caracterizaciÓn preliminar de eichhornia crassipes y

CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE Eichhornia crassipes Y APROXIMACIÓN A SU ACTIVIDAD BIOLÓGICA CONTRA LARVAS

DE Culex quinquefasciatus

SILVIA RIVERA

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BOGOTÁ D. C. Julio de 2005

CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR DE Eichhornia crassipes Y APROXIMACIÓN A SU ACTIVIDAD BIOLÓGICA CONTRA LARVAS

DE Culex quinquefasciatus

SILVIA RIVERA

Trabajo de grado para optar al título de Microbióloga

Director JENNY DUSSAN GARZÓN

M.Sc. Microbióloga

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BOGOTÁ D. C. Julio de 2005

CONTENIDO

Pág. RESUMEN 1 INTRODUCCIÓN 2 1. OBJETIVOS 3 2. JUSTIFICACIÓN 4 3. MARCO TEÓRICO 5 3.1 Culex spp. 5 3.1.1 Clasificación taxonómica 5 3.1.2 Generalidades 5 3.1.3 Ciclo de vida 5 3.1.4 Importancia como vectores 7 3.2 Eichhornia crassipes 8 3.2.1 Clasificación taxonómica 8 3.2.2 Generalidades 8 3.2.3 Efecto de las infestaciones sobre el ecosistema e importancia sanitaria 9 3.2.4 Reportes de estudios fitoquímicos para E. crassipes 10 4. MARCO CONTEXTUAL 11 5. METODOLOGÍA 13 5.1 Obtención del material biológico 13 5.2 Metodologías de extracción 13 5.2.1 Extracción Soxhlet utilizando agua como solvente. 13 5.2.2 Extracción Soxhlet utilizando acetato de etilo como solvente 14 5.3 Evaluación de la actividad tóxica de los extractos de E. crassipes sobre larvas de C. quinquefasciatus: Bioensayos 15 5.4 Pruebas fitoquímicas cualitativas realizadas al extracto de E. crassipes 16 5.5. Identificación de compuestos por Cromatografía en Capa Delgada (TLC) 16

6. RESULTADOS 18 6.1 Extracción 18 6.2 Pruebas fitoquímicas cualitativas 19 6.3 Identificación de compuestos por Cromatografía en Capa Delgada (TLC) 20 6.4 Evaluación de la actividad tóxica de los extractos de E. crassipes sobre larvas de C. quinquefasciatus: bioensayos 20 6.4.1 Mortalidad de larvas 20 6.4.2 Aparición de pupas 22 6.4.3 Mortalidad de pupas 24 6.4.4 Emergencia de adultos 25 6.5 Comparación de resultados con los estudios base de la investigación 26 7. CONCLUSIONES 28 8. RECOMENDACIONES 30 ANEXOS 31 BIBLIOGRAFÍA 56

RESUMEN El objetivo de este trabajo es realizar una aproximación a la composición química y a la actividad biológica del extracto de Eichhornia crassipes sobre larvas de Culex quinquefasciatus, con el fin de evaluar sus efectos tóxicos y su potencial uso en el control de estos organismos. Después de una revisión bibliográfica previa, y la obtención del material biológico, se empezó a buscar una metodología de extracción para el extracto de la planta utilizando agua y acetato de etilo como solventes de extracción, posteriormente se realizó la evaluación de la actividad tóxica de los diferentes extractos y se realizaron algunas pruebas como aproximación a la caracterización fitoquímica del extracto. Respecto a la fitoquímica del extracto, no se pudieron identificar por pruebas colorimétricas cualitativas los posibles compuestos tóxicos, debido principalmente a la alta concentración de clorofilas, es posible que la sensibilidad de los métodos no detecte las concentraciones de dichos compuestos en el extracto, o que los compuestos tóxicos no correspondieran a los de la búsqueda realizada. En los resultados se obtiene que sí existe un efecto sobre el desarrollo de larvas de C. quinquefasciatus expuestas a altas concentraciones de extracto en cuanto a mortalidad de larvas, aparición de pupas y emergencia de adultos; y que el extracto con mejores resultados fue el que utilizaba como solvente de extracción acetato de etilo puro (el cual generó mortalidad de larvas de aproximadamente un 80% en el promedio acumulado de las réplicas en el tiempo para cada concentración), sin embargo los efectos totales valorados en porcentaje, no son competitivos frente a otros métodos de control en condiciones de laboratorio, con los cuales se podría llegar a obtener efectos superiores en cuanto a mortalidad en un menor tiempo; adicionalmente, las máximas emergencias de adultos alcanzadas (de 13% a 60 % según el tratamiento), apoyan su no aplicabilidad debido al alto –e importante epidemiológicamente– porcentaje de individuos que logran llegar a adultos. Las diferencias de los resultados obtenidos en este ensayo respecto a los ensayos base, reflejan el hecho que la composición química de las plantas varía dependiendo de su lugar de origen y las condiciones de crecimiento, y así mismo, el potencial efecto que pudiesen tener sus extractos sobre la biología de otros organismos.

INTRODUCCIÓN Desde el problema ambiental que se presenta en la hidroeléctrica del Muña, que principalmente representa un reservorio para mosquitos, se han intentado buscar soluciones de rápida acción que no han tenido los efectos esperados, siendo una de las principales el control químico. Éste cuerpo de agua se encuentra perturbado por la planta invasiva E. crassipes, que entre otros factores ha afectado la aplicación y efectividad de los métodos de control; lo cual ha llevado a tenerlo en cuenta como un ecosistema al que debe continuarse prestando urgente atención, esencialmente por los efectos que tiene sobre las poblaciones humanas cercanas.

A partir de reportes (1, 33) que evidencian la toxicidad de extractos de plantas de E. crassipes sobre Culex spp., con este trabajo se busca estudiar el potencial tóxico, los efectos del extracto y hacer un acercamiento a la composición química de plantas de E. crassipes que crecen en la hidroeléctrica del Muña, con el fin de juzgarlo como un posible método de control de C. quinquefasciatus. Esta investigación refleja entonces una primera aproximación al potencial uso del extracto de plantas de E. crassipes recolectadas en un punto específico en la hidroeléctrica del Muña para el control de C. quinquefasciatus, desde el diseño de una metodología o protocolo de extracción, la evaluación de los efectos de los extractos logrados, hasta la realización de algunas pruebas para la detección cualitativa de potenciales compuestos fitoquímicos que pudiesen tener efectos tóxicos sobre C. quinquefasciatus. Dentro de las variables estudiadas para la evaluación de la toxicidad y las consecuencias sobre la biología de C. quinquefasciatus, se encuentran la mortalidad de larvas, la aparición y mortalidad de de pupas y la emergencia de adultos, determinados como efectos a lo largo del tiempo y comparados estadísticamente como efectos acumulados en el tiempo para las diferentes concentraciones de extracto. En este documento se encuentra detallada la metodología de trabajo para la preparación de los extractos y la evaluación de los efectos tóxicos de los mismos (bioensayos); los resultados se presentan como análisis estadísticos de los datos base obtenidos en la experimentación tanto para los bioensayos como para las pruebas cualitativas fitoquímicas; a partir de los cuales se genera una discusión que finalmente se resume en las conclusiones y recomendaciones concretadas por esta investigación.

1. OBJETIVOS i. Objetivo general

Realizar una aproximación a la composición química y a los efectos del extracto de Eichhornia crassipes, sobre el control de Culex quinquefasciatus.

ii. Objetivos específicos

Evaluar el efecto de extractos crudos de E. crassipes sobre la mortalidad de larvas, la aparición de pupas y la emergencia de adultos de C. quinquefasciatus.

Realizar una aproximación a la fitoquímica del extracto de E. crassipes.

Proponer una metodología para la preparación del extracto de E. crassipes, que genere los mejores resultados sobre la mortalidad y el desarrollo de C. quinquefasciatus.

2. JUSTIIFICACIÓN A partir del problema ambiental que se presenta en la hidroeléctrica del Muña, que ha perjudicado la salud y las actividades de los pobladores de la región, al ser el origen de malos olores y principalmente un reservorio para mosquitos (promoviendo su proliferación descontrolada), se han intentado buscar soluciones de rápida acción que no han tenido los efectos esperados, siendo una de las principales el control químico. Éste cuerpo de agua se encuentra perturbado por una planta invasiva (Eichhornia crassipes) (Anexo 1, Figura 9) que ha afectado la aplicación y efectividad de los métodos de control, así como el desarrollo de actividades acuícolas; adicionalmente se presentan otros problemas como la contaminación debido a la desembocadura del río Bogotá, lo cual ha llevado a tenerlo en cuenta como un ecosistema al que debe continuarse prestando urgente atención principalmente por los efectos que tiene sobre las poblaciones humanas cercanas.

Esta situación particular permitió pensar inicialmente en la oportunidad de utilizar la cepa nativa de Bacillus sphaericus OT.4b.25, con la cual el área de Control Biológico del Centro de Investigaciones Microbiológicas CIMIC ha trabajado desde su aislamiento y caracterización como biocontrolador de larvas de Culex quinquefasciatus (9,10, 11, 27, 42), y, posteriormente con la revisión bibliográfica (realizada como trabajo preliminar para este proyecto), en la posibilidad de utilizar el extracto de E. crassipes para el cual se ha reportado toxicidad contra larvas de Culex (1, 33), como método de control que genere menor impacto ambiental en comparación al control químico. En este trabajo se pretende entonces estudiar la toxicidad y efectos del extracto de las plantas de E. crassipes que crecen en la hidroeléctrica del Muña con el ánimo de proponerlo como un método de control que generase menor impacto ambiental en contraste con el control químico, de forma tal que se aprovechase y optimizase la planta problema como recurso dentro de un sistema de manejo integrado de plagas.

3. MARCO TEÓRICO El marco teórico describe las dos especies involucradas en este estudio: Culex spp. y Eichhornia crassipes, definiéndolos como organismos y resumiendo las propiedades y características concernientes a este trabajo de investigación. 3.1 Culex spp 3.1.1 Clasificación taxonómica Se clasifica taxonómicamente a los mosquitos en general como pertenecientes a la Clase Insecta, del Orden Diptera. (14, 28) La Familia Culicidae es en donde se clasifican más de 2500 especies conocidas comúnmente como mosquitos; esta Familia se encuentra dividida en tres subfamilias siendo la Familia Culicini quien incluye al género Culex. (14) 3.1.2 Generalidades Los mosquitos siempre han sido para el hombre una molestia que empezó a cobrar importancia desde que se sugirió que además se ser una molestia, podían tener un papel importante en la transmisión de enfermedades. Con las consecuentes investigaciones y descubrimientos sobre éste aspecto a comienzos del siglo pasado, empiezan entonces a ser los mosquitos el foco de atención en cuanto a que se determinan ciertas especies como las responsables de epidemias de impacto importante sobre las poblaciones humanas, y se inician estudios profundos de exploración, descripción y clasificación. El interés taxonómico se relegó un poco hacia la segunda mitad del siglo pasado, cobrando mayor importancia estudios a cerca de su comportamiento, y otros aspectos de la biología de los mosquitos: su ecología, etología, fisiología y genética, recibiendo especial atención aquellas especies que afectan indirecta o directamente la salud humana (14). 3.1.3 Ciclo de vida Los mosquitos presentan metamorfosis completa, es decir, poseen estadios consecutivos de huevo, larva, pupa y adulto: i. huevos. Los huevos de la mayoría de Culicidae son puestos juntos en gran número, formando una estructura en forma de balsa que flota sobre la superficie del agua, unas pocas especies depositan los huevos individualmente y/o unidos a la vegetación flotante (14, 2). Cuando los huevos son puestos, el desarrollo de los embriones comienza; la tendencia es una eclosión conjunta del grupo de huevos depositados (lo cual no es regla, pues huevos depositados por una sola hembra después del apareamiento pueden eclosionar a intervalos irregulares de horas o días), donde comienza el primer estadio larvario. El periodo desde la puesta hasta

la eclosión de los huevos es variable (aproximadamente una semana), y depende en gran medida de la temperatura ambiental. Los huevos representan en muchas especies un estadio de resistencia, que puede llegar incluso a tolerar muy baja o nula humedad (sin perder su viabilidad), en espera de condiciones de humedad alta (por ejemplo inundaciones) que les permitan desarrollarse (junto con otros factores estimulantes de la eclosión como por ejemplo la disminución del oxígeno disuelto en el agua o feromonas); esto le permite a muchas especies tener fluctuaciones de su población: en periodos secos bajas densidades que se incrementan en periodos de lluvia. En las regiones tropicales las condiciones ambientales más constantes permiten el desarrollo de los estados larvales en días, observándose un incremento poblacional rápido una semana después de periodos de lluvia continuos. (14) (Anexo 1, Figura 1) ii. Larvas. Los huevos en condiciones favorables incuban en varios días y dan origen a larvas vermiformes cubiertas por vellosidades. Esta etapa o estadio puede considerarse la más larga de la vida del mosquito, tanto así que algunos autores consideran que el estadio de adulto es solo una etapa corta donde se incrementa la variabilidad genética por la reproducción sexual y se disemina la especie, como preparación para la explotación de nuevas aguas por las larvas. Durante esta etapa las larvas se alimentan vorazmente, esencialmente son filtradores de alimento, ya que en el extremo anterior poseen una boca con estructuras similares a brochas de aproximadamente miles de cerdas que en algunas especies pueden ser dentadas (dependiendo de sus hábitos alimenticios), y permiten la entrada al aparato digestivo de partículas de determinado tamaño. El comportamiento de alimentación se encuentra relacionado con el modo de respiración, ya que en la parte posterior poseen un sifón respiratorio con el extremo terminal hidrofóbico, por medio del cual obtienen el oxígeno de la superficie del agua; en el género Culex posee un sifón largo y rígido que le permite a la larva tener contacto con la superficie para respirar mientras el resto del cuerpo permanece sumergido. Durante su vida acuática las larvas mudan cuatro veces, cada muda correspondiendo a un instar o fase (donde la última es la de más larga duración) y al cabo de una semana aproximadamente se transforman en pupas, aumentando el tamaño del tórax, empezando a desarrollar los futuros músculos para el vuelo, y otros órganos bajo la cutícula. (14, 2) (Anexo 1, Figura 2). iii. Pupas. La morfología de las pupas es bastante uniforme entre géneros y no son muy informativas en este aspecto. (2) Las pupas tienen un extremo anterior globoso constituido por cabeza y tórax y un abdomen segmentado y curvo. Las trompetas o sifones respiratorios están localizados en la parte anterior, y se mantienen en contacto con la superficie para tomar el aire atmosférico. Las pupas son móviles respondiendo a disturbios o amenazas pero no se alimentan (no poseen un aparato bucal). (14, 2) Durante este estadio ocurren las principales y mayores transformaciones del insecto: desarrolla sus largas patas, las estructuras

para el vuelo y para la alimentación en la vida adulta. Después de pocos días, según la temperatura y la especie, las pupas salen a la superficie del agua y rompiendo el caparazón quitinoso emergen los adultos. (2) (Anexo 1, Figura 3) iv. Adultos. Después de la eclosión de la pupa, tanto hembras como machos se encuentran en la capacidad de alimentarse y usualmente las primeras veces lo hacen del néctar de flores u otras fuentes de azúcares que usan como la principal fuente de energía. (14) Solamente las hembras de los mosquitos son hematófagas, pues necesitan el estímulo de la toma de sangre y ciertas proteínas presentes en ésta para la maduración de los huevos (sin embargo, en algunas especies las hembras no necesitan tomar sangre para la primera puesta de huevos (14)); mientras que los machos se alimentan del néctar y líquidos de las plantas durante toda su vida. (2) Por lo tanto las hembras poseen un aparato bucal largo y adaptado para perforar y succionar la sangre y en los machos, éste es rudimentario debido a que sus hábitos alimenticios se limitan a néctar y agua. (3) La longevidad de los adultos varía de acuerdo con las especies, la alimentación, la temperatura y otros factores ambientales, oscilando entre 4 y 40 días en los trópicos (2) (Anexo 1, Figura 4). 3.1.4 Importancia como vectores. A finales del siglo XIX, se determinó que la picadura de los mosquitos era el vehículo para la transmisión de la fiebre amarilla, filariasis y malaria. (5) Los mosquitos no son normalmente infecciosos hasta que han vivido lo suficiente como para permitir la multiplicación de patógenos en su interior después de haber tomado sangre de animales infectados. (14) El papel de los mosquitos en la transmisión de enfermedades puede variar debido a cambios estacionales y geográficos (dependiendo de la disponibilidad y densidad de población de los hospederos en un área determinada) en los patrones de alimentación. (5, 12) Las principales enfermedades transmitidas al hombre por mosquitos del género Culex incluyen las encefalitis virales (especialmente al equina) y filariosis en Colombia. (14, 28, 2): Las filariosis son producidas por nemátodos filiformes como Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Mansonella ozzardi y Loa loa. Los dos primeros son adquiridos por mosquitos de la familia Culicidae (Anopheles, Culex, Aedes y Mansonia) de la sangre de pacientes infectados (22); sufren una serie de transformaciones en el estómago y músculos de los mosquitos, donde se maduran hasta larvas infectantes en un período de 12 a 14 días (22) dirigiéndose al aparato picador de éstos vectores, cuando la hembra se alimenta transmite estos estadios infectantes que buscan el sistema linfático donde sufren una serie de mudas permaneciendo como parásitos adultos por períodos muy prolongados (3 a 15 meses (22)) y generando cambios histopatológicos generalizados, inflamación de los vasos linfáticos, incluyendo una etapa final caracterizada por elefantiasis. (2, 3) (Anexo 1, Figura 5). La encefalitis equina es una enfermedad infecciosa que tiene

presentación epidémica y afecta no solo al hombre, sino a otros mamíferos (ej. caballos) y pájaros. Es producida por un virus que afecta al sistema nervioso central, presentándose una situación clínica semejante a la gripe que progresa hacia la inflamación del cerebro y de la médula espinal, con un cuadro de fiebre alta, cefalea, dolores musculares y en algunos casos convulsiones, en la mayoría de los casos llega hasta el coma. (3) La enfermedad se transmite a través de mosquitos de la familia Culicidae de los géneros Culex, Aedes y Mansonia. (14, 2) El ciclo de la enfermedad incluye un ciclo en aves que sirven como reservorio y donde se amplifica el virus tanto en éstos huéspedes como en los mosquitos; el movimiento de aves a zonas cercanas a poblaciones humanas fomenta que los mosquitos que habitan estas poblaciones transmitan el virus de las aves a hospederos mamíferos como caballos y el hombre causando su muerte. (14) (Anexo 1, Figura 6). 3.2 Eichhornia crassipes

3.2.1 Clasificación taxonómica Según su clasificación taxonómica, éste organismo pertenece al Reino Plantae, Subreino Tracheobionta (plantas vasculares), Superdivisión Spermatophyta (plantas con semillas), División Magnoliophyta (Plantas floreadas), Clase Liliopsida (Monocotiledóneas), Subclase Liliidae, Orden Liliales, Familia Pontederiaceae (Familia “Jacinto de agua”), Género Eichhornia, y Especie Eichhornia crassipes (39, 37) (Anexo 1, Figura 7). 3.2.2 Generalidades Eichhornia crassipes, conocida como “jacinto de agua” o “buchón”, es una macrófita acuática perenne, su rizomas y tallos normalmente flotan, y sus hojas con pecíolos esponjosos, pueden ser circulares a reniformes con aprox. 4 -12 cm. de ancho. (8) Su tamaño depende de los nutrientes disponibles en el cuerpo de agua que colonice y la intensidad de luz que allí se presente (teniendo altos requerimientos en este aspecto). Crece en un rango de temperaturas de 15° - 30° C. (38) En condiciones favorables forma una flor similar al jacinto de 4 -15 cm. de longitud. (8) Es nativa del Brasil, se encuentra distribuida a lo largo del trópico (8, 38), las tasas de crecimiento exceden la producción de biomasa seca de cualquier macrófita vascular terrestre, de aguas salinas o de aguas frescas (Wolverton y McDonald, 1978) y se ha convertido en una amenaza cubriendo superficies de cuerpos de agua, dispersándose en la superficie causando serias dificultades y problemas económicos en cuanto a que impide actividades acuícolas y explotación del cuerpo de agua: navegación, suministro de agua, disposición de aguas negras, generación de energía y pesca. (26, 38, 34, 21)

Se ha reportado que los problemas anteriormente mencionados son causados por el rápido incremento de la población de plantas acuáticas en general, cuando un ecosistema acuático es perturbado perdiendo su equilibrio, siendo además la introducción de especies de plantas exóticas un factor parcialmente responsable del incremento de su dominancia en un ecosistema. (34, 18) Adicionalmente, la eutroficación se ha visto que ayuda a su dispersión (34), ya que las macrófitas acuáticas (como E. crassipes y Salvinia auriculata) funcionan como sistemas naturales (para la remoción de compuestos contaminantes como nitrógeno (N) y fósforo (P).(29) Los sistemas que usan plantas acuáticas para la remoción de N requieren una recolección regular de biomasa, ya que puede llegar al punto de máximo de almacenamiento y la toma de N es balanceada retornando al agua el N orgánico a formas inorgánicas en el proceso de senescencia; sin embargo, la manutención de este sistema es un proceso es bastante costoso, y por tanto el mecanismo dominante de remoción del N es realizado por bacterias nitrificantes, para las cuales las raíces de las plantas acuáticas proporcionan micrositios adecuados, de forma tal que pueden tener relación directa con el incrementando potencial de poblaciones bacterianas. (18, 23) 3.2.3 Efecto de las infestaciones sobre el ecosistema e importancia sanitaria Algunos autores (34) reportan que las altas densidades de plantas acuáticas flotantes tienen un efecto adverso sobre los ecosistemas, ya que crean condiciones anóxicas y de oscuridad que fuertemente reducen la diversidad y la biomasa animal y vegetal; sin embargo otras fuentes (21) informan que el crecimiento denso de plantas acuáticas puede proporcionar un hábitat ideal para la manutención y el desarrollo de grandes poblaciones de invertebrados y vertebrados, incluyendo a las larvas de mosquitos, ya que las raíces acuáticas y el crecimiento aéreo de las hojas los protegen de sus predadores, además el O2 liberado por las raíces de las plantas (que puede ser relativamente pequeña en comparación con la difusión de O2 de la atmósfera), puede contribuir a la asociación de algunas especies de la Familia Culicidae en sus estados inmaduros (larva y pupa) para obtener O2 y alimentarse de materia orgánica derivada de éstas. (18) Algunas especies de mosquitos que se han reportado como cercanamente relacionadas con plantas acuáticas, incluyen larvas de Mansonia spp. con especies de macrófitas acuáticas como Eichhornia crassipes y Ceratopteris sp. (24) y E. crassipes, Pistia stratiotes y Salvinia molesta (14, 20); un subgrupo del género Culex con E. crassipes, Marsilea quadrifolia y Spirodella polyrhiza (40), y larvas de Anopheles albimanus con E. crassipes (32). (Anexo 1, Figura 8) Otro tipo de asociaciones conocidas relacionan a ciertas plantas acuáticas como E. crassipes con algunos biotipos virulentos de Vibrio choleae (concentrando éstos patógenos en su superficie e incrementando su viabilidad en el ecosistema

acuático); (35) y con caracoles, permitiendo su multiplicación y promoviendo los ciclos de vida de nemátodos parásitos en el hombre como Schistosoma, Fasciola hepatica y Clonorchis sinensis (21, 30); por lo cual E. crassipes debe tenerse en cuenta como una potencial amenaza sanitaria para poblaciones cercanas a los cuerpos de agua infestados. 3.2.4 Reportes de estudios fitoquímicos para E. crassipes La composición química de E. crassipes depende principalmente del tipo de agua que colonice (29). La siguiente tabla (Tabla 1) presenta la composición reportada por diferentes autores de algunos elementos y componentes comúnmente evaluados. Tabla 1. Composición química reportada por diferentes autores de plantas de E. crassipes

Autor Cenizas (%)a

C (%)

N (%) C/N P

(%) K

(%) Ca (%)

Mg (%)

Na (%)

MOb (%)

Polprsert, 1994 (31) 19.2 34.9 1.61 23.3 0.31 3.81 1.66 0.56 0.56 NR*

Suzuki et. al (13) NR 36.6 1.69 21.7 0.66 4.86 NR NR NR NR Universidad de

los Andes –Emgesa, 1998

(13)

NR 46.03 4.87 11.4

8 0.08 NR NR NR NR NR

Duke, 1983 (8) 24.2 1.5 NR NR NR NR NR NR NR Matai and Bagchi,

1980 (23) 24.2 28.7 1.5 NR 7.0 NR 12.8 NR 1.8 75.8

Gohl c (1981) (16) 11.9

- 20.1

NR NR NR 0.21

– 0.64

NR 1.70

- 2.16

NR NR NR a % en materia seca b MO (Materia orgánica) c Rango de valores obtenidos para diferentes lugares en India, Filipinas y Sudan * NR (No Reportado)

Adicionalmente Boyd (1974, citado por Polpraset (31)), reporta que en base seca hay 17.1% proteína cruda, 3.6% grasas y 28.2% de celulosa. Matai y Bagchi (1980) (23) reporta que la proteína cruda contiene por cada 100 g: 0.72 g metionina, 4.72 g fenilalanina, 4.32 g treonina, 5.34 g lisina, 4.32 g isoleucina, 0.27 g valina, y 7.2 g leucina. Gohl (1981, citado por (8)), reporta que contiene HCN, alcaloides y triterpenoides.

Otros estudios más detallados que investigan algunos compuestos específicos incluyen el de Center T. & Wright A. (1991) quienes estudian la relación de la composición de las hojas jóvenes y viejas de E. crassipes con la selectiva predación por parte del cucarrón Neochetina eichhornia (Coleoptera: Curculionidae) y reportan que las hojas jóvenes poseen altos contenidos de N, P, K y Mg, pero bajos contenidos de Ca y Mn comparadas con hojas viejas; adicionalmente encuentran que los compuestos fenólicos totales reducidos por el reactivo de Folin, eran más abundantes en tejidos jóvenes, sin embargo metodologías como la TLC y HPLC mostraban bajas concentraciones en los mismos, sugiriendo entonces que existen productos naturales en esta planta (no necesariamente fenólicos) que atraen ciertos insectos a tejidos de determinada edad. Greca, M. (1992) reportan fenalen-metabolitos (fenalenonas) en esta planta, y estos autores en 1991 aíslan y caracterizan de esta planta tres nuevos esteroles oxigenados con actividad fitotóxica sobre el crecimiento de las raíces de plántulas de rábano. Hölscher D. & Schneider B. (2004) aíslan de hojas y raíces compuestos del tipo 8-fenillfenalenona y proponen su ruta biosintética con dos intermediarios a partir de (1-13C)fenilalanina. Reportes de estudios fitoquímicos para la Familia Pontederiaceae: Prychid C. J. & Rudall P. J. (1999) estudian tipos de cristales de oxalato de calcio en monocotiledóneas como una herramienta taxonómica y reportan la presencia de cristales del tipo estiloides en la familia Pontederiaceae. Hamana K. et. al., reportan en 1994 las poliaminas norspermidina, norspermina, homospermidina y caldopetamina, y en 1998 reportan en hojas de plantas acuáticas de las Familias Nymphaeaceae, Hydrocaryaceae e Hydrocaryaceae las poliaminas termospermina, aminopropilhomospermidina, bis(aminopropil)etanediamina, metilespermidina, diaminopropano, putrescina, cadaverina, espermidina, espermina, y agmatina. Las raíces naturalmente adsorben contaminantes, incluyendo metales tóxicos como plomo (6, Akein et. al 1994, citado por A1), mercurio, estroncio90 ( (6), cadmio, zinc, cromo, Delgado et. al citado por A1), cadmio, cobre, níquel y zinc, así como algunos compuestos orgánicos que se creen carcinógenos en concentraciones 10.000 veces superiores al agua circundante. Dentro de los compuestos potencialmente tóxicos reportados para E. crassipes adicionales a los metales pesados que pudiese acumular se pueden encontrar saponinas y poliaminas como homosperina, caldopetamina, espermidina y espermita.

4. MARCO CONTEXTUAL Dentro de las investigaciones que relacionan a E. crassipes con Culex spp, y que son el punto de partida de este estudio, las cuales ayudaron a proponer el uso del extracto de esta planta como un potencial controlador de larvas de C. quinquefasciatus, se encuentran la realizada por Saxena et. al. (1992) (33) y por Assar & el-Sobky (2003) (1): Los primeros autores prueban que el extracto con éter de petróleo como solvente de plantas de E. crassipes muestreadas en la India, genera inhibición del crecimiento general de todos los estadios de de C. quinquefasciatus expuestos desde larva al extracto, y actividad imitadora de la hormona juvenil (prolongando el período larval significativamente); adicionalmente se demuestran cambios fisiológicos notorios en intermediarios larva-pupa, pupas transformadas, formas de balsa de los huevos defectuosas, adultos con músculos para el vuelo deformados, pérdida de fecundidad (más no efectos esterilizadores) y adultos obtenidos de larvas expuestas a los extractos con ovoposición de balsas de huevos más cortas que el tratamiento control. (33) Assar & el-Sobky (2003) experimentan también con plantas de E. crassipes de Egipto, mostrando efectos semejantes en C. pipiens y otros adicionales como la mortalidad de larvas, que dependen de la dosis del extracto y el tiempo de exposición, revelando que el extracto agua de E. crassipes generaba efectos histopatológicos drásticos en el intestino medio de las larvas, integumento, grasas y músculos. (1)

5. METODOLOGÍA 5.1 Obtención del Material Biológico La recolección de las hojas de E. crassipes fue realizada en un solo punto en la orilla sur-occidental en embalse de El Muña (aprox. Lat. 4° 31’ N Long. 74° 15’ O), ubicado en el municipio de Soacha, (Anexo 1, Figuras 9 y 10) a una altura de 2574 m. s. n. m. con una temperatura promedio de 14° C. (15) Se recolectaron en total aproximadamente 3 Kg de hojas sin tallos, las cuales se llevaron al laboratorio para su procesamiento e investigación. Para la realización de los bioensayos, las larvas de C. quinquefasciatus en 2do-3er instar fueron adquiridas de la colonia de referencia de la Unidad de Entomología del Instituto Nacional de Salud, para lo cual se solicitaron larvas en los instar ya nombrados cada vez que se realizaba una serie de bioensayos. 5.2 Metodologías de Extracción 5.2.1 Extracción Soxhlet utilizando agua como solvente. A las hojas frescas de E. crassipes se les realizó el mismo proceso de desinfección aplicado en la metodología de maceración, posteriormente fueron cortadas en pequeños trozos (aprox. 0.5 cm2) con un bisturí, y se pesó una cantidad de 30 g, los cuales se distribuyeron para llenar dos dedales Soxhlet con 15 g cada uno, que se coloraron en sistemas Soxhlet (Anexo 1, Figura 11) con agua destilada como solvente. El proceso de extracción se mantuvo por 24 h hasta que el solvente al pasar por los dedales perdiese el color verde característico (criterio para finalizar la extracción bajo el indicio que el solvente había extraído la mayoría de compuestos de la muestra). Se recuperó un total de 120 mL de extracto de los dos sistemas, el cual se almacenó por un día en nevera hasta su uso. (Anexo 1: Ilustración 202) De forma paralela se realizó el mismo procedimiento con otros 30 g de hojas para establecer el rendimiento de la extracción y la concentración del extracto, retirando el solvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio (40° C, 40 r. p. m.) y pesando el residuo seco sin solvente, estableciendo que en el proceso de los 30 g de hojas se extraían aprox. 1.25 g de extracto sin solvente. Por tanto, en el extracto se tenía una concentración inicial de 1.04% (p/v) (en un volumen de 120 mL), a partir de la cual se realizaron diluciones respectivas (0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.1%, 0.2% y 0.3%) para aplicar en los bioensayos.

Posteriormente se realizó el mismo procedimiento utilizando 70 g de hojas para obtener un extracto más concentrado y poder evaluar concentraciones superiores y similares a las anteriormente evaluadas (con el ánimo de evaluar adicionalmente la reproducibilidad de los efectos del extracto sobre las larvas). Del extracto recuperado de los sistemas Soxhlet se retiró el solvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio y se estableció que se extrajeron 3.03 g, los cuales se recuperaron diluyendo nuevamente con agua destilada estéril y aforando a un volumen de 50 mL, teniendo entonces un extracto con una concentración de 6.06% (p/v), a partir de la cual se realizaron diluciones respectivas (0.03%, 0.06%, 0.12%, 0.25%, 0.5% y 1.0%) para aplicar en los bioensayos. 5.2.2 Extracción Soxhlet utilizando acetato de etilo como solvente A las hojas frescas de E. crassipes se les realizó el proceso de desinfección aplicado en las dos metodologías anteriores y fueron de la misma forma cortadas en pequeños trozos (aprox. 0.5 cm2) con un bisturí. Se realizó la extracción de 100 g de hojas en el sistema Soxhlet, utilizando acetato de etilo como solvente orgánico, colocando en los dedales 20 g a la vez y dejándolos por 20 h en proceso de extracción (hasta observar pérdida del color del solvente al pasar por la muestra). Se recogieron las 5 fracciones obtenidas de extracto crudo y se llevó toda la muestra a un evaporador rotatorio a presión reducida (30° C, 40 r. p. m.) para retirar la totalidad del solvente, se pudo estimar que se recuperaban 2.0 g de extracto sin solvente, los cuales se resuspendieron en acetato de etilo y aforando a un volumen de 50 mL, logrando una concentración de 4% (p/v). Este extracto almacenó a temperatura ambiente y se utilizó para la realización de las pruebas fitoquímicas. Al realizar la extracción con acetato de etilo, se apreciaban claramente dos fases: una más oscura menos polar que se depositaba en el fondo del recipiente y una clara con una mayor polaridad en la parte superior del recipiente que contenía el extracto (ver 8. Resultados). Se decidió entonces realizar bioensayos con las dos fases juntas y las dos fases por separado, para comparar los efectos del extracto realizado con agua y conocer en qué fase se encontraban los compuestos tóxicos que tenían actividad sobre las larvas de C. quinquefasciatus. Para éste fin, otros 100 g de hojas frescas desinfectadas y cortadas con el mismo procedimiento anterior se colocaron en el sistema de extracción Soxhlet utilizando acetato de etilo como solvente, llenado los dedales con 20 g a la vez y dejándolos en proceso de extracción por 20 h cada uno. Al retirar el solvente a presión reducida en el evaporador rotatorio, se estableció que se recuperaron 1.8 g de extracto sin solvente, los cuales se aforaron a 50 mL con agua destilada estéril. Este extracto con una concentración de 3.6% (p/v) se utilizó para la realización de

bioensayos diluyéndolo a las concentraciones respectivas (0.1%, 0.5%, 0.25%, 0.12%, 0.06% y 0.3%). Para la preparación del extracto a partir del cual se separarían las dos fases para realizar bioensayos con cada una, se efectuó la extracción de 300 g de hojas de la misma forma que se acaba de describir. Se separaron las dos fases utilizando un embudo de decantación y posteriormente se procedió a retirar el solvente a presión reducida en el evaporador rotatorio a cada una de las fases, determinando que se recuperaban al final de todo el proceso 2.0 g de la fase con mayor polaridad (acetato de etilo puro) y 2.8 g de la otra fase (azeótropo), este material se resuspendió por separado en 50 mL de agua destilada estéril, obteniendo concentraciones de 4% (p/v) y 5.6% (p/v) respectivamente, a partir de las cuales se realizaron las diluciones respectivas (0.1%, 0.5%, 0.25%, 0.12%, 0.06% y 0.3%), que se evaluaron en los bioensayos. 5.3 Evaluación de la Actividad Tóxica de los Extractos de E. crassipes Sobre Larvas de C. quinquefasciatus: Bioensayos Los extractos preparados por las diferentes metodologías presentadas anteriormente, fueron ensayados en las concentraciones ya mencionadas, sobre larvas de C. quinquefasciatus en 2° – 3° instar. Cada unidad experimental (Anexo 1, Figura 12b) correspondía a 10 larvas en un frasco de vidrio en un volumen total de 30 mL de medio (agua destilada estéril + extracto), con la boca del frasco cubierta con vinilpel con pequeños agujeros para permitir la aireación e impedir la salida de los adultos emergentes. Se evaluó cada concentración por triplicado (tres réplicas por concentración) y por cada serie de bioensayos se realizaron los respectivos controles negativos (igualmente por triplicado) que correspondían a unidades experimentales sin extracto en el mismo volumen de medio. Las unidades experimentales se mantuvieron en una incubadora bajo condiciones controladas a 25° C, 60-65% de humedad relativa y fotoperíodo de 12/12 h luz/oscuridad (Anexo 1, Figura 12a). En todas las unidades experimentales las larvas se alimentaron con alimento para ratones pulverizado (Rodentina) cada 4 días a partir del montaje de los bioensayos. Se realizó un seguimiento de cada serie de bioensayos realizando lecturas cada 12 h para el primer ensayo con el extracto obtenido por el método de maceración y cada 24 h para los demás por 17-18 días, efectuando un conteo de larvas muertas, aparición de pupas y emergencia de adultos. El diseño experimental que se siguió para la realización de los bioensayos fue el diseño completamente al azar a través del tiempo, debido a que las unidades experimentales se encontraban en condiciones controladas y existía alta homogeneidad entre submuestreos (larvas). El análisis estadístico se trabajó bajo el modelo Yijk = µ + Ci + Dj +CDij + Eijk, donde el efecto del extracto o variable

observable (Yijk ) se asume que depende de la suma de los efectos de una media general (µ), la concentración (Ci), los días, la interacción entre días y concentración (CDij) y un posible error experimental (Eijk). Para la evaluación de los efectos de cada concentración en el tiempo, se utilizó el estimador de mínimos cuadrados el cual utiliza los promedios acumulados de cada concentración teniendo en cuenta las réplicas realizadas. Los análisis estadísticos se realizaron en Statistix 8.0 (36). 5.4 Pruebas fitoquímicas cualitativas realizadas al extracto de E. crassipes Existen ciertos compuestos de interés fitoquímico que se buscan como parte del análisis preliminar en el estudio de plantas con presuntivas actividades farmacológicas, los cuales se pueden restringir en análisis rutinarios a: flavonoides y compuestos afines, sesquiterpenlactonas, coumarinas, lignanos, triterpenoides (triterpenos, esteroles, esteroides, saponinas, sapogeninas, metilesteroles, glicósidos cardiotónicos, diterpenoides y giberelinas), quinonas, limonoides, meliacinas, simaroubalidanos, azúcares, alcaloides, aceites esenciales, fenoles y ácidos fenólicos, fenilpropanoides, antocianinas, xantonas, estilbenos, taninos, quinonas, carotenoides, lípidos, ácidos grasos, poliacetilenos, alcanos, compuestos sulfurados, aminoácidos, aminas, indoles, clorofilas, proteínas, azúcares y sus derivados (7, 19); de los cuales se realizan pruebas para su detección dependiendo de la actividad y/o aplicaciones de la planta en estudio. Para limitar la realización de las pruebas preliminares en este estudio, se realizó una búsqueda de compuestos reportados para E. crassipes y plantas pertenecientes a la Familia Pontederiaceae, para tener un punto de referencia de los posibles compuestos de interés fitoquímico que se podrían encontrar en E. crassipes, teniendo en cuenta su potencial efecto sobre las larvas de C. quinquefasciatus, y a partir de esta búsqueda se limitaron las pruebas a la identificación de alcaloides, triterpenoides (esteroides, saponinas, sapogeninas) y compuestos fenólicos. Los protocolos de dichas pruebas se encuentran en el Anexo 2. 5.5 Identificación de compuestos por Cromatografía en Capa Delgada (TLC) Para la confirmación de saponinas en el extracto, se realizó una prueba más sensible que permitió separar pigmentos y posteriormente revelar la posible presencia de este compuesto. Se realizó una TLC sobre una placa de sílica gel, utilizando una cámara cromatográfica de vidrio y butanol diluido en agua como fase móvil, (ya que se ha reportado la recuperación de saponinas en fases butanólicas (19)). Tras varios ensayos, la mejor resolución de las bandas se obtuvo con butanol al 90% en agua y una placa de 2.8 x 14 cm.

Para detectar saponinas en la placa cromatográfica se usó como método de revelado tricloruro de antimonio en agua rociado sobre la placa, con un posterior calentamiento de la misma a 110° C por 10 min. Como control positivo se usó el extracto de las flores de Calendula officinalis para quien se han reportado saponinas en estas estructuras (4).

6. RESULTADOS 6.1 Extracción A partir de las metodologías de extracción, y los diferentes ensayos realizados se presentan los valores del rendimiento de la extracción y las concentraciones stock que se elaboraron a partir de éste para la realización de pruebas fitoquímicas y los bioensayos. Tabla 2. Rendimiento de la extracción y concentración stock preparada a partir de este para pruebas posteriores (bioensayos y pruebas fitoquímicas)

Extracto Peso inicial hojas (g)

Rendimiento (g)a

Concentración stock (% p/v)

Agua (B)b 70 3.03 6.06 Acetato etilo mezclac (P) 100 2.0 4.0 Acetato etilo mezcla(B) 100 1.8 3.6 Acetato etilo purod (B) 2.0 4.0 Azeótropoe (B) 300 2.8 5.6 a peso del extracto sin solvente obtenido después del proceso de extracción b (B) = Bioensayos; (P) = pruebas fotoquímicas c mezcla = acetato de etilo puro más azeótropo (explicación en el texto) d, e la explicación de esta terminología se encuentra dentro del texto

Las diferentes extracciones usaban básicamente acetato de etilo y agua, sin embargo el acetato de etilo mostraba de forma natural la separación de dos fases, correspondiendo la primera y más superficial al acetato de etilo puro y la segunda más densa y oscura al azeótropo formado por la mezcla de aprox. 7% agua (proveniente de la muestra de hojas frescas) y un 93% de acetato de etilo. El azeótropo por definición (41), es una mezcla líquida de 2 o más componentes que se comporta como una sustancia pura con propiedades particulares e independientes de las de las sustancias que originalmente lo componen; por tanto se decidió evaluar tanto el extracto realizando con la mezcla del acetato de etilo puro y el azeótropo, como cada una de las dos fases por separado. La Tabla 2 resume los datos del peso inicial de la muestra, el rendimiento o peso del extracto sin solvente para cada extracción y la concentración a la cual se llevó el extracto concentrado; adicionalmente se realizaron extracciones previas que no se presentan en la tabla para determinar rendimientos y afinar la metodología. Las extracciones que la tabla presenta incluyen una extracción con agua para ser

utilizada en los bioensayos, una con acetato de etilo (que se mantuvo almacenado en nevera) para realizar las pruebas fotoquímicas, y otra con el mismo solvente para los bioensayos; las dos últimas que la tabla presenta corresponden a una sola extracción con acetato de etilo para obtener tanto el acetato de etilo puro como el azeótropo en concentraciones lo suficientemente altas como para poder compararse con los demás extractos en los bioensayos. Los rendimientos alcanzados utilizando acetato de etilo como solvente de extracción son inferiores a los alcanzados por el agua en cuanto al peso del material extraído, sin embargo, como se podrá apreciar más adelante, los resultados de toxicidad de los extractos se obtienen mejores para el primero. Por tanto se puede decir que los compuestos más tóxicos se extraen con mayor eficiencia en acetato de etilo y se propone entonces que los compuestos tóxicos y alteradores del desarrollo son de naturaleza altamente polar, debido a la alta polaridad del solvente. 6.2 Pruebas fitoquímicas cualitativas Los resultados para las pruebas fitoquímicas realizadas se muestran en la siguiente tabla (para fotografías de dichas pruebas ver Anexo 3, Tabla 3) Tabla 3. Resultados pruebas fitoquímicas generales Prueba Resultado Mayer - alcaloides Negativo * Rosenheim - Esteroides Negativo* Salkowski –Triterpenoides en general Negativo* Tricloruro de antimonio –saponinas Negativo** Molisch - saponinas Positivo* Folin –Compuestos fenólicos Negativo* Cloruro férrico – Compuestos fenólicos Negativo** * Prueba realizada para el extracto con solvente (acetato de etilo) ** Prueba realizada para extracto con y sin solvente

Los cambios de coloración que se debían apreciar en las pruebas cualitativas presentaron problemas para su visualización debido a la alta concentración de pigmentos (clorofilas), las cuales impidieron en la mayoría de los casos afirmar los cambios de color; por lo tanto al no se apreciar cambios evidentemente positivos, se reportan como negativos. Aunque existen protocolos o métodos para la precipitación de clorofilas, no se emplearon debido a que al aplicarlos a la muestra se corre el riesgo de precipitar otros compuestos que pudiesen ser de interés, ya

que no se conoce la naturaleza de los potenciales compuestos tóxicos del extracto. 6.3 Identificación de compuestos por Cromatografía en Capa Delgada (TLC) Como en las pruebas cromogénicas no se obtuvieron resultados evidentes, ya que la apreciación de cambios en el color fue difícil por la alta concentración de pigmentos, se realizaron pruebas más sensibles que permitieron separar los pigmentos e identificar compuestos posteriormente. Debido a que en las pruebas cromogénicas la prueba de Molisch arrojó resultados positivos, se procedió a confirmar la presencia de saponinas; sin embargo los resultados del revelado de la cromatografía (Anexo 3, Figura 13) comprueban que no se encuentran presentes saponinas en el extracto, ya que la aparición de puntos púrpura o rosa que reflejan un resultado positivo (que sí se pueden apreciar en el control) no se obtuvo en el extracto de E. crassipes. La posible razón que explica el resultado positivo en la prueba de Molisch es que esta prueba identifica también glicósidos. 6.4 Evaluación de la actividad tóxica de los extractos de E. crassipes sobre larvas de C. quinquefasciatus: bioensayos Los datos base sobre los cuales se realizó el análisis estadístico que se muestra a continuación se encuentran en el Anexo 4, Tablas 7 - 21. Se evaluaron los efectos de los extractos anteriormente mencionados a lo largo del tiempo, incluyendo como posibles variables observables (a partir de las investigaciones previas (1, 33), la mortalidad de larvas, la aparición de pupas, la mortalidad de pupas y la emergencia de adultos. Los resultados que se muestran a continuación en las gráficas de barras, son los efectos acumulados de las concentraciones a través del tiempo. 6.4.1 Mortalidad de larvas. La Gráfica 1 muestra en el eje y los promedios acumulados de la mortalidad de larvas para las diferentes concentraciones (eje x) de los diferentes extractos (eje z); las letras que se encuentran en cada una de las columnas o barras corresponden a los grupos estadísticos determinados a partir del análisis de varianza y la aplicación de la prueba de comparaciones pareadas de Tukey (las letras en las gráficas solo son comparables por colores, es decir entre concentraciones dentro de cada extracto, más no entre extractos). En cuanto a la mortalidad de larvas en todos los ensayos con los diferentes extractos se observó la misma tendencia: el análisis de varianza para la variable mortalidad de larvas muestra diferencias altamente significativas entre

concentraciones y entre los días. El promedio de la mortalidad de larvas muestra una relación proporcional con la concentración que se pierde aprox. al 10 día; por tanto, se decidió no incluir los días posteriores al 10 dentro del tratamiento estadístico, debido a la estabilización de los datos en los últimos días y a que no se deseaba incluir variables independientes al efecto del extracto (como por ejemplo la senescencia natural de las larvas). Se puede apreciar adicionalmente que las altas concentraciones de extracto tienen los más altos valores para mortalidad de larvas, seguidos por las concentraciones intermedias y las bajas. El tratamiento sin extracto hace parte de un grupo estadístico diferente (extracto-agua y extracto-acetato de etilo) o se asocia con las bajas concentraciones (extracto-acetato de etilo mezcla y extracto-azeótropo), por tanto se puede validar este tratamiento como control negativo dentro del ensayo, y los valores de mortalidad en este, reflejan la proporción de larvas que mueren de forma independiente al efecto del extracto. Esta diferencia estadística demuestra también que los extractos en altas concentraciones sí tienen efecto sobre la mortalidad de larvas proporcional a la concentración. Por otro lado, se puede apreciar que las larvas en los tratamientos con extracto mueren más rápido en comparación al tratamiento control (Tabla 4), relacionándose también las altas concentraciones con un más pronto inicio de la mortalidad de larvas; el único tratamiento en el que las larvas empiezan a morir casi al mismo tiempo que en el control es el tratamiento con el extracto-azeótropo (que muestra también los más bajos niveles de mortalidad promedio). Tabla 4. Día en el cual inicia la mortalidad de larvas

Concentración

Extracto 0,0 0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1,0

Días de diferencia

con el control

Agua 8 4 3 2 1 1 1 3 – 7

Acetato etilo mezcla 9 7 4 3 2 1 1 2 – 8

Acetato etilo puro 7 3 2 1 1 1 1 4 – 8

Azeótropo 9 9 9 9 5 2 2 0 - 7

El tratamiento con el que se obtienen los más altos niveles de mortalidad de larvas es el tratamiento con el extracto-acetato de etilo, y no solo mueren más larvas en este tratamiento sino que mueren más rápido (Tabla 4).

Gráfica 1. Mortalidad promedio de larvas de los días 1 al 10 para los diferentes extractos

6.4.2 Aparición de pupas. La Gráfica 2 muestra en el eje y los promedios acumulados de la aparición de pupas para las diferentes concentraciones (eje x) de los diferentes extractos (eje z). En cuanto a la aparición de pupas en todos los ensayos se observó la misma tendencia (menos en el tratamiento con el extracto-azeótropo): el análisis de varianza para la variable aparición de pupas muestra diferencias altamente significativas entre concentraciones y entre los días. Para el análisis de esta variable se tomaron los datos a partir al día 7 después del inicio o montaje de las series de bioensayos, debido a que por la metamorfosis natural de las larvas en los primeros 7 días las larvas no mostraban un desarrollo importante a pupas.

El promedio de la aparición de pupas muestra una relación proporcional con la concentración solo entre concentraciones bajas e intermedias), mientras que las altas concentraciones se asocian estadísticamente con las bajas; esto se debe no a un efecto del extracto retardante sobre la aparición de pupas, sino a una asociación puramente matemática debido a que la alta mortalidad de larvas en las altas concentraciones dejan en estos tratamientos pocas larvas sobrevivientes capaces de pupar. Haciendo esta aclaración, se puede apreciar en general que las concentraciones intermedias de extracto se encuentran relacionadas con una baja aparición de pupas, seguidas por las bajas concentraciones. Al observar esta variable, el tratamiento control hace parte de un grupo estadístico diferente en todos los extractos, menos en el extracto-azeótropo, por lo tanto se puede decir que en estos tratamientos existe una relación con la baja aparición de pupas igualmente dependiente de la concentración. En el tratamiento con el extracto-azeótropo el control se encuentra asociado con las demás concentraciones, por tanto se puede concluir que éste extracto no tiene un efecto sobre la aparición de pupas.

Gráfica 2. Aparición de pupas promedio en los días 8 al 17 para los diferentes extractos

6.4.3 Mortalidad de pupas. La Gráfica 3 muestra los promedios acumulados de la mortalidad de pupas para las diferentes concentraciones de los diferentes extractos. En cuanto a la mortalidad de pupas en todos los ensayos se observó la misma tendencia: el análisis de varianza para la variable mortalidad de pupas muestra diferencias significativas entre concentraciones y entre los días. Para el análisis de esta variable se tomaron los datos a partir al día 6 hasta el día 11 después del inicio de las series de bioensayos, debido a que no se deseaba incluir los extremos porque en los primeros días no se había desarrollado el estadio de pupa y en los últimos la estabilización de los datos no arrojaba información importante para el análisis, además de estar posiblemente incluyendo factores independientes al efecto del extracto. El promedio de la mortalidad de pupas no muestra una relación proporcional clara con la concentración; adicionalmente aunque las altas concentraciones se relacionan con una alta mortalidad de pupas en contraste con las demás y con el control, los diferentes tratamientos con extracto estadísticamente no se diferencian del control, ya sea por una asociación directa o por una asociación indirecta al compartir grupos estadísticos con el control; por tanto se puede decir que no existe un efecto o entre los diferentes extractos y la mortalidad de pupas.

Gráfica 3. Mortalidad de pupas promedio en los días 6 al 17 para los diferentes extractos.

6.4.4 Emergencia de adultos. La Gráfica 4 muestra los promedios acumulados de la emergencia de adultos para las diferentes concentraciones de los diferentes extractos. En cuanto a la emergencia de adultos en todos los ensayos se observó la misma tendencia: el análisis de varianza para la variable emergencia de adultos muestra diferencias altamente significativas entre concentraciones y entre los días. Para el análisis de esta variable se tomaron los datos a partir al día 8 después del montaje de las series de bioensayos, debido a que por la metamorfosis natural de las pupas en los primeros 7 días las pupas no se habían desarrollado a adultos. Las altas concentraciones se encuentran relacionadas estadísticamente con las bajas, y las intermedias: aunque no se puede hablar estadísticamente de diferencias entre concentraciones de extracto dentro de los diferentes tratamientos, se puede apreciar al ver la gráfica que los mejores efectos (los más bajos valores de adultos emergentes) se logran con las altas concentraciones. El control hace parte de un grupo diferente para cada tratamiento, lo cual muestra que el extracto sí tiene efecto sobre la emergencia de adultos de larvas expuestas al extracto a través de su desarrollo en comparación a aquellas no expuestas. Como el efecto final de los diferentes extractos muestra que no existen diferencias estadísticas claras entre concentraciones dentro de cada extracto, ya que las diferentes concentraciones para todos los tratamientos aunque se muestran diferentes al control, se encuentran estadísticamente asociadas entre sí de forma directa o indirecta al compartir grupos estadísticos, se puede concluir que las diferentes concentraciones evaluadas tienen el mismo efecto final. El tratamiento con el que se obtuvieron los más altos valores para la emergencia de adultos fue el tratamiento con el extracto-azeótropo, el cual no mostró diferencias estadísticas en comparación al control, por tanto se puede decir que este tratamiento es el único que no tiene efectos sobre la emergencia de adultos. La emergencia de adultos es el aspecto más importante en cuanto a que resume los efectos totales de los extractos sobre los individuos expuestos desde larva, determinando qué tan efectivo es el extracto en cuanto a la cantidad de individuos adultos que potencialmente pueden concluir su ciclo hematófago. Aunque como ya se explicó, no existen diferencias estadísticas entre concentraciones, el tratamiento con el que se logró el menor valor promedio para emergencia de adultos (como se puede apreciar en la gráfica), corresponde al tratamiento con el extracto-agua. Sin embargo, queriendo dar validez e importancia a las demás variables evaluadas, el extracto-acetato de etilo tiene mejores efectos y en cuanto

a la emergencia de adultos los valores promedio alcanzados son similares a los obtenidos con el extracto-agua; por tanto si se propusiera o escogiera un extracto dentro de todos los tratamientos evaluados, sería el extracto acetato de etilo (un aspecto que valida esta propuesta, debe tenerse bajo consideración, y se manifestará más adelante en las recomendaciones). Gráfica 4. Emergencia de adultos promedio en los días 8 al 17 para los diferentes

extractos. 6.5 Comparación de resultados con los estudios base de la investigación Aunque se obtuvieron efectos similares en comparación con la investigación base de Assar y colaboradores (1): al presentarse un efecto en el desarrollo de los individuos expuestos al extracto desde larva en comparación a los tratamientos control, dependiente de la dosis y el tiempo de exposición, en cuanto a mortalidad de larvas, aparición de pupas y emergencia de adultos; los valores obtenidos para cada una de estas variables son llamativamente diferentes (Tabla 5). Como aclaración, los extractos se comparan teniendo en cuenta que el solvente de extracción trabajado por Assar es agua y con el que se pretende comparar es

acetato de etilo, ya que con éste que se obtuvieron los mejores resultados en la presente investigación. Como se puede apreciar en la Tabla 5, que compara algunas variables clave evaluadas en las dos investigaciones, se logran valores para la mortalidad de larvas similares entre las mismas, sin embargo, en la investigación llevada a cabo por Assar se obtienen estos valores en 72 h, mientras que en la presente investigación se logra un porcentaje ligeramente menor acumulado en 288 h. Por otro lado los valores para la aparición de pupas y emergencia de adultos son de 250 a 400 veces mayores (respectivamente) en esta investigación, logrados asimismo en los mismos tiempos. Tabla 5. Comparación de efectos logrados con el extracto al 1% entre investigaciones

Efecto % efecto investigación Assar et. al

% efecto en esta investigación

Mortalidad de larvas 81a 80 b Aparición de pupas 0.05 20 Emergencia de adultos 0.04 10 a 72h b 288h (12 días) Es por tanto bastante evidente que la toxicidad de las plantas recolectadas para esta investigación es mucho menor a las recolectadas para la de Assar, y esto evidencia la variabilidad en la composición de las plantas de una misma especie que crecen en regiones con condiciones ambientales y nutrientes diferentes. Probablemente las condiciones para el crecimiento de las plantas recolectadas en la hidroeléctrica del Muña, no permitan que las plantas produzcan o acumulen los suficientes compuestos tóxicos que si es posible que lo hagan las plantas recogidas por Assar, y por tanto las diferencias de la toxicidad del extracto en las dos investigaciones se deban principalmente a factores desconocidos de esta clase.

7. CONCLUSIONES

En esta investigación se presentan efectos claros sobre el desarrollo de larvas expuestas a altas concentraciones de extracto, en cuanto a mortalidad de larvas, aparición de pupas y emergencia de adultos. Mientras que no se encontraron efectos sobre la mortalidad de pupas.

Los extractos (especialmente el extracto-acetato etilo), tienen un efecto importante sobre la mortalidad de larvas (hasta de un 80%), sin embargo los valores que genera no son competitivos frente a otros métodos de control en condiciones de laboratorio, en donde se pueden generar valores de mortalidad de larvas del 100% en un menor tiempo. Igualmente, frente a la propuesta que presenta Assar y colaboradores (1) en donde se utiliza la misma especie de planta para producir el extracto, en esta investigación se obtienen resultados inferiores, y se propone que esto se deba a la variabilidad en la composición de las plantas de una misma especie que crecen en regiones con condiciones ambientales y nutrientes diferentes, las cuales influyen en que las plantas produzcan o acumulen diversos compuestos tóxicos en cantidades distintas.

Respecto a la fitoquímica del extracto, no se pudieron identificar por pruebas colorimétricas cualitativas los posibles compuestos tóxicos, debido principalmente a la alta concentración de clorofilas, es posible que la sensibilidad de los métodos no detecte las concentraciones de dichos compuestos en el extracto, o que los compuestos tóxicos no correspondieran a los de la búsqueda en esta investigación.

Se podría proponer el acetato de etilo como el mejor solvente para extraer compuestos tóxicos comparando con las demás extracciones; y consecuentemente, como el extracto-acetato de etilo genera los mejores resultados, se podría decir que los compuestos tóxicos y alteradores del desarrollo son de naturaleza polar, debido a la más alta polaridad de este solvente comparado con el agua.

Epidemiológicamente, la emergencia de adultos es el aspecto más importante en cuanto a que resume los efectos totales de los extractos sobre los individuos expuestos desde larva, determinando qué tan efectivo es el extracto en cuanto a la cantidad de individuos adultos que potencialmente pueden concluir su ciclo hematófago. Por tanto, como tratamiento independiente, el extracto-acetato de etilo con el que se obtuvieron los mejores resultados en este investigación, no sería aplicable, debido a las máximas emergencias de adultos alcanzadas (superiores al 10%).

Si el extracto cumpliese con características residuales, o efectos sobre la biología de los adultos, es decir, adultos con aptitud baja incapaces de llevar a cabo una vida normal al no poseer estructuras adecuadas, estar carentes de la posibilidad de tener descendencia exitosa y/o con un comportamiento alterado (como lo proponen los resultados de Saxena y colaboradores (33)), valdría la pena aplicado con un tratamiento de impacto, dentro de un sistema de manejo integrado de plagas.

Adicionalmente, otro factor que reduce la aplicabilidad del extracto es la alta cantidad de material inicial necesaria para lograr altas concentraciones, si a nivel de laboratorio se trabajó con pesos relativamente altos (300 gr.) con el fin de lograr un volumen pequeño (50 mL) de las concentraciones stock; para aplicaciones en campo lograr concentraciones efectivas en volúmenes de agua cientos de veces superiores a las trabajadas en laboratorio, requeriría de una cantidad demasiado alta de material inicial, que además necesitaría de procesos de extracción demasiado prolongados semejantes al sistema Soxhlet.

8. RECOMENDACIONES Debe tenerse bajo consideración, que en esta investigación, no se evaluó un efecto independiente sobre cada estadio, sino un efecto acumulado de individuos expuestos continuamente desde larva al extracto. Por tanto es difícil diferenciar cuándo un estadio se ve directamente afectado por el extracto, y cuándo los resultados son una consecuencia reflejo de efectos previos sobre los estadios anteriores. Por ello, se podría proponer que para esta clase de investigaciones, en donde se pretende observar variables en el tiempo relacionadas con fragmentos del desarrollo, que la exposición de los individuos además de ser continua (como sucedería en la naturaleza) se realice de forma independiente para cada una de las etapas del desarrollo. Como ya se expuso, sería necesario evaluar aspectos como la residualidad y los posibles efectos sobre la biología de los mosquitos adultos, para que así la utilización del extracto que se propone en este trabajo sea viable, y de igual forma se debería continuar con la investigación de sistemas de producción para el extracto que generen ventajas competitivas frente a otros métodos de control.

ANEXO 1. Ilustraciones Figura 1. Huevos Culex spp. (17) Figura 2. Larvas Culex spp. (17)

a b Figura 3. a. Pupa Culex spp. (6) b. Mosquito adulto emergiendo de la pupa. (1)

e

Figura 4. Adultos Culex quinquefasciatus (17)

Figura 5. Filariosis, ciclo de vida general de de las filarias como agentes etiológicos, y papel de los mosquitos de la familia Culicidae (Anopheles, Culex, Aedes) dentro del mismo, (2) descripción dentro del texto. Figura 6. Encefalitis equina, ciclos de transmisión del virus que muestra papel de Culex spp., (2) descripción dentro del texto.

Figura 7. Eichhornia crassipes (42)

a b

Figura 8. a. Larvas de Mansonia uniformis unidas a raíces de plantas (25). b. Grupo de huevos de Mansonia ovopositados sobre una hoja de Salvinia (14)

Figura 9. Invasión por E. crassipes en la hidroeléctrica del Muña; recolección de hojas a la orilla del cuerpo de agua. (Tomado por Silvia Rivera)

Figura 10. Sitio de recolección de las hojas de E. crassipes

Figura 11. Sistema Soxhlet

Punto de recolección

a b

Figura 12. Bioensayos. a. Serie de bioensayos, b. Unidad experimental

ANEXO 2. Protocolos para las pruebas fitoquímicas cualitativas i. Pruebas para alcaloides (19): Reactivo de Mayer Se disolvieron 0.136 g de HgCl2 en 6 mL de agua y 0.5 g de KI en 1 mL de agua. Se mezclaron las dos soluciones y se aforan a 100 mL. El reactivo se añadió a la muestra previamente acidulada con gotas HCl diluido. Se añadieron unas gotas de reactivo y se observó cambio de color. Reactivo de Dragendorff Se disolvieron 0.8 g de Bi(NO3)3 5 H2O en 2 mL de HNO3 (al 30%) y 2.72 g de KI en 5 mL de agua destilada. Se mezclaron las dos soluciones y se dejaron reposar 24 h. Se decantó la solución y se aforó con agua destilada a 10 mL. El reactivo se añadió a la muestra acidulada con HCl diluido. Se observó si se presentaba aparición de un precipitado anaranjado-marrón como prueba positiva. ii. Pruebas para triterpenoides en general (19): Prueba de Salkowski A la muestra se le retiró el acetato de etilo a presión reducida en el evaporador rotatorio y se resuspendió en cloroformo. 1 mL de esta solución se puso en contacto con 1 mL de ácido sulfúrico. Se observó si había aparición de colores amarillo o rojo como pruebas positivas. iii. Pruebas para esteroides/esteroles (19): Prueba de Rosenheim Una solución clorofórmica de la muestra obtenida con el procedimiento descrito en la prueba anterior, se puso en contacto con ácido tricloroacético al 90% en agua. Se observó si había aparición de color violeta que cambia a azul después de 20 min. como prueba positiva. iv. Saponinas y sapogeninas (19): La muestra en acetato de etilo se puso en contacto con la solución de los cristales hidratados (con la humedad ambiental) de tricloruro de antimonio, y se observó cambio en la coloración como prueba positiva. Prueba de Molisch Se mezclaron 2 mL de la muestra con 1-2 gotas de solución al 5% de α-naftol en etanol y por la pared del tubo se dejó resbalar H2SO4 concentrado. Se observó si aparecía un anillo violeta como prueba positiva. v. Compuestos fenólicos (7): Reducción con el reactivo de Folin A 2 mL de muestra en acetato de etilo se adicionaron gotas de reactivo de Folin comercial, se observó si había cambio de color a azul como prueba positiva. Prueba con cloruro férrico alcohólico Para detectar fenoles simples se adicionó cloruro férrico en metanol al 1% observando si aparecían colores como verde, púrpura, azul o negro como prueba positiva.

ANEXO 3: Resultados de las pruebas fitoquímicas.

Tabla 6. Resultados detallados de las pruebas fitoquímicas generales

Prueba Resultado y observaciones

Mayer - alcaloides

Negativo Debe verse un cambio de color (no es claro el cambio)

Rosenheim - Esteroides

Negativo Debe verse color violeta que cambia a azul después de 20 min. (no se observó ninguno de los dos colores en los 20 min.)

Salkowski –Triterpenoides en general

Negativo Debe apreciarse una coloración amarilla o roja (no se pueden apreciar ninguno de estos dos colores)

Tabla 6. (continuación)


(muestra en acetato de etilo)

Tricloruro de antimonio –saponinas

Negativo Se debe ver un cambio de coloración (no es evidente en ninguno de los dos casos evaluados)

(muestra sin solvente)

Molisch - saponinas

Positivo Se debe apreciar la formación de un anillo violeta Esta es la única evidentemente positiva


Tabla 6. (continuación)


Folin –Compuestos fenólicos

Negativo No se aprecia cambio a azul esperado


(muestra sin solvente)

Cloruro férrico – Compuestos fenólicos

Negativo Se debe ver cambo a verde, púrpura azul o negro (no es evidente un cambio a estos colores)


Resultados de las pruebas fitoquímicas (Continuación)

Figura 13. Cromatografía en Capa Delgada (TLC)

Manchas púrpura en el control

E. crassipes

C. officinalis

Anexo 4. Tablas de resultados base de los bioensayos Tabla 7. Ensayo extracto agua: Datos obtenidos para la mortalidad de larvas en cada concentración en el tiempo Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Concentración a R1

b R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3

0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 1 2 0 1 3 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 3 0,06 0 0 0 1 0 0 2 0 1 2 0 1 2 2 1 2 2 1 2 2 3 3 2 3 5 2 3 0,12 0 0 0 1 2 2 2 2 2 5 2 2 5 2 3 5 3 4 5 3 4 5 5 4 6 5 4 0,25 1 3 3 1 3 3 1 4 3 2 4 3 2 5 4 2 5 4 3 5 4 3 6 6 3 6 6 0,50 2 3 2 3 3 4 5 3 6 5 4 6 5 4 6 7 5 6 7 6 7 7 6 8 7 6 8 1,00 5 3 3 5 3 3 6 4 3 6 6 3 6 6 4 6 7 5 7 7 6 7 7 6 7 7 6

Control 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 Día 10 11 12 13 14 15 16 17 Horas 240 264 288 312 336 360 384 408 Concentración a R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3

0,03 4 4 3 4 4 3 5 4 3 6 7 5 6 7 7 7 7 8 7 7 8 7 7 8 0,06 5 2 4 7 4 5 7 4 6 7 6 6 7 6 6 7 6 6 8 7 6 9 7 7 0,12 7 6 6 7 6 6 7 6 6 7 6 7 7 6 7 7 6 7 7 6 7 7 6 8 0,25 4 6 6 4 7 6 6 7 7 6 7 7 6 7 7 6 7 7 6 7 7 6 7 7 0,50 7 6 8 7 6 8 7 6 8 7 6 8 7 6 8 7 6 8 7 6 8 7 6 8 1,00 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6

Control 1 0 1 2 0 1 2 0 2 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 a % (w/v)

b R = Réplica c Promedio de las réplicas para cada día

Tabla 8. Ensayo extracto agua: Datos obtenidos para la aparición de pupas en cada concentración en el tiempo Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Concentración a R1


0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 1 2 1 1 3 2 1 3 3 1 3 4 1 3 4 1 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 2 1 1 4 3 1 4 3 2 4 3 2 0,50 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 2 1 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 2 3 1 2 4


0,03 2 1 0 2 1 0 3 1 1 3 1 1 3 2 1 3 2 1 3 2 2 3 3 2 0,06 1 2 2 1 2 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 3 0,12 3 4 2 3 4 2 3 4 2 3 4 2 3 4 2 3 4 2 3 4 2 3 4 2 0,25 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 4 0,50 2 2 2 3 2 2 3 3 2 3 3 2 3 4 2 3 4 2 3 4 2 3 4 4 1,00 1 2 4 2 2 4 3 2 4 3 2 4 3 2 4 3 2 4 3 2 4 3 2 4

Control 3 5 4 4 5 4 4 6 4 4 6 5 6 6 5 6 7 6 6 7 6 6 8 7 a % (w/v)


Tabla 9. Ensayo extracto agua: Datos obtenidos para la mortalidad de pupas en cada concentración en el tiempo Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Concentración a R1


0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 2 0 1 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 2 1 1 2 1 1 0,50 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 2 1 1 2 1 1 2 1 1 1,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 2 2 0 2 2


0,03 1 1 0 1 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 1 2 2 1 2 2 2 2 3 2 0,06 0 1 1 0 1 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0,12 2 0 1 2 1 1 2 1 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 0,25 2 1 1 2 1 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 0,50 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 1,00 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 3 2 2 3

Control 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 2 2 1 2 3 a % (w/v)


Tabla 10. Ensayo extracto acetato de etilo mezcla: Datos obtenidos para la mortalidad de larvas en cada concentración en el tiempo Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Concentración a R1


0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0,12 0 0 0 0 0 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 0,25 0 0 0 0 0 1 1 0 1 2 1 1 2 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 2 3 2 3 0,50 0 0 1 2 2 3 2 2 3 2 2 4 3 2 4 3 3 4 3 4 5 4 5 5 4 5 6 1,00 3 2 0 3 3 1 3 3 2 3 3 2 4 3 3 4 5 3 4 5 3 4 5 5 6 5 6


0,03 1 1 1 2 1 1 2 1 3 2 1 4 2 3 4 3 3 4 4 3 4 4 3 4 0,06 0 1 2 1 2 2 1 3 2 2 3 3 3 4 3 3 5 3 4 5 4 5 6 4 0,12 3 2 2 4 3 2 4 5 3 4 6 4 5 6 4 6 6 5 6 6 5 6 6 6 0,25 4 2 3 4 3 5 4 4 5 5 6 5 5 6 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 0,50 4 6 6 5 6 6 5 6 6 5 6 6 5 6 6 5 6 6 5 6 6 5 6 6 1,00 6 7 6 7 7 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6 7 8 6

Control 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 a % (w/v)


Tabla 11. Ensayo extracto acetato de etilo mezcla: Datos obtenidos para la aparición de pupas en cada concentración en el tiempo Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Concentración a R1


0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 2 0 1 20,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 00,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 2 1 1 2 1 2 3 20,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 3 3 1 3 3 1 3 3 3 4 30,50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 3 4 4 3 4 4 4 4 41,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 2 2 1


0,03 0 1 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 0,06 1 3 1 1 3 1 2 3 1 2 3 1 3 3 2 3 3 2 3 3 3 3 3 4 0,12 2 3 2 2 3 2 2 3 2 2 4 2 2 4 3 2 4 3 2 4 3 2 4 4 0,25 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 0,50 4 4 4 5 4 4 5 4 4 5 4 4 5 4 4 5 4 4 5 4 4 5 4 4 1,00 3 2 1 3 2 2 3 2 4 3 2 4 3 2 4 3 2 4 3 2 4 3 2 4

Control 4 3 4 5 4 4 5 4 4 6 5 6 6 7 6 7 8 6 8 8 6 8 9 6 a % (w/v)


Tabla 12. Ensayo extracto acetato de etilo mezcla: Datos obtenidos para la mortalidad de pupas en cada concentración en el tiempo Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Concentración a R1


0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0,50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 2 1 0


0,03 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0,06 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0,12 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 2 0,25 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0,50 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1,00 2 1 0 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1

Control 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 a % (w/v)


Tabla 13. Ensayo extracto acetato de etilo mezcla: Datos obtenidos para la emergencia de adultos en cada concentración en el tiempo Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Concentración a R1


0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 10,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 00,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 10,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 00,50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 11,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 2 0 1 3


0,03 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 2 1 1 2 1 2 2 1 2 2 2 2 2 2 0,06 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 3 0 2 3 1 2 3 1 2 3 2 2 3 3 0,12 1 2 1 2 2 1 2 2 1 2 3 1 2 3 1 2 4 2 2 4 2 2 4 2 0,25 1 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0,50 2 2 3 3 3 4 4 3 4 4 3 4 4 3 4 4 3 4 4 3 4 4 3 4 1,00 1 1 3 1 1 3 1 1 3 1 1 3 1 1 3 1 1 3 1 1 3 1 1 3

Control 3 2 3 4 2 4 4 3 4 4 3 4 5 6 5 6 6 5 6 7 6 7 8 6 a % (w/v)


Tabla 14. Ensayo extracto acetato de etilo puro: Datos obtenidos para la mortalidad de larvas en cada concentración en el tiempo Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Concentración a R1


0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 2 2 1 2 2 2 2 2 2 3 2 2 3 2 3 3 0,06 0 0 0 1 2 0 1 3 1 2 4 3 3 4 3 3 5 3 3 5 4 4 5 4 4 5 4 0,12 1 0 0 1 1 1 2 1 1 4 2 2 5 3 2 5 4 3 5 5 3 5 5 4 5 5 5 0,25 1 3 2 2 3 3 1 4 3 2 5 3 3 6 4 4 6 5 4 6 5 4 7 5 5 7 6 0,50 3 3 2 4 3 3 6 5 3 6 6 5 7 6 6 7 6 6 7 6 6 7 7 6 7 8 6 1,00 4 3 4 5 3 4 5 4 6 6 5 6 6 6 7 7 6 7 7 6 8 7 6 8 8 6 8


0,03 2 3 3 3 3 4 4 3 5 5 4 7 5 5 7 7 6 8 7 7 8 7 7 8 0,06 4 5 4 4 6 6 5 6 6 6 7 6 6 7 6 7 7 6 7 8 7 7 8 7 0,12 5 6 5 6 7 5 6 7 6 7 7 6 7 7 6 7 7 8 7 7 8 7 7 8 0,25 5 7 6 6 7 6 7 7 7 8 7 7 8 7 7 8 7 7 8 7 8 8 7 8 0,50 7 8 6 7 8 8 7 8 8 7 8 8 8 8 9 8 8 9 8 8 9 8 8 9 1,00 8 7 8 8 7 8 8 7 8 8 7 8 8 7 9 8 7 9 8 7 9 8 7 9

Control 1 0 1 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 0 3 a % (w/v)


Tabla 15. Ensayo extracto acetato de etilo puro: Datos obtenidos para la aparición de pupas en cada concentración en el tiempo Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Concentración a R1


0,03 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 2 1 0 2 1 0 2 1 2 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2 1 2 2 2 3 2 2 3 3 2 3 3 2 3 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 1 1 2 1 2 2 2 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 0,25 0 0 0 0 0 0 0 2 1 1 2 1 2 2 1 2 3 2 2 3 2 2 3 2 2 3 2 0,50 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 2 1 1 2 1 1 2 2 1 2 2 1 1,00 0 0 0 0 0 0 2 1 1 2 1 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 3 1 2 3 1


0,03 3 2 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 0,06 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 0,12 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 3 3 2 0,25 2 3 2 2 3 2 2 3 2 2 3 2 2 3 2 2 3 2 2 3 2 2 3 2 0,50 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 1,00 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1

Control 7 7 5 7 7 6 7 8 6 7 8 7 8 10 7 8 10 7 8 10 7 8 10 7 a % (w/v)


Tabla 16. Ensayo extracto acetato de etilo puro: Datos obtenidos para la mortalidad de pupas en cada concentración en el tiempo

Día 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Horas 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Concentración a R1


0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 2 1 1 2 1 1 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 2 1 1 2 1 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 1 2 1 1 2 2 0,50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1,00 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 2 1 0 2 2 0 0 2 0


0,03 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 0,06 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 0,12 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 0,25 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 1 2 2 0,50 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1,00 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0

Control 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 a % (w/v)


Tabla 17. Ensayo extracto acetato de etilo puro: Datos obtenidos para la emergencia de adultos en cada concentración en el tiempo



0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 2 1 1 2 1 1 2 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 2 1 1 2 1 1 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0,50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1


0,03 1 1 0 1 1 0 1 1 0 2 1 0 2 1 0 2 2 0 2 2 0 2 2 0 0,06 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 0,12 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 0,25 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0,50 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1,00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Control 3 4 3 3 4 3 3 4 3 5 7 4 6 7 5 6 7 6 8 8 6 8 8 6 a % (w/v)


Tabla 18. Ensayo extracto azeótropo (acetato de etilo + agua): Datos obtenidos para la mortalidad de larvas en cada concentración en el tiempo



0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0,50 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 2 2 1 2 1,00 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 2 1 1 2 1 2 2 1 2 3 2 2 3


0,03 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0,06 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0,12 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0,25 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0,50 2 1 2 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1 3 1,00 2 2 3 4 3 4 2 3 4 5 3 4 5 3 4 5 3 4 5 3 4 5 3 4

Control 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 a % (w/v)


Tabla 19. Ensayo extracto azeótropo (acetato de etilo + agua): Datos obtenidos para la aparición de pupas en cada concentración en el tiempo



0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 2 2 1 2 2 2 3 4 2 3 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 2 1 1 3 1 2 3 1 2 3 4 3 0,50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 2 1 1 2 2 1 3 2 2 5 4 3 4 5 4 1,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 3 1 3 4 2 4 4 3 4 4 3 4 5 3


0,03 2 3 3 2 3 3 4 4 5 4 4 5 6 6 6 7 6 6 8 6 6 8 6 6 0,06 2 3 4 4 3 4 5 4 4 6 4 5 7 6 6 7 7 6 8 7 6 8 7 6 0,12 4 2 4 5 2 4 5 2 5 5 2 6 5 4 6 6 4 7 6 4 7 6 5 7 0,25 3 4 3 3 5 4 4 5 4 4 6 4 5 6 4 5 7 4 6 7 6 6 7 6 0,50 4 5 4 5 5 4 5 5 4 5 5 4 6 5 4 6 5 5 6 6 5 7 6 5 1,00 4 5 3 4 5 3 4 5 3 4 6 3 4 6 3 4 6 3 5 6 4 5 6 4

Control 4 3 4 5 4 4 5 5 4 6 5 6 6 6 6 7 8 6 7 8 6 7 8 7 a % (w/v)


Tabla 20. Ensayo extracto azeótropo (acetato de etilo + agua): Datos obtenidos para la mortalidad de pupas en cada concentración en el tiempo



0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0


0,03 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0,06 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0,12 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0,25 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0,50 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 0 1 2 0 1,00 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 2 0 1 2 0 1 2 1 1 2 1

Control 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 a % (w/v)


Tabla 21. Ensayo extracto azeótropo (acetato de etilo + agua): Datos obtenidos para la emergencia de adultos en cada concentración en el tiempo



0,03 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0,06 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 2 0 1 1 0 1 1 0,12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 2 0 0 2 0,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 0 1 2 1 2 0,50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 1,00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 2 1 3 3 2 3 4 3


0,03 1 1 2 2 1 2 2 2 3 2 3 3 3 2 3 3 3 4 5 4 4 6 5 5 0,06 1 2 1 1 2 2 2 3 3 2 3 3 4 3 3 5 4 3 6 5 5 6 7 5 0,12 2 2 3 2 2 1 3 2 3 4 2 4 4 2 5 5 3 5 5 4 5 6 4 6 0,25 2 1 2 3 1 2 3 4 3 3 4 4 3 4 4 4 5 4 5 5 4 5 6 4 0,50 3 3 2 4 4 3 4 4 3 4 4 3 4 4 3 5 4 4 5 4 4 6 4 5 1,00 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 3 4 3 4 4 3 4 4 3

Control 3 3 4 3 3 4 4 4 4 4 4 4 5 5 4 6 5 5 6 6 5 6 7 6 a % (w/v)


BIBLIOGRAFÍA 1. Assar A. A. and el-Sobky M. M. 2003. Biological and histopathological studies of some plant

extracts on larvae of Culex pipiens (Diptera: Culicidae). J Egypt Soc Parasitol., 33(1):189-200.

2. Botero, D y Restrepo M. (1998) Parasitosis Humanas. CIB (Corporación para Investigaciones Biológicas). pp. 158-165, 294-297, 378-382. Tercera Edición. Medellín, Colombia.

3. Biblioteca de Consulta Microsoft ® Encarta ® 2004. © 1993-2003 Microsoft Corporation.

Reservados todos los derechos. Búsquedas: Mosquito, Filarias, Fiebre amarilla, Dengue. 4. Bruneton J. Farmacognosia: fitoquímica, plantas medicinales. 2a edición, Zaragoza, España.

Editorial Acribia, 2001 5. Curtis C. F. Control of Malaria Vectors in Africa and Asia. Consultado 26 marzo de 2005 en

http://ipmworld.umn.edu/ chapters/curtiscf.htm 6. Doggett S. NSW Health. Consultado 26 marzo de 2005 en

http://www.arbovirus.health.nsw.gov.au/

7. Dominguez X. A. (1979) Métodos de Investigación Fitoquímica. Editorial Limusa S.A. México. 8. Duke. J. Handbook of Energy Crops – 1983 Handbook of Energy Crops. Unpublished. Publicado

solo en Internet. last update July 9, 1996. Consultado 14 octubre de 2005 en http://www.hort.purdue.edu/newcrop/duke_energy/Eichornia_crassipes.html

9. Dussán, J., Andrade, D., Lozano, L. 1995 Microbiología aplicada II : Caracterización de ADN plasmídico de cepas nativas útiles en control biológico CIMIC-Colciencias.

10. Dussán, J., Andrade, D., Lozano, L.1997. Relación de ADN plasmídico y actividad larvicida en

cepas nativas de Bacillus sphaericus. Revista Colombiana de Entomología. 23:103-106 11. Dussán, J., Andrade, D., Lozano, L. & Vanegas, S. 2002. Caracterización fisiológica y genética de

cepas nativas de Bacillus sphaericus. Revista Colombiana de Biotecnología. 4:89-99. 12. Edman J. Day J. and Walker E. (1985). Ecology of Mosquitoes Proceedings of Workshop. Vector-

Host interplay, Factors Affecting Disease Transmission. pp. 273-285 Edited by Lounibos L. P., Rey J. R. and Frank J. H. Florida Medical Entomology Laboratory. Vero Beach, Florida. USA.

13. Emgesa-Centro de Investigaciones en Ingeniería Ambiental (CIIA) (1998). Saneamiento Ambiental

del Embalse del Muña.

14. Gillett J. D. (1971) Mosquitos. Richard Clay (The Chaucer Press), Ltd. Chapter 1: Mosquitos in General pp. 1-11; Chapter 2: Eggs pp. 12, 26; Chapter 3: Larvae pp. 27-48; Chapter 4: Pupae pp. 49-55; Chapter 5: Adults pp. 56-78; Chapter 7: The Feeding Cycle pp 89-99. Chapter 8: The Ovarian Cycle pp. 100-105. The Circadian Rhythm pp. 106-118. London, Great Britain.

15. Gobernación de Cundinamarca. Consultado 23 de Agosto de 2005 en

http://www.cundinamarca.gov.co/cundinamarca/municipios

16. Gohl, B. 1981. Tropical feeds. Feed information summaries and nutritive values. FAO Animal Production and Health Series 12. FAO, Rome. Citado por (8)

17. Grantham R., General Mosquito Biology. Consultado 26 marzo de 2005 en

http://www.ento.okstate.edu/mosquito/biology.html 18. Hamersley M. R., Howes B. L., and White D. S. (2003) Wetlands and Aquatic Processes:

Particulates, Not Plants, Dominate Nitrogen Processing in a Septage-Treating Aerated Pond System. J. Environ. Qual. 32:1895–1904.

19. Harborne J. B. (1998) Phytochemical Methods: A guide to modern techniques of plant analysis.

Chapman & Hall 3rd edition. UK. 20. Krishnamoorthy K., Rajendran G. and Panicker K. N. (1994) Aquatic vegetation and their natural

hospitability to the immatures of Mansonia mosquitos, the vectors of Brugia malayi in Shertallai, Kerala, India. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 25(4):760-5

21. Lancar L. and Krake K. (2002) Aquatic Weeds & their Management. International Commission on

Irrigation and Drainage. pp 2, 20. 22. Lymphatic Filariasis. Consultado 26 marzo de 2005 en http://scarab.msu.montana.edu/

historybug/filariasis.htm 23. Matai, S. and Bagchi, D.K. 1980. Water hyacinth: a plant with prolific bioproductivity and

photosynthesis. p. 144-148. In: Gnanam, A., Krishnaswamy, S., and Kahn, J.S. (eds.), Proc. Internat. Symp. on Biol. Applications of Solar Energy. MacMillan Co. of India, Madras. Citado por (8)

24. Menezes R. L., da Silva E., Ferreira N. T., Hamada N. (2003) Mansonia spp. (Diptera: Culicidae)

associated with two species of macrophytes in a Varzea lake, Amazonas, Brazil. Entomotropica, Vol. 18(1): 21-25.

25. Mosquito Photos, NSW Health. Coquillettidia & Mansonia Adults & Larvae. Consultado 26 marzo

de 2005 en http://www.arbovirus.health.nsw.gov.au/areas/arbovirus/mosquit/photos/mosquitophotos_coquillettidia_mansonia.htm

26. Ogari J. and M. Van Der Knaap (2002) Management and Ecological Note Solarization of water hyacinth, Eichhornia crassipes, on Lake Victoria. Fisheries Management and Ecology 9, 365–367

27. Ortega G., 2004; Evaluación de la producción piloto de la cepa nativa Bacillus sphaericus

OT.4b25 utilizando sustratos comerciales; Tesis de grado MSc Universidad de los Andes; Bogotá. Colombia

28. Pedigo, L. P. Entomology & Pest Managment. 3.Insect Classification. pp. 126-129. Second

Edition. Prentice Hall N.York. 29. Petrucio M. M. and Esteves M. A. (1999) Uptake Rates of Nitrogen and Phosphorous in the Water

by Eichhornia crassipes and Salvinia auriculata. Rev. Brasil. Biol., 60(2): 229-236 30. Plummer M. L. (2005) Impact of Invasive Water Hyacinth (Eichhornia crassipes) on Snail Hosts of

Schistosomiasis in Lake Victoria, East Africa. © EcoHealth Journal Consortium.

31. Polprasert, C.; Kongsricharoern, N. and Kanjanaprapin, W. (1994) Production of feed and fertilizer

from water hyacinth plants in the tropics Waste Management and Research 12:1. Citado por (13) 32. Savage H. M. , Rejmankova E. , Arredondo-Jiménez J. I. , Roberts D. R. and Rodríguez M. H.

(1990) Limnological and botanical characterization of larval habitats for two primary malarial vectors, Anopheles albimanus and Anopheles pseudopunctipennis, in coastal areas of Chiapas State, Mexico. J Am Mosq Control Assoc. 6(4):612-20.

33. Saxena R. C, Dixit O. P, and Sukumaran P. (1992) Laboratory assessment of indigenous plant

extracts for anti-juvenile hormone activity in Culex quinquefasciatus. Indian J Med Res. 95:204-6. 34. Scheffer M., Szabó S., Gragnani A., van Nes E. H., Rinaldi S., Kautsky N., Norberg J., Roijackers

R. M. M., and Franken R. J. M. (2003) Floating plant dominance as a stable state. PNAS: Vol. 100, No. 7: 4040–4045

35. Spira W. M., Huq A., Ahmed Q. S., and Saeed Y. A. (1981) Uptake of Vibrio cholerae Biotype eltor

from Contaminated Water by Water Hyacinth (Eichornia crassipes) Applied and Environmental Microbiology, Vol. 42, No. 3: p. 550-553.

36. Statistix 8.0. Copyright ©, 1985-2003, Analytical Software. All Rights Reserved. 37. Taxonomy NCBI, Eichhornia crassipes Consultado 10 septiembre de 2005 en

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=44947. 38. Tropica acuarium plants, Eichhornia crassipes. Consultado 15 septiembre de 2005 en

http://www.tropica.dk/productcard_1.asp?id=095 39. United States Department of Agriculture Natural Resources Conservation Service. Plants

Database. Consultado 12 septiembre de 2005 http://plants.usda.gov/ 40. Victor T. J. , Marimuthu S. and Sivaramakrishnan K. G. (1991) Aquatic macrophytes and the

associated mosquitoes in and around Madurai City (Tamil Nadu). Indian J Malariol., 28(3):151-5. 41. Wikimedia Foundation. Búsqueda azeótropo, consultado el 13 de Abril de 2006 en

http://es.wikipedia.org, Wikipedia® es una marca registrada de Wikimedia Foundation, Inc. 42. Zamora J. y Dussan J., 2005; Caracterización cinética de la cepa nativa Colombiana OT 4b.25 de

Bacillus sphaericus para el escalamiento y formulación de un biopesticida controlador de mosquitos vectores de enfermedades tropicales; Proyecto del Centro De Investigaciones Microbiológicas-CIMIC, Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Bogotá. Colombia.

caracterizaciÓn preliminar de eichhornia crassipes y

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