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UNIVERSIDAD NACIONAL DE GENERAL SAN MARTÍN
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas “Rodolfo A. Ugalde”
Caracterización antigénica y funcional de la
proteína TSSA (Trypomastigote Small Surface
Antigen) de Trypanosoma cruzi
Tesis para optar por el Título de Licenciada en Biotecnología de la
Universidad Nacional de General San Martín.
Autor: Virginia Balouz
Director: Carlos A. Buscaglia
Octubre 2014
Abreviaturas
2
Agradecimientos
“… debemos compartir nuestro conocimiento con otros; todos tenemos muchas más capacidades de las que
utilizamos. Algunos lo descubrimos antes que otros…”
Brian Weiss: “Muchas vidas, muchos maestros”.
Agradezco a mis papás, por darme la oportunidad de estar aquí, ahora. Por el amor y apoyo
incondicional.
A Carlos, por su paciencia y por permitirme trabajar a su lado. Gracias por transmitirme tu
conocimiento y pasión por la investigación.
A Nati y Male, por ser hermanas, amigas y ejemplo. Las amo.
A Gaspar, por enseñarme y tenerme paciencia cuando más lo necesité.
Gracias a mis profesores, por transmitirme su pasión por el conocimiento.
Al Dr. Santiago Carmona y al Dr. Fernán Agüero, por compartir sus resultados conmigo, a la Dra.
Valeria Tekiel, por las infecciones de los ratones y a la Dra. Karina Pasquevich, que me ayudó a
entender y aplicar mejor la estadística.
A Mili por los ensayos de infección con parásitos y a Diego Rey, por compartir sus HeLa conmigo y
ensañarme a cuidarlas.
Agos, Su, Vicky, Jose, Sole, Chechu, Nicolino, Fran, Euge, les agradezco por ser una compañía
irremplazable, por hacerme reír siempre. A mis compañeros de en frente Maru, Cyn y Eze, por la
sonrisa y el ejemplo de pasión por el trabajo.
A Mili, Toti, Nachon, por compartir su conocimiento conmigo y ayudarme siempre.
Lu, gracias por tu paciencia y altruismo, por transmitirme tu amor por el trabajo bien hecho.
A Peter, quien me recomendó el libro citado al principio de esta página, gracias por ayudarme a
vencer mis miedos y transitar esta vida con más paz.
A mis amigas, Kei, Orne, Caro y Mai, por ir conmigo a la par.
A Pablín: Lamentablemente, en tantos años de estudio y a pesar de los esfuerzos, no hemos podido
demostrar la ausencia de ALIENS en nuestro planeta. Considerando nuestros avistamientos diarios,
creo que sería prudente abortar la misión. P.D.: Deberías considerar comprarte una agenda, genio.
A mis compañeros, Ani, Tite, Brian, Agus, Fran, Lu, por transitar conmigo este camino y enseñarme
que los prejuicios son sólo eso, prejuicios.
A Nelly, Heber, Nancy, Zulma, Kari y Fede por la sonrisa de todos los días.
A Magia y Timba, por su amor incondicional en cualquier situación, por recibirme siempre con un
rabo oscilante y demostrarme lo poco que les importa cuánto yo sepa, al quedarse dormidas en mi
falda en cada informe redactado frente a la PC.
A Juani, por tu paciencia, tu compañía, por hacerme feliz, por ayudarme a ser mejor persona y
amarme como soy (yo sé que es difícil). Te amo. Gracias.
I
Parte de los resultados obtenidos en este trabajo han sido presentados
(o están próximos a ser presentados) en los siguientes trabajos:
Cytokine Production but Lack of Proliferation in Peripheral Blood Mononuclear Cells from Chronic Chagas'
Disease Cardiomyopathy Patients in Response to T. cruzi Ribosomal P Proteins. Silvia A. Longhi, Augusto
Atienza, Graciela Perez Prados, Alcinette Buying, Virginia Balouz, Carlos A. Buscaglia, Radleigh Santos,
Laura M. Tasso, Ricardo Bonato, Pablo Chiale, Clemencia Pinilla, Valeria A. Judkowski, Karina A. Gómez.
PLoS Negl Trop Dis. 2014 doi: 10.1371/journal.pntd.0002906.
Use of high-density peptide microarrays to study natural immune responses directly from human clinical
samples. Santiago J Carmona, Morten Nielsen, Claus Schäfer-Nielsen, Juan S Mucci, Virginia Balouz,
Valeria Tekiel, Alberto C Frasch, Oscar Campetella, Jaime Altcheh, Carlos A Buscaglia, and Fernán Agüero.
Manuscrito enviado
Mapping antigenic and adhesive motifs in the Trypomastigote Small Surface Antigen (TSSA) from
Trypanosoma cruzi. Virginia Balouz, María de los Milagros Cámara, Gaspar E. Cánepa, Santiago J.
Carmona, Romina Volcovich, Jaime Altcheh, Fernán Agüero and Carlos A. Buscaglia. Manuscrito
en preparación
Abreviaturas
II
Abreviaturas
aa: Aa
abs: Absorbancia.
ABTS: 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)
ADN: Ácido desoxirribonucleico.
amp: Ampicilina.
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero.
BSA: Albúmina sérica bovina.
cm: Cloranfenicol.
DAPI: 4',6-diamino-2-fenilindol.
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium.
DMSO: Dimetilsulfóxido.
dpi: Días post-infección.
DTT: Ditiotreitol.
EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético.
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay): Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas.
FN: Falso negativo.
fw: Forward.
GPI: Glicosilfosfatidilinositol.
GST: Glutatión-S-Transferasa.
HAI: Hemoaglutinación indirecta.
HRP (horseradish peroxidase): Peroxidasa de rábano.
IFI: Inmunofluorescencia indirecta.
IgG: Inmunoglobulina G.
IgM: Inmunoglobulina M.
IPTG: Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido.
kDa: KiloDalton.
km: Kanamicina.
LB: Medio de cultivo Luria-Bertani.
MASPs (Mucin-associated surface proteins): Proteínas de superficie asociadas a mucinas.
MEM (minimum essential medium): Medio mínimo esencial.
min.: Minutos
nm: Nanómetros.
NTD (Neglected Tropical Disease): Enfermedad tropical desatendida.
Abreviaturas
III
OVA: Ovoalbúmina.
PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis): Electroforesis en gel de poliacrilamida.
PBS: Buffer fosfato salino.
PCR (Polimerase Chain Reaction): Reacción en cadena de la polimerasa.
rv: Reverse.
SAPA (Shed Acute Phase Antigen): Antígeno secretado de fase aguda
SD: Desvío estándar.
SFB: Suero fetal bovino.
TBS: Tris buffer salino.
TIA (Trans-sialidase Inhibition Assay): Ensayo de inhibición de la trans-sialidasa.
TMB: 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina.
TPBS: Tween 20 al 0,05% en buffer fosfato salino.
TTBS: Tween 20 al 0,05% en buffer Tris salino.
TSs: Trans-sialidasas
TSSA (Trypomastigote Small Surface Antigen): Antígeno pequeño de la superficie del tripomastigote.
U.A.: Unidades Arbitrarias.
VP: Verdadero positivo.
5-FAM: 5- CarboxyFluorescein-Aminohexyl Amidite.
Glosario
IV
Glosario
carrier: Proteína transportadora usada para la conjugación de péptidos.
cut-off: Línea de corte.
if-then: Si- entonces
performance: Desempeño, rendimiento.
pooles: Mezclas.
screening: Búsqueda, en general a gran escala, de fenómenos de interés.
Índice
V
Índice
Introducción 1
Trypanosoma cruzi y Enfermedad de Chagas 1
Transmisión de la Enfermedad de Chagas 2
Epidemiología e Iniciativas para el control de la Enfermedad de Chagas 3
Diagnóstico de la Enfermedad de Chagas 4
Mecanismos de invasión de Trypanosoma cruzi 5
Trypomastigote Small Surface Antigen (TSSA) 6
Objetivos 9
Objetivos Generales 9
Objetivos Específicos 9
Resultados 10
I. Caracterización de la respuesta inmune humoral contra TSSA en pacientes
Chagásicos 10
I.I Estudio de la región antigénica de TSSA VI 10
I.I.I Microarreglo de péptidos 10
I.I.II Clonado, expresión y purificación de proteínas recombinantes 11
I.I.III Estudios de ELISA usando proteínas recombinantes 12
I.II Ensayo de inmunodetección basado en el péptido E2E3 16
I.II.I Estandarización 16
I.II.II Evaluación 19
I.III Exploración de la variabilidad de la respuesta inmune humoral contra TSSA 21
I.III.I Evaluación de TSSA como marcador de infecciones congénitas 21
I.III.II Estudio de la respuesta inmune contra TSSA en un modelo de infección
murino 24
II. Mapeo del dominio de interacción de TSSA VI con células no macrofágicas 27
II. I Ensayos de interacción con monocapas de células no macrofágicas 27
II. II Ensayos de infección in vitro 28
Discusión 32
I. Caracterización de la respuesta inmune humoral contra TSSA en pacientes
Chagásicos 32
Índice
VI
II. Mapeo del dominio de interacción de TSSA VI con células no macrofágicas de
mamíferos 36
Conclusiones 38
Materiales y Métodos 39
Microarreglo de péptidos 39
Cepas bacterianas y plásmidos 40
Oligonucleótidos 41
Preparación de células competentes 41
Construcción de las variantes delecionales de TSSA VI 41
Secuenciación 42
Expresión y purificación de proteínas recombinantes 42
Condiciones de Cultivo bacteriano 43
Técnicas de biología molecular 43
Péptidos 43
Acoplamiento de los péptidos 43
Homogenato de tripomastigotes 44
ELISA 44
ELISA de desplazamiento 45
Ensayos de pegado de proteínas recombinantes a células en cultivo 45
Detección colorimétrica 46
Criterios de positividad y negatividad en los ensayos de ELISA 46
Paneles de sueros usados 47
Infecciones de ratones 47
Infecciones de células en cultivo con T. cruzi 47
Viabilidad de los parásitos 48
Viabilidad celular 48
Análisis estadístico 49
Información suplementaria 50
Referencias Bibliográficas 52
Notas 58
Introducción
1
Introducción
Trypanosoma cruzi y Enfermedad de Chagas
La Tripanosomiasis Americana, comúnmente llamada Enfermedad de Chagas, es causada por el
parásito protozoario Trypanosoma cruzi1. Considerada una de las 17 enfermedades tropicales desatendidas
(Neglected Tropical Diseases, NTD) actuales2, la Enfermedad de Chagas es endémica en 21 países de
América. En los últimos años, y debido a fenómenos migratorios humanos, también se ha registrado un
aumento en el número de casos en países no endémicos3.
T. cruzi es un parásito unicelular flagelado cuyo ciclo de vida digeneico se desarrolla alternando entre
insectos triatominos (Subfamilia: Triatominae, Familia: Reduviidae, Orden: Hemiptera) y un amplio rango de
hospedadores vertebrados domésticos y salvajes, incluyendo al hombre1,4
. En cada hospedador, el parásito
atraviesa distintos estadios morfológicos mayoritarios; dentro del insecto vector se desarrollan los estadios de
epimastigote y tripomastigote metacíclico y en el hospedador vertebrado, los estadios de amastigote y
tripomastigote sanguíneo4. El ciclo infectivo comienza cuando el insecto hematófago ingiere tripomastigotes
(forma infectiva no replicativa) presentes en la sangre del humano infectado. Dentro del tracto digestivo del
insecto, los tripomastigotes se diferencian extracelularmente a epimastigotes (forma replicativa no infectiva).
Al alcanzar la última porción del tracto digestivo, los parásitos se diferencian al estadio de tripomastigote
metacíclico (forma infectiva no replicativa), los cuales son liberados junto a las heces del insecto cuando éste
se alimenta. El parásito ingresa al organismo humano por lesiones en la piel o las mucosas, e infecta las
células cercanas al sitio de inoculación. Una vez dentro de las células, el parásito se diferencia a amastigote,
que es la forma replicativa intracelular. Luego de varias rondas de división celular en el citoplasma de la
célula infectada, los amastigotes se transforman nuevamente en tripomastigotes (distintos bioquímica y
morfológicamente a los tripomastigotes metacíclicos), los cuales escapan de la célula y, vía fluídos
extracelulares, invaden distintos tipos celulares del corazón, ganglios y otros tejidos1.
Luego de un período de incubación de 5-40 días, el 10-30% de los individuos infectados comienzan a
manifestar los síntomas de la etapa aguda de la Enfermedad de Chagas. En esta etapa resulta frecuente la
aparición de un edema en el sitio de infección denominado ‘Chagoma’ o bien, cuando la entrada del parásito
es por conjuntiva ocular, de un edema palpebral unilateral característico denominado Signo de Romagna5,6
.
Estas manifestaciones facilitan el diagnóstico de la enfermedad; sin embargo, es común que la misma se
presente de manera subclínica o asociada con síntomas inespecíficos como dolor de cabeza, fiebre, dolor
estomacal, anorexia, entre otros. La tasa de mortalidad del Chagas agudo es del 5-10%, siendo las víctimas
más frecuentes los niños que desarrollan miocarditis o meningoencefalitis5,6
. La fase aguda, caracterizada por
altos niveles de parasitemia, concluye cuando se alcanza un equilibrio patógeno-hospedador en el cual el
número de tripomastigotes circulantes se reduce drásticamente y se produce la “seropositivización”: un
aumento significativo de la reactividad serológica contra distintos antígenos de T. cruzi.
Introducción
2
En ausencia de tratamiento con las drogas disponibles, que presentan eficacia subóptima y efectos
adversos7, las personas infectadas entran en la fase crónica de la enfermedad. La mayoría de los pacientes
Chagásicos permanecen asintomáticos durante sus vidas, aunque representan una potencial fuente de
transmisión y pueden sufrir una reactivación de la infección si son inmunosuprimidos8. Alrededor del 30% de
las personas infectadas desarrollan, al cabo de años o décadas, las manifestaciones clínicas características de
la Enfermedad de Chagas crónica9. Las patologías más comunes incluyen las cardiomiopatías y desórdenes
gastrointestinales como megaesófago y megacolon1,6,10,11
.
Las variaciones geográficas en la prevalencia y gravedad de las formas clínicas han sido asociadas
con aspectos inmunológicos y/o genéticos de las diferentes poblaciones humanas y/o a la complejidad
genotípica de la población del parásito12
. Hasta el momento, distintas tipificaciones bioquímicas y
moleculares realizadas sobre múltiples aislamientos o cepas del parásito han permitido delinear al menos 6
linajes evolutivos dentro de la especie T. cruzi, llamados TcI a TcVI13
. Estos linajes muestran fenotipos muy
diferentes a nivel de infectividad en el insecto vector, invasión y multiplicación intracelular in vitro,
susceptibilidad a drogas, tropismo tisular y/o virulencia en modelos animales definidos14–17
. Si bien la
situación eco-epidemiológica no ha sido bien definida, el escenario emergente de distintos estudios indica que
los linajes TcIII y TcIV son encontrados principalmente en animales selváticos mientras que los linajes
restantes parecerían estar relacionados con los ciclos de infección peridomésticos y/o domésticos, y de hecho
también han sido encontrados en pacientes infectados17,18
. Más recientemente, sin embargo, el linaje TcIV
(junto al TcI) ha sido identificado en brotes infecciosos humanos en zonas selváticas, posiblemente
relacionados con la vía de transmisión oral del parásito (ver debajo)19,20
.
Transmisión de la Enfermedad de Chagas
En zonas endémicas la vía de transmisión más prevalente es la vectorial, aunque el contagio también
puede ocurrir por transmisión oral al consumir comidas o bebidas contaminadas con insectos infectados o su
excreta19,20
. Otros modos de transmisión conocidos son la transferencia vertical de madre a hijo durante el
embarazo o en el parto, la transmisión por trasplantes con órganos infectados y/o transfusiones sanguíneas,
así como también por accidentes en laboratorios1. Las medidas sanitarias tomadas por los países endémicos
(ver más adelante) han logrado disminuir significativamente los casos de infección vectorial1. Sin embargo,
esta disminución ha puesto de manifiesto la importancia de la transmisión vertical, incluso en países donde la
enfermedad no es endémica. La prevalencia de la Enfermedad de Chagas en mujeres embarazadas en
América Latina es de 12,5% a 40% dependiendo de la zona geográfica, y la tasa de transmisión vertical oscila
entre un 1% a un 18,2%21
, indicando que la infección congénita por T. cruzi será un tema central de la Salud
Pública regional por al menos los próximos 20 años. Los factores que han sido relacionados con el riesgo de
trasmisión vertical incluyen la fase de la enfermedad en la que se encuentra la madre, el estatus
inmunológico, el linaje evolutivo de la cepa infectante y el aumento de la carga parasitaria por fenómenos de
Introducción
3
“reactivación”22
. A modo de prevención, se recomienda hacer análisis serológicos a las mujeres embarazadas
que vivan o hayan vivido en zonas endémicas, que vivan en zonas no endémicas pero hayan recibido
transfusiones sanguíneas en un país endémico, o que sean hijas de madres nativas de zonas endémicas. Los
recién nacidos infectados con T. cruzi suelen nacer prematuramente razón por la cual presentan bajo peso y
dificultad respiratoria, también pueden presentar un menor índice de APGAR, hepatomegalia,
esplenomegalia e ictericia23
. Muchos casos de infección congénita con T. cruzi, sin embargo, pueden
presentar síntomas no específicos, tal como se observa en otras infecciones congénitas (por ejemplo,
Toxoplasma gondii, el virus Rubéola, virus Herpex Simplex y Citomegalovirus21,24
).
Epidemiología e Iniciativas para el control de la Enfermedad de Chagas
Se estima que existen alrededor de 10 millones de personas infectadas con T. cruzi en Latinoamérica
y El Caribe y 0,4 millones de personas infectadas en países no endémicos. Cada año se registran 40000
nuevas infecciones, alrededor de 14000 recién nacidos con infección congénita y 20000 muertes relacionadas
con la Enfermedad de Chagas25
. Debido a las condiciones socio-economicas desfavorables de la mayoría de
las zonas endémicas, se estima que existen entre 25-90 millones de personas en riesgo de infección26
. Sin
embargo, todas estas son aproximaciones imprecisas ya que se basan en estudios estadísticos y supuestos
porcentuales1,27
. Entre las causas que podrían llevar a una subestimación en los índices de prevalencia se
encuentran la falta de una infraestructura adecuada (personal, insumos) para el diagnóstico y tratamiento en
zonas endémicas y las características clínicas particulares de la enfermedad. Por estas razones, se recomienda
tener en cuenta otros factores como presencia y tasa de infección de vectores, prevalencia en animales
domésticos que puedan actuar como reservorio del parásito, seroprevalencia poblacional y porcentajes de
infección en bancos de sangre, para realizar estudios epidemiológicos válidos. A su vez, se recomienda
analizar regiones delimitadas, ya que la prevalencia varía significativamente entre zonas rurales y urbanas1.
Debido a la ausencia de vacunas contra la Enfermedad de Chagas, los métodos más efectivos de
prevención son el control de las poblaciones de vectores mediante el uso de insecticidas (piretroides), el
testeo serológico de bancos de sangre y poblaciones de riesgo28
y la concientización de la población en zonas
endémicas. En países endémicos se han creado programas abocados a controlar la diseminación de la
enfermedad de Chagas usando una combinación de los métodos anteriormente descriptos. Los programas
incluyen el INCOSUR (Iniciativa del Cono Sur, 1991) en Argentina, Brasil, Chile, Paraguay y Uruguay,
IPCA (Iniciativa de los países de Centroamérica, 1997), IPA (Iniciativa de los países Andinos, 1998),
AMCHA (Iniciativa de los países del Amazonas, 2003) y la Iniciativa Mexicana (Iniciativa para la Vigilancia
y el Control de la Enfermedad de Chagas en la República Mexicana, 2004). En Argentina, la prevención y
control de la transmisión de la enfermedad de Chagas fue declarada de interés nacional en la Ley de Chagas
(Ley 26.281 del año 2007) que establece la obligatoriedad de realizar pruebas diagnósticas en mujeres
embarazadas, recién nacidos, hijos de madres infectadas y niños de 6 a 12 años de edad. También, son
Introducción
4
obligatorios los controles serológicos en donantes y receptores de órganos, tejidos y sangre. Los bancos de
sangre y tejidos humanos, los servicios de hemoterapia y los establecimientos públicos o privados de
cualquier denominación legalmente autorizados a extraer o transfundir sangre humana o sus componentes y a
realizar injertos de tejidos y trasplantes de órganos deben practicar los exámenes que establece la autoridad
sanitaria nacional y tomar los recaudos necesarios para evitar toda posibilidad de transmisión de la
enfermedad.
Diagnóstico de la Enfermedad de Chagas
Durante la etapa aguda, y debido a los altos niveles de parasitemia característicos, los métodos
diagnósticos más apropiados son los de detección parasitológica directa. Los métodos más utilizados son el
Strout, Microhematocrito, la Gota fresca, la Gota gruesa y Microtubo. Los 4 últimos son apropiados para
emplear en niños y neonatos debido al bajo volumen de sangre que emplean (0,3 ml). Todos estos métodos se
basan en la detección de parásitos en sangre por microscopía y precisan de personal calificado e
infraestructura adecuada29
. Existen también métodos parasitológicos indirectos como el hemocultivo y el
xenodiagnóstico, aunque éstos son más costosos y laboriosos29
. Por otro lado, se han desarrollado métodos
moleculares para la detección de “productos” del parásito, entre los que destacan los basados en técnicas de
PCR. El blanco más usado es el ADN extranuclear del kinetoplasto30
, el cual se presenta en múltiples copias
(~5.104) dentro de la mitocondria del parásito
31 y, por lo tanto, aumenta la sensibilidad del método respecto a
usar blancos en el ADN nuclear32
. Sin embargo, estos ensayos no son de rutina en el diagnóstico clínico por
su alto costo, requerimientos de equipamiento y personal especializado, y performance subóptima29
.
El diagnóstico de infecciones congénitas puede realizarse sobre sangre del neonato o del cordón
umbilical. Se recomienda la técnica de microhematocrito frente a la gota fresca por ser más sensible,
económica y rápida. En el caso de que el resultado sea negativo se debe realizar un test de detección de
anticuerpos contra T. cruzi luego de 9-12 meses, cuando el neonato ya no presente anticuerpos maternos en
sangre24,29
. En lo que respecta al diagnóstico serológico de infecciones agudas y congénitas, los métodos
basados en la detección de IgMs de distintas especificidades contra antígenos del parásito son
desaconsejados33
y los resultados más promisorios hasta el momento se han obtenido mediante la búsqueda
de IgGs contra el antígeno SAPA (Shed Acute Phase Antigen)34–37
.
Debido a la baja o nula parasitemia, los métodos de detección parasitológica directa y/o indirecta
(microscopía, hemocultivo, xenodiagnóstico y PCR) muchas veces arrojan resultados negativos falsos
durante la fase crónica, por lo que los test serológicos emergen como las herramientas más apropiadas para el
diagnóstico. Algunos de los test usados son: Inmunofluorescencia indirecta (IFI), hemoaglutinación indirecta
(HAI), ELISA, la fijación de complemento, radioinmunoprecipitación y Western blot33,38,39
. De estos ensayos,
los tres primeros se implementan en la actualidad en forma rutinaria en la clínica debido a su simplicidad,
bajos costos y buena performance40
. Debe mencionarse que existen tests de diagnóstico serológico más
Introducción
5
sensibles y específicos, basados en la identificación de anticuerpos particulares, los cuales lamentablemente
son laboriosos y difíciles de implementar a gran escala. Entre ellos, se destaca el TIA (Trans-sialidase
Inhibition Assay) y la detección de anticuerpos contra epitopes glicosídicos de alfa-Galactosa (alfa-Gal)
presentes en las mucinas de tripomastigotes (fracción 2/3 o tGPI-mucins), con propiedades líticas41–44
.
Dado que no existe un ensayo gold standard (que muestre 100% de sensibilidad y especificidad) para
el diagnóstico de la enfermedad de Chagas, la Organización Mundial de la Salud recomienda el uso de al
menos dos test en paralelo, basados en criterios diferentes (en general ELISA y HAI o IFI)45,46
. En caso de
tener resultados ambiguos o discordantes, se recomienda la realización de un tercer test33
. Algunos de los test
de ELISA comerciales se basan en la detección de anticuerpos contra lisados parasitarios (obtenidos de
formas epimastigote) descripto originalmente por Voller y col. en 197547
. Este test, al igual que todos los que
usan mezclas indefinidas de antígenos de T. cruzi, presenta baja especificidad debido a la reacción cruzada de
anticuerpos contra Leishmania spp y ciertas enfermedades autoinmunes48,49
. Distintos antígenos definidos han
sido propuestos y en algunos casos implementados para el diagnóstico de Chagas por ELISA con el objeto de
mejorar la especificidad y sensibilidad. Estos incluyen proteínas purificadas por lectinas50,51
, péptidos
sintéticos52,53
, proteínas recombinantes54–58
y antígenos secretados/excretados de tripomastigotes (TESA)59,60
.
En este contexto, la búsqueda activa de nuevas herramientas (reactivos y/o plataformas de acoplamiento de
los mismos) para el mejoramiento del serodiagnóstico constituye una prioridad en la investigación en
Enfermedad de Chagas33
.
Mecanismos de invasión de Trypanosoma cruzi
El proceso de interacción T. cruzi-célula hospedadora incluye la adhesión y reconocimiento,
señalización, invasión y remodelado. El primer evento involucra el reconocimiento entre moléculas presentes
tanto en el parásito como en la célula huésped; aunque también es posible que moléculas excretadas por el
parásito participen en este proceso61,62
. Un gran número de moléculas del glicocálix de T. cruzi (con aparente
redundancia funcional) han sido involucradas en la interacción inicial de las distintas formas tripomastigote
con la membrana plasmática de la célula huésped63,64
. Estas moléculas, por lo general ancladas por
glicosilfosfatidil inositol (GPI) a la superficie del parásito, se agrupan en distintas familias de glicoproteínas
incluyendo mucinas, trans-sialidasas (TSs)65–67
, moléculas tipo TS (TS-like) y MASPs (Mucin-
associated surface proteins)68,69
entre otras63,64,70
. Las propiedades adhesivas de todas estas moléculas del
parásito se dedujeron inicialmente a partir de ensayos de interacción con células completas y experimentos en
los que la adición exógena de moléculas solubles (proteínas nativas, recombinantes, anticuerpos específicos,
fragmentos Fab o glicosil hidrolasas) modulaba la adhesión e internalización del parásito, interfiriendo con la
interacción receptor-ligando.
Dentro de la familia de las TSs, se ha demostrado que Tc-85 y gp (glicoproteína) 83, restringidas a
los tripomastigotes derivados de células, se unen a integrinas, al receptor del factor de crecimiento nervioso
Introducción
6
TrkA (receptor de tropomiosin kinasa A) y a componentes de la matriz extracelular como fibronectina y
laminina71–74
. Las TSs activas, además, cumplen un rol ‘indirecto’ en la interacción, transfiriendo residuos de
ácido siálico desde los glicoconjugados del huésped a las mucinas del parásito y generando epitopes
glicosídicos involucrados en la adhesión, sobrevida e infectividad del tripomastigote75,76
. La proteína gp82
(un miembro de la familia de TSs restringido a tripomastigotes metacíclicos) interactúa con mucinas
epiteliales77
, mientras que otras moléculas relacionadas como gp90 y gp30 participan en la adhesión de estos
estadios via receptores celulares aún desconocidos65
.
Las mucinas son el grupo de glicoproteínas más numeroso en la superficie de T. cruzi y están
codificadas por dos grandes familias génicas llamadas TcMUC y TcSMUG78
. Las mucinas de T. cruzi
presentan una región central de entre 50-200 aminoácidos (aa) ricas en residuos Ser y Thr, aptas para la O-
glicosilación que les confiere el carácter hidrofílico característico75
. La expresión coordinada de un gran
repertorio de mucinas que contienen regiones variables en la cubierta del tripomastigote sugiere su
participación en la interacción con distintos tipos celulares y/o en el escape de la respuesta inmune del
hospedador78
. Como se mencionó arriba, se ha demostrado que proteínas de superficie tipo mucinas (y/o
epitopes sacarídicos que decoran estas moléculas) están implicadas en el reconocimiento y señalización de la
célula hospedadora65,76,78,79
. Si bien la variabilidad de las mucinas de T. cruzi tanto a nivel de secuencia
peptídica como de modificaciones post-traduccionales es enorme78
, los ligandos celulares para algunas de
estas moléculas han sido propuestos80
.
Trypomastigote Small Surface Antigen (TSSA)
En el año 2002, Di Noia y colaboradores81
describieron una proteína de T. cruzi expresada en la
superficie de tripomastigotes a la cual llamaron antígeno pequeño de la superficie del tripomastigote (TSSA,
Trypomastigote Small Surface Antigen), que generaba una fuerte respuesta humoral en humanos y animales
infectados. Análisis por Southern blot indicaron que el gen que codifica para TSSA se encuentra como copia
única81
, lo cual fue luego ratificado al secuenciarse el genoma de la cepa CL Brener82
. TSSA es una mucina
perteneciente al grupo III de la familia TcMUC78
, el cual comparte la presencia de sitios hipervariables
cercanos al extremo amino terminal, pero no presenta secuencias repetitivas ni corridas de residuos Thr como
los grupos I y II83
. Algoritmos de predicción y comparaciones de la secuencia de TSSA con mucinas
pertenecientes a los grupos TcMUC I y II, permitieron identificar una secuencia señal en el amino terminal de
26 aa con un 76% de similitud83,84
, y una secuencia de anclaje por GPI de 27 aa en el extremo carboxilo
terminal, la cual presenta un 85% de identidad con la señal de anclaje por GPI descripta para los grupos I y
II83
(figura I.1). En consecuencia, luego del procesamiento intracelular de estas señales, la proteína madura (o
core en la figura I.1) contendría aproximadamente 40 aa. Estudios acerca de la expresión a nivel
transcripcional evidenciaron la presencia del ARNm de TSSA en los estadios de epimastigote, tripomastigote
derivados de células, amastigote y tripomastigote metacíclico, siendo este último el de mayor nivel de
Introducción
7
transcripción. Sin embargo, el patrón observado a nivel de transcripción no parece correlacionarse con los
niveles de expresión proteica, ya que estudios por Western blot e inmunofluorescencia indirecta mostraron
que la expresión de TSSA se restringe al estadio de tripomastigotes derivados de células81
. Este fenómeno es
consistente con el predominio de la regulación génica posttranscripcional descripto en T. cruzi, en el cual la
abundancia de ARNm no correlaciona con los niveles de proteína expresada85
.
Análisis bioquímicos sobre la proteína TSSA nativa (aislada de tripomastigotes derivados de células),
así como también sobre la proteína recombinante expresada por epimastigotes transfectados, indicaron que
TSSA es procesada y expuesta en la superficie del parásito como una proteína tipo mucina43,86
. Sin embargo,
en contraste con la mayoría de las proteínas tipo mucina descriptas en T. cruzi78,87
, TSSA es muy pequeña (14
kDa) y no parece sufrir una abundante O-glicosilación in vivo81,86
. Péptidos sintéticos y/o proteínas
recombinantes basados en la región central de TSSA fueron fuertemente reconocidos por sueros de pacientes
Chagásicos y animales infectados con T. cruzi43,81,88
. A su vez, anticuerpos contra la proteína TSSA expresada
en bacterias (sin glicosilar), fueron capaces de reconocer a TSSA en la superficie de tripomastigotes
derivados de células86
. Todos estos resultados, en conjunto, sugieren la exposición de secuencias peptídicas
“desnudas” (es decir, hipoglicosiladas o no glicosiladas) en la superficie de los tripomastigotes derivados de
célula. Por lo tanto, el uso proteínas recombinantes expresadas en E.coli y/o de péptidos sintéticos
constituyen herramientas adecuadas para el estudio de las propiedades antigénicas y funcionales de TSSA86
.
Estudios sobre el locus de tssa, demostraron la presencia de secuencias polimórficas en la zona
central de la molécula, la cual contiene los secuencias antigénicas81
(ver abajo). En la actualidad se han
descripto al menos 6 isoformas mayoritarias de TSSA (figura I.1), las cuales se encuentran en los diferentes
linajes de T. cruzi (TcI a VI), sugiriendo el uso potencial de esta molécula en la tipificación indirecta, usando
técnicas serológicas 43,88–90
.
Proteínas recombinantes conteniendo toda la región central de TSSA VI (presente en los linajes TcII,
TcV y TcVI, figura I.1) o TSSA I (presente en el linaje TcI) fusionadas a Glutatión-S-Transferasa (GST) y un
extenso panel de sueros Chagásicos crónicos y de pacientes afectados por otras parasitosis o enfermedades
autoinmunes permitió el estudio del potencial serodiagnóstico de TSSA. La ausencia de reacción cruzada con
antígenos de Leishmania, la especificidad del 97,4% comparada con el 80-90% que se alcanza con los test
diagnósticos basados en mezclas indefinidas de antígenos y la sensibilidad del 87% usando muestras de
sueros de pacientes Chagásicos seropositivos y más de un 98% al usar muestras de pacientes con parasitemia
positiva, demostraron el potencial de TSSA VI como herramienta para el diagnóstico de infecciones
crónicas43
. Interesantemente, TSSA I mostró un reconocimiento nulo (similar al del control de GST) sobre
esa misma población de pacientes, sugiriendo un fuerte sesgo en los linajes circulantes en infecciones
humanas, al menos en la población estudiada (Argentina, Brasil). Estos datos mostraron cierta correlación
con los obtenidos por tipificación directa de parásitos aislados de pacientes de estas mismas regiones
geográficas89,91
.
Introducción
8
Un mapeo preliminar de epitopes B lineales (los cuales suelen estar conformados por 8-11 aa92
) en la
proteína TSSA VI, basado en un arreglo de péptidos de 8-11 aa con un solapamiento de 5 aa, permitió
identificar la presencia de una secuencia serorreactiva principal 41
KPATGEAPSQ50
y dos secuencias de
menor reactividad 30
TSSTPPSGTEN40
y 36
SGTENKPATG45
(esta última conformada por secuencias de las
dos primeras). Sin embargo, estudios posteriores en el laboratorio mostraron que los datos surgidos de este
mapeo preliminar deben ser revisados, ya que un péptido sintético de secuencia 41
KPATGEAPSQ50
presentó
una prevalencia subóptima al ser ensayado contra un panel de sueros Chagásicos crónicos (~60%; datos no
publicados).
Más recientemente, estudios acerca de la función de TSSA demostraron su participación activa en el
reconocimiento y entrada del parásito en la célula huésped. Este fenómeno quedó evidenciado por la
interacción de moléculas recombinantes de TSSA VI con células de mamíferos, por la drástica reducción de
los niveles de infección de monocapas celulares in vitro en presencia de anticuerpos específicos y/o
moléculas recombinantes de TSSA VI adicionadas exógenamente, y por la complementación del fenotipo
“adhesivo” a estadios no invasivos de T. cruzi (epimastigotes) por expresión ectópica de TSSA VI93
.
Interesantemente, la adición exógena de péptidos sintéticos de TSSA VI provocó la movilización de Ca+2
intracelular y cascadas de señalización de quinasas en la célula huésped. En contraste con estos resultados,
TSSA I presentó bajo niveles de adhesión a monocapas de células no macrofágicas. Más aún, la adición
exógena de péptidos solubles de TSSA I no afectó la infectividad in vitro de tripomastigotes del linaje TcVI
y/o TcI. En conjunto con los datos mencionados anteriormente, estos resultados sugieren que las variaciones
entre las secuencias de las isoformas de TSSA tienen no sólo un impacto en su antigenicidad43,81
, sino que
poseen también un correlato funcional en términos de adhesión y transducción de señales86
.
Objetivos
9
Objetivos
Objetivos Generales
Caracterizar la respuesta inmune humoral contra TSSA VI en pacientes Chagásicos.
Mapear el dominio de interacción de TSSA VI con células no macrofágicas.
Objetivos Específicos
Mapear las secuencias inmunorreactivas de TSSA VI en la etapa crónica de la enfermedad.
Evaluar la reactividad de TSSA VI en sueros de pacientes agudos vectoriales, congénitos y
crónicos, con el propósito de identificar posibles características diferenciales entre los mismos.
Mapear el dominio de interacción entre TSSA y células no macrofágicas de mamíferos.
Resultados
10
Resultados
I. Caracterización de la respuesta inmune humoral contra TSSA VI en pacientes
Chagásicos
I.I Estudio de la región antigénica de TSSA VI
I.I.I Microarreglo de péptidos
Con el objetivo de mapear las secuencias
antigénicas de TSSA VI, se realizó un análisis basado
en un microarreglo de péptidos de alta densidad94
. El
arreglo contenía la secuencia completa de la proteína
TSSA VI, representada por 78 péptidos de 15 aa,
solapados en 14 aa de forma tal de tener una máxima
capacidad de resolución. Este microarreglo fue
evaluado con 2 mezclas de IgGs, cada una de ellas
purificada a partir de un pool de 5 sueros Chagásicos
crónicos, las cuales se ensayaron por duplicado.
La secuencia de cada uno de los péptidos del
microarreglo y sus reactividades individuales para cada
de las muestras se detalla en la tabla S. 1. El perfil de
reactividad global obtenido para cada una de las
muestras se muestra en la figura R.1. En la parte
superior de la imagen se indicaron los péptidos que
coinciden con las proteínas recombinantes usadas en
los análisis posteriores (ver a continuación). Ambas mezclas mostraron un pico único y amplio de
fluorescencia donde no fue posible identificar epitopes B discretos, con reactividad positiva (definida como >
3 Unidades Arbitrarias, U.A., de fluorescencia) para cada uno de los péptidos del 24 al 44 (figura R.1 y tabla
S. 1). Los péptidos reactivos, en conjunto, abarcan la secuencia
24TANGGSTSSTPPSGTENKPATGEAPSQPGASSGEA
58, la cual fue definida como la región antigénica de
TSSA VI. Cada mezcla de IgGs usada generó un perfil de reconocimiento peptídico diferente (figura R.1),
con una reactividad máxima para el péptido 31 (31
SSTPPSGTENKPATG45
, tabla S.1) en la mezcla 1 y para el
péptido 36 (36
SGTENKPATGEAPSQ50
, tabla S.1) en la mezcla 2, poniendo en evidencia la variabilidad de la
respuesta inmune humoral contra TSSA VI en pacientes Chagásicos crónicos. Estos resultados, además,
sugieren que la respuesta inmune humoral contra TSSA VI en muestras de pacientes Chagásicos crónicos es
Resultados
11
compleja, y está conformada por anticuerpos de especificidad levemente diferencial y, por lo tanto,
orientados a distintas secuencias de esta molécula (figura R.1).
I.I.II Clonado, expresión y purificación de proteínas recombinantes
A continuación, con el objetivo de profundizar los estudios sobre la respuesta inmune humoral contra
TSSA VI y refinar la búsqueda de secuencias inmunodominantes dentro de esta molécula, utilizamos un
nuevo acercamiento basado en proteínas recombinantes. Para ello, se generaron 2 conjuntos de variantes
delecionales de la proteína TSSA VI, uno compuesto por 5 proteínas de 15 aa cada una y otro conformado
por 4 proteínas de 9 aa cada uno. Las variantes delecionales se clonaron en el vector de expresión pGEX-2T
con el fin de obtener proteínas de fusión a GST. Los plásmidos obtenidos se introdujeron en la cepa de
Escherichia coli BL21-CodonPlus y se indujo la expresión de las proteínas recombinantes con IPTG. Estas
proteínas fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad a partir de la fracción soluble obtenida luego
de la lisis bacteriana. En paralelo, se expresaron y purificaron siguiendo la misma metodología las proteínas
recombinantes GST, GST-TSSA VI (residuos 24 a 62) y GST-TSSA I (residuos 24 a 61) para ser usadas
como controles. Las últimas 2 proteínas, que ya habían sido descriptas86
, carecen de las secuencias de
direccionamiento a retículo endoplásmico y anclaje por GPI, abarcando exclusivamente la porción de la
proteína potencialmente expuesta en la superficie del tripomastigote de uno u otro linaje evolutivo (ver figura
I.1), que en el caso de TSSA VI coincide casi perfectamente con la región antigénica identificada en el
microarreglo (figura R.1).
Resultados
12
En la figura R.2 se muestran geles SDS-PAGE 12,5% teñidos con Azul brillante de Coomassie en los
que se sembraron 0,5 µg de cada una de las proteínas purificadas. En el panel a se muestran las proteínas
purificadas correspondientes a las variantes de 15 aa (con un peso molecular aparente de ~30 kDa) y las
proteínas GST-TSSA VI y GST-TSSA I, con un peso molecular aparente de ~37kDa y ~35kDa,
respectivamente. En todos los casos, los pesos moleculares aparentes fueron compatibles con los esperados
(ver figura R.3). La figura R.2 (panel b) muestra las proteínas purificadas correspondientes al panel de
variantes de 9 aa, que en todos los casos mostraron un peso molecular estimado de ~29kDa, también
compatibles con los esperados (ver figura R.3). Las diferencias de peso molecular aparente entre GST-TSSA
VI y GST-TSSA I, que no pueden ser explicadas a partir de las diferencias en su composición aminoacídica
(ver figura R.3), ya habían sido reportadas86
. En todos los casos obtuvimos una pureza considerable, reflejada
en la ausencia de bandas adicionales, aunque las proteínas GST-TSSA VI-e2 y GST-TSSAVI-eD,
presentaron bandas secundarias de menor peso molecular aparente, probablemente atribuibles a productos de
degradación parcial. Como resultado final se obtuvieron las proteínas de fusión a GST, representadas
esquemáticamente en la figura R.3. Las variantes delecionales de la serie GST-TSSA VI-e1 a -e5, tienen 15
aa de longitud y presentan un solapamiento parcial de 9 aa entre ellas, mientras que la serie GST-TSSA VI-
eA a -eD se compone de 4 proteínas de 9 aa de longitud y presentan un solapamiento parcial de 3 aa entre
ellas. Como se mencionó, las secuencias aminoacídicas contenidas en las variantes delecionales de 15 aa se
corresponden exactamente con algunos de los péptidos de los microarreglos (figura R.1 y tabla S.1) y, en
conjunto, conforman toda la secuencia inmunorreactiva de TSSA VI deducida a partir del análisis de los
mismos (residuos 24 a 62).
I.I.III Estudios de ELISA usando proteínas recombinantes
Se realizaron ensayos de ELISA usando individualmente las variantes delecionales de 15 aa
explicadas en el punto anterior. Como control positivo se usó la proteína GST-TSSA VI y como controles
negativos las proteínas GST y GST-TSSA I (que no es reconocida por sueros Chagásicos crónicos del sur de
Sudamérica81
). Se analizó un panel de 51 muestras de sueros Chagásicos crónicos (individuos adultos, de
distintos sexos y características etnográficas, y con > de 5 años de infección) proporcionados por el Instituto
Nacional de Parasitología “Dr. Mario Fatala Chabén” y del Laboratorio de Parasitología-Enfermedad de
Chagas del Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutierrez”. Para la determinación del cut-off se usaron en cada
ensayo de 2 a 4 sueros del mismo grupo etario, negativos para los test de Chagas convencionales, obtenidos
de hemocentro (datos no mostrados).
Resultados
13
La proteína TSSA VI (control positivo), presentó una prevalencia de ~90% (46 sueros positivos sobre
51 sueros totales ensayados), concordante con los datos previos43,86
; mientras que la proteína TSSA I no
mostró reactividad con ninguno de los sueros analizados (figura R.4 y datos no mostrados). Interesantemente,
la proteína TSSA VI-e2 presentó la misma prevalencia, y en un 81% de los casos reactividad similar que la
proteína TSSA VI, sugiriendo que es capaz de recapitular en gran medida la performance diagnóstica de
TSSA VI (figura R.4). Las proteínas TSSA VI-e3 y TSSA VI-e4 mostraron prevalencias del ~57% y ~41%,
respectivamente, mientras que las proteínas TSSA VI-e1 y TSSA VI-e5, no mostraron reactividad en los
ensayos (figura R.4). El péptido 48, que posee la misma secuencia que TSSA VI-e5, tampoco había mostrado
reactividad en el ensayo del microarreglo peptídico (figura R.1 y tabla S.1). Sin embargo, el péptido 24, que
posee la misma secuencia que la proteína TSSA VI-e1, sí mostró reactividad para ambas mezclas de IgGs en
el microarreglo (figura R.1 y tabla S.1). Más allá de esta discrepancia, que podría atribuirse a diferencias
metodológicas entre los ensayos de microarreglos peptídicos y ELISA basado en proteínas recombinantes
utilizados, ambos ensayos mostraron resultados altamente coincidentes.
A continuación, expresamos un nuevo panel de 4 variantes delecionales de 9 aa cada una, solapadas
en 3 residuos. Estas variantes delecionales, en conjunto, abarcan las secuencias contenidas en TSSA VI-e2,
TSSA VI-e3 y TSSA VI-e4, reactivas en el ensayo de ELISA anterior (figura R.4). La reactividad de estas
nuevas variantes delecionales se analizó por ELISA, siguiendo el mismo protocolo descripto para las
variantes de 15 aa. La prevalencia de las variantes delecionales TSSA VI-eA y eD fue de 0%, mientras que
TSSA VI-eB y eC presentaron un ~33% y ~37% de prevalencia, respectivamente (figura R.4). Estos
resultados indican que la reactividad de la proteína de TSSA VI-e2 depende de residuos presentes tanto en su
Resultados
14
extremo N-terminal como C-terminal, ya que su fragmentación en dos variantes delecionales de 9 aa (TSSA
VI-eA y eB) conlleva una significativa reducción en la performance serodiagnóstica de las mismas (figuras
R.3 y R.4). Una situación similar ocurre con TSSA VI-e3, ya que su reactividad fue sustancialmente mayor
que la obtenida para las variantes delecionales TSSA VI-eB y eC derivadas de ella (figuras R.3 y R.4). En
contraste con estos resultados, la variante delecional TSSA VI-e4 presentó reactividad individual similar para
los sueros ensayados y valores de prevalencia comparables con TSSA VI-eC (~41% vs. ~37%,
respectivamente), indicando que los residuos 51 a 56 no contribuirían significativamente al potencial
serodiagnóstico de TSSA VI-e4 (figuras R.3 y R.4).
Resultados
15
El distinto patrón de reconocimiento antigénico para cada uno de los sueros analizados (figura R.4),
pone en evidencia la variabilidad en la especificidad de anticuerpos anti-TSSA VI dentro de la población
analizada, lo cual es coincidente con los datos del microarreglo peptídico. Más importante, el conjunto de los
resultados presentados hasta aquí sugieren que la respuesta inmune humoral contra TSSA VI está dirigida
principalmente hacia la secuencia 30
TSSTPPSGTENKPAT44
(TSSA VI-e2) y, en menor medida, hacia la
secuencia 36
SGTENKPATGEAPSQ50
(TSSA VI-e3).
Con el objetivo de evaluar esta hipótesis, llevamos a cabo un ensayo de desplazamiento usando
péptidos sintéticos (tabla M.3). Los sueros fueron preincubados 30 min con el péptido sintético indicado o
con PBS (control negativo), en un volumen final 10 μl (figura R.5). Luego de la incubación, se llevaron las
mezclas a un volumen final de 250 μl con solución de bloqueo y se sembraron, por triplicado, en placas de
ELISA previamente sensibilizadas con 0,5 μg de la proteína GST-TSSA VI. Finalmente, las muestras se
procesaron por ELISA según lo descripto y se revelaron con anticuerpos anti-IgG humana acoplados a
peroxidasa. En un primer ensayo, se usaron los péptidos sintéticos derivados de la secuencia de TSSA VI-e2
(E2), TSSA VI-e3 (E3), para estandarizar la cantidad de péptido adecuada para el desplazamiento. Para ello
se usaron dos sueros previamente caracterizados, uno de reactividad predominante para TSSA VI-e2 y otro
con reactividad predominante para TSSA VI-e3 (sueros 27935 y 30385, respectivamente, figura R.4). Se
preincubó cada suero con cantidades crecientes de péptido (0,02 μg; 0,2 μg y 2 μg) o con PBS como control
negativo. De esta manera, se determinó que la cantidad adecuada para obtener un desplazamiento cercano al
50% es 2 μg de péptido por pocillo (figura R.5). A continuación, se usaron 8 sueros de pacientes Chagásicos
crónicos reactivos para TSSA VI11
pero cuya especificidad de anticuerpos contra TSSA VI no había sido
mapeada. Además de los péptidos E2 y E3, en este análisis se incluyó un péptido llamado E2E3
(CTSSTPPSGTENKPATGEAPSQ) que combina la secuencia de TSSA VI-e2 y TSSA VI-e3 y, como
control negativo adicional, un péptido de igual composición aminoacídica que este último pero de secuencia
alterada (E2E3sc: CGPSNESTEKSPQSATATGPPT) (tabla M.3).
En concordancia con la hipótesis planteada anteriormente, en 7 sueros el desplazamiento con el
péptido E2 redujo la reactividad en más del 50%, mientras que el suero restante presentó una disminución de
la reactividad del 28%. La preincubación con el péptido E3, en cambio, produjo una disminución
significativa de la reactividad en sólo 3 de los 8 sueros analizados (figura R.5). Más importante, el péptido
E2E3 que combina ambas secuencias antigénicas provocó un aumento del efecto de desplazamiento que
alcanzó en los 8 sueros un 70 a 90%. En conclusión, estos resultados en conjunto con los obtenidos
previamente validan la “jerarquía” antigénica propuesta para distintas secuencias de TSSA VI e indican que
la secuencia 30
TSSTPPSGTENKPATGEAPSQ50
sería una herramienta adecuada para el desarrollo de un
nuevo reactivo de serodiagnóstico basado en TSSA VI.
Resultados
16
I.II Ensayo de inmunodetección basado en el péptido E2E3
I.II.I Estandarización
Basándonos en los resultados obtenidos en la sección anterior estandarizamos las condiciones para la
evaluación del péptido sintético E2E3 como reactivo de serodiagnóstico para la Enfermedad de Chagas
crónica. En un primer paso, los péptidos E2E3 y E2E3sc se acoplaron a la proteína carrier maleimida-
ovoalbúmina (OVA), a través de un residuo Cys artificial (ausente en la secuencia de TSSA VI) presente en
sus extremos N-terminales (tabla M.3). Distintas cantidades de los péptidos, acoplados a la proteína OVA o
sin acoplar, se usaron para sensibilizar las placas de ELISA, las cuales fueron luego ensayadas con 4 sueros
de pacientes Chagásicos crónicos; 2 con reactividad baja para TSSA VI-e3 y alta para TSSA VI-e2 (28222 y
28221); uno con reactividad alta para ambas variantes delecionales (13t) y uno con reactividad baja para
ambas variantes delecionales (20i) (figura R.4).
Resultados
17
En la figura R.6 se muestran los resultados obtenidos en el ensayo de estandarización de la cantidad
de péptido E2E3 y OVA-E2E3 por pocillo. El péptido E2E3 de mostró reactividad similar al usar 10 µg y 1
µg para los sueros 28222 y 20i, mientras que la cantidad siguiente (0,01 µg) mostró un decaimiento leve en la
reactividad para ambos sueros. En los sueros restantes, se observó un decaimiento leve en función de la
cantidad de E2E3, en todo el rango de cantidades ensayadas. Por otro lado, en las cantidades de 1 µg y 0,1
µg/pocillo de péptido acoplado a OVA se observaron absorbancias similares, y mientras que al usar 0,01
µg/pocillo se observó un decaimiento en la reactividad en todos los sueros. El péptido E2E3sc, tanto en
solución como acoplado a OVA, no mostró diferencias de reactividad en función de la cantidad usada. En
todos los casos, E2E3sc mostró absorbancias menores a 0,1, lo que indica que es un control adecuado para los
ensayos y que la reactividad del péptido E2E3 es específica de secuencia. En conclusión, se determinó que la
cantidad adecuada de péptido/pocillo para sensibilizar las placas de ELISA es de 1 µg para el péptido en
solución, sin acoplar a OVA y de 0,1 µg para el péptido acoplado a la proteína OVA.
Resultados
18
Tabla R.1: Evaluación del acoplamiento del péptido E2E3.
Suero
GS
T-
TS
SA
VI-
e2
GS
T-
TS
SA
VI-
e3
GS
T-
TS
SA
VI
E2
E3
OV
A-E
2E
3
30385 + +++ ++
30682 ++ ++
31070 ++ ++
19i +++ ++ +++
P08
P21 ++
P22
P25 +
RM1
RM2
RM08
RM10
RM12
RM13
A continuación, se realizó un ensayo en el cual se evaluó el desempeño del péptido E2E3 en
condiciones más astringentes (performance frente a sueros con reactividad baja o nula para TSSA VI) y
también la necesidad de acoplarlo a OVA. Con este objetivo, seleccionamos un total de 14 sueros de
pacientes Chagásicos crónicos, 4 de ellos previamente analizados (figura R.4) y 10 sueros con baja o negativa
reactividad para TSSA VI, no mostrados anteriormente11
. Se usaron los péptidos E2E3 y E2E3sc (ambos
acoplados o no a OVA) para el ensayo de ELISA y, para la determinación del cut-off, se ensayaron en
paralelo 3 pooles de 10 sueros negativos cada uno (datos no mostrados). Todos los sueros positivos para la
proteína GST-TSSA VI, resultaron positivos para E2E3 y OVA-E2E3; a su vez, todos los sueros negativos
para TSSA VI, resultaron también negativos para el péptido E2E3 (acoplado o en solución), indicando que la
sensibilidad del método de ELISA no pudo ser mejorada al usar el péptido sintético en cualquiera de las
presentaciones ensayadas (tabla R.1). El péptido E2E3sc no mostró reactividad en ningún caso (datos no
+++ Suero positivo con Abs450nm mayor a 0,8.
++ Suero positivo con Abs450nm entre 0,5 y 0,8.
+ Suero positivo con Abs450nm entre 0,5 y 0,4.
Suero negativo
Resultados
19
mostrados). En conclusión, dado que no se observaron diferencias significativas entre E2E3 acoplado o en
solución, se optó por usar el péptido libre (en solución) para la sensibilización en todos los ensayos
posteriores.
I.II.II Evaluación
Dados los resultados del punto anterior, realizamos un análisis exhaustivo del potencial
serodiagnóstico (en términos de especificidad y sensibilidad) del péptido E2E3. A fines comparativos, se
evaluó en paralelo a la proteína GST-TSSA VI. Para ello se usó un total de 108 muestras de sueros, 70
correspondientes a pacientes con infección Chagásica crónica y 38 muestras de individuos del mismo grupo
etario, negativos para los test de diagnóstico de Chagas comerciales. De las 70 muestras positivas, 51 habían
sido usadas en el análisis de mapeo de la región antigénica de la proteína TSSA VI (figura R.4). Se analizó la
reactividad de ambos antígenos y sus respectivos controles (E2E3sc y GST) en ensayos ELISA. Todos los
sueros fueron ensayados por triplicado, y su reactividad fue normalizada a la de un suero patrón de
reactividad conocida, que se evaluó en paralelo en cada ensayo. Como puede verse en la figura R.7, ambos
antígenos mostraron una capacidad para discriminar las poblaciones positivas y negativas de sueros altamente
significativa. Con los datos obtenidos, se graficaron las curvas ROC (receiver-operating characteristic) para
cada antígeno y se obtuvieron los parámetros de sensibilidad y especificidad y área bajo la curva de cada uno.
En la figura R.7, se muestra un modo alternativo de graficar los valores de sensibilidad y especificidad para
cada posible valor de corte. En este caso, se graficó sensibilidad o especificidad en función del cut-off
(expresado como porcentaje de reactividad) en un mismo eje cartesiano; las curvas de sensibilidad y
especificidad se cortan para un cierto valor de reactividad que corresponde al valor de cut-off para el cual se
obtiene la mejor combinación posible de sensibilidad y especificidad.
El análisis por curvas ROC deriva en un análisis gráfico que permite evaluar la performance de un
determinado ensayo en términos de sensibilidad y especificidad para cada posible valor de cut-off del ensayo.
Para realizar este análisis, se deben considerar punto a punto las dos afirmaciones correctas, verdadero
positivo (VP) y falso negativo (FN), que dependen del cut-off seleccionado. Las variaciones en el número de
estos parámetros dan lugar a diferentes valores de sensibilidad y especificidad.
Teniendo en cuenta que cuanto más cercano a 1 es el valor del área bajo la curva (AUC), más
informativo es el test diagnóstico aplicado95
, se dedujo que TSSA VI (AUC=0,9647) y E2E3 (AUC=0,9741)
son antígenos con alta performance diagnóstica (figura R.7). En el análisis realizado, el valor de sensibilidad
que maximizó la especificidad fue de 91,43% para GST- TSSA VI y de 88,57% para E2E3 (tabla R.2). Esto
indica que al exigir una especificidad del 100% (no tener falsos positivos), se obtendrá un 8,57% de FN en el
primer caso y 11,43% en el caso de usar E2E3.
Resultados
20
Por otro lado, el valor de especificidad que maximizó la sensibilidad fue 18,42% para GST- TSSA VI
y 31,58% para E2E3 (tabla R.2). Estos valores fueron bajos debido a que se incluyeron en el panel analizado
muestras de pacientes Chagásicos crónicos que no presentaban reactividad contra TSSA VI (figura R.4); por
lo tanto, exigir una sensibilidad del 100% requiere un valor de corte tan bajo que aumenta el número de
muestras positivas falsas (disminuyendo la especificidad). Por esta razón, consideramos más acertado
analizar la mejor combinación de valores de especificidad y sensibilidad (tabla R.2). Se obtuvieron valores
comparables en ambos antígenos, a su vez el porcentaje de especificidad mejoró con respecto al anterior
(94,74%) en ambos casos. Finalmente, realizamos el análisis estadístico propuesto por DeLong y
colaboradores96
para comparar las curvas ROC obtenidas para TSSA VI y E2E3 usando el software MedCalc.
No se obtuvieron diferencias significativas entre las curvas (P=0,4792), lo cual indica que la performance de
los antígenos evaluados para el diagnóstico de Chagas crónico es similar en estas condiciones experimentales.
En conclusión, obtuvimos un reactivo alternativo de serodiagnóstico basado en TSSA VI, con una
performance similar que la proteína recombinante GST-TSSA VI usada hasta este momento.
Tabla R.2: Valores de sensibilidad y especificidad calculados a partir de la figura R.10.
Antígeno % cut-off (PR)* % Sensibilidad % Especificidad
E2E3 8,025 100,00 31,58
19,04 88,57 100,00
GST-TSSA VI 5,72 100,00 18,42
16,24 91,43 100,00
E2E3 12,98 92,86 94,74
GST-TSSA VI 13,77 94,29 94,74 *PR: Porcentaje de reactividad
Resultados
21
I.III Exploración de la variabilidad de la respuesta inmune humoral contra TSSA
I.III.I Evaluación de TSSA como marcador de infecciones congénitas
Debido a la transferencia pasiva de anticuerpos maternos de isotipo IgG en los sueros de los
neonatos92
, se evaluó la presencia de anticuerpos IgM anti-TSSA VI, por el método ELISA, en un panel de 24
muestras Chagásicas; 12 correspondientes a pacientes menores de un año con infección congénita y 12 de
niños sanos del mismo grupo etario, hijos de madres infectadas. Para la determinación del cut-off se
ensayaron tres sueros de individuos del mismo grupo etario, hijos de madres no Chagásicas. Como controles
se usaron las proteínas GST, GST-SAPA (antígeno considerado gold-standard para la detección serológica
de infecciones agudas/congénitas35
) y homogenato de tripomastigotes. Cuatro sueros resultaron positivos para
el análisis de IgM contra la proteína GST-SAPA, de los cuales sólo uno resultó positivo también para la
proteína GST-TSSA VI y otro para el homogenato de tripomastigotes. Como se esperaba, el control con GST
no mostró reactividad en ningún caso, y las muestras provenientes de niños nacidos de madres no Chagásicas
tampoco mostraron reactividad para ninguno de los antígenos (tabla R.3). Estos resultados indican que la
presencia de IgM en general, y de IgM anti-TSSA VI en particular, no es un buen biomarcador para la
detección de infecciones congénitas.
Tabla R.3: Análisis de inmunoglobulinas en muestras de niños menores a un año nacidos de madres infectadas
Isotipo Muestras de sueros n GST GST- TSSA
VI
GST-
SAPA
Homogenato de
Tripomastigotes
IgM Infectados (MH+) 12 0 1* 4 1*
Sanos 12 0 0 0 0
IgG Infectados (MH+) 12 0 9 8 10
Sanos 12 0 5 2 6
IgG IgG bebé > IgG materna
Muestras pareadas 5 N.A. 0 4 N.A.
* Sueros con reactividad IgM contra GST-SAPA. MH+: Microhematocrito positivo. N.A.: No aplica.
Interesantemente, al analizar 9 muestras pareadas de madres infectadas con hijos sanos, encontramos
una madre infectada con presencia de anticuerpos IgM contra TSSA VI (datos no mostrados). En contraste,
ninguna de las madres de niños infectados mostró anticuerpos IgM contra TSSA VI ni SAPA (datos no
mostrados). Estos resultados indican que la presencia de IgM no se limita a la etapa aguda de la enfermedad
de Chagas, una de las razones por las que su uso es desaconsejado para el diagnóstico de infecciones
congénitas33
.
Resultados
22
En paralelo, se estudió también la presencia de anticuerpos de isotipo IgG dirigidos contra TSSA VI
en muestras pareadas de los bebés y madres infectadas (tabla R.3), usando los mismos controles que en el
ensayo anterior. Si bien todos los bebés infectados (y muchos de los no infectados) mostraron anticuerpos de
isotipo IgG contra TSSA VI, en ningún caso el título de los mismos superó el título de anticuerpos de isotipo
IgG contra el mismo antígeno en las madres (tabla R.3). Estos resultados sugieren que las IgG contra TSSA
VI presentes en los bebés podrían deberse a la transferencia pasiva de anticuerpos maternos. De todas
maneras, dado que se habían obtenido títulos muy altos para algunas de las muestras pareadas (figura R.8,
familia 1), cercanos al límite del rango dinámico de la técnica, decidimos re-evaluar la reactividad serológica
contra TSSA VI usando diluciones seriadas de los sueros (figura R.8). Se analizó la reactividad contra TSSA-
VI en 2 diluciones de suero materno y del bebé, en 2 de las muestras pareadas; una de ellas con valores de
reactividad contra TSSA VI altos y similares entre la madre y el niño (familia 1) y la familia 2 con
reactividad diferencial contra TSSA VI entre la madre y el hijo. En ninguna de las muestras pareadas se
observó una dilución con mayor reactividad contra TSSA VI en el niño que en su respectiva madre.
En contraste con estos resultados, el título de anticuerpos de isotipo IgG contra el antígeno SAPA
mostró ser, en el 80% de los casos, mayor en los bebés que en sus madres (tabla R.3), sugiriendo fuertemente
la síntesis endógena de anticuerpos de isotipo IgG contra SAPA como resultado de la infección activa, tal
cual lo sugerido36
. Estos resultados, en conjunto, indican que TSSA VI no es un buen biomarcador de
infecciones congénitas.
Por otro lado, buscamos explorar la utilidad de la variabilidad inter-individual (figura R.4) de la
respuesta inmune humoral contra TSSA VI con fines diagnósticos más específicos, particularmente como un
posible indicador de la progresión de la infección. El reconocimiento diferencial de anticuerpos contra
Resultados
23
distintos epitopes de un mismo antígeno a distintos tiempos de una respuesta inmune ha sido reportado97–99
.
Con el objetivo de analizar esta hipótesis, se evaluaron dos poblaciones de pacientes Chagásicos: la primera
correspondiente a 20 pacientes Chagásicos con infección congénita, de entre 1 y 3 años (población de
“crónicos tempranos”) y la segunda, compuesta por 6 pacientes con infección aguda vectorial, cuyo tiempo
de infección es menor a un año. Se evaluó la reactividad de todos los sueros contra GST-TSSA VI y todas sus
variantes delecionales en ensayos de ELISA, usando como control la proteína GST. En todos los casos, para
la determinación del cut-off se evaluaron 3 muestras de sueros de individuos sanos del mismo grupo etario.
De las 20 muestras de pacientes “crónicos tempranos”, 18 resultaron positivos para TSSA VI mientras que de
las 6 muestras de pacientes agudos, 3 resultaron positivos para esta proteína. Interesantemente, el isotipo
mayoritario en estas 3 muestras era IgM en vez de IgG; y en los 3 casos también presentaron IgM circulantes
contra SAPA (datos no mostrados). Posteriormente, se analizó la especificidad de anticuerpos en los sueros
positivos para TSSA VI. Ninguno de los sueros analizados mostró reactividad contra las variantes
delecionales TSSA VI-e1, TSSA VI-e5, TSSA VI-eA ni TSSA VI-eD (datos no mostrados).
Con el objetivo de identificar patrones de especificidad de anticuerpos diferenciales entre las
poblaciones, realizamos un análisis comparativo incluyendo a la población de pacientes Chagásicos crónicos
cuya especificidad de anticuerpos había sido mapeada anteriormente (figura R.4). El estudio incluyó sólo las
proteínas para las cuales al menos un suero mostró reactividad en cualquiera de las poblaciones (TSSA VI-
e2, e3, e4, eB, eC). La figura R.9 detalla, para cada población, el porcentaje de sueros que comparten un
perfil determinado de reactividad (indicado a la derecha).
Para evaluar las diferencias entre los perfiles de reconocimiento entre las poblaciones se aplicaron
árboles de decisión, que representan funciones lógicas (if- then). Brevemente, a partir de un conjunto de datos
de entrenamiento (en este caso el patrón obtenido para cada suero perteneciente a las diversas poblaciones) el
algoritmo infiere (aprende) de dicho conjunto de datos y genera un modelo (conjunto de reglas). Este modelo
deduce (o predice) las clases contenidas en el conjunto de datos de entrenamiento (en este caso, a qué
población corresponde) y como resultado crea un conjunto de datos de testeo100
. Mediante la comparación de
las clases reales contenidas en el conjunto de datos de entrenamiento con las clases predichas en el conjunto
de datos de testeo se determina el porcentaje de aciertos logrados. Con este porcentaje se estima en qué
medida el modelo creado es adecuado para clasificar los datos. En este caso, utilizamos el algoritmo “J48”
que utiliza un método heurístico para inferir el árbol, donde se realiza la selección del atributo en cada nivel
del árbol en función de la calidad de división que produce101
. El árbol de decisión que genera este algoritmo
se basa en la teoría del Grano de Información donde la bifurcación en cada nodo busca la mayor ganancia de
información, y se generan reglas de decisión que son fáciles de interpretar101
.
El árbol de decisión obtenido, logró clasificar correctamente 50 de 65 sueros totales (diagonal en la
tabla R.4), es decir que obtuvimos un 23% de sueros mal diagnosticados. Esto indica que, al menos con el
diseño experimental propuesto, no es posible identificar un patrón de reconocimiento distintivo de una dada
Resultados
24
población. Aparentemente la población “crónica” y “crónica temprana” poseen especificidades similares, que
a su vez difieren de la población de pacientes con infección aguda; sin embargo, los resultados de esta última
población se encuentran sesgados por la escasa cantidad de sueros incluidos.
Tabla R.4: Clasificación de los sueros usando el árbol de decisión generado
Población Clasificados como
Crónicos Crónicos tempranos Agudos
Crónicos 44 0 0
Crónicos tempranos 14 4 0
Agudos 1 0 2
I.III.II Estudio de la respuesta inmune contra TSSA en un modelo de infección murino
El antecedente de la presencia de IgM contra TSSA VI en sólo 1 de las 12 muestras de sueros de
pacientes con infección congénita comparado con la presencia de reactividad (IgM) en 3 de las 6 muestras de
pacientes con infección aguda, sugirieron la presencia de respuesta inmune humoral diferencial contra TSSA
VI (y posiblemente contra otros antígenos del parásito) debida a los distintos modos de infección. Sin
Resultados
25
embargo, la carencia de sueros de pacientes con infección aguda vectorial, acotó las posibilidades de hacer un
estudio exhaustivo al respecto. Como aproximación alternativa, nos propusimos evaluar la respuesta inmune
humoral en un modelo de infección en ratones, el cual es ampliamente usado en estudios de inmunidad en
infecciones por T. cruzi102,103
. Para el estudio se realizaron 3 infecciones independientes con la cepa RA
perteneciente al linaje Tc VI104
, en ratones hembra adultas (5-6 semanas) de las cepas C3H/HeJ y CF1. Se
infectaron un total de 16 ratones, aunque uno de ellos no sobrevivió más allá de los 15 dpi y por lo tanto fue
excluido del análisis. Los 15 ratones restantes negativizaron la parasitemia a los 25-35 dpi; sin embargo sólo
en 9 de ellos se logró detectar inmunidad humoral contra distintos antígenos de T. cruzi, según la reactividad
obtenida por ELISA contra un homogenato de tripomastigotes. En estos animales, se obtuvieron los valores
de parasitemia y los títulos de anticuerpos de isotipos IgM e IgG contra los antígenos GST-TSSA VI, GST-
SAPA y homogenato de tripomastigotes usando como control la proteína GST, a distintos dpi. A
continuación, se muestran los resultados de uno de los seguimientos (en representación de los tres realizados)
en el cual se infectaron 4 ratones hembras (CF1) con la cepa RA.
La figura R.10 muestra la curva de parasitemia y los títulos de anticuerpos IgM e IgG contra el
homogenato de tripomastigotes. Alrededor del día 15 post-infección comienza a aumentar la concentración
de parásitos en sangre, que muestra un pico al día
20 post-infección y comienza a decaer hasta
niveles indetectables a los 40 dpi. Este periodo, en
el cual se detecta presencia de parásitos en sangre,
correspondería a la etapa aguda en humanos
infectados. En infecciones en humanos, la
desaparición de la parasitemia marca el fin de la
etapa aguda y comienzo de la fase crónica de la
enfermedad, la cual se caracteriza también por la
presencia de anticuerpos contra los antígenos de T.
cruzi (seropositividad). Basándonos en estas
características, definimos estas etapas en el modelo
de infección estudiado.
Se observó un aumento de los en los títulos
de anticuerpos IgM contra TSSA VI, SAPA y
homogenato de tripomastigotes alrededor del día
24 post-infección (figuras R.10 y 11). Estos títulos
se mantuvieron hasta el día 42 post-infección y
luego disminuyeron hasta la finalización del
ensayo. Al analizar la parasitemia en conjunto con
Resultados
26
estos resultados, se observó que el título de inmunoglobulinas de isotipo M aumenta mientras todavía existen
parásitos en sangre (fase “aguda”) y se mantienen luego de su desaparición (fase "crónica”). A su vez, se
analizaron los títulos de anticuerpos para cada antígeno y se encontró que el antígeno con mayor título de
anticuerpos IgM entre los evaluados fue TSSA VI, seguido del homogenato de tripomastigotes y SAPA.
Para el análisis del perfil de anticuerpos de isotipo IgG generados durante la infección, se usaron los
mismos controles que en el estudio anterior (figura R.10 y 11). Se observó un aumento en los títulos de
anticuerpos IgG contra TSSA VI, SAPA y homogenato de tripomastigotes alrededor del día 24 post-
infección, estos títulos continuaron aumentando hasta el día 40, a partir del cual se mantuvieron constantes.
Al analizar la parasitemia en conjunto con estos resultados, se observó que el título de inmunoglobulinas de
isotipo G aumenta mientras todavía existen parásitos en sangre (fase “aguda”) y se mantienen luego de su
desaparición (fase “crónica”). A su vez, se encontraron diferencias significativas al comparar la reactividad
general (IgG) contra TSSA VI contra GST- SAPA (P<0,001) y el homogenato de tripomastigotes (P<0,05),
según el test estadístico de Bonferroni (ANOVA de dos vías).
Finalmente, al analizar el perfil de anticuerpos IgM e IgG en conjunto, pudimos observar que los
títulos de ambos isotipos aumentan de manera coordinada hacia el día 24 para los antígenos analizados; estos
resultados difieren con los observados en las respuestas inmunes clásicas donde al principio de la infección se
sintetizan inmunoglobulinas de isotipo IgM y, al madurar la respuesta se realiza el cambio de isotipo de
inmunoglobulinas a IgG92
. En conjunto, estos resultados muestran que, en el modelo de infección aguda
murina, existe una respuesta inmune primaria contra la proteína TSSA VI con presencia de anticuerpos de
isotipo IgM (7 de 9 ratones que montaron una respuesta inmune contra T. cruzi). La cinética de aparición de
Resultados
27
anticuerpos de isotipo IgM fue similar a la observada para SAPA. Estos resultados son más similares a lo
observado en pacientes con infección aguda vectorial que en pacientes con infección congénita.
II. Mapeo del dominio de interacción de TSSA VI con células no macrofágicas
II. I Ensayos de interacción con monocapas de células no macrofágicas
Estudios previos en nuestro laboratorio habían puesto en evidencia la interacción entre la proteína
TSSA VI con monocapas de células no macrofágicas de mamíferos86
. Teniendo en cuenta las variantes
delecionales de TSSA VI generadas anteriormente en este trabajo (figura R.3), decidimos utilizarlas como
herramientas moleculares para hacer un mapeo del motivo de esta proteína involucrado en el fenómeno de
interacción.
Los ensayos de interacción realizados constaron de la incubación de las diferentes proteínas
recombinantes con monocapas de células HeLa. Como controles positivos se usaron la proteína GST-TSSA
Resultados
28
VI86
y una proteína recombinante GST-MASP (conteniendo parte de la proteína codificada por el gen
TcCLB.511173.64) generada en el laboratorio, para la cual se habían verificado propiedades similares
(Ignacio Durante, resultados sin publicar)68
. Brevemente, el ensayo se basa en que las proteínas con motivos
adhesivos interaccionan con receptor/es no identificado/s en la superficie de las células, mientras que las que
carecen de motivos adhesivos son retiradas con los lavados posteriores. Dado que todas las proteínas usadas
se expresan como proteínas de fusión a GST, la reactividad de anticuerpos contra GST en un ensayo tipo
ELISA es indicador de la interacción (figura M.2)64
. En nuestro caso, usamos 3 tipos de anticuerpos anti-GST
(1 monoclonal comercial y 2 anticuerpos policlonales generados en ratón y conejo) para revelar estos
ensayos.
En todos los casos, la proteína TSSA VI-e4 mostró valores de adhesión significativamente mayores
que GST (P<0,001), e inclusive mayores que los de la proteína TSSA VI (figura R.12). En 2 casos, la
proteína TSSA VI-e2 mostró valores significativos de adhesión, aunque menores a TSSA VI-e4 (figura
R.12). A su vez, la proteína TSSA VI-eD mostró valores de interacción significativos en 2 de los 3 casos. Los
resultados obtenidos con TSSA VI-eD apoyan la especificidad de la interacción observada en para la proteína
TSSA VI-e4 (de la cual deriva TSSA VI-eD, figura R.3). Sin embargo, esta adhesividad es susceptible al
agregado de los 6 aa subsiguientes de la molécula de TSSA VI en el extremo carboxilo terminal, ya que
TSSA VI-e5 mostró una nula capacidad de interacción (figura R.12). Más importante, y en concordancia con
los resultados anteriores, ensayos preliminares usando concentraciones crecientes de las proteínas TSSA VI-
e2 y TSSA VI-e4 mostraron patrones de adhesión dosis dependiente y saturables, sugiriendo una interacción
del tipo receptor-ligando (datos no mostrados), de manera similar a los obtenidos en ensayos previos usando
la proteína TSSA VI86
. Próximamente, intentaremos validar estos resultados usando una alternativa basada
en el uso de péptidos fluoresceinados, cuya interacción con células adherentes puede determinarse de manera
directa (figura M.2). Si bien estos péptidos ya han sido sintetizados (tabla M.3), la implementación de estos
ensayos requiere de herramientas adicionales (microplacas, etc) que a la fecha no están a nuestra disposición.
II. II Ensayos de infección in vitro
Estudios anteriores en nuestro laboratorio mostraron que la adición del péptido tssa VI (cuya
secuencia es equivalente al péptido de fusión expresado en la proteína GST-TSSA VI, ver tabla M.3) o de la
proteína recombinante GST-TSSA VI a monocapas de células previo al desafío con tripomastigotes, producía
una disminución en los porcentajes de infección mientras que la adición del péptido tssa I (cuya secuencia es
equivalente al péptido de fusión expresado en la proteína GST-TSSA I, ver tabla M.3) o de la proteína
recombinante GST-TSSA I no producía este efecto86
(figura R.13). Más allá de correlacionar con la distinta
“adhesividad” de estas secuencias a monocapas celulares (figura R.12 y referencia86
), el efecto inhibitorio del
péptido tssa VI demostró ser cepa-dependiente, sustentando la especificidad de estos resultados. Brevemente,
el péptido tssa VI produjo una significativa reducción en los niveles de infección de tripomastigotes de la
Resultados
29
cepa CL Brener (que pertenecen al linaje TcVI y que expresan TSSA VI en su superficie) y no en
tripomastigotes de la cepa Sylvio X-10 (que pertenecen al linaje TcI y que expresan TSSA I en su superficie)
(figura R.13).
Teniendo en cuenta estos antecedentes, intentamos validar y verificar los resultados obtenidos para
nuestras variantes delecionales de TSSA en los ensayos de interacción proteína/célula (figura R.12). Para
ello, se estudió el porcentaje de adhesión e infección in vitro de tripomastigotes de T. cruzi luego de la
adición exógena de péptidos sintéticos (figura 14). En un primer experimento, se evaluó el efecto de la
adición de péptidos sintéticos en la infectividad de tripomastigotes de la cepa CL Brener sobre células HeLa.
Los péptidos sintéticos usados fueron: E2E3 (equivalente a las secuencias combinadas de TSSA VI-e2 y e3),
E2VI (equivalente a TSSA VI-e2) y E4VI (equivalente a TSSA VI-e4); como controles negativos se usaron
los péptidos tssa I (el cual no presenta efecto inhibitorio de los niveles de infección en la cepa CL Brener,
figura R. 13), E1VI (equivalente a TSSA VI-e1, secuencia que no mostró propiedades adhesivas en los
ensayos de adhesión), E4I (equivalente del péptido E4VI aunque en la proteína TSSA I) y como control
positivo se usó el péptido tssa VI (figura R.13).
Resultados
30
Los péptidos E2E3, E2VI y E4VI provocaron una notable disminución en los porcentajes de
infección, dosis-dependientes, comparables a los obtenidos con el péptido tssa VI (figura 14 y datos no
mostrados). En el caso de E2E3, sin embargo, estos resultados no fueron estadísticamente significativos.
Consistentemente, la adhesión de tripomastigotes a células en cultivo mostró una disminución significativa en
presencia del péptido E4VI pero no del
péptido E1VI (figura R.14). En conjunto,
estos resultados muestran una alta
correlación entre los niveles de adhesión
a células en cultivo e inhibición de la
interacción parásito-célula para los
péptidos TSSA VI-e4 y TSSA VI-e2.
Por otro lado, ensayos de
infección y adhesión realizados con
amastigotes (que no expresan TSSA en
su superficie,81
) de la cepa CL Brener en
presencia de los péptidos E1VI, E2VI,
Resultados
31
E4VI no mostraron diferencias significativas
respecto del control con PBS (figura R.15).
Resultados preliminares indican que
tampoco resultan inhibitorios en ensayos en
infección usando tripomastigotes de la cepa
Sylvio X-10 (datos nos mostrados).
Finalmente, con el objetivo de
descartar posibles efectos tóxicos de los
péptidos en los parásitos y/o en las células en
cultivo, se realizaron controles de viabilidad
(figura R.16). Para el control de toxicidad
celular, se incubaron células HeLa en
presencia de los péptidos E1VI, E2VI, E4VI,
E4VIsc o PBS durante 3 horas para luego
lavar e incubar en medio DMEM 4%. Al día
siguiente se tripsinizaron las células, se las
trató con el colorante vital Azul de Trypan y
se obtuvo el porcentaje de células no viables,
por conteo bajo el microscopio (figura R.16).
En ningún caso se observaron diferencias significativas con respecto al control tratado con PBS. Para el
control de viabilidad de parásitos, tripomastigotes de la cepa CL Brener fueron incubados con los péptidos
E1VI, E2VI, E4VI o con PBS durante 3 horas y luego tratados con el colorante vital ioduro de propidio y
analizados por citometría de flujo (figura R.16). Como controles se analizaron parásitos sin tratar con ioduro
de propidio (curva sombreada) y parásitos tratados con formol 4% (curva negra). Ninguno de los péptidos
evaluados mostró un efecto tóxico en los parásitos, a diferencia del control con formol 4%, en el cual se
observa que gran parte de la población de parásitos (97,8%) han incorporado la marca fluorescente. En
conjunto, estos resultados descartan un posible sesgo por toxicidad hacia las células y/o los parásitos en el
efecto de los péptidos sintéticos en los ensayos de invasión y adhesión.
Discusión
32
Discusión
I. Caracterización de la respuesta inmune humoral contra TSSA en pacientes
Chagásicos
En el marco de un proyecto más amplio, tendiente a identificar y mapear epitopes B lineales en
antígenos de T. cruzi a escala proteómica usando microarreglos de péptidos de alta densidad y máxima
resolución105
, re-evaluamos la reactividad de la proteína TSSA VI completa, incluyendo sus señales
secretorias, frente a IgGs purificadas a partir de sueros de Chagásicos crónicos. Este estudio nos permitió
delimitar una única zona antigénica dentro de esta molécula, comprendida por los residuos Thr24
a Ala58
. El
perfil de reactividad observado en el microarreglo (un único “pico ancho”) no permitió la identificación de
epitopes B discretos en TSSA VI. Este perfil de reactividad, en cambio, se corresponde mejor con la
presencia de distintos epitopes parcialmente solapados dentro de la región antigénica de esta proteína, los
cuales serían reconocidos por poblaciones de anticuerpos mostrando especificidades levemente diferenciales.
Según nuestra hipótesis, el solapamiento inter-epitópico dificultaría la resolución de “picos” individuales del
tamaño de un epitope B discreto92
en los microarreglos. La reactividad de variantes delecionales presentando
un solapamiento mínimo (como por ejemplo TSSA VI e2 y TSSA VI e4) y los mayores niveles de titulación
de anticuerpos obtenidos con el péptido E2E3 en comparación a los péptidos E2 y/o E3 determinados en el
ELISA de desplazamiento también son indicativos de la presencia de distintos epitopes dentro de TSSA VI,
los cuales serían reconocidos por poblaciones de anticuerpos con especificidades diferentes. Es importante
remarcar que, si bien no es la situación más común, perfiles de antigenicidad similares se han identificado en
otras moléculas de T. cruzi incluidas en los ensayos de microarreglos de péptidos105
.
Con el propósito de mapear las secuencias inmunorreactivas más relevantes dentro de la región
antigénica de TSSA VI, aplicamos un acercamiento basado en proteínas recombinantes. En este caso,
analizamos la respuesta individual de cada suero contra TSSA VI (conteniendo toda la región antigénica
identificada en el microarreglo) y distintas variantes delecionales de 15 y 9 aa. El resultado más evidente de
estos ensayos es que la población de sueros Chagásicos crónicos analizada muestra patrones de anticuerpos
anti-TSSA VI variables entre individuos. Estos datos son concordantes con los obtenidos en el microarreglo
de péptidos, en el cual las distintas mezclas de IgGs analizadas mostraron patrones de reactividad diferentes.
La compleja estructura antigénica de esta molécula y, sobre todo, diferencias en el estado inmunológico, el
background genético de los pacientes y eventualmente de la(s) cepa(s) infectante(s) en cada caso, podrían
contribuir a la variabilidad de la respuesta inmune contra TSSA VI106–108
.
Más importante, los estudios usando moléculas recombinantes nos permitieron identificar una
proteína (TSSA VI-e2) que reproduce casi completamente la performance diagnóstica de la proteína TSSA
VI y que, por lo tanto, contendría la mayoría de los determinantes antigénicos relevantes. Además, se
Discusión
33
identificaron otras dos proteínas, TSSA VI-e3 y TSSA VI-e4, que corresponden a secuencias
inmunorreactivas secundarias. El mapeo realizado con variantes delecionales de 9 aa, nos sugirió que las
secuencias inmunorreactivas principales de TSSA VI-e4 están en su extremo amino-terminal (proteína TSSA
VI-eC, de secuencia compartida con TSSA VI-e3), mientras que los residuos presentes en su extremo
carboxi-terminal (proteína TSSA VI-eD) serían dispensables a fines serodiagnósticos. Las proteínas TSSA
VI-e2 y -e3, en cambio, dependen para su inmunorreactividad de residuos distribuídos a lo largo de toda su
secuencia. En conjunto, los resultados obtenidos en los microarreglos, los ELISA usando variantes
delecionales y los ELISA de desplazamiento indican que la respuesta inmune humoral contra TSSA VI está
dirigida hacia la región central y variable entre las isoformas de TSSA; principalmente hacia la secuencia
30TSSTPPSGTENKPAT
44 y, en menor medida, hacia la secuencia
36SGTENKPATGEAPSQ
50.
Estos resultados difieren de los obtenidos en un mapeo preliminar de epitopes B lineales en TSSA
VI81
, en el cual se había definido una zona antigénica más acotada, conformada por una secuencia con
reactividad predominante 41
KPATGEAPSQ50
(la cual había sido definida como epitope principal) y otras dos
secuencias de mucha menor reactividad 30
TSSTPPSGTEN40
y 36
SGTENKPATG45
. Las diferencias se pueden
atribuir al distinto diseño experimental y, sobre todo, al mayor poder resolutivo de las estrategias utilizadas
aquí. Revisando aquellos datos a la luz resultados obtenidos en este trabajo, se pueden sacar algunas
conclusiones importantes. En primer término, que el sesgo en los resultados en ese mapeo preliminar se debió
fundamentalmente a la utilización de un menor número de péptidos de menor tamaño (8-11 residuos) y de
menor solapamiento entre ellos (5 residuos en vez de 14)81
. Esto determinó que algunas de las secuencias
identificadas aquí como críticas para el reconocimiento de los anticuerpos específicos no estuviesen
representadas. Entre ellas, la secuencia correspondiente a TSSA VI-e2 (30
TSSTPPSGTENKPAT44
), la cual
resultó fraccionada entre los péptidos 30
TSSTPPSGTEN40
(similar a TSSA VI-eA, sin reactividad por
ELISA) y 36
SGTENKPATG45
(similar a TSSA VI-eB, de baja prevalencia). La subrepresentación de
secuencias llevó, además, a proponer la secuencia 41
KPATGEAPSQ50
, que está incluida dentro de la proteína
TSSA VI-e3, como el epitope lineal B inmunodominante de TSSA VI81
. Interesantemente, un péptido
sintético conteniendo esta secuencia mostró una prevalencia de apenas ~60% al ser ensayado contra un panel
de sueros crónicos (Carlos Buscaglia, datos sin publicar), lo cual correlaciona perfectamente con el ~57%
determinado en este trabajo para TSSA VI-e3.
Basados en el mapeo antigénico refinado de TSSA VI, propusimos que el péptido sintético E2E3,
conteniendo las secuencias de TSSA VI-e2 y TSSA VI-e3 sería el candidato más adecuado para el desarrollo
de un reactivo alternativo de serodiagnóstico. La reactividad del péptido sintético E2E3 fue comparada en
ensayos de ELISA con la proteína GST-TSSA VI, el estándar para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas
crónico basado en TSSA43
. La comparación de las curvas ROC obtenidas indicó que el péptido E2E3
presenta una performance serodiagnóstica muy similar, en términos de sensibilidad y especificidad, que la
Discusión
34
proteína recombinante, lo cual alienta una futura evaluación a mayor escala y frente a una población más
heterogénea de pacientes (por ejemplo, obtenidos de distintas regiones geográficas).
Los péptidos sintéticos ofrecen múltiples ventajas comparativas con respecto de las proteínas
recombinantes en términos de aplicación diagnóstica. Por un lado, su producción no implica el uso de
microorganismos; lo que se traduce en menores requerimientos de infraestructura y equipamiento para su
producción y purificación, controles de calidad más simples, disminución de la variabilidad entre los
diferentes lotes de producción, una mayor facilidad de estandarización y escalado, menores costos de
producción, etc. A su vez, los péptidos sintéticos no presentan secuencias adicionales (necesarias para su
correcta expresión y/o purificación) y/o antígenos contaminantes provenientes del sistema de expresión, lo
que redunda en un reactivo de mayor especificidad que la obtenida al usar proteínas recombinantes43,58
. En el
caso del péptido E2E3, además, nuestros resultados indican que no es necesario su acoplamiento a proteínas
carrier o recurrir a otras estrategias alternativas de síntesis o funcionalización109,110
para obtener una óptima
sensibilidad, por lo cual su implementación diagnóstica se vería simplificada. En este contexto, sin embargo,
y dado que E2E3 presenta una prevalencia menor al 100%, es preciso remarcar que en caso de ser utilizado
con fines diagnósticos, E2E3 debería ser incluído en el marco de un kit incluyendo otros antígenos de T.
cruzi111
.
A continuación, se evaluó la posibilidad de explotar la variabilidad inter-individual de la respuesta
inmune humoral anti-TSSA VI para el desarrollo de herramientas diagnósticas más específicas, de gran
necesidad en la investigación en Enfermedad de Chagas actual33
. En primer término, para el diagnóstico
serológico de infecciones congénitas. Para ello, se analizó la presencia de anticuerpos IgM e IgG en muestras
de sueros de bebés (infectados congénitamente o no) por técnicas de ELISA. La ausencia de anticuerpos IgM
contra TSSA VI en la mayoría de las muestras de sueros de bebés infectados es concordante con resultados
previos para otros antígenos de T. cruzi112,113
, y sugiere que la detección de IgM contra TSSA VI (y de IgM
en general) no es una herramienta adecuada para el diagnóstico de Chagas congénito. La presencia de estos
anticuerpos en un porcentaje de las madres Chagásicas también ha sido descripto114
, y puede atribuirse al
estado de inmunosupresión característico del embarazo el cual, en algunos casos, puede promover la
“reactivación” de la infección21,22
.
Es interesante notar que, en contraste con los pacientes con infección congénita, un 50% de los
pacientes con infección aguda vectorial mostraron reactividad de tipo IgM contra TSSA VI. Lo mismo fue
verificado en un modelo de infección murino, donde la cinética de aparición de estos anticuerpos fue similar
a la de los generados contra un antígeno de fase aguda (SAPA), e inclusive alcanzaron títulos mucho
mayores. Esta discrepancia puede atribuirse a diferencias intrínsecas de las poblaciones humanas agudas
estudiadas (grupo etario, maduración inmunológica, background genético, etc)106–108
, que exceden la vía de
infección. Sin embargo, teniendo en cuenta la fuerte reactividad de isotipo IgG contra TSSA VI en la mayoría
Discusión
35
de los pacientes Chagásicos crónicos43
y la transferencia pasiva de este isotipo de anticuerpos de madres a
niños durante el embarazo, es posible que los altos títulos de anticuerpos IgG de origen materno haya
interferido con la detección de anticuerpos de isotipo IgM en los ensayos de ELISA realizados a los bebés
con infección congénita. Esta hipótesis, basada en la titulación de antígenos provocada por las IgG maternas,
ha sido demostrada, por ejemplo, en el serodiagnóstico de la Toxoplasmosis congénita. En este caso, para
mejorar la sensibilidad del método, se emplean técnicas de purificación o inmunocaptura de IgM previas a la
incubación con antígenos de Toxoplasma gondii115
. El fenómeno de titulación de TSSA VI por la presencia
de IgG con especificidades similares, de existir, no se aplicaría en el caso de pacientes con infección aguda
vectorial. La comparación de los títulos IgG contra TSSA VI en muestras pareadas de madres Chagásicas y
niños infectados o sanos tampoco arrojó resultados alentadores. En contraste a lo reportado y a nuestros
propios resultados en paralelo con el antígeno de fase aguda SAPA34–37
, los títulos de IgG contra TSSA VI en
las madres infectadas resultaron consistentemente mayores que en los bebés, sugiriendo que no existe síntesis
endógena de anticuerpos IgG contra este antígeno en los niños menores a 1 año. En definitiva, el conjunto de
estos resultados indica que TSSA VI no sería un buen biomarcador para la detección de infecciones
congénitas, aunque en un futuro implementaremos técnicas de purificación de IgM a partir de muestras de
neonatos previas al test diagnóstico para evaluar mejor este punto.
En segundo término, exploramos la posibilidad de que la presencia de múltiples secuencias
inmunoreactivas dentro de TSSA correlacionara con una maduración de la especificidad de los anticuerpos
contra esta proteína a lo largo de la infección97
. Para ello, realizamos un estudio comparativo del perfil de
reconocimiento de anticuerpos obtenidos a partir de tres poblaciones de pacientes Chagásicos definidas
arbitrariamente de acuerdo a su tiempo estimado de infección: crónicos (> de 5 años de infección); “crónicos
tempranos” (entre 1 y 3 años de infección) y agudos (< de 1 año de infección). Nuestros resultados indican
que existe tanta variabilidad entre los grupos estudiados como dentro de los mismos; y que, por lo tanto, no es
posible diferenciar las poblaciones, sobre todo los pacientes crónicos y “crónicos tempranos”, basándose en
el perfil de reactividad contra TSSA VI. El árbol de decisión aplicado, sin embargo, clasificó correctamente
dos de los tres sueros de pacientes con infección aguda, por lo que podrían existir diferencias en el patrón de
reconocimiento de esta población. Alternativamente, la escasa cantidad de sueros usados podría haber
producido un efecto de sesgo en los resultados de esta población.
De manera análoga a lo mostrado en este capítulo, la complejidad epitópica y la variabilidad de la
respuesta inmune humoral contra TSSA VI podría ser explorada en otras áreas de activo interés en
Enfermedad de Chagas actual como la determinación de la efectividad de la quimioterapia33
, estudios de
epidemiología molecular89,90,116
para la identificación de perfiles de reactividad con valor prognóstico sobre la
patología de la enfermedad107,108
.
Discusión
36
II. Mapeo del dominio de interacción de TSSA VI con células no macrofágicas
Estudios previos en nuestro laboratorio pusieron en evidencia la interacción entre la proteína TSSA
VI con monocapas de células no macrofágicas de mamíferos y su participación activa en el reconocimiento y
entrada del parásito en la célula huésped86
. La adición exógena de péptidos sintéticos de TSSA VI provocó la
movilización de Ca++
intracelular y la activación de cascadas de señalización de quinasas en la célula
huésped. En contraste con estos resultados, TSSA I presentó bajo niveles de adhesión a monocapas de células
no macrofágicas de mamíferos y la adición exógena de péptidos solubles de TSSA I no afectó la infectividad
in vitro de tripomastigotes del linaje TcVI y/o TcI86
. Teniendo en cuenta las variantes delecionales de TSSA
VI generadas anteriormente en este trabajo, decidimos utilizarlas como herramientas moleculares para hacer
un mapeo del motivo involucrado en el fenómeno de interacción (pegado). Los estudios de pegado de
proteínas recombinantes a células y de infecciones in vitro mostraron una gran correlación e indicaron que
TSSA VI presenta dos motivos de interacción con células no macrofágicas, TSSA VI-e4 y TSSA VI-e2.
Ambos motivos mostraron los mismos niveles de inhibición de la infección que un péptido conteniendo la
secuencia de toda la región central de TSSA VI (péptido tssa VI) usado de control.
El modelo propuesto86
propone que TSSA funcionaría como un determinante positivo de la
interacción entre tripomastigotes y la célula blanco. La interacción de TSSA VI, anclada a la superficie del
tripomastigote a través de un motivo GPI, con receptor/es (aún no descripto/s) en la superficie de la célula no
macrofágica favorecería la internalización del parásito. La adición de TSSA VI “soluble” disminuiría la
cantidad de moléculas disponibles para interacción parásito-célula, provocando una disminución de los
niveles de infección de los tripomastigotes. Los porcentajes de inhibición máxima observados, cercanos al
50%, son compatibles con la presencia de mecanismos de invasión redundantes en T. cruzi78
. La especificidad
de los resultados quedó evidenciada por la ausencia de cambios en los niveles de infección al adicionar las
secuencias adhesivas de TSSA VI en tripomastigotes de la cepa Sylvio (TcI) y en amastigotes de CL Brener
(que no expresan la proteína TSSA en su superficie81
), los cuales presentarían mecanismos alternativos para
la invasión de células no macrofágicas. Estudios estructurales y genéticos, actualmente en curso, permitirán
comprender mejor la participación de TSSA en los eventos de interacción entre el parásito y la célula, así
como también validar los fenómenos observados en este trabajo. A su vez, la identificación de motivos de
interacción con mayor “afinidad” que la proteína TSSA VI completa surgen como herramientas apropiadas
para la identificación de ligandos en la superficie de las células blanco.
En resumen, en este trabajo de Tesis hemos analizado la respuesta inmune humoral contra TSSA en
pacientes Chagásicos e identificado las secuencias inmunorreactivas principales dentro de esta proteína
usando distintas aproximaciones. Los conocimientos y las herramientas generadas para esta caracterización
antigénica, las hemos luego utilizado para el desarrollo de un reactivo de serodiagnóstico alternativo, para la
exploración de la variabilidad en la respuesta inmune contra esta proteína con fines específicos y para la
Discusión
37
identificación de secuencias dentro de esta proteína relevantes para la interacción del parásito con la élula
hospedadora.
Conclusiones
38
Conclusiones
Identificamos una zona inmunorreactiva dentro de la proteína TSSA VI conformada por los residuos
Thr30
a Gln50
.
La respuesta inmune humoral contra TSSA VI presenta variaciones entre individuos.
Desarrollamos un reactivo de serodiagnóstico peptídico basado en la secuencia inmunorreactiva
identificada, el cual mostró una performance diagnóstica similar a la proteína TSSA VI.
La presencia de anticuerpos de diferentes isotipos/especificidad contra TSSA VI no parece ser un
buen biomarcador para el diagnóstico de infecciones congénitas o para determinar el tiempo de
infección.
Se encontraron dos motivos de interacción con células no macrofágicas dentro de la molécula de
TSSA VI.
Materiales y métodos
39
Materiales y métodos
Microarreglo de péptidos
En el contexto de un proyecto tendiente a la identificación y mapeo de epitopes B en las proteínas de T. cruzi
a gran escala105
, se analizó la secuencia de la proteína TSSA VI en microarreglos peptídicos, los cuales
presentaban la totalidad de la secuencia de esta proteína, incluyendo las señales secretorias, representada por
78 péptidos de 15 aa, con un solapamiento parcial de 14 aa. Brevemente, se incubaron microarreglos
peptídicos de última generación94
durante la noche con 1 ml de IgG purificada diluida a 20 mg/ml en
Tris/acetato pH 8, 0,1 Tween 20. La purificación se realizó con el kit Melon Gel IgG (Thermo Scientific),
acorde a las instrucciones del fabricante. La pureza fue evaluada por tinción con Coomassie brilliant blue en
geles SDS-PAGE y la concentración fue estimada por comparación con una curva estándar de γ-globulina
purificada (BioRad Laboratories). Luego de lavar con buffer de incubación, los slides se incubaron con una
solución 1 µg/ml del anticuerpo secundario (IgG Cy3 de cabra anti-humana, Abcam) durante 2 h. Luego de
un segundo lavado con buffer de incubación, seguido de una etapa de lavado posterior con n-metil-
pirrolidona y diclorometano y secado al aire, se determinaron las señales en los arreglos con un scanner láser
(InnoScan 900, INNOSYS, Carbonne, France) con 1 µm de resolución, con una longitud de onda de
excitación de 532nm. Cada muestra correspondió a 5 individuos distintos (3 µl cada uno), que fueron
mezclados antes de la purificación de IgG. Los arreglos de péptidos se ensayaron secuencialmente, primero
con una muestra negativa (IgG purificada a partir de 5 individuos sanos) y luego con la muestra positiva (IgG
purificada a partir de 5 individuos infectados con T. cruzi). Con este diseño experimental, se obtuvieron 2
conjuntos de datos para cada experimento: uno correspondiente a la lectura de individuos sanos (control
negativo) y uno correspondiente a la señal acumulada de las muestras de la señal negativa + las muestras de
los pacientes infectados, a la cual por sustracción se le calcula la reactividad. Se graficaron los valores medios
de fluorescencia obtenidos luego de la sustracción de cada uno de los 78 péptidos derivados de TSSA VI.
Integrando todas las señales del microarreglo (que incluía controles positivos y negativos), se estableció un
valor de corte de 3 U.A. (unidades arbitrarias) de fluorescencia para el cual la sensibilidad y especificidad son
óptimas. Cabe señalar que, a pesar de CL Brener es un clon híbrido117
, la proteína TSSA deducida en ambos
alelos (TcCLB.507511.81 y TcCLB.507511.91) es idéntica. Por lo tanto, no se evaluaron polimorfismos de
TSSA en los arreglos.
Materiales y métodos
40
Cepas bacterianas y plásmidos
Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados en este trabajo se describen en la tabla M.1.
Tabla M.1: Cepas bacterianas y plásmidos utilizados
Cepas o plásmidos Características Referencia
Escherichia coli
DH5αF'IQ™
F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-,
mk+) phoAsupE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1/F´ proAB+ lacIqZΔM15
zzf::Tn5 [Kmr].
Invitrogen
Escherichia coli BL21-
CodonPlus(DE3)-RP
E. coli B F- ompT hsdS(rB mB ) dcm Tet gal l(DE3) endA Hte [argU
proL Camr] Stratagene
pGEX2T Vector de expresión, Ampr GE Healthcare
pGEX1λT Vector de expresión, Ampr GE Healthcare
pGEX1λT- SAPA Contiene la región repetitiva y antigénica del gen que codifica para la
proteína SAPA clonado en el vector pGEX1λT Ref.
118
pGEX2T-TSSA VI
Contiene la región comprendida entre los residuos 24 y 62 del gen
que codifica para la proteína TSSA VI(obtenida a partir de la cepa CL
Brener) clonado en el vector pGEX2T
Ref.81
pGEX2T-TSSA I
Contiene la región comprendida entre los residuos 24 y 61 del gen
que codifica para la proteína TSSA I (obtenida a partir de la cepa
Sylvio X-10) clonado en el vector pGEX2T
Ref.81
pGEX2T-TSSA VI-e1 Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-e1
clonada en el vector pGEX2T Este trabajo
pGEX2T-TSSA VI-e2 Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-e2
clonada en el vector pGEX2T Este trabajo
pGEX2T-TSSA VI-e3 Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-e3
clonada en el vector pGEX2T Este trabajo
pGEX2T-TSSA VI-e4 Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-e4
clonada en el vector pGEX2T Este trabajo
pGEX2T-TSSA VI-e5 Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-e5
clonada en el vector pGEX2T Este trabajo
pGEX2T-TSSA VI-eA Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-eA
clonada en el vector pGEX2T Este trabajo
pGEX2T-TSSA VI-eB Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-eB
clonada en el vector pGEX2T Este trabajo
pGEX2T-TSSA VI-eC Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-eC
clonada en el vector pGEX2T Este trabajo
pGEX2T-TSSA VI-eD Contiene la secuencia que codifica para el péptido TSSA VI-eD
clonada en el vector pGEX2T Este trabajo
Abreviaturas: Ampr, resistencia a ampicilina; Cam
r, resistencia a cloranfenicol; Km
r, resistencia a kanamicina.
Materiales y métodos
41
Oligonucleótidos
Los oligonucleótidos utilizados se detallan en la tabla M.2.
Tabla M. 2: Oligonucleótidos usados
Variante delecional
de 15 aa que
conforma
Nombre Secuencia nucleotídica (de 5’ a 3’)
Epitope 1 TSSA Ep 1 Forward CAGGATCCACAGCGAATGGTGGGTCTACTAGTTCT
TSSA Ep 1 Reverse CAGAATTCACGTACCAGAAGGTGGGGTAGAACTAGT
Epitope 2 TSSA Ep 2 Forward CAGGATCCACTAGTTCTACCCCACCTTCTGGTACG
TSSA Ep 2 Reverse CAGAATTCATGTAGCTGGTTTATTTTCCGTACCAGA
Epitope 3 TSSA Ep 3 Forward CAGGATCCTCTGGTACGGAAAATAAACCAGCTACA
TSSA Ep 3 Reverse CAGAATTCATTGAGATGGAGCTTCCCCTGTAGCTGG
Epitope 4 TSSA Ep 4 Forward CAGGATCCCCAGCTACAGGGGAAGCTCCATCTCAA
TSSA Ep 4 Reverse CAGAATTCAACCTGAAGAAGCCCCCGGTTGAGATGG
Epitope 5 TSSA Ep 5 Forward CAGGATCCCCATCTCAACCGGGGGCTTCTTCAGGT
TSSA Ep 5 Reverse CAGAATTCATGAGGAGGCTTCTGCTTCACCTGAAGA
N.A. pGEX Forward GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT
N.A. pGEX Reverse CCGGGAGCTGCATGTGTCAGA
N.A.: No aplica. Los sitios de restricción se indicaron con letra negrita y subrayada.
Preparación de células competentes
Las células competentes de las cepas Escherichia coli DH5αF'IQ™ y Escherichia coli BL21-
CodonPlus(DE3)-RP fueron preparadas por el método SEM (simple and efficient method)119
.
Construcción de las variantes delecionales de TSSA VI
Las construcciones de las variantes delecionales de TSSA VI se realizaron por rellenado mediado por
Taq polimerasa de oligonucleótidos parcialmente complementarios. Para la obtención de las variantes
delecionales TSSA VI-e1 a e5 se alinearon los oligonucleótidos TSSA VI Ep n Fw y TSSA VI Ep n Rv (tabla
M.2). En figura M.1 (panel a), se esquematizó el alineamiento correspondiente a la variante delecional TSSA
VI-e1, a modo de ejemplo. Para la obtención de las variantes delecionales TSSA VI-eA a eB, se alinearon los
oligonucleótidos TSSA VI Ep n+1 Fw con los TSSA VI Ep n Rv (tabla M.2). En la figura M.1 (panel b) se
esquematizó el alineamiento correspondiente a la variante delecional TSSA VI-eA, a modo de ejemplo. El
alineamiento y rellenado de los oligonucleótidos parcialmente complementarios se basó en una variante de la
reacción de PCR la cual consiste en un ciclo de desnaturalización, seguido de la disminución paulatina de la
temperatura para favorecer el alineamiento y una polimerización (rellenado) final con polimerasa Taq
Materiales y métodos
42
(Fermentas). A continuación, se realizó la restricción de los productos obtenidos usando las enzimas EcoRI y
BamHI (ambas de Fermentas). Los fragmentos obtenidos se ligaron en el plásmido pGEX2T previamente
digerido con las mismas enzimas de restricción. Este plásmido permite expresar proteínas como fusión al
extremo carboxilo terminal de la proteína Glutatión-S-Transferasa de Schistosoma japonicum (GST). Se
transformaron bacterias competentes DH5α con los distintos plásmidos y se realizó el screening de colonias
por PCR, usando los oligonucleótidos pGEX Fw y pGEX Rv (tabla M.2). Los plásmidos se purificaron a
partir de cultivos de colonias positivas crecidos toda la noche siguiendo protocolos descriptos y se analizaron
por secuenciación.
Secuenciación
La secuenciación de ADN fue realizada utilizando el secuenciador automático modelo ABI PRISM
377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer Applied Biosystems Division) según las indicaciones del fabricante.
Expresión y purificación de proteínas recombinantes
Se transformaron bacterias competentes Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3)-RP con los
plásmidos pGEX2T, pGEX2T-TSSA VI-e1 a e5, pGEX2T-TSSA VI-eA a eD y pGEX2T-TSSA I y VI. La
cepa usada posee genes extra que codifican para los ARN de transferencia menos representados en el genoma
bacteriano, permitiendo mayores niveles de expresión de proteínas codificadas por genes heterólogos. Las
cepas resultantes de la transformación, se cultivaron en medio LB a 37ºC (250 rpm) hasta llegar a una
OD600nm de 0,6 y se indujo la expresión de las proteínas con IPTG 250 M y se incubó 16 horas a 28ºC en
agitación. La purificación se realizó a partir de la fracción soluble por cromatografía de afinidad hacia el
dominio GST de fusión, utilizando columnas de Glutatión-Sefarosa, siguiendo las indicaciones del fabricante
(Glutathione Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare). Las proteínas se dializaron contra PBS 0,5 X en
columna NAP10 y se concentraron en SpeedVac (Savant ISS110) alcanzando aproximadamente la mitad del
volumen de elución. Se verificó la pureza e integridad de las proteínas obtenidas en geles de poliacrilamida
12,5% teñidos con Coomassie Blue. La cuantificación se realizó por los métodos de Picodrop y Bradford
Materiales y métodos
43
según las indicaciones de los fabricantes (BioRad) usando como estándar soluciones de concentraciones
conocidas de BSA.
Condiciones de cultivo bacteriano
Las cepas de Escherichia coli fueron cultivadas a 37ºC en agitador rotatorio (200 - 250 rpm) o en
placas de Petri con agar 1,5% en medio Luria-Bertani (LB)120
. Según la cepa, el medio se suplementó con
los siguientes antibióticos: Ampicilina 100 μg/ml o cloranfenicol 34 μg/ml.
Técnicas de biología molecular
Las técnicas de restricción, ligación y purificación de ADN plasmídico, PCR, generación y
transformación de bacterias competentes son de uso corriente en el laboratorio. Se realizaron según se indica
en120
y según las indicaciones de los fabricantes de los diferentes kits y/o insumos utilizados para cada caso.
Péptidos
Los péptidos fueron sintetizados por GenScript. La pureza (>90%) e identidad de los péptidos fue
determinada por el fabricante usando cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y confirmada por
espectrometría de masa, respectivamente. Los péptidos usados se detallan en la tabla M.3.
Tabla M. 3: Detalle de péptidos usados
Nombre Secuencia Origen Particularidades
E4VI 42
PATGEAPSQPGASSG56
TSSA VI 5 FAM en NH2
E4I 41
TAAGGTPSPSGASSG55
TSSA I 5 FAM en NH2
E4VIsc GSPAPTGEPASQAGS(*) TSSA VI 5 FAM en NH2
E2VI 30
TSSTPPSGTENKPAT44
TSSA VI 5 FAM en NH2
E1VI 24
TANGGSTSSTPPSGT38
TSSA VI 5 FAM en NH2
tssa VI C24
TANGGSTSSTPPSGTENKPATGEAPSQPGASSGEAEASS62
TSSA VI Cys en NH2
tssa I 27
GGSTSSTPPGTDKKTAAGGTPSPSGASSG55
C TSSA I Cys en COOH
E2 C 28
GSTSSTPPSGTENKPAT44
TSSA VI Cys en NH2
E3 39
ENKPATGEAPSQ50
C TSSA VI Cys en COOH
E2E3 C 30
TSSTPPSGTENKPATGEAPSQ50
TSSA VI Cys en NH2
E2E3sc C GPSNESTEKSPQSATATGPPT (**) TSSA VI Cys en NH2
5-FAM: 5-CarboxyFluorescein-Aminohexyl Amidite.
*Contiene la misma composición aminoacídica que el péptido E4VI, aunque en distinta secuencia.
**Contiene la misma composición aminoacídica que el péptido E2E3, aunque en distinta secuencia.
Materiales y métodos
44
Acoplamiento de los péptidos
Para el acoplamiento de los péptidos se utilizó la proteína OVA activada por maleimida (Thermo
Scientific). Se diluyeron 2 mg de la proteína comercial con 200 µl de agua, los cuales se fraccionaron
inmediatamente en 5 tubos (40 µl cada uno), a los cuales se agregó 1 mg de péptido sintético liofilizado. La
concentración final se calculó en función de la proteína carrier.
Homogenato de tripomastigotes
Los tripomastigotes puros (conteniendo menos del 5% de contaminación con otros estadíos) se
lavaron con PBS y se lisaron mediante incubación en buffer RIPA (50 mM Tris pH = 8, NaCl 150 mM, 1 mM
Cl2Mg, 0,1% de SDS, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) al cual se le agregó un cóctel de inhibidores de
proteasas (Sigma) y DNAsaI (10 µg/ml) durante 30 min en hielo. El lisado se clarificó mediante
centrifugación y la concentración de proteínas en el sobrenadante se cuantificó por el método de Bradford y
se ajustó a 1 µg/µl con PBS. Finalmente, alícuotas de estas preparaciones se almacenaron a -80°C hasta su
uso104
.
ELISA
Se realizó la adsorción del antígeno a placas de 96 pocillos (Nunc MaxiSorp) en buffer bicarbonato
0,05M pH 9,6 a 4°C durante 16 horas. A continuación se bloqueó por una hora a 37°C, se lavó y se incubó
con el anticuerpo primario una hora a 37 ºC. Pasado el tiempo de incubación, se lavó y se incubó una hora
con el anticuerpo secundario correspondiente en cada caso. Finalmente se lavó el anticuerpo secundario y se
procedió con el revelado y finalización de la reacción para luego hacer la lectura de absorbancia a 450nm. En
todos los casos los sueros se analizaron por duplicado (excepto indicación contraria indicada en resultados).
Para el análisis de reactividad de las proteínas de fusión a GST o de los péptidos sin acoplar en muestras de
pacientes con infección crónica, congénita y/o aguda, se usó 1 μg de antígeno por pocillo. Se bloqueó con
leche descremada 4% en TBS y se incubaron los sueros diluidos 1:500 en solución de bloqueo. Se reveló con
anticuerpos anti-IgG humanos acoplados a HRP (Sigma) 1:5000, en solución de bloqueo. Para el análisis de
reactividad de los péptidos sintéticos acoplados a OVA, se usó 0,1 μg de proteína acoplada por pocillo. Se
bloqueó con 4% leche descremada en TBST 0,05% y se incubaron los sueros diluidos 1:500 en esta solución.
El procedimiento de revelado fue el mismo que en el caso anterior. Para el análisis de presencia de IgM en
muestras de sueros de humanos infectados (muestras de niños con infección congénita y muestras pareadas
madre/hijo), se usó 1 μg de proteína de fusión por pocillo. Se bloqueó con leche descremada 4% en TBS y se
incubaron los sueros diluidos 1:100 en esta solución en agitación (160 rpm). Se reveló con anticuerpos anti-
IgM humana acoplados a HRP (Sigma) 1:5000, en solución de bloqueo. Para el análisis de muestras de
sueros de pacientes con infección aguda se usó 1 μg de proteína de fusión por pocillo, bloqueó con leche
Materiales y métodos
45
descremada 4% en TBS y se incubaron los sueros diluidos 1:500 en solución de bloqueo. Se reveló con
anticuerpos anti-IgA, IgM, IgG humanas acoplados a HRP (Sigma) diluidos 1:5000 en solución de bloqueo.
Para el seguimiento serológico de ratones infectados con T. cruzi, se usaron 0,3 μg de proteína de fusión por
pocillo, se bloqueó con leche descremada 5% en TPBS 0,05% y se incubaron los sueros diluidos 1:400 en 1%
leche descremada en TPBS 0,05%. Se reveló con anticuerpos anti-IgG o anti-IgM de ratón acoplados a HRP,
diluidos 1:5000 o 1:1000, respectivamente. Las soluciones de revelado (1 mg de TMB (Sigma-Aldrich), 333
μl de DMSO y 120 μl de H2O2 (30 vol) en 10 ml de buffer citrato 0,1 M pH 4,2) y finalización (Ácido
sulfúrico 2M) fueron idénticas para todos los ensayos de ELISA.
ELISA de desplazamiento
El protocolo fue adaptado de 121
. Se sensibilizaron las placas con 0,5 μg de proteína GST-TSSA VI y
se procedió de igual modo que para el análisis de IgG (ver punto anterior). Sin embargo, los sueros fueron
preincubados durante 30 min. con el péptido sintético (2 μg; 0,2 μg; 0,02 μg por pocillo, para la
estandarización y 2 μg en el ensayo final) en un volumen final de 10 μl (en PBS). Antes de su incubación en
la placa de ELISA, se llevó a volumen la mezcla de suero-péptido con TBS-Leche 4% y se procedió tal cual
lo descripto en el punto anterior. La absorbancia de muestras de suero preincubadas con 10 μl de PBS en
ausencia de péptido y procesadas en paralelo de igual manera fue tomada como 100% de reactividad (0%
inhibición).
Ensayos de pegado de proteínas recombinantes a células en cultivo
Se crecieron células HeLa CCL2 (ATCC) en medio DMEM (Gibco) suplementado con SFB 10%
(Natocor), 100 µg/ml de estreptomicina y 100 unidades/ml de penicilina (Gibco). Se tripsinizaron con una
solución de tripsina-EDTA 0,05% (Gibco), y se calculó la concentración celular con cámara de Neubauer. Se
sembraron 4.104 células por pocillo en medio DMEM completo, en una placa de 96 pocillos (Orange
Scientific), las cuales fueron incubadas durante 16 horas a 37°C y 5% CO2. Pasado este tiempo, se extrajo el
medio de cultivo y se lavaron las células con 500 μl de PBS (3 lavados de 5 min cada uno) para luego fijarlas
con 100 μl de paraformaldehido 4% durante 20 minutos. Una vez fijadas las células se lavaron con PBS-
Tween (TPBS) 0,05% y se procedió a bloquear con SFB 5% (en TPBS) por una hora para luego lavar con
TPBS. A continuación se incubó con 100 μl de una solución de 200 μg/ml de la proteína de fusión a analizar
en SFB 2% (en TPBS). Como controles negativos se utilizaron las proteínas TSSA I, GST y como control
positivo se utilizó la proteína GST-MASP (que contiene un segmento adhesivo de una proteína MASP
clonada en el laboratorio) (Ignacio Durante, resultados sin publicar). Pasado el tiempo de incubación se lavó
con TPBS y se incubó por una hora con anticuerpos diluidos en SFB 2% (en TPBS). Se utilizaron anticuerpos
anti-GST monoclonales (clon M2, Sigma, 1:5000) o policlonales generados por inmunización en ratones o
conejos (1:250) (figura M.2). Luego se lavó con TPBS y se incubó por una hora con una dilución 1:1000 del
Materiales y métodos
46
anticuerpo secundario dirigido contra ratón o conejo conjugado a HRP, en SFB 2% (en TPBS). Finalmente se
lavó con TPBS y reveló con 100 μl de solución de revelado de ABTS: 10 ml de buffer fosfato-citrato 0,1 M
pH 5, 1 tableta de ABTS (Sigma) y 30 μl de H2O2. Se detuvo la reacción con SDS 1% y se determinaron los
valores de absorbancia a 405 nm.
Detección colorimétrica
La detección colorimétrica en los ensayos ELISA y de pegado de proteínas recombinantes a células
en cultivo descriptos arriba se realizaron con el sistema FilterMax F5 Multimode Microplate Reader
(Molecular Devices).
Criterios de positividad y negatividad en los ensayos de ELISA
En los ensayos en los que se usaron muestras de sueros de pacientes infectados crónicos, “crónicos
tempranos” y agudos se incluyeron de 2 a 4 sueros negativos del mismo grupo etario que el de muestreo. Los
sueros analizados se consideraron:
Positivos para cierto antígeno si la media de la absorbancia de la muestra menos 3 SD era mayor a la
media del valor obtenido para el mismo antígeno con los sueros negativos más 3 SD.
Negativos si la media de la absorbancia de la muestra menos 3 SD era menor a la media del valor
obtenido para el mismo antígeno con los sueros negativos más 3 SD.
Para los ensayos ELISA en los que se comparó el título de IgG anti-TSSA VI y anti- SAPA entre las madres
y los bebés, se consideró:
Materiales y métodos
47
Positivo si la media de la absorbancia obtenida en el suero del bebé para cierto antígeno menos 3 SD
superaba la media de la absorbancia de ese antígeno obtenida para el suero de la madre.
Negativo en el caso contrario.
Paneles de sueros usados
El panel de sueros de pacientes Chagásicos crónicos fue provisto por el Instituto Nacional de
Parasitología “Dr. Mario Fatala Chabén” (con resultados positivos para las técnicas IFI, HAI y ELISA
comerciales) y el Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutierrez” (con resultados positivos para las técnicas
ELISA y HAI comerciales). En todos los casos, los sueros pertenecían a pacientes mayores a 10 años,
nacidos en zonas endémicas y con más de 5 años de residencia en zonas no endémicas. Los sueros negativos
se obtuvieron de la Fundación Hemocentro Buenos Aires y fueron provistos por Jorgelina Blejer. El panel de
sueros de pacientes Chagásicos “crónicos tempranos” fue provisto por el Hospital de Niños “Dr. Ricardo
Gutierrez” (con resultados positivos para las técnicas ELISA y HAI comerciales). En todos los casos, los
sueros pertenecían a pacientes de entre 1 y 3 años, de residencia en zonas no endémicas y probable infección
congénita. Las muestras de sueros de pacientes con infección aguda (método de diagnóstico no especificado),
las muestras de suero de pacientes con infección congénita (con resultados positivos para las técnicas de
ELISA y HAI ), las muestras de sueros pareadas de madres infectadas con niños con infección congénita
(parasitemia positiva) y las muestras de pacientes sanos del grupo etario correspondiente, fueron
proporcionados por el Dr. Jaime Altcheh del Hospital de Niños “Dr. Ricardo Gutiérrez”, con quien se
estableció una colaboración de trabajo. Finalmente, los 8 sueros usados en el ensayo de desplazamiento con
péptidos sintéticos fueron proporcionados por la Dra. Karina Gomez del Instituto de Investigaciones en
Ingeniería Genética y Biología Molecular, “Dr. Héctor N. Torres”. Estos pacientes dieron resultados positivos
por las técnicas IFI, ELISA, HAI o fijación de complemento y habían sido testeados por ELISA contra TSSA
VI11
.
Infecciones de ratones con T. cruzi
Las infecciones, el sangrado de los animales y las determinaciones de parasitemia fueron realizadas
por la Dra. Valeria Tekiel del Laboratorio de Genética Molecular de Tripanosomátidos del Instituto de
Investigaciones Biotecnológicas “Dr. Rodolfo A. Ugalde”. Se realizaron 3 ensayos de infección
independientes utilizando hembras de las cepas de ratón C3H/HeJ y CF1. Se infectó cada ratón con 50
parásitos y se les extrajo sangre a distintos días post infección (dpi). Se midió la parasitemia por cámara de
Neubauer y, en alícuotas de esas mismas muestras, se determinó la presencia de anticuerpos por el método de
ELISA descripto arriba.
Materiales y métodos
48
Infecciones de células en cultivo con T. cruzi
Se crecieron células HeLa CCL2 en medio DMEM (Gibco) suplementado con SFB 4% (Natocor),
100 µg/ml de estreptomicina y 100 unidades/ml de penicilina (Gibco) en estufa a 37°C y 5% CO2. Se
tripsinizaron con una solución de tripsina-EDTA 0,05% (Gibco), y se calculó la concentración celular con
cámara de Neubauer. Se sembraron 1.104 células por pocillo en medio DMEM completo, en una placa de 24
pocillos con cubreobjetos circulares para microscopía, incubando 16 horas a 37°C y 5% CO2. Al día siguiente
se agregaron 5.105 tripomastigotes o amastigotes (ambos obtenidos a partir de sobrenadantes de células Vero
infectadas) por well en presencia 100 µg/ml de proteína recombinante o 200 µg/ml de péptido sintético por
pocillo. Luego de 3 horas de incubación a 37°C y 5% CO2 los cultivos se lavaron con PBS (4 lavados de 500
µl cada uno) para remover los parásitos no adheridos y se fijaron con paraformaldehido 4% inmediatamente
(ensayos de adhesión) o luego de una incubación de 36 horas en medio MEM 4% SFB (ensayos de
infección). A continuación, se lavaron las células con PBS, se incubaron 10 minutos con NH4Cl 25 mM, se
bloquearon 1 hora con PBS 2% BSA y 2% suero normal de cabra y se procesaron para IIF. Los parásitos
extracelulares se marcaron con suero de ratón infectado con T. cruzi (1:500 en solución de bloqueo) seguido
de la incubación con una solución 1:1000 en solución de bloqueo del anticuerpo secundario anti-Ig ratón
conjugado a Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes). Los parásitos intracelulares (marcación realizada sólo
para el ensayo de invasión) se marcaron a continuación con suero de conejo infectado con T. cruzi (1:500 en
solución de bloqueo con 0,5% saponina) y luego se incubó con una solución de anticuerpo secundario anti-Ig
conejo 1:1000 en solución de bloqueo marcado con AlexaFluor® 564 (Molecular Probes). Los cubreobjetos
se montaron en portaobjetos en presencia de 10 µl del agente Fluor Save (Calbiochem) con 1 µg/ml de DAPI
(Invitrogen). Se analizaron las imágenes en el microscopio Nikon Eclipse E600 acoplado a la cámara SPOT
RT™ (Diagnostic Instruments). Se contaron 300 células infectadas/no infectadas de manera manual.
Viabilidad de los parásitos
Se incubaron 1.106 parásitos en medio MEM con SFB 4% por 3 horas con PBS (control negativo),
con 200 μg/ml del péptido indicado (E1, E2 y E4) o con formol 4% (control positivo). Luego, se lavó 2 veces
con PBS y se incubó por 2 min con 1 μg/ml de ioduro de propidio. Se realizó un control sin teñir. A
continuación, se fijaron los parásitos por 20 min con paraformaldehido 4% en PBS, se lavó 3 veces con PBS
y se resuspendieron en 1 ml de PBS. Se analizaron las muestras en el canal F3 en el citómetro Partec
CyFlow® space.
Viabilidad celular
Se incubaron 1.103
células HeLa por pocillo en placa para cultivo celular de 96 pocillos (Orange
Scientific). Al día siguiente, se lavaron con PBS y se incubaron durante 3 horas con 200 μg/ml de péptido
Materiales y métodos
49
(E1VI, E2VI, E4VI, E4VIsc) o PBS (control negativo), por triplicado A continuación se lavó 2 veces con
PBS y se incubaron hasta el día siguiente en medio DMEM SFB 10%. Al día siguiente se tripsinizaron las
células con una solución de tripsina-EDTA 0,05% (Gibco) y se agregó un volumen de Azul de Trypan 0,4%.
Se contó el total de células vivas y muertas bajo el microscopio.
Análisis estadístico
Los distintos test estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 5. Los resultados de ELISA e
interacción proteína-célula se analizaron con test estadístico ANOVA de una o dos vías según se aclare en el
texto; se utilizó la variante Bonferroni para comparar con un tratamiento control. La comparación entre las
curvas ROC se realizó con el software estadístico MedCalc.
Información suplementaria
50
Información suplementaria
Tabla S. 1: Secuencia y reactividad de los péptidos de TSSA VI presentes en el microarreglo.
Péptido Proteína
recombinantea
Secuencia Mezcla #1 Mezcla #2
Media S.D. Media S.D.
p1-15 MTTCRLLCALLALAL -0,042 0,197 -0,047 0,028 p2-16 TTCRLLCALLALALC -0,045 0,212 -0,073 0,022 p3-17 TCRLLCALLALALCC -0,051 0,233 -0,095 0,008
p4-18 CRLLCALLALALCCC -0,064 0,223 -0,116 0,008 p5-19 RLLCALLALALCCCL -0,068 0,216 -0,151 0,008
p6-20 LLCALLALALCCCLT -0,074 0,226 -0,151 0,022 p7-21 LCALLALALCCCLTA -0,083 0,239 -0,151 0,028
p8-22 CALLALALCCCLTAC -0,063 0,227 -0,159 0,037
p9-23 ALLALALCCCLTACT -0,043 0,217 -0,16 0,037 p10-24 LLALALCCCLTACTT -0,025 0,21 -0,162 0,049
p11-25 LALALCCCLTACTTA 0,008 0,233 -0,164 0,085 p12-26 ALALCCCLTACTTAN 0,024 0,22 -0,172 0,05
p13-27 LALCCCLTACTTANG 0,045 0,166 -0,178 0,044
p14-28 ALCCCLTACTTANGG 0,053 0,148 -0,178 0,044 p15-29 LCCCLTACTTANGGS 0,055 0,142 -0,172 0,034
p16-30 CCCLTACTTANGGST 0,041 0,119 -0,164 0,034 p17-31 CCLTACTTANGGSTS 0,031 0,114 -0,162 0,027
p18-32 CLTACTTANGGSTSS -0,01 0,146 -0,16 0,003 p19-33 LTACTTANGGSTSST -0,054 0,101 -0,159 0,003
p20-34 TACTTANGGSTSSTP -0,067 0,128 -0,151 0,003
p21-35 ACTTANGGSTSSTPP -0,101 0,148 -0,124 0,01 p22-36 CTTANGGSTSSTPPS -0,118 0,162 -0,016 0,051
p23-37 TTANGGSTSSTPPSG 0,03 0,191 0,5 0,034 p24-38 TSSA VI-e1 TANGGSTSSTPPSGT 21,62 2,16 4,513 0,712
p25-39 ANGGSTSSTPPSGTE 29,71 0,55 10,68 3,289
p26-40 NGGSTSSTPPSGTEN 36,96 2,86 16,4 3,359 p27-41 GGSTSSTPPSGTENK 44,62 0,91 22,93 4,129
p28-42 GSTSSTPPSGTENKP 57,09 1,42 28,72 5,154 p29-43 STSSTPPSGTENKPA 78,24 2,1 33,71 6,734
p30-44 TSSA VI-e2 TSSTPPSGTENKPAT 95,02 2,24 42,82 8,505
p31-45 SSTPPSGTENKPATG 97,54 2,23 47,52 7,689 p32-46 STPPSGTENKPATGE 92,5 0 50,9 7,038
p33-47 TPPSGTENKPATGEA 86,37 5,29 53,48 5,08 p34-48 PPSGTENKPATGEAP 78,61 0,36 57,9 6,353
p35-49 PSGTENKPATGEAPS 70,15 3,7 62,76 8,612 p36-50 TSSA VI-e3 SGTENKPATGEAPSQ 55,19 2,6 66,97 9,299
p37-51 GTENKPATGEAPSQP 44,79 0,78 64,88 2,275
p38-52 TENKPATGEAPSQPG 40,27 0,11 54,13 2,346 p39-53 ENKPATGEAPSQPGA 32,65 0,05 47,65 2,656
p40-54 NKPATGEAPSQPGAS 27,83 1,47 41,6 3,387 p41-55 KPATGEAPSQPGASS 24,08 2,98 28,45 5,224
p40-56 TSSA VI-e4 PATGEAPSQPGASSG 18,55 4,12 18,6 18,738
p43-57 ATGEAPSQPGASSGE 10,01 3,82 10,75 14,897 p44-58 TGEAPSQPGASSGEA 2,31 0,141 5,291 3,828
p45-59 GEAPSQPGASSGEAE 0,09 0,164 2,74 0,443 p46-60 EAPSQPGASSGEAEA -0,042 0,181 2,126 0,2
p47-61 APSQPGASSGEAEAS -0,086 0,168 1,694 0,13 p48-62 TSSA VI-e5 PSQPGASSGEAEASS -0,125 0,251 1,508 0,099
p49-63 SQPGASSGEAEASSN -0,156 0,316 1,272 0,071
p50-64 QPGASSGEAEASSNK -0,165 0,336 0,986 0,016
Información suplementaria
51
p51-65 PGASSGEAEASSNKN -0,145 0,294 0,42 0,009 p52-66 GASSGEAEASSNKND -0,107 0,212 0,075 0,008
p53-67 ASSGEAEASSNKNDG -0,083 0,162 0,03 0,017 p54-68 SSGEAEASSNKNDGS -0,067 0,128 -0,008 0,058
p55-69 SGEAEASSNKNDGSL -0,055 0,102 -0,064 0,019 p56-70 GEAEASSNKNDGSLS -0,046 0,084 -0,111 0,01
p57-71 EAEASSNKNDGSLSS -0,047 0,033 -0,112 0,01
p58-72 AEASSNKNDGSLSSS -0,05 0,033 -0,098 0,01 p59-73 EASSNKNDGSLSSSA -0,057 0,033 -0,097 0,01
p60-74 ASSNKNDGSLSSSAW -0,059 0,031 -0,105 0,01 p61-75 SSNKNDGSLSSSAWV -0,101 0,039 -0,102 0,01
p62-76 SNKNDGSLSSSAWVS -0,115 0,053 -0,103 0,01
p63-77 NKNDGSLSSSAWVSA -0,127 0,059 -0,072 0,003 p64-78 KNDGSLSSSAWVSAP -0,128 0,062 -0,036 0,003
p65-79 NDGSLSSSAWVSAPL -0,132 0,075 0 0,008 p66-80 DGSLSSSAWVSAPLA -0,125 0,074 0,004 0,022
p67-81 GSLSSSAWVSAPLAL -0,121 0,076 0,001 0,034 p68-82 SLSSSAWVSAPLALA -0,107 0,041 -0,017 0,05
p69-83 LSSSAWVSAPLALAA -0,028 0,076 -0,038 0,09
p70-84 SSSAWVSAPLALAAS -0,021 0,08 -0,076 0,079 p71-85 SSAWVSAPLALAASA -0,008 0,065 -0,105 0,09
p72-86 SAWVSAPLALAASAL -0,003 0,031 -0,146 0,09 p73-87 AWVSAPLALAASALA -0,018 0 -0,177 0,09
p74-88 WVSAPLALAASALAY -0,022 0,014 -0,161 0,081
p75-89 VSAPLALAASALAYT -0,064 0,112 -0,128 0,05 p76-80 SAPLALAASALAYTA -0,061 0,098 -0,103 0,049
p77-91 APLALAASALAYTAL -0,06 0,08 -0,074 0,063 p78-92 PLALAASALAYTALG -0,068 0,052 -0,047 0,063
Cada arreglo fue ensayado por duplicado. Se indicó para cada mezcla de IgG la media de la reactividad y el desvío
estándar (S.D) obtenidos en cada péptido (la reactividad se expresó como unidades arbitrarias de fluorescencia). Se
consideraron reactivos los péptidos que arrojaron valores de media mayores a 3 unidades arbitrarias de
fluorescencia; los péptidos reactivos para cada mezcla se encuentran resaltados y el péptido de mayor reactividad
se encuentra subrayado. a Se indica la proteína recombinante conteniendo la secuencia correspondiente a este
mismo péptido (ver figura R.3)
Referencias bibliograficas
52
Referencias bibliográficas
1. WHO | Chagas disease (American trypanosomiasis). WHO at
<http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/>
2. Holmes, P. & WHO Strategic and Advisory Group on Neglected Tropical Diseases. Neglected tropical
diseases in the post-2015 health agenda. Lancet 383, 1803 (2014).
3. Schmunis, G. A. & Yadon, Z. E. Chagas disease: A Latin American health problem becoming a world
health problem. Acta Trop. 115, 14–21 (2010).
4. Brener, Z. Biology of Trypanosoma Cruzi. Annu. Rev. Microbiol. 27, 347–382 (1973).
5. Tanowitz, H. B. et al. Chagas’ disease. Clin. Microbiol. Rev. 5, 400–419 (1992).
6. Teixeira, A. R. L., Nascimento, R. J. & Sturm, N. R. Evolution and pathology in chagas disease--a
review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 101, 463–491 (2006).
7. Viotti, R. et al. Towards a Paradigm Shift in the Treatment of Chronic Chagas Disease. Antimicrob.
Agents Chemother. 58, 635–639 (2014).
8. Pinazo, M.-J. et al. Immunosuppression and Chagas Disease: A Management Challenge. PLoS Negl.
Trop. Dis. 7, (2013).
9. Remme, J. H. F. et al. in Disease Control Priorities in Developing Countries (eds. Jamison, D. T. et al.)
(World Bank, 2006). at <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK11745/>
10. Prata, A. Clinical and epidemiological aspects of Chagas disease. Lancet Infect. Dis. 1, 92–100 (2001).
11. Longhi, S. A. et al. Cytokine Production but Lack of Proliferation in Peripheral Blood Mononuclear
Cells from Chronic Chagas’ Disease Cardiomyopathy Patients in Response to T. cruzi Ribosomal P
Proteins. PLoS Negl. Trop. Dis. 8, e2906 (2014).
12. Brener, Z. in Advances in Parasitology (ed. W.H.R. Lumsden, R. M. and J. R. B.) Volume 18, 247–292
(Academic Press, 1980).
13. Zingales, B. et al. A new consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature: second revision
meeting recommends TcI to TcVI. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 104, 1051–1054 (2009).
14. Filardi, L. S. & Brener, Z. Susceptibility and natural resistance of Trypanosoma cruzi strains to drugs
used clinically in Chagas disease. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 81, 755–759 (1987).
15. Martínez-Díaz, R. A., Escario, J. A., Nogal-Ruiz, J. J. & Gómez-Barrio, A. Biological characterization of
Trypanosoma cruzi strains. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 96, 53–59 (2001).
16. Sánchez-Guillén, M. del C. et al. Trypanosoma cruzi strains isolated from human, vector, and animal
reservoir in the same endemic region in Mexico and typed as T. cruzi I, discrete typing unit 1 exhibit
considerable biological diversity. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 101, 585–590 (2006).
17. Barnabé, C., Brisse, S. & Tibayrenc, M. Population structure and genetic typing of Trypanosoma cruzi,
the agent of Chagas disease: a multilocus enzyme electrophoresis approach. Parasitology 120, 513–526
(2000).
18. Lewis, M. D. et al. Genotyping of Trypanosoma cruzi: systematic selection of assays allowing rapid and
accurate discrimination of all known lineages. Am. J. Trop. Med. Hyg. 81, 1041–1049 (2009).
19. Ramírez, J. D. et al. Molecular Epidemiology of Human Oral Chagas Disease Outbreaks in Colombia.
PLoS Negl Trop Dis 7, e2041 (2013).
20. Andrade, S. G. et al. Biological, biochemical and molecular features of Trypanosoma cruzi strains
isolated from patients infected through oral transmission during a 2005 outbreak in the state of Santa
Catarina, Brazil: its correspondence with the new T. cruzi Taxonomy Consensus (2009). Mem. Inst.
Oswaldo Cruz 106, 948–956 (2011).
21. Cevallos, A. M. & Hernandez, R. Chagas’ Disease: Pregnancy and Congenital Transmission. BioMed
Res. Int. 2014, (2014).
22. Brutus, L. et al. Detectable Trypanosoma cruzi parasitemia during pregnancy and delivery as a risk factor
for congenital Chagas disease. Am. J. Trop. Med. Hyg. 83, 1044–1047 (2010).
23. Torrico, F. et al. Maternal Trypanosoma cruzi infection, pregnancy outcome, morbidity, and mortality of
congenitally infected and non-infected newborns in Bolivia. Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 201–209 (2004).
Referencias bibliograficas
53
24. Carlier, Y. et al. Congenital Chagas disease: recommendations for diagnosis, treatment and control of
newborns, siblings and pregnant women. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1250 (2011).
25. Schmidt, M., Geilenkeuser, W.-J., Sireis, W., Seifried, E. & Hourfar, K. Emerging Pathogens - How Safe
is Blood? Transfus. Med. Hemotherapy Off. Organ Dtsch. Ges. Fur Transfusionsmedizin
Immunham atologie 41, 10–17 (2014).
26. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K. & Periago, M. R. The Neglected Tropical
Diseases of Latin America and the Caribbean: A Review of Disease Burden and Distribution and a
Roadmap for Control and Elimination. PLoS Negl. Trop. Dis. 2, (2008).
27. Schmunis, G. A. & Cruz, J. R. Safety of the Blood Supply in Latin America. Clin. Microbiol. Rev. 18,
12–29 (2005).
28. Dias, J. C. P., Silveira, A. C. & Schofield, C. J. The impact of Chagas disease control in Latin America: a
review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 97, 603–612 (2002).
29. Congenital infection with Trypanosoma cruzi: from mechanisms of transmission to strategies for
diagnosis and control. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 36, 767–771 (2003).
30. Wincker, P. et al. High correlation between Chagas’ disease serology and PCR-based detection of
Trypanosoma cruzi kinetoplast DNA in Bolivian children living in an endemic area. FEMS Microbiol.
Lett. 124, 419–423 (1994).
31. Hajduk, S. & Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA Biol. 7, 229–236 (2010).
32. Diez, M. et al. Usefulness of PCR strategies for early diagnosis of Chagas’ disease reactivation and
treatment follow-up in heart transplantation. Am. J. Transplant. Off. J. Am. Soc. Transplant. Am. Soc.
Transpl. Surg. 7, 1633–1640 (2007).
33. Gomes, Y. M., Lorena, V. M. B. & Luquetti, A. O. Diagnosis of Chagas disease: what has been
achieved? What remains to be done with regard to diagnosis and follow up studies? Mem. Inst. Oswaldo
Cruz 104 Suppl 1, 115–121 (2009).
34. Affranchino, J. et al. Identification of a Trypanosoma cruzi antigen that is shed during the acute phase of
Chagas’ disease. Mol. Biochem. Parasitol. 34, 221–228 (1989).
35. Russomando, G., Sánchez, Z., Meza, G. & de Guillen, Y. Shed acute-phase antigen protein in an ELISA
system for unequivocal diagnosis of congenital Chagas disease. Expert Rev. Mol. Diagn. 10, 705–707
(2010).
36. Reyes, M. B., Lorca, M., Munoz, P. & Frasch, A. C. Fetal IgG specificities against Trypanosoma cruzi
antigens in infected newborns. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 2846–2850 (1990).
37. Mallimaci, M. C. et al. Early Diagnosis of Congenital Trypanosoma cruzi Infection, Using Shed Acute
Phase Antigen, in Ushuaia, Tierra del Fuego, Argentina. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 55–59 (2010).
38. Leguizamón, M. S. et al. Antibodies inhibiting Trypanosoma cruzi trans-sialidase activity in sera from
human infections. J. Infect. Dis. 170, 1570–1574 (1994).
39. Almeida, I. C., Ferguson, M. A., Schenkman, S. & Travassos, L. R. Lytic anti-alpha-galactosyl
antibodies from patients with chronic Chagas’ disease recognize novel O-linked oligosaccharides on
mucin-like glycosyl-phosphatidylinositol-anchored glycoproteins of Trypanosoma cruzi. Biochem. J. 304
( Pt 3), 793–802 (1994).
40. Rassi, A., Rassi, A. & Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet 375, 1388–1402 (2010).
41. Almeida, I. C., Covas, D. T., Soussumi, L. M. & Travassos, L. R. A highly sensitive and specific
chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of active Trypanosoma cruzi
infection. Transfusion (Paris) 37, 850–857 (1997).
42. Buchovsky, A. S. et al. trans-sialidase inhibition assay, a highly sensitive and specific diagnostic test for
Chagas’ disease. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 187–189 (2001).
43. De Marchi, C. R. et al. Evaluation of a Recombinant Trypanosoma cruzi Mucin-Like Antigen for
Serodiagnosis of Chagas’ Disease. Clin. Vaccine Immunol. CVI 18, 1850–1855 (2011).
44. Ashmus, R. A. et al. Potential use of synthetic α-galactosyl-containing glycotopes of the parasite
Trypanosoma cruzi as diagnostic antigens for Chagas disease. Org. Biomol. Chem. 11, 5579–5583
(2013).
45. Salles, N. A. et al. Risk of exposure to Chagas’ disease among seroreactive Brazilian blood donors.
Transfusion (Paris) 36, 969–973 (1996).
Referencias bibliograficas
54
46. Reithinger, R., Tarleton, R. L., Urbina, J. A., Kitron, U. & Gurtler, R. E. Eliminating Chagas disease:
challenges and a roadmap. BMJ 338, b1283 (2009).
47. Voller, A., Draper, C., Bidwell, D. E. & Bartlett, A. Microplate enzyme-linked immunosorbent assay for
chagas’ disease. Lancet 1, 426–428 (1975).
48. Caballero, Z. C., Sousa, O. E., Marques, W. P., Saez-Alquezar, A. & Umezawa, E. S. Evaluation of
serological tests to identify Trypanosoma cruzi infection in humans and determine cross-reactivity with
Trypanosoma rangeli and Leishmania spp. Clin. Vaccine Immunol. CVI 14, 1045–1049 (2007).
49. Davies, J. M. Molecular mimicry: can epitope mimicry induce autoimmune disease? Immunol. Cell Biol.
75, 113–126 (1997).
50. Schechter, M. et al. Purified Trypanosoma cruzi specific glycoprotein for discriminative serological
diagnosis of South American trypanosomiasis (Chagas’ disease). Lancet 2, 939–941 (1983).
51. Marcipar, I. S., Welchen, E., Roodveldt, C., Marcipar, A. J. & Silber, A. M. Purification of the 67-kDa
lectin-like glycoprotein of Trypanosoma cruzi, LLGP-67, and its evaluation as a relevant antigen for the
diagnosis of human infection. FEMS Microbiol. Lett. 220, 149–154 (2003).
52. Vergara, U., Veloso, C., Gonzalez, A. & Lorca, M. Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent
assay for the diagnosis of Chagas’ disease using synthetic peptides. Am. J. Trop. Med. Hyg. 46, 39–43
(1992).
53. Peralta, J. M. et al. Serodiagnosis of Chagas’ disease by enzyme-linked immunosorbent assay using two
synthetic peptides as antigens. J. Clin. Microbiol. 32, 971–974 (1994).
54. Umezawa, E. S. et al. An improved serodiagnostic test for Chagas’ disease employing a mixture of
Trypanosoma cruzi recombinant antigens. Transfusion (Paris) 43, 91–97 (2003).
55. Meira, W. S. F. et al. Use of the Trypanosoma cruzi recombinant complement regulatory protein to
evaluate therapeutic efficacy following treatment of chronic chagasic patients. J. Clin. Microbiol. 42,
707–712 (2004).
56. Meira, W. S. F. et al. Trypanosoma cruzi recombinant complement regulatory protein: a novel antigen
for use in an enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of Chagas’ disease. J. Clin. Microbiol.
40, 3735–3740 (2002).
57. Ferreira, A. W., Belem, Z. R., Lemos, E. A., Reed, S. G. & Campos-Neto, A. Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay for Serological Diagnosis of Chagas’ Disease Employing a Trypanosoma cruzi
Recombinant Antigen That Consists of Four Different Peptides. J. Clin. Microbiol. 39, 4390–4395
(2001).
58. Da Silveira, J. F., Umezawa, E. S. & Luquetti, A. O. Chagas disease: recombinant Trypanosoma cruzi
antigens for serological diagnosis. Trends Parasitol. 17, 286–291 (2001).
59. Umezawa, E. S., Nascimento, M. S. & Stolf, A. M. Enzyme-linked immunosorbent assay with
Trypanosoma cruzi excreted-secreted antigens (TESA-ELISA) for serodiagnosis of acute and chronic
Chagas’ disease. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 39, 169–176 (2001).
60. Berrizbeitia, M. et al. Purified excreted-secreted antigens from Trypanosoma cruzi trypomastigotes as
tools for diagnosis of Chagas’ disease. J. Clin. Microbiol. 44, 291–296 (2006).
61. Romano, P. S. et al. Molecular and cellular mechanisms involved in the Trypanosoma cruzi/host cell
interplay. IUBMB Life 64, 387–396 (2012).
62. Fernandes, M. C. & Andrews, N. W. Host cell invasion by Trypanosoma cruzi: a unique strategy that
promotes persistence. FEMS Microbiol. Rev. 36, 734–747 (2012).
63. Augustine, S. A. J. et al. Molecular Cloning of a Trypanosoma cruzi Cell Surface Casein Kinase II
Substrate, Tc-1, Involved in Cellular Infection. Infect. Immun. 74, 3922–3929 (2006).
64. Baida, R. C. P. et al. Molecular characterization of serine-, alanine-, and proline-rich proteins of
Trypanosoma cruzi and their possible role in host cell infection. Infect. Immun. 74, 1537–1546 (2006).
65. Yoshida, N. Molecular basis of mammalian cell invasion by Trypanosoma cruzi. An. Acad. Bras. Ciênc.
78, 87–111 (2006).
66. Epting, C. L., Coatesa, B. M. & Engmanb, D. M. Molecular Mechanisms of Host Cell Invasion by
Trypanosoma cruzi. Exp. Parasitol. 126, 283–291 (2010).
67. Villalta, F. et al. Perspectives on the Trypanosoma cruzi-host cell receptor interactions. Parasitol. Res.
104, 1251–1260 (2009).
Referencias bibliograficas
55
68. De Pablos, L. M. et al. Differential expression and characterization of a member of the mucin-associated
surface protein family secreted by Trypanosoma cruzi. Infect. Immun. 79, 3993–4001 (2011).
69. De Pablos, L. M. & Osuna, A. Conserved Regions as Markers of Different Patterns of Expression and
Distribution of the Mucin-Associated Surface Proteins of Trypanosoma cruzi. Infect. Immun. 80, 169–
174 (2012).
70. Araya, J. E. et al. Calcineurin B of the human protozoan parasite Trypanosoma cruzi is involved in cell
invasion. Microbes Infect. Inst. Pasteur 10, 892–900 (2008).
71. Magdesian, M. H. et al. A conserved domain of the gp85/trans-sialidase family activates host cell
extracellular signal-regulated kinase and facilitates Trypanosoma cruzi infection. Exp. Cell Res. 313,
210–218 (2007).
72. Chuenkova, M. V. & PereiraPerrin, M. Chagas’ disease parasite promotes neuron survival and
differentiation through TrkA nerve growth factor receptor. J. Neurochem. 91, 385–394 (2004).
73. Nde, P. N. et al. Silencing of the laminin gamma-1 gene blocks Trypanosoma cruzi infection. Infect.
Immun. 74, 1643–1648 (2006).
74. Nde, P. N. et al. Gene network analysis during early infection of human coronary artery smooth muscle
cells by Trypanosoma cruzi and Its gp83 ligand. Chem. Biodivers. 7, 1051–1064 (2010).
75. Pereira-Chioccola, V. L. et al. Mucin-like molecules form a negatively charged coat that protects
Trypanosoma cruzi trypomastigotes from killing by human anti-alpha-galactosyl antibodies. J. Cell Sci.
113 ( Pt 7), 1299–1307 (2000).
76. Schenkman, S., Jiang, M. S., Hart, G. W. & Nussenzweig, V. A novel cell surface trans-sialidase of
Trypanosoma cruzi generates a stage-specific epitope required for invasion of mammalian cells. Cell 65,
1117–1125 (1991).
77. Staquicini, D. I. et al. Role of GP82 in the Selective Binding to Gastric Mucin during Oral Infection with
Trypanosoma cruzi. PLoS Negl. Trop. Dis. 4, (2010).
78. Buscaglia, C. A., Campo, V. A., Frasch, A. C. C. & Di Noia, J. M. Trypanosoma cruzi surface mucins:
host-dependent coat diversity. Nat. Rev. Microbiol. 4, 229–236 (2006).
79. Turner, C. W., Lima, M. F. & Villalta, F. Trypanosoma cruzi uses a 45-kDa mucin for adhesion to
mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 290, 29–34 (2002).
80. Kleshchenko, Y. Y. et al. Human galectin-3 promotes Trypanosoma cruzi adhesion to human coronary
artery smooth muscle cells. Infect. Immun. 72, 6717–6721 (2004).
81. Di Noia, J. M., Buscaglia, C. A., De Marchi, C. R., Almeida, I. C. & Frasch, A. C. C. A Trypanosoma
cruzi small surface molecule provides the first immunological evidence that Chagas’ disease is due to a
single parasite lineage. J. Exp. Med. 195, 401–413 (2002).
82. El-Sayed, N. M. et al. The genome sequence of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease.
Science 309, 409–415 (2005).
83. Di Noia, J. M., D’Orso, I., Aslund, L., Sánchez, D. O. & Frasch, A. C. The Trypanosoma cruzi mucin
family is transcribed from hundreds of genes having hypervariable regions. J. Biol. Chem. 273, 10843–
10850 (1998).
84. Emanuelsson, O., Nielsen, H., Brunak, S. & von Heijne, G. Predicting subcellular localization of proteins
based on their N-terminal amino acid sequence. J. Mol. Biol. 300, 1005–1016 (2000).
85. De Gaudenzi, J. G., Noé, G., Campo, V. A., Frasch, A. C. & Cassola, A. Gene expression regulation in
trypanosomatids. Essays Biochem. 51, 31–46 (2011).
86. Cánepa, G. E., Degese, M. S., Budu, A., Garcia, C. R. S. & Buscaglia, C. A. Involvement of TSSA
(trypomastigote small surface antigen) in Trypanosoma cruzi invasion of mammalian cells. Biochem. J.
444, 211–218 (2012).
87. Buscaglia, C. A. et al. The surface coat of the mammal-dwelling infective trypomastigote stage of
Trypanosoma cruzi is formed by highly diverse immunogenic mucins. J. Biol. Chem. 279, 15860–15869
(2004).
88. Cimino, R. O. et al. Immuno-enzymatic evaluation of the recombinant TSSA-II protein of Trypanosoma
cruzi in dogs and human sera: a tool for epidemiological studies. Parasitology 138, 995–1002 (2011).
89. Risso, M. G. et al. Immunological identification of Trypanosoma cruzi lineages in human infection along
the endemic area. Am. J. Trop. Med. Hyg. 84, 78–84 (2011).
Referencias bibliograficas
56
90. Bhattacharyya, T. et al. Development of peptide-based lineage-specific serology for chronic Chagas
disease: geographical and clinical distribution of epitope recognition. PLoS Negl. Trop. Dis. 8, e2892
(2014).
91. Cura, C. I. et al. Trypanosoma cruzi discrete typing units in Chagas disease patients from endemic and
non-endemic regions of Argentina. Parasitology 139, 516–521 (2012).
92. Abbas, A. K., Lichtman, A. H. H. & Pillai, S. Cellular and Molecular Immunology. (Elsevier Health
Sciences, 2014).
93. Canepa, G. E., Mesias, A. C., Yu, H., Chen, X. & Buscaglia, C. A. Structural Features Affecting
Trafficking, Processing, and Secretion of Trypanosoma cruzi Mucins. J. Biol. Chem. 287, 26365–26376
(2012).
94. Buus, S. et al. High-resolution Mapping of Linear Antibody Epitopes Using Ultrahigh-density Peptide
Microarrays. Mol. Cell. Proteomics 11, 1790–1800 (2012).
95. Morell, E. B. & Bernal, E. Bioestadística Básica para Investigadores con SPSS. (Bubok, 2013).
96. DeLong, E. R., DeLong, D. M. & Clarke-Pearson, D. L. Comparing the areas under two or more
correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach. Biometrics 44, 837–845
(1988).
97. Pitcovsky, T. A., Buscaglia, C. A., Mucci, J. & Campetella, O. A functional network of intramolecular
cross-reacting epitopes delays the elicitation of neutralizing antibodies to Trypanosoma cruzi trans-
sialidase. J. Infect. Dis. 186, 397–404 (2002).
98. Yeh, W. W. et al. Envelope variable region 4 is the first target of neutralizing antibodies in early simian
immunodeficiency virus mac251 infection of rhesus monkeys. J. Virol. 86, 7052–7059 (2012).
99. Di Zenzo, G. et al. Demonstration of epitope-spreading phenomena in bullous pemphigoid: results of a
prospective multicenter study. J. Invest. Dermatol. 131, 2271–2280 (2011).
100. Corso C. Aplicación de algoritmos de clasificación supervisada usando Weka. (2008).
101. Kohavi, R. & Quinlan, J. R. in (eds. Klösgen, W. & Zytkow, J. M.) 267–276 (Oxford University Press,
Inc., 2002). at <http://dl.acm.org/citation.cfm?id=778212.778254>
102. Machado, F. S. et al. Current Understanding of Immunity to Trypanosoma cruzi Infection and
Pathogenesis of Chagas Disease. Semin. Immunopathol. 34, 753–770 (2012).
103. Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Gonzalez Cappa, S. M. & Frasch, A. C. Mice infected with
Trypanosoma cruzi produce antibodies against the enzymatic domain of trans-sialidase that inhibit its
activity. Infect. Immun. 62, 3441–3446 (1994).
104. Bernabó, G. et al. TcTASV-C, a protein family in Trypanosoma cruzi that is predominantly
trypomastigote-stage specific and secreted to the medium. PloS One 8, e71192 (2013).
105. Carmona, S. J. et al. Use of high-density peptide microarrays to study natural immune responses directly
from human clinical samples. (Manuscrito enviado).
106. Manoel-Caetano, F. da S. & Silva, A. E. Implications of genetic variability of Trypanosoma cruzi for the
pathogenesis of Chagas disease. Cad. Saúde Pública 23, 2263–2274 (2007).
107. Macedo, A. M. & Pena, S. D. Genetic Variability of Trypanosoma cruzi:Implications for the
Pathogenesis of Chagas Disease. Parasitol. Today Pers. Ed 14, 119–124 (1998).
108. Ayo, C. M. et al. Genetic Susceptibility to Chagas Disease: An Overview about the Infection and about
the Association between Disease and the Immune Response Genes. BioMed Res. Int. 2013, e284729
(2013).
109. Houghton, R. L. et al. Multiepitope synthetic peptide and recombinant protein for the detection of
antibodies to Trypanosoma cruzi in patients with treated or untreated Chagas’ disease. J. Infect. Dis. 181,
325–330 (2000).
110. Houghton, R. L. et al. A multi-epitope synthetic peptide and recombinant protein for the detection of
antibodies to Trypanosoma cruzi in radioimmunoprecipitation- confirmed and consensus-positive sera. J.
Infect. Dis. 179, 1226–1234 (1999).
111. Afonso, A. M., Ebell, M. H. & Tarleton, R. L. A Systematic Review of High Quality Diagnostic Tests
for Chagas Disease. PLoS Negl Trop Dis 6, e1881 (2012).
112. Lorca, M. & Thiermann, E. Valor diagnostico de la inmunofluorescencia indirecta con anti-IgM para
Enfermedad de Chagas, en adultos y recién nacidos. Rev. Chil. Pediatría 53, 199–204 (1982).
Referencias bibliograficas
57
113. Altcheh J, M. R. et al. Consenso de Infecciones perinatales. Infecciones perinatales parasitarias. at
<http://www.sap.org.ar/infecciones_perinatales_parasitarias.php>
114. Brabin, L. The epidemiological significance of Chagas’ disease in women. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 87,
73–79 (1992).
115. Robert-Gangneux, F. & Darde, M.-L. Epidemiology of and Diagnostic Strategies for Toxoplasmosis.
Clin. Microbiol. Rev. 25, 264–296 (2012).
116. Mendes, T. A. de O. et al. Identification of strain-specific B-cell epitopes in Trypanosoma cruzi using
genome-scale epitope prediction and high-throughput immunoscreening with peptide arrays. PLoS Negl.
Trop. Dis. 7, e2524 (2013).
117. Zingales, B. et al. The revised Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature: rationale, epidemiological
relevance and research applications. Infect. Genet. Evol. J. Mol. Epidemiol. Evol. Genet. Infect. Dis. 12,
240–253 (2012).
118. Melli Luciano J. Desarrollo de inmunobiosensores ópticos y electroquímicos para el diagnóstico de la
enfermedad de Chagas. (2011).
119. Inoue, H., Nojima, H. & Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.
Gene 96, 23–28 (1990).
120. Sambrook, J. & Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (CSHL Press, 2001).
121. Srinivasan, P. et al. Immunization with a functional protein complex required for erythrocyte invasion
protects against lethal malaria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10311–10316 (2014).
Notas
58
Notas
Notas
59