que el estudio de la

epidemiología molecular de este patógeno ha estado ligado primordialmente a la

medicina humana, más que a la medicina veterinaria (Zadoks et al., 2011). Sin embargo,

uno de los mayores interrogantes en la epidemiología molecular de S. agalactiae, es

determinar si la transmisión interespecies ocurre (i.e. entre humanos y bovinos) y cuál

de estas especies actúa como reservorio (Manning et al., 2009; Zadoks et al., 2011).

Recientemente nuevos interrogantes han surgido respecto al fenómeno observado en

países como Dinamarca, donde la infección por S. agalactiae, se ha convertido en una

enfermedad re-emergente (Zadoks et al., 2011 ). En la década de los 80 y los 90 se había

logrado reducir la prevalencia de este patógeno hasta el 2%, gracias a esfuerzos

sistemáticos de control (Andersen et al., 2003). Pero desde el año 2000, la prevalencia

ha venido incrementándose progresivamente, hasta el punto que en el 2009 se reportó

que el 28% de los hatos eran positivos para esta bacteria, incluyendo su positividad para

cepas de origen humano (Katholm et al., 2009). Sin embargo, es desconocido el cómo y

el por qué emergió este patógeno con una prevalencia tan alta, lo cual puede

relacionarse con cambios en la virulencia o adaptabilidad, lo que requiere mayor

investigación (Zadoks et al., 2011).

Por lo anterior, la clasificación y caracterización molecular del S. agalactiae aislado de

muestras de leche cruda, ayudaría a ampliar el conocimiento acerca de aspectos

importantes en la biología, virulencia, epidemiología y transmisión de este

microorganismo. Así mismo, brindará información acerca de cuáles factores de riesgo

se encuentran asociados con la positividad a las diferentes cepas de S. agalactiae en los

tanques lecheros, contribuyendo a establecer planes de prevención y control para este

patógeno, lo que sin duda impactará en la salud pública, en la rentabilidad y

competitividad del sector lácteo regional y colombiano.

4.2 Marco Teórico

El S. agalactiae es un coco Gram positivo aerobio, encapsulado, β-hemolítico,

clasificado dentro del grupo B de Lancefield (Lancefield, 1934). Este microorganismo

es intramamario obligado, ya que generalmente no sobrevive por largos períodos fuera

de la glándula mamaria, tiene la habilidad de adherirse al epitelio de la glándula

mamaria y de adaptarse al microambiente específico de la ubre para reproducirse en la

misma (Keefe, 1997).

El S. agalactiae es responsable en bovinos, de mastitis subclínicas crónicas y altamente

contagiosas, que difícilmente pueden curarse en forma espontánea, con aumentos

moderados en el conteo de células somáticas. Debido a que este patógeno ocasiona

mastitis subclínicas, los animales pueden pasar largos períodos de tiempo sin ser

diagnosticados, actuando como reservorio de la infección, ya que no son sometidos a

tratamiento, segregación o sacrificio. El principal método de transmisión de esta

bacteria es por contacto entre cuartos susceptibles y cuartos contaminados, por medio de

equipos o las manos del operario; por lo tanto el ordeño es el momento de mayor riesgo

para adquirir la infección (Keefe, 2012).

Por otro lado, el S. agalactiae adquiere un nivel de importancia en salud pública, ya que

coloniza fácilmente la región anorrectal y el tracto genitourinario de las mujeres, con

mayor frecuencia en aquéllas gestantes. El neonato se infecta con este patógeno al pasar

por el canal del parto, por infección intrauterina o por adquisición nosocomial postparto,

adquiriendo la enfermedad conocida como septicemia neonatal (Montibello et al.,

2011). En mujeres, este patógeno puede causar abscesos y mastitis durante la lactancia,

lo cual es un factor de riesgo para la presentación de este patógeno en la infancia del

lactante (Dinger et al., 2002). En adultos, la infección por S. agalactiae suele

presentarse de manera asintomática. Sin embargo, puede generar infecciones en el tracto

genitourinario y tejidos blandos enfermedades severas como neumonía, bacteriemia,

artritis y meningitis (Delannoy et al., 2013).

Diversos estudios han sugerido que es probable que exista una transmisión interespecie

de S. agalactiae, ya que se ha encontrado este microorganismo de origen humano

adherido a las células epiteliales de la glándula mamaria del bovino causando la

infección (Martínez et al., 2000; Bohnsack et al., 2004; Reyes et al., 2013 proyecto

Juan). Así mismo, se ha considerado la hipótesis que indica que las cepas humanas

evolucionaron de cepas bovinas, debido a que estas cepas se encuentran conectadas por

medio de dos variantes de un único locus (Bisharat et al., 2004).

A pesar de la similitud entre las cepas humanas y bovinas, estudios recientes han

identificado que estas cepas pertenecen a dos subtipos diferentes, sugiriendo que la cepa

humana no es una variante de la bovina, sino que son poblaciones diferentes (Brochet et

al., 2006). Pese a lo anterior, la cepa más frecuente en los humanos sigue siendo

encontrada en bovinos, perros, cocodrilos y mamíferos acuáticos (Zadoks y Shukken,

2006). Otros reportes han sugerido que sí es posible la transmisión interespecies, pero

esta es de rara ocurrencia (Sukhnanand et al., 2005; Reyes et al., 2013).

A finales del año 2006, se publicó la secuenciación completa del genoma de una de las

cepas del S. agalactiae de origen bovino (ST67), lo cual permitió compararlo con

genomas de cepas de origen humano, revelándose ocho nuevas islas genómicas que

probablemente fueron adquiridas por transmisión horizontal de genes (Richards et al.,

2011). Entre estas islas genómicas se incluyen los operones de lactosa y fructosa para

las cepas bovinas y humanas respectivamente, los cuales determinan las diferencias en

el uso de la lactosa, azúcar que es metabolizada por las cepas de origen bovino

(Richards et al., 2011). No obstante, Sorensen y colaboradores (2010) reportaron que el

13% de los aislamientos de S. agalactiae de origen humano fermentaba lactosa. Este

hallazgo hizo retomar la discusión acerca del vínculo de las cepas humanas y bovinas.

Es evidente, que existen vacíos en el conocimiento epidemiológico del S. agalatiae.

Estos interrogantes asociados a la epidemiología de las cepas de un mismo

microorganismo, están siendo abordados por la epidemiología molecular. La cual es una

rama de la epidemiología que estudia la distribución y los determinantes de salud y de

enfermedad a través del uso de técnicas moleculares (Riley, 2004). No obstante, el

objetivo de la epidemiología molecular no sólo es clasificar los organismos por su

taxonomía o sus grupos filogenéticos, sino que además identifica las fuentes, las

relaciones biológicas, las rutas de transmisión, los genes responsables de la virulencia,

resistencia y los antígenos de importancia para el desarrollo de vacunas de los

organismos patógenos (Zadoks y Shukken, 2006).

Para el estudio de la epidemiología molecular del S. agalactiae, numerosos métodos

moleculares han sido utilizados, incluyendo métodos comparativos como la

electroforesis en campo pulsado (PFGE), el cual es adecuado para realizar

investigaciones de brotes de la enfermedad (Wang et al., 2010). Sin embargo, cuando se

trata de análisis genéticos de poblaciones altamente estandarizadas, como es el caso del

S. agalactiae, es preferible utilizar técnicas tipo librería como el caso del Multi-locus

Sequence Typing (MLST) (Jolley et al., 2005), este es un método preciso basado en la

secuenciación de una serie de genes altamente conservados o “housekeeping”, que

codifican para funciones esenciales de la célula. EL ADN de estos genes es tan

conservado, que un cambioen el mismo, pondría en riesgo la sobrevivencia de la célula

bacteriana. La identificación de las cepas por medio de este método, incluye en algunos

casos, la identificación adicional de genes de virulencia, de resistencia, del metabolismo

o de respuesta al estrés

El MLST, tiene un alto poder discriminatorio, permitiendo identificar las diferencias

genotípicas entre aislados, con el fin de diferenciar las cepas del mismo patógeno

(Zadoks y Shukken, 2006), las bases de datos resultantes de la tipificación de las cepas

en diferentes lugares del mundo se encuentran en línea (www.mlst.net), permitiendo

estudiar la evolución de las cepas y monitorear su estado en diferentes aislados de una

misma bacteria (Alcaine et al., 2005).

El estudio de la epidemiología molecular de S. agalctiae, incluyendo su evolución y la

diferenciación de las cepas aisladas, tiene importancia para esclarecer cuáles son los

reservorios, los métodos de transmisión y de virulencia. Con lo cual se puede prevenir y

controlar los brotes de las enfermedades asociadas a este patógeno tanto en humanos

como en bovinos (Hillerton, 2004; Zadoks y Shukken, 2006). Este estudio también

permitiría desarrollar pruebas piloto que permitan conocer mejor los mecanismos de

transmisión del patógeno tanto intra como interespecies y daría pie para el desarrollo de

investigaciones posteriores que permitan involucrar no solamente hembras bovinas sino

que adicionalmente identificar mujeres gestantes que puedan potencialmente poner en

riesgo la salud del bebé.

4.3 Objetivos

Objetivo general

Caracterizar molecularmente los aislamientos de S. agalactiae en leche de ganaderías

lecheras del departamento de Caldas, seleccionadas sobre la base de su positividad a la

bacteria y al RCS.

Objetivos específicos

• Estandarizar y validar la técnica de MLST para la genotipificación de

aislamientos de S. agalactiae de origen bovino en lecherías de Caldas.

• Establecer el origen intrapredial de las cepas de S. agalactiae aisladas en

lecherías de Caldas seleccionadas sobre la base de su RCS y positividad a la

bacteria

• Determinar las eventuales diferencias genotípicas en las cepas de S. agalactiae

de origen bovino con patrones positivos obtenidos de pruebas de tamizaje en

mujeres embarazadas.

• Establecer la asociación entre el recuento de células somáticas y los eventuales

genotipos de S. agalactiae aislados de las vacas provenientes de las lecherías

seleccionadas para el estudio.

• Evaluar la asociación entre la presencia de las diferentes cepas de S. agalactiae

con los diferentes factores de riesgo para la infección por este patógeno.

4.4 Metodología propuesta

El presente trabajo corresponde a un estudio observacional de tipo transversal, que será

llevado a cabo en lecherías ubicadas en el departamento de Caldas, las cuales serán

seleccionadas de acuerdo al historial de mastitis causadas por S. agalactiae y al recuento

de células somáticas en el tanque.

Tamaño muestral

Según la sugerencia hecha por Dopfer et al (2008), el tamaño de la muestra para análisis

moleculares puede fluctuar entre dos y 20 aislados de cada bacteria para asegurar con un

95% de certeza que es posible establecer la heterogeneidad entre los aislados. No

obstante, estos mismos autores indican que el número de aislados analizados puede

variar por conveniencia o por el presupuesto del estudio. Por lo anterior, en esta

investigación se consideraran 150 aislados obtenidos de 50 vacas de las lecherías

seleccionadas.

Aislamiento del S. agalactiae en leche

En las fincas seleccionadas se tomarán dos muestras de leche de 30 mL de cada animal,

en frascos estériles. La punta de cada pezón será limpiada y desinfectada mediante la

aplicación de una gasa con alcohol. Las muestras serán transportadas al laboratorio de

calidad de leche de la Universidad de Caldas bajo condiciones de refrigeración.

Posteriormente, se cultivarán las muestras directamente en agar sangre con esculina

mediante un esparcidor T y se incubarán 24 horas a 35°C. Las cepas serán identificadas

con base a su morfología y hemólisis. Las colonias sospechosas de Streptococcus

agalactiae, serán confirmadas fenotípicamente mediante una reacción de CAMP.

(Hogan et al., 1999; Keefe et al., 2010).

Multilocus sequence typing (MLST)

Extracción de ADN, verificación de la calidad y concentración

La extracción de ADN de las cepas positivas de S. agalactiae obtenidas de los tanques

de leche y posteriormente cultivadas, se realizará mediante el kit de extracción DNA

Bacterial UltraClean® de Mobio, USA; según las recomendaciones del fabricante. La

calidad del ADN se verificará en geles de agarosa teñidos con bromuro de ethidio y

visualizados mediante luz ultravioleta. Para la verificación de la relación del radio a una

absorbancia entre 260/280 nm, las muestras se leerán en un nanodrop (Termo Fisher,

USA).

Amplificación y purificación de los productos

Las reacciones de amplificación se realizarán mediante PCR multiplex con los siete

genes Housekeeping, tal cual como se plantea para la técnica MLST según Sukhnanand

et al (2005); las secuencias de estos genes, citados en la Tabla 1, han sido tomados del

sitio web para el MLST: http://pubmlst.org/sagalactiae/. La purificación de los

amplicones se llevará a cabo según las recomendaciones del BioResource Center en la

Universidad de Cornell, Estados Unidos, en donde serán finalmente secuenciadas.

Tabla 1. Iniciadores para GBS MLST, Jolley et al., 2004

Locus Forward (5' to 3') Reverse (5' to 3') Amplicon size (bp) adhP amplification GTTGGTCATGGTGAAGCACT ACTGTACCTCCAGCACGAAC 672

Sequencing GGTGTGTGCCATACTGATTT ACAGCAGTCACAACCACTCC 498 pheS amplification GATTAAGGAGTAGTGGCACG TTGAGATCGCCCATTGAAAT 723

Sequencing ATATCAACTCAAGAAAAGCT TGATGGAATTGATGGCTATG 501 atr amplification CGATTCTCTCAGCTTTGTTA AAGAAATCTCTTGTGCGGAT 627

Sequencing ATGGTTGAGCCAATTATTTC CCTTGCTCAACAATAATGCC 501 glnA amplification CCGGCTACAGATGAACAATT CTGATAATTGCCATTCCACG 589

Sequencing AATAAAGCAATGTTTGATGG GCATTGTTCCCTTCATTATC 498 sdhA amplification AGAGCAAGCTAATAGCCAAC ATATCAGCAGCAACAAGTGC 646

Sequencing AACATAGCAGAGCTCATGAT GGGACTTCAACTAAACCTGC 519 glcK amplification CTCGGAGGAACGACCATTAA CTTGTAACAGTATCACCGTT 607

Sequencing GGTATCTTGACGCTTGAGGG ATCGCTGCTTTAATGGCAGA 459 tkt amplification CCAGGCTTTGATTTAGTTGA AATAGCTTGTTGGCTTGAAA 859

Sequencing ACACTTCATGGTGATGGTTG TGACCTAGGTCATGAGCTTT 480 Análisis del MLST

Análisis de las secuencias de ADN

La alineación de las secuencias de los siete genes Housekeeping, se realizará usando el

Clustal W algorithm en MegAlign (DNAStar). Los datos serán usados por eBURST

(http:// eburst.mlst.net/)

Análisis de los datos arrojados por MLST

El software TOPAL, se usará para hallar evidencias de eventos de recombinación

intragénica. El árbol filogenético se obtendrá mediante el método de Neighbor-joining a

través de los programas SEQBOOT, DNAPARS, CONSENSE y DRAWTREE de

PHYLIP, mediante el Mega software; empleado para organizar las relaciones más

cercanas de los tipos alélicos de los siete genes Hosekeeping al interior del grupo. Para

determinar el poder de discriminación del método de subtipificación empleado, se

calculará el índice de discriminación de Simpson`s (SID). Para comparar las

distribuciones de frecuencia de cada uno de las agrupaciones en los siete genes

Housekeeping para cepas humanas y bovinas, se realizará una prueba de independencia

X2, usando el programa estadístico SAS; SAS Institute, Cary, N.C.

Aislamiento de la cepa de origen humano

Se contactarán hospitales, centros médicos y laboratorios del eje cafetero que realicen

citologías vaginales con el objetivo de que informen al laboratorio de calidad de leche

de la Universidad de Caldas acerca de los aislamientos de S. agalactie. La cepa

encontrada será conservada en microviales con glicerol y enviada al laboratorio con el

fin de ser confirmada molecularmente, mediante MLST.

Recuento de células somáticas (RCS)

A una de las muestras de leche se le adicionará dicromato de potasio para conservar las

propiedades de la leche. El RCS, se realizará utilizando la técnica de la citometría de

flujo en disco con coloración del ADN de los leucocitos en la muestra de leche,

realizado por un contador de células portátil y automatizado (DCC DeLaval®. DeLaval,

Tumba, Suecia).

Evaluación de los factores de riesgo

En las lecherías del estudio se aplicará una encuesta diseñada para colectar información

con respecto a los procedimientos y rutina de ordeño, bioseguridad en el rebaño,

tratamiento de mastitis, manejo y funcionamiento del equipo de ordeño e higiene

general de las vacas y los pezones.

Análisis estadístico

Se realizarán bases de datos en el programa EpiData Entry, Versión 3.1 (EpiData

Association, Odense, Dinamarca), las cuales serán exportadas al programa STATA

Versión 12.1 (StataCorp. College Station, TX, Estados Unidos). La asociación entre las

variables será evaluada inicialmente mediante regresión lineal o regresión logística

según corresponda. Aquellas variables asociadas (P≤0,15) serán incluidas

posteriormente en un modelo mutivariado removiendo aquellas no significativas

mediante eliminación de paso atrás (backward elimination), fijando como significante

un valor P<0,05. El ajuste de los modelos estadísticos será evaluado mediante la prueba

de Hosmer y Lemeshow (Dohoo et al., 2009; Elmoslemany et al., 2009a).

4.5 Resultados esperados

Generación de conocimiento

Los resultados de esta investigación aportarán al conocimiento de la epidemiología

molecular del S. agalactiae, permitirá identificar las cepas prevalentes de este

microorganismo en algunas lecherías de Manizales, así como el origen de las mismas

(bovino o humano). Así mismo, este estudio permitirá comparar las diferencias en las

cepas aisladas en lecherías y será la base para estudios posteriores involucrando

aislamientos de origen humano, lo que permitirá establecer en un futuro las diferencias

genotípicas existentes.

Adicionalmente, la presente investigación identificará cuáles son los factores de riesgo

existentes en las lecherías del triángulo del café para la presentación de las diferentes

cepas de S. agalactiae en el tanque de leche y se establecerá cuáles de ellas ocasionan

mayores recuentos de células somáticas en el tanque de leche.

Fortalecimiento de la comunidad científica

La ejecución de este proyecto permitirá estandarizar y validar la técnica de MLST para

la caracterización molecular del S. agalactiae en el laboratorio de calidad de leche de la

Universidad de Caldas, el cual será pionero en esta técnica, ya que no está siendo

realizada en ningún laboratorio del país.

De otra parte, este proyecto fortalecerá los vínculos internacionales de la Universidad de

Caldas, debido a que este estudio se realizará en cooperación con la Universidad Isla

Príncipe Eduardo (Canadá) y la Universidad de Concepción (Chile). Así mismo, se

formará un estudiante de doctorado y se capacitarán dos integrantes del grupo de

investigación en biología de la producción pecuaria y ASPA en el diagnóstico

molecular de S. agalactiae.

Apropiación social/pública del conocimiento

Los resultados de esta investigación serán divulgados a la comunidad científica

mediante la publicación de un artículo en revista de alto impacto (A1) y mediante la

participación en un evento científico en el área.

Adicionalmente, se divulgarán los resultados en las centrales lecheras más importantes

de la región, así como con la comunidad médica.

4.6 Impactos esperados a partir del uso de los resultados

La estandarización de la técnica de MLST para identificar las cepas del S. agalactiae,

fortalecerá la capacidad técnica y diagnóstica del laboratorio de calidad de leche de la

Universidad de Caldas, el cual se convertirá en un laboratorio de referencia en el país.

Además se podrá prestar el servicio de diagnóstico molecular de este patógeno a

investigadores y profesionales de las ciencias de la salud y de la medicina veterinaria.

De otra parte, el reconocimiento del origen de las cepas de S. agalactiae encontradas en

las lecherías de la región, ayudará a establecer planes de prevención y control más

específicos de este microorganismo, debido a que se podrá establecer la fuente, y así

intervenir en su ciclo epidemiológico. Lo que se traducirá en mejor calidad de leche,

mejor productividad y competitividad del sector lácteo de la región, disminuyendo el

riesgo potencial para la salud pública.

La integración con centrales lecheras del país e investigadores reconocidos

internacionalmente en el área, fortalecerá la relación entre la academia y la industria, lo

cual permitirá la divulgación de resultados para los productores y la oportunidad de

implementar técnicas que permitan producir leche con mayor inocuidad y calidad de la

mano de los avances científicos realizados en las condiciones reales de los productores.

De igual manera, este proyecto será clave para investigaciones futuras en el área y

referente para el uso de técnicas diagnósticas moleculares para S. agalactiae.

4.7 Cronograma de actividades:

ACTIVIDADES MESES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Revisión de literatura

Entrenamiento en técnicas de laboratorio

Prueba piloto

Toma de muestras de leche

Análisis de laboratorio de las muestras

Elaboración de bases de datos

Análisis de la información

Elaboración de informes

Elaboración de artículos científicos

5. Compromisos

Los investigadores del presente proyecto se comprometen con una publicación científica

en una revista indexada u homologada por Colciencias en categoría A1.

6. Bibliografía

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PRESUPUESTO TOTAL *

RUBROS

FUENTES

TOTAL UNIVERSIDAD DE

CALDAS FINANCIACIÓN

EXTERNA RECURRENTE

[1] Solicitado a

V.I.P RECURRENTE RECURSOS FRESCOS

1. SERVICIOS PERSONALES 33,417,000 0 45,000,000 4,900,000 83,317,000 1.1. Investigadores 33,417,000 0 45,000,000 4,900,000 83,317,000 1.2. Auxiliares 0 0 0 0 0 2. GASTOS GENERALES 0 39,800,000 0 0 39,800,000 2.1. Servicios técnicos 0 21,000,000 0 0 21,000,000 2.1.2. Pruebas técnicas 0 21,000,000 0 0 21,000,000 2.2. Materiales e insumos 0 13,800,000 0 0 13,800,000 2.2.1. De campo 0 1,000,000 0 0 1,000,000 2.2.2. De oficina (papel, tinta, fotocopias) 0 300,000 0 0 300,000

2.2.3. De laboratorio 0 12,500,000 0 0 12,500,000 2.3. Apoyo económico para gastos de viaje 0 5,000,000 0 0 5,000,000

2.3.1. Tiquetes aéreos 0 2,000,000 0 0 2,000,000 2.3.3. Gastos de viaje (gasolina y peajes) 0 700,000 0 0 700,000

2.3.4. Auxilio para viaje 0 300,000 0 0 300,000 2.3.5. Apoyo económico para alojamiento y alimentación [2] 0 2,000,000 0 0 2,000,000

SUB-TOTAL 33,417,000 39,800,000 45,000,000 4,900,000 123,117,000 ADMINISTRACIÓN, 20% 0 0 0 1,025,000 1,025,000 TOTAL 33,417,000 39,800,000 45,000,000 5,925,000 124,142,000 PORCENTAJE DE FUENTES 26.9% 32.1% 36.2% 4.8% 100.0%