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UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL

CARACTERIZAÇÃO DOS EFEITOS PROVOCADOS PELA ACUMULAÇÃO DE S-ADENOSIL-HOMOCISTEÍNA NA

EXPRESSÃO DOS GENES ENVOLVIDOS NA BIODISPONIBILIDADE DE ÓXIDO NÍTRICO

Maria Madalena Henriques Serras Vicente Barroso

MESTRADO EM BIOLOGIA MOLECULAR HUMANA

2009

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL

CARACTERIZAÇÃO DOS EFEITOS PROVOCADOS PELA ACUMULAÇÃO DE S-ADENOSIL-HOMOCISTEÍNA NA

EXPRESSÃO DOS GENES ENVOLVIDOS NA BIODISPONIBILIDADE DE ÓXIDO NÍTRICO

Maria Madalena Henriques Serras Vicente Barroso

Dissertação de mestrado orientada

pela Professora Doutora Anita Gomes Unidade de Imunologia Molecular Instituto de Medicina Molecular

e pela Professora Doutora Margarida Meireles Departamento de Química e Bioquímica

Faculdade de Ciências – Universidade de Lisboa

MESTRADO EM BIOLOGIA MOLECULAR HUMANA

2009

| ii

Caracterização dos Efeitos Provocados pela Acumulação de S-Adenosil-homocisteína na expressão de genes envolvidos na biodisponibilidade de NO

O trabalho apresentado foi realizado no Centro de Patogénese Molecular –

Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, no grupo de Metabolismo e Genética

integrado no iMed – Instituto de Ciências Médicas e Farmacêuticas.

| iii


A doença vascular, nos países ditos industrializados, constitui a principal causa de

mortalidade e morbilidade. Recentemente foi sugerido o possível envolvimento de

alterações epigenéticas na toxicidade vascular observada em situações de

hiper-homocisteinémia (HHcy), promovidas pela acumulação intracelular do precursor da

homocisteína: a S-adenosil-homocisteína (SAH).

RESUMO

No presente estudo procurou esclarecer-se o efeito da acumulação intracelular de

SAH na expressão dos genes envolvidos na biodisponibilidade da principal molécula

anti-trombótica endógena - o óxido nítrico (NO). Foi estudada a expressão da enzima

responsável pela síntese de NO, a sintase de óxido nítrico endotelial (eNOS) e das enzimas

envolvidas no metabolismo do seu inibidor endógeno - a dimetilarginina assimétrica. Foi

ainda analisada a proteína responsável pela inibição da eNOS, essencialmente ao nível

cavéolar - Caveolin-1 (Cav-1).

Como modelo de estudo foram utilizadas culturas de células endoteliais humanas

isoladas da veia de cordão umbilical, nas quais a acumulação intracelular de SAH foi

conseguida através da manipulação do metabolismo da homocisteína.

Os resultados obtidos mostram que o estado de hipometilação induzido pela

acumulação de SAH foi responsável pelo aumento da transcrição de todos os genes

estudados. No entanto, ao nível da tradução, foram observadas alterações significativas

apenas para a expressão das proteínas: eNOS e Cav-1, nomeadamente, uma diminuição e

aumento, respectivamente. O contraste entre a diminuição da expressão de eNOS e o

aumento de Cav-1 sugere que a diminuição da produção de NO observada poderá resultar

de um aumento de Cav-1, a qual, para além de exercer um efeito inibitório sobre a eNOS ao

nível membranar e citosólico, poderá ainda contribuir para uma degradação ou translocação

subcelular da enzima.

Assim, o mecanismo proposto poderá contribuir para a elucidação do binómio

HHcy-doença vascular, e futuramente, possibilitar o desenvolvimento estratégias

terapêutico-preventivas que permitam a redução da incidência da principal causa de morte,

a doença cardiovascular.

- Homocisteína - S-adenosil-homocisteína - metilação

PALAVRAS-CHAVE

- biodisponibilidade de NO - disfunção endotelial -

| iv


Cardiovascular diseases are the leading cause of mortality and morbility in the

developed countries. Recently, the involvement of epigenetic modifications in the vascular

toxicity has been suggested in hiperhomocysteinemia situations, as a result of the

accumulation of homocysteine´s precursor, S-adenosylhomocysteine (SAH).

ABSTRACT

The central aim of this study was to elucidate whether SAH accumulation, through an

epigenetic mechanism mediated by cellular hypomethylation, alters the expression patterns

of genes related to the availability of the most important endogenous anti-trombotic molecule

– nitric oxide (NO). With this purpose we studied the expression of gene products involved

either in NO synthesis (endothelial nitric oxide synthase, eNOS) or in the metabolism of its

endogenous inhibitor - asymmetric dimethylarginine (ADMA). In addition, we studied

Caveolin-1 (Cav-1) expression, which is responsible for eNOS inhibition essentially at

caveola´s level.

Cultured human umbilical vein endothelial cells were used to assess the impact of

SAH accumulation on NO production. Intracellular SAH accumulation was promoted by

homocysteine´s metabolism manipulation.

The results demonstrate that SAH accumulation was responsible for increased

transcription rates for all of the target genes. However, at translation level, only two proteins

showed significant alterations, namely eNOS and Cav-1, whose expression was decreased

and increased, respectively, relative to control samples. The disparity between eNOS and

Cav-1 expression pattern seems to be determinant for a reduction of NO biosynthesis. We

propose that Cav-1 could not only inhibit eNOS at the membranar and cytosolic level, but

also induce sub-cellular translocation or degradation.

In the future, the proposed mechanism may contribute for the elucidation of the

connection between HHcy and vascular disease, further allowing the development of new

therapies and the implementation of prevention strategies to reduce the major cause of

death, the cardiovascular diseases.

- Homocysteine - S-adenosylhomocysteine - methylation

KEYWORDS

- NO bioavailability – endothelial dysfunction -

| v


AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos aqueles que tornaram possível a realização deste trabalho…

À Professora Rita Castro que esteve comigo no “campo de batalha” e viveu todas as

aventuras e desventuras desta caminhada, obrigada pelo disponibilidade e preocupação

constante e por tudo o que me ensinou, me deu a descobrir e a viver;

À Professora Anita o apoio e orientação “em tempo real” e de última hora;

À Professora Margarida Meireles por ter aceite ser minha orientadora interna;

À Professora Isabel Tavares de Almeida por me ter acolhido no seu grupo, pela

preocupação com o meu trabalho, e pelo esforço e dedicação com que orienta todo o grupo;

A todas as Professoras do Met&Gen sempre disponíveis para ajudar e ensinar, em

particular à professora Isabel Rivera e à Professora Paula Leandro por todas as sugestões

no delineamento do trabalho experimental e ensinamentos científicos;

A todos os colegas e amigos do grupo Met&Gen, sem os quais não teria sido

possível trabalhar, por tornarem o meu dia-a-dia bem disposto e por toda a ajuda e

ensinamentos preciosos. Em particular às Anas e à Mónica que comigo partilharam o

“laboratório do DNA”, à Cátia e ao Ruben pela boa disposição, ao Israel pelas proteínas, ao

Esse sempre disposto a ajudar e a pôr a saúde em primeiro lugar;

À Mónica, à Marisa e a todos os que na VU contribuíram para que as quantificações

de SAM/SAH chegassem a Portugal;

A todas os elementos do CPM que sempre se mostraram disponíveis a ajudar e

partilhar experiências. Agradeço, a partilha de conhecimentos laboratoriais, ao grupo das

células da glia, e em particular à Eduarda com quem o dia começa sempre melhor;

A todos os meus amigos que, fora do ambiente académico, salpicaram de alegria e

boa disposição este tempo, nem sempre fácil;

À minha Jô, por tudo, por estar sempre comigo;

A toda a minha família... Aos meus tios sempre dispostos a acolher-me e a

apoiar-me, ao tio Zé e à tia Fátima agradeço os ensinamentos clínicos e a disponibilidade

para revisões a toda e a qualquer hora. Ao João e ao Dida, verdadeiras pílulas de boa

disposição. À Joanaz e ao Jorgez pela amizade e por todo o precioso apoio. À Tota por toda

a ajuda e incentivo fazendo com que, mesmo “em bolinhas”, tudo faça sentido.

Ao meu irmão, pela amizade e por tudo o que teve de aturar,

Aos meus pais, sem os quais nada seria possível, pelo apoio e amizade, conselhos

e, acima de tudo, pelo exemplo de vida.

Obrigada!

| vi


ABREVIATURAS

5,10-MeTHF 5,10-metileno-tetrahidrofolato 5-MTHF 5-metil-tetra-hidrofolato Abs Absorvência ADA Adenosina-2,3-dialdeído ADMA Dimetilarginina assimétrica ATP5B Subunidade β da ATP sintase mitocondrial BCA Ácido bicinconínico BH Tetra-hidrobiopterina 4

BHMT Betaína-homocisteína metiltransferase BSA Albumina de soro bovino Cav-1 Caveolin- 1 CBS Cistationina beta sintase cDil-Ac-LDL Fluorescein isothiocyanate (Dil)-labeled acetylated LDL cDNA DNA complementar cGMP Guanosina-monofosfato cíclico Ctrl Controlo

Cys Cisteína DDAH Dimetilarginina dimetilamina-hidrolase

DNA Ácido desoxirribonucleico dNTP Trifosfato de desoxinucleótido DTT Ditiotreitol EDRF Endothelium-derived relaxant factor EIF4A2 Eukaryotic Translation Initiation Factor 4A, Isoform 2 eNOS (NOS-3) Sintase de NO endotelial FAD Flavina-adenina-dinucleótido FMN Flavina Mononucleótido GC Guanilato ciclase GTP Guanosina trifosfato Hcy Homocisteína HHcy Hiper-homocisteinémia HRP Horse radish peroxidase Hsp90 Heat shock protein 90 HUVEC Células endoteliais de cordão umbilical Humano KCl Cloreto de potássio kb Kilo-bases Km Constante de Michaelis-Menten iNOS (NOS-2) Sintase de NO indutível L-Arg L-arginina LDH Lactato Desidrogenase LDL Lipoproteína de baixa densidade MAT Metionina adenosil transferase Met Metionina MgCl Cloreto de magnésio 2 MMA Monometilarginina

| vii


mRNA RNA mensageiro MS Metionina sintase MTHFR 5,10-metileno-tretra-hidrofolato redutase NAD Nicotinamida Adenina Dinucleótido + NADH Nicotinamida Adenina Dinucleótido Reduzida NADPH Fosfato de Nicotinamida Adenina Dinucleótido Reduzido nNOS (NOS-1) Sintase de NO neuronal NO Óxido nítrico NO2 Ião nitrito - NOSs Sintases de NO ONOO Ião peroxinitrito - pb Pares de bases PCR Polymerase chain reaction PMSF Fluoreto de fenil-metil-sulfonilo PRMTs Proteína-arginina metiltransferases PVDF Difluoreto de polivinidileno RNA Ácido ribonucleico RNP Ribonucleoproteínas ROS Espécies reactivas de oxigénio RP-HPLC Cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa RT Transcrição Reversa SAH S- adenosil-homocisteína SAHH SAH hidrolase SAM S- adenosilmetionina SDMA Dimetilarginina simétrica SDS Dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis -SH Grupo sulfidrilo SHMT Serina hidroxi-metiltransferase TBS-T Solução tampão Tris com 0,1% de Tween-20 tHcy Homocisteína total THF Tetra-hidrofolato Tris Tris(hidroximetil)amina UBC Ubiquitin C UTR Região não traduzida

| viii


Introdução Teórica 1

ÍNDICE

1. Homocisteína e Doença vascular 1 1.1 Hiper-homocisteinémia 1 1.2 Metabolismo da Homocisteína 2

I. Via da Transulfuração II. Via da Remetilação

1.3 Homocisteína e a sua Regulação 3 1.4 Determinantes de Hiper-homocisteinémia 4 1.5 Hiper-homocisteinémia e Doença Vascular 4 1.6 Homocisteína e Metilação 5

I. Metilação de DNA II. Metilação de Proteínas

2. Óxido Nítrico e Disfunção endotelial 6 2.1 Endotélio e Fisiologia das Células Endoteliais 6

2.2 Disfunção Endotelial 6 3. Biodisponibilidade de Óxido Nítrico (NO) 7

3.1 Molécula e Relevância Fisiológica 7 3.2 Sintases de NO - eNOS 7

I. Gene – NOS3 II. Proteína – eNOS

3.3 Regulação de eNOS 8 I. Expressão e Localização Subcelular II. Modificações Pós-Traducionais III. Mecanismo de Activação Induzido por Agonistas IV. Relação com a Concentração de Substrato

3.4 Inibidores Endógenos de eNOS 10 I. Síntese de ADMA – PRMT1 II. Degradação de ADMA – DDAH2

4. Objectivos 11 5. Materiais e Métodos 12

5.1 Cultura de Células 12

5.2 Análise da Libertação de Óxido Nítrico 12

5.3 Determinação da Concentração de Proteína 13 5.4 Determinação dos Níveis de Hcy total, ADMA e SDMA 13 5.5 Determinação de SAM e SAH 13

5.6 Extracção de RNA e RT-PCR quantitativo 13 5.7 Extracção de Proteína e Western Blot 14

5.8 Extracção de DNA e Determinação da Metilação Específica 15

5.9 Análise Estatística 15

| ix


6. Resultados 16 6.1 Avaliação da Citotoxicidade de ADA 16

6.2 Análise da Libertação de Óxido Nítrico 16

6.3 Avaliação do Export de Hcy, ADMA e SDMA 17

6.4 Razão SAM/SAH 17

6.5 Avaliação dos Níveis de Transcrição 18

I. eNOS II. PRMT1 III. DDAH2 IV. Cav-1

6.6 Avaliação da Expressão Proteica 19

6.7 Análise de metilação Especifica 20 7. Discussão 21

7.1 Diminuição dos Níveis de NO 21

7.2 Razão SAM/SAH e Estado de Hipometilação 22

7.3 Avaliação do Export de Hcy 22

7.4 Avaliação do Export de ADMA e SDMA 22

7.5 Acumulação de SAH e Regulação da Transcrição 23


7.6 Análise de Expressão Proteica 25


7.7 Interacção eNOS – Cav-1 26

7.8 Efeito da Acumulação de SAH na biodisponibilidade de NO 27 8. Conclusões e Perspectivas Futuras 28 9. Bibliografia 29

Anexos Figuras e Tabelas A1

Soluções e Especificações dos Métodos A5

| 1

Introdução Caracterização dos Efeitos Provocados pela Acumulação de S-Adenosil-homocisteína na expressão de genes

envolvidos na biodisponibilidade de NO

A ruptura da placa aterosclerótica, com consequente emergência para o lúmen do

vaso do material aterogénico, desencadeia uma situação de aterotrombose. As plaquetas ao

serem activadas agregam, contribuindo, no local, para a formação de um rolhão hemostático

que vai determinar a formação do trombo. Estão criadas as condições hemodinâmicas para

a interrupção da corrente sanguínea. É assim o despoletar daquela que é maior das causas

de morte no mundo – A Doença Cardiovascular –.

INTRODUÇÃO

De acordo com a Organização Mundial de Saúde, as doenças cardiovasculares são

responsáveis por cerca de 30% das mortes a nível mundial, assumindo maior relevância nos

países desenvolvidos1. A sua causa é multifactorial e diversos são os factores de risco

conhecidos, entre os quais a hiper-homocisteinémia.

1. HOMOCISTEÍNA E DOENÇA VASCULAR

A Hiper-homocisteinémia (HHcy) caracteriza-se pelo aumento dos níveis plasmáticos

de homocisteína total (tHcy). Em jejum, os níveis plasmáticos de tHcy considerados normais

estão compreendidos entre 5 e 15 µM; valores superiores conduzem ao estado de

hiperhomocisteinémia. A HHcy classifica-se em moderada, intermédia ou severa consoante

os valores acumulados de tHcy se encontram entre 16 - 30, 31-100 ou >100 µM,

respectivamente

1.1 HIPER-HOMOCISTEINÉMIA

2, 3

A homocisteína (Hcy) é um pequeno aminoácido sulfurado que deriva da

desmetilação da metionina (Met) ingerida na dieta alimentar

.

4. Esta desmetilação é essencial

e ubíqua pois liberta grupos metilo necessários para actividades celulares tão fundamentais

como a síntese de DNA, de hormonas esteróides e de algumas proteínas4. Em 1960, a Hcy

assume relevância clínica com a descrição de uma perturbação metabólica rara no

metabolismo da Met – a homocistinúria (níveis elevados de Hcy no plasma e na urina)3, 4.

Contudo, foi em 1969 que McCully estabeleceu, pela primeira vez, a relação entre Hcy e

doença vascular ao observar, post-mortem, artérias com graves lesões ateroscleróticas num

doente com HHcy severa5, 6. Com efeito, nos últimos 20 anos, evidências epidemiológicas

permitiram classificar a HHcy como um factor de risco para a doença vascular independente

de factores há muito conhecidos, como a hiperlipidémia, hipertensão arterial, diabetes

mellitus e tabaco5

Níveis elevados de Hcy estão igualmente associados a outras patologias como

alterações na formação do tubo neural, epilepsia, doença de Alzheimer, osteoporose ou

problemas renais

.

5, 7-10.

| 2



1.2

A produção de Hcy inicia-se através de uma reacção de transmetilação, na qual o

aminoácido essencial Met é convertido num composto altamente energético –

S-adenosilmetionina (SAM). A formação de SAM é catalisada pela enzima metionina

adenosil-transferase (MAT), com gasto de uma molécula de ATP. SAM é o dador universal

de grupos metilo na célula, transferindo-o, por acção de metiltransferases, para inúmeros

substratos (incluindo DNA e proteínas) e resultando na formação de

S-adenosil-homocisteína (SAH), a qual funciona como inibidor das metiltransferases

dependentes de SAM atrás referenciadas

METABOLISMO DA HOMOCISTEÍNA

11, 12. A SAH é então hidrolisada pela enzima SAH

hidrolase, resultando na formação de adenosina e Hcy, através de uma reacção que é

reversível e com um equilíbrio dinâmico que favorece a síntese de SAH em detrimento da

sua hidrólise (Figura 1)12. Assim, em casos de HHcy, o aumento intracelular de Hcy resulta

na acumulação, também intracelular, de SAH. Por esta razão, a remoção rápida e eficiente

da Hcy acumulada é crucial para que esta reacção ocorra no sentido da formação de Hcy.

Deste modo, e tal como observado quer in vitro, quer in vivo, qualquer perturbação

metabólica que conduza a um aumento da concentração intracelular de Hcy promove,

igualmente, o aumento dos níveis intracelulares de SAH13, 14

O metabolismo da Hcy compreende duas vias alternativas: a via da transsulfuração e

a via da remetilação.

.

I.

A Hcy é irreversivelmente metabolizada pela via da transsulfuração (Figura 1). Esta

via ocorre essencialmente no fígado e rim e inicia-se com a condensação da Hcy com uma

serina, formando cistationina, numa reacção catalisada pela cistationina β-sintase (CBS). A

VIA DA TRANSSULFURAÇÃO

Figura 1 – Metabolismo da Homocisteína.

| 3



cistationina é posteriormente clivada em cisteína (Cys) e α-oxobutirato pela γ-cistationase.

Quer a CBS quer a γ-cistationase utilizam fosfato de piridoxal como co-factor12, 15, 16

II.

.

Alternativamente, a Hcy pode ser remetilada a Met através da via da remetilação,

utilizando o 5-metil-tetra-hidrofolato (5-MTHF) ou a betaína como dadores de grupos metilo

consoante esta remetilação seja dependente ou independente de folato, respectivamente

(Figura 1)

VIA DA REMETILAÇÃO

12, 15, 16

Na via de remetilação dependente de folato a enzima metionina sintase (MS) utiliza a

vitamina B

.

12 como co-factor para catalisar a transferência do grupo metilo do 5-MTHF para a

Hcy formando-se Met e tetra-hidrofolato (THF)12, 15, 16. Nesta via, o metabolismo da Hcy

encontra-se directamente associado ao ciclo do folato. Com efeito, a enzima MS é a única

fonte de produção de THF e este pode ser ainda convertido em 5,10-metileno-

tretrahidrofolato (5,10-MeTHF) pela serina hidroxi-metiltransferase (SHMT), que recorre à

vitamina B6 como co-factor, o qual é posteriormente reduzido a 5-MTHF pela enzima

5,10-metileno-tretrahidrofolato redutase (MTHFR) e vitamina B2 na sua forma activa12, 15

A via de remetilação independente de folato utiliza a enzima betaína-homocisteína

metiltransferase (BHMT) para catalisar a transferência do grupo metilo da betaína

(intermediário da oxidação da colina) para a Hcy formando-se Met e dimetilglicina. A enzima

BHMT é expressa principalmente no rim e fígado, ao contrário da MS que é expressa em

praticamente todas as células

.

12

1.3

.

A Hcy é estruturalmente semelhante à Cys, sendo que ambas possuem um grupo

sulfidrilo (-SH), mas diferindo num átomo de carbono e no tamanho da cadeia alifática que é

maior na Hcy. As suas características químicas são também semelhantes, permitindo

ambas a formação de pontes persulfureto com outras moléculas detentoras de um grupo

-SH livre.

HOMOCISTEÍNA E A SUA REGULAÇÃO

As concentrações intracelulares de Hcy são estritamente controladas, sendo as

concentrações óptimas essencialmente reguladas pela via de remetilação dependente de

folato. As células hepáticas e renais são excepções pois também recorrem às vias da

transsulfuração e de remetilação independente de folato. Quando existe um excesso de Hcy

intracelular esta começa a ser activamente exportada para o meio extra-celular12, 17. No

plasma, devido à reactividade do grupo –SH e às condições oxidativas do meio, apenas 1%

da Hcy se encontra sob a sua forma livre, a grande maioria encontra-se associada a

proteínas (principalmente albumina) (70-80%) ou a outras moléculas, como outra molécula

de Hcy, formando um dímero, ou a outros tióis (20-30%)17.

| 4



O catabolismo e excreção da Hcy são essencialmente conseguidos por via hepática

e renal. O fígado e rins expressam grandes concentrações de CBS e BHMT que promovem

o catabolismo da Hcy. O fígado é principalmente responsável por metabolizar uma

proporção substancial de Hcy associada a proteína, enquanto o rim cataboliza

essencialmente os dissulfitos de Hcy. A excreção ocorre durante o processo de filtração do

sangue, onde graças ao meio intracelular redutor a Hcy será libertada12

O conhecimento do metabolismo da Hcy é fundamental para a compreensão da

etiologia das várias formas de HHcy.

.

1.4 Quando a Hcy se acumula no meio intracelular é continuamente exportada para o

plasma até que se reponham os seus níveis homeostáticos intracelulares, instalando-se

assim uma situação de HHcy. Os seus determinantes podem ser de natureza genética ou

não genética. Os de

DETERMINANTES DE HIPER-HOMOCISTENÉMIA

terminantes genéticos resultam de alterações nos genes que codificam

para as enzimas intervenientes no seu metabolismo e que conduzem à acumulação da Hcy

que fica assim por metabolizar12, 15

Nos

.

determinantes não genéticos encontramos factores como a idade, já que os

níveis de Hcy duplicam desde a infância até à terceira idade, e o sexo, uma vez que os

homens possuem valores de Hcy superiores aos indivíduos de sexo feminino12, 15. O estilo

de vida pode igualmente condicionar os níveis circulantes de Hcy, nomeadamente os

hábitos tabágicos e o consumo elevado de álcool ou de café estão associados a um

aumento dos mesmos15. Da maior importância nos determinantes não genéticos

encontramos as deficiências em vitaminas do grupo B, as quais participam como co-factores

no metabolismo da Hcy. Com efeito, níveis insuficientes de vitaminas B6, B12 e folato

resultam em níveis circulantes de Hcy aumentados. Finalmente, porque os rins são os

órgãos responsáveis pela excreção da Hcy do organismo, uma função renal deficiente é

igualmente um importante determinante não-genético de HHcy12, 15

.

1.5 Apesar da já estabelecida a relação entre HHcy e doença vascular, os mecanismos

subjacentes a esta causalidade continuam por esclarecer. No entanto, sabe-se que um

aumento de Hcy promove a disfunção endotelial, primeiro passo para o desencadear do

processo ateroesclerótico

HIPERHOMOCISTENÉMIA E DOENÇA VASCULAR

18

Entre os mecanismos de toxicidade directa propostos encontra-se o stress oxidativo.

Com efeito, a oxidação do grupo -SH da Hcy gera espécies reactivas de oxigénio (ROS),

nomeadamente, radicais superóxido e peróxido de hidrogénio, que contribuem para a

disfunção endotelial

.

12, 18. Indirectamente, estes radicais podem ainda promover a oxidação

das lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e a inactivação do óxido nítrico, acelerando a

| 5



disfunção do endotélio; pensa-se ainda que sejam igualmente responsáveis pela

proliferação das células musculares lisas dos vasos que também contribuem para a

aterogénese4, 19. Alternativamente, outros estudos revelam que a HHcy pode acelerar o

processo de inflamação vascular através da indução da libertação de citocinas pró-

inflamatórias18

Mais recentemente surgiu a hipótese de que a HHcy pode induzir alterações

epigenéticas responsáveis pelo aparecimento da disfunção endotelial

.

13, 20

1.6

contexto em que

se enquadra o presente trabalho.

O campo da epigenética revela-nos outro modo de regulação da expressão genética

que vai para além de alterações na sequência de nucleótidos do DNA. A SAM, intermediário

da via de transmetilação (Figura 1), é dador de grupos metilo em praticamente todas as

reacções biológicas de metilação, tornando-se assim um composto chave no campo de

epigenética onde se inserem as variações do estado de metilação do DNA, histonas e

factores de transcrição. As enzimas metiltransferases recorrem a SAM para a manutenção

dos padrões de metilação, daí resultando a formação de SAH. Uma diminuição da razão

SAM/SAH é utilizada como um marcador de hipometilação e está associada a casos de

HHcy

HOMOCISTEÍNA E METILAÇÃO

13, 20

I.

.

A metilação de DNA corresponde a um mecanismo de regulação epigenética e a sua

importância é clara durante os processos de embriogénese e diferenciação celular. Em

mamíferos ocorre quase exclusivamente na posição 5’ da citosina constituinte de um

dinucleótido CpG e, em células somáticas normais, 70 a 80% destes dinucleótidos

encontram-se metilados

METILAÇÃO DE DNA

21, 22. No entanto, existem regiões onde estes dinucleótidos se

encontram preferencialmente desmetilados, sendo estas usualmente conhecidas como ilhas

CpG. Estas regiões são especialmente ricas em CG (≥60%) e com um rácio CpG/GpC de

pelo menos 60%. As ilhas CpG são encontradas na região reguladora 5´ de cerca de

metade dos genes presentes no genoma22, 23. A metilação de DNA está geralmente

associada a uma repressão da transcrição através de três mecanismos: interferindo

directamente com activadores de transcrição e impedindo a sua associação ao DNA,

permitindo o reconhecimento por repressores específicos da transcrição ou induzindo a

formação de cromatina estruturalmente inactiva22

II.

.

Para além do DNA também as proteínas são alvo de metilação, por exemplo, as

histonas possuem como principal função a regulação da cromatina e da expressão génica. A

metilação de histonas, ao contrário da sua acetilação, não apresenta um efeito linear sobre

METILAÇÃO DE PROTEÍNAS

| 6



a transcrição. No caso dos resíduos de lisina a activação ou repressão da transcrição

depende do resíduo de lisina metilado e do grau de metilação (mono-, di- ou tri-metilada)23

2.

.

ÓXIDO NÍTRICO E DISFUNÇÃO ENDOTELIAL

O endotélio vascular corresponde à monocamada de células que cobre a superfície

interna dos vasos sanguíneos, estabelecendo assim a barreira entre o sangue e os tecidos.

É um tecido bastante activo respondendo a estímulos, quer físicos, quer químicos, a fim de

garantir a manutenção da homeostase do tecido vascular. Com efeito, tem a propriedade de

produzir moléculas agonistas e antagonistas que modulam o relaxamento e a contracção

das células musculares lisas dos vasos

2.1 ENDOTÉLIO E FISIOLOGIA DAS CÉLULAS ENDOTELIAIS

24. O endotélio intervém ainda na proliferação e

migração celular, na adesão e activação de leucócitos e nos processos imunológicos e

inflamatórios24, 25

Uma das particularidades da célula endotelial consiste no facto de 1/3 da superfície

da sua membrana celular ser constituída por invaginações com formas irregulares muito

ricas em lípidos, esfingomielina, estruturas proteicas complexas e receptores, designadas

por cavéolas. Estas estruturas conferem diversas funções ao endotélio vascular, entre as

quais o armazenamento e transporte de substâncias

.

24, 26

Os factores de risco da doença cardiovascular reduzem a capacidade do endotélio

manter a homeostase vascular, favorecendo o desenvolvimento de processos inflamatórios

patológicos e a instalação da doença vascular.

.

A disfunção endotelial é actualmente considerada como passo chave no

desenvolvimento do processo aterosclerótico. Com efeito, quando o endotélio perde a

capacidade de manter a homeostase vascular, instalam-se as condições apropriadas para

este ser invadido por lípidos e leucócitos; a resposta inflamatória é incitada e surgem estrias

lipídicas, o primeiro passo na formação da placa ateromatosa. Se a situação persistir, as

estrias lipídicas progridem e a placa fica exposta a ruptura, predispondo o endotélio à

ocorrência de trombogénese e oclusão vascular

2.2 DISFUNÇÃO ENDOTELIAL

24, 27

A disfunção endotelial é também caracterizada por uma redução na

biodisponibilidade de vasodilatadores, em particular de óxido nítrico, enquanto os factores

contrácteis derivados do endotélio estão aumentados. Deste modo, instala-se um estado

específico designado por “activação endotelial” que é caracterizado por um meio

pró-inflamatório, proliferativo e pró-coagulante, favorecendo assim todos os estados de

aterogénese

.

25, 27

.

| 7



3. BIODISPONIBILIDADE DE ÓXIDO NÍTRICO (NO)

O relaxamento vascular dependente de acetilcolina foi reconhecido pela primeira vez

em 1980 por Furchgott e Zawadzki como sendo mediado por um factor difusível libertado

pelo endotélio (endothelium-derived relaxant factor, EDRF) com um tempo de semi-vida de

escassos segundos

3.1 MOLÉCULA E RELEVÂNCIA FISIOLÓGICA

28, 29. Durante 6 anos, a natureza do EDRF permaneceu desconhecida

até Furchgott e Ignarro reconhecerem que este se tratava de uma simples molécula

inorgânica – o óxido nítrico30, 31

O NO é uma molécula apolar que se difunde livremente através das membranas

celulares, possuindo um vasto número de destinos possíveis dependendo da célula alvo e

da entidade química com a qual vai interagir. A libertação de NO na corrente sanguínea e

nos fluidos tecidulares permite a sua participação numa variedade de reacções químicas,

como a combinação com oxigénio (formando [NO

.

2-]), com o anião superóxido (formando

[ONOO-]) e com grupos -SH de péptidos, proteínas, aminoácidos e outras pequenas

moléculas para formar nitroso-tióis32

Nas células musculares lisas, a ligação do NO à enzima guanilato ciclase (GC) induz

uma alteração conformacional de que resulta a exposição do domínio catalítico da GC para

o substrato GTP, conduzindo à formação de guanosina-monofosfato cíclico (cGMP)

.

33.

Posteriormente, segue-se uma activação de proteína-cinases dependentes de cGMP e a

fosforilação de proteínas intracelulares, incluindo as cinases da cadeia leve de miosina e

canais de potássio activados por cálcio que completam a cascata mediada pelo NO,

responsável pela indução do relaxamento vascular34

Para além de induzir vasodilatação, o NO inibe a adesão e agregação de plaquetas,

contribuindo para as propriedades anti-trombóticas da parede vascular. Apresenta também

um papel na inibição da adesão de monócitos e leucócitos ao endotélio e inibe a proliferação

das células musculares lisas dos vasos. O NO reduz ainda a produção vascular de radicais

superóxido, actuando como inibidor da oxidação de LDL

.

35.

A biosíntese de NO a partir da L-arginina e do oxigénio molecular é mediada por uma

família de 3 enzimas – as sintases de NO (NOSs). A sintase de NO endotelial (eNOS),

assim como a sintase de NO neuronal (nNOS), foram inicialmente caracterizadas como

tendo uma actividade constitutiva responsável por gerar os níveis basais de NO

3.2 SINTASES DE NO - ENOS

36. Estas

contrastavam com a iNOS (NOS indutível) que requer um estímulo inflamatório para a sua

expressão37. As NOSs são também conhecidas por NOS-1 (nNOS), NOS-2 (iNOS) e NOS-3

(eNOS) consoante a cronologia com que foram identificadas38.

| 8



I.

O gene que codifica para a eNOS, gene NOS3, localiza-se no cromossoma 7q35-36

e possui 26 exões que ocupam cerca de 21 kb de DNA genómico

GENE – NOS3

38, 39. O seu promotor não

possui TATA box e exibe elementos consistentes com os genes expressos

constitutivamente nas células endoteliais (GATA; SP1), elementos de resposta ao “stress

por deformação” (Shear Stress), entre outros como NF-1, AP-1 e AP-2 (Anexo 1 - Figura

1A)40, 41. O promotor de NOS3 não se encontra numa ilha CpG, no entanto, é extremamente

rico em dinucleótidos CG e a metilação do DNA assume especial importância na regulação

da expressão do gene de eNOS humano40

II.

.

Tal como as restantes isoformas, a eNOS tem um domínio com actividade de

redutase no terminal carboxílico (C-terminal) e um domínio oxidativo no terminal amina

(N-terminal)

PROTEÍNA - ENOS

38. A forma activa da eNOS corresponde a um homodímero que catalisa a

formação de NO a partir do aminoácido L-arginina e do oxigénio molecular numa reacção

que envolve a oxidação dos 5 electrões do terminal azoto do grupo guanidino da L-arginina.

O NADPH é um co-substrato para esta reacção, que também envolve os co-factores FAD

(flavina-adenina-dinucleótido), FMN (mononucleótido de flavina), calmodulina, tetra-

hidrobiopterina (BH4) e o grupo heme associado à enzima. A L-arginina é oxidada a L-

citrulina – um co-produto formado em quantidades equimolares com o NO38, 42. Os sítios de

ligação a FAD, FMN, calmodulina e NADPH estão localizados no C-terminal do domínio

redutase. O sítio de ligação ao heme/arginina está menos bem caracterizado mas pensa-se

que se encontra no domínio N-terminal38.

I.

3.3 REGULAÇÃO DE ENOS

A eNOS é regulada a diversos níveis, desde a transcrição até às modificações pós-

traducionais. A transcrição do gene NOS3 ocorre especificamente ao nível do endotélio por

uma regulação epigenética. Com efeito, esta resulta da desmetilação do seu promotor, ao

invés do que se verifica nas células não-endoteliais onde este se encontra altamente

metilado

EXPRESSÃO E LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR

40. A nível transcricional, a expressão da eNOS é ainda regulada por activadores

específicos. Um exemplo de regulação positiva acontece na presença de shear stress, na

qual se verifica uma expressão aumentada de eNOS43. Encontra-se descrito um elemento

específico de resposta ao shear stress no promotor de NOS3 composto por uma sequência

de 6 pb (Anexo 1 - Figura 1A)44

Existe também regulação ao nível pós-transcricional; o mRNA de eNOS é

geralmente bastante estável o que se verificou ser dependente de vários elementos da

região 3’ não traduzida (3’UTR) que formam complexos de ribonucleoproteínas (RNP)

.

| 9



Figura 2 – Mecanismo de activação de eNOS dependente de Ca2+. Modificações pós-traducionais de eNOS determinam a sua localização ao nível membranar onde se encontra inactiva por interacção com a proteína caveolin-1. A presença de Ca2+ determina a activação da proteína calmodulina e a sua associação a eNOS, com consequente dissociação de caveolin-1, sendo assim accionada a síntese de NO. A enzima pode posteriormente voltar a ser incorporada na caveola.

estáveis. Diversos estudos sobre a formação dos complexos RNP-mRNA NOS3 sugerem a

interacção de várias proteínas que devem funcionar em conjunto para regular a estabilidade

dos transcritos de eNOS41

A eNOS foi inicialmente isolada do endotélio onde é essencialmente expressa, mas

sabe-se que existe noutros tipos celulares

.

45. Encontra-se funcionalmente activa no citosol

mas está também presente a nível da membrana celular, em particular nas cavéolas, onde

se encontra associada a um dos seus principais componentes, a proteína Caveolin-1 (Cav-

1), e num estado funcionalmente inactivo46. Esta interacção envolve uma região conservada

de 20 aminoácidos da Cav-1 e uma região de ligação à Cav-1 no domínio N-terminal da

eNOS47. A ligação de eNOS à membrana é determinada pelas modificações de que é alvo,

pela adição de ácido miristíco e/ou palmitoilação na região N-terminal48, 49

II.

.

Sabe-se que a eNOS é alvo de modificações pós-traducionais as quais regulam a

sua actividade. Com efeito, ao contrário do processo de

MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS

miristilação, o processo de

palmitoilação/despalmitoilação que sofre é reversível, constituindo assim mais um modo de

regulação da enzima49. Para além da miristilação e palmitoilação que determinam a sua

localização subcelular, a eNOS sofre também fosforilação nos resíduos de serina, alteração

que ocorre após a exposição ao shear stress e que tem sido associada à translocação para

o citosol através de um mecanismo independente de Ca2+/calmodulina50, 51

III.

.

O aumento da actividade de

eNOS, quando exposto a moléculas

agonistas, parece ser dependente de

níveis aumentados de cálcio

intracelular e é mediado pela ligação

de eNOS à proteína dependente de

cálcio – calmodulina

MECANISMO DE ACTIVAÇÃO INDUZIDO POR AGONISTAS

52

A proteína Cav-1 exerce um

efeito inibidor sobre a eNOS, pois

impede a associação da calmodulina

à eNOS. A presença de Ca

. Esta ligação e

activação parecem estar associadas

à dissociação da eNOS da Cav-1.

2+ induz a

activação da função catalítica de eNOS por dissociação de eNOS de Cav-1 (Figura 2)38

O microambiente da cavéola constitui também um modo de regulação de eNOS pois

a concentração local de substrato e de co-factores é limitada

.

47.

| 10



IV.

O aminoácido L-arginina existe no plasma em concentrações entre 50-100µM e já

foram determinadas concentrações endoteliais intracelulares de 800µM

RELAÇÃO COM A CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO

53. Estas

concentrações são muito superiores ao Km da enzima para a L-arginina (1-4 µM) pelo que,

o substrato não parece ser um factor limitante38, 54.

3.4 INIBIDORES ENDÓGENOS DE ENOS

Em 1992, Vallence et al., identificaram como inibidores endógenos de eNOS, os

análogos da L-arginina: a monometilarginina (MMA) e a dimetilarginina assimétrica

(ADMA)55. No entanto, as quantidades intracelulares de MMA são muito reduzidas, sendo a

ADMA o inibidor endógeno de eNOS mais abundante35

Os resíduos de arginina metilados resultam da hidrólise das proteínas das quais

eram parte constituinte e são normalmente libertados para o plasma e excretados na urina

.

55.

Estes compostos podem igualmente contribuir para uma diminuição da concentração de

arginina (substrato) intracelular, impedindo a sua entrada através do transportador y+56

.

A metilação de resíduos de arginina é uma modificação pós-traducional comum que

aumenta a diversidade estrutural das proteínas e pode modular a sua função. Existem três

tipos de resíduos de arginina metilados: MMA, ADMA e SDMA (dimetilarginina simétrica),

sendo a ADMA o mais abundante dos três. A síntese destes resíduos nas células de

mamíferos é promovida por uma família de enzimas: as proteína-arginina metiltransferases

(PRMTs) (Figura 3)55, 57. São conhecidas e bem caracterizadas 6 PRMTs que se subdividem

em PRMT do tipo I e do tipo II. As enzimas da família PRMT diferem em actividade,

especificidade de substrato e localização subcelular. Todas as PRMTs metilam, a partir de

SAM, azotos do grupo guanidino dos resíduos de arginina nos seus substratos, para formar

MMA. Num segundo passo, as PRMTs catalisam a dimetilação das argininas alvo sendo

classificadas consoante esta metilação é realizada de forma simétrica ou assimétrica.

Figura 3 – Regulação da Concentração de ADMA eNOS. Os resíduos de arginina (R) presentes nas proteínas podem ser mono-, ou dimetilados simetricamente por PRMTs do tipo I. As proteínas metiladas nos resíduos de arginina ao sofrerem proteólise podem originar MMA e ADMA, inibidores da actividade de eNOS. Resíduos de ADMA podem ainda ser metabolizados pela enzima DDAH2 de onde resulta a formação de dimetilamina e citrulina (Cit).

I. SÍNTESE DE ADMA – PRMT1

| 11



PRMTs do tipo I (PRMT1, -3, -4 ou CARM1, -6 e -8) produzem resíduos metilados

assimetricamente (ADMA) enquanto as PRMT do tipo II (PRMT5) catalisam a formação de

resíduos metilados de forma simétrica (SDMA)57

A proteína PRMT1 do tipo I é a responsável pela maior parte da produção de ADMA

nas células de mamífero (85%), possuindo uma grande variedade de possíveis substratos

tanto no núcleo como no citosol

.

58. Os principais alvos de PRMT1 foram identificados como

proteínas nucleares que interactuam com os ácidos nucleicos, tais como as histonas H3 e

H4, e componentes das ribonucleoproteínas (RNP) particularmente envolvidas no

processamento e transporte do mRNA58, 59

O gene que codifica para a PRMT1 localiza-se no cromossoma 19q13.3-q13.4 e é

formado por 12 exões, apresentando homologia estrutural com os outros genes PRMT.

Existem 3 variantes de PRMT1 que resultam de splicing alternativo; a comparação das

sequências amino-acídicas das diferentes variantes indica que todas são enzimaticamente

activas, mas com diferentes regiões hidrofóbicas N-terminal

.

59.

A ADMA é libertada durante os processos de proteólise e não volta a ser

incorporada nas proteínas. A enzima dimetilarginina dimetilamina-hidrolase (DDAH),

hidrolisa a ADMA em citrulina e dimetilamina (Figura 3)

II. DEGRADAÇÃO DE ADMA – DDAH2

60

Existem duas isoformas humanas de DDAH, DDAH1 e DDAH2, sendo a última

expressa essencialmente em tecidos muito vascularizados que expressam eNOS ou iNOS

.

60.

O gene DDAH2 encontra-se no cromossoma 6p21.3 e a região codificante está dividida em

8 exões61. A transcrição de DDAH2 pode ser iniciada a partir de 3 sítios diferentes e o

mRNA é ainda alvo de splicing alternativo. Sabe-se que o gene da DDAH2 tem um promotor

sem TATA-box e possui uma ilha CpG que se sobrepõe ao primeiro exão (Anexo 1 - Figura

2A)60, 61. Já foi demonstrado o envolvimento de DDAH2 na regulação positiva da síntese de

NO, visto ser responsável pela hidrólise de ADMA, inibidor da eNOS61

4.

.

O presente trabalho visa aprofundar os conhecimentos sobre a patofisiologia do

metabolismo da Hcy e a sua correlação com a disfunção endotelial, primeira etapa da

doença vascular e aterosclerose.

OBJECTIVOS

Postulamos que um dos mecanismos envolvidos na toxicidade vascular promovida

pela Hcy, nomeadamente, na diminuição da biodisponibilidade do NO, pode resultar de

alterações epigenéticas induzidas pela acumulação de SAH. Por esta razão, o presente

trabalho visa a elucidação do possível efeito da acumulação intracelular de SAH na

expressão dos genes directa ou indirectamente responsáveis pelos níveis de NO no

endotélio vascular.

| 12

Métodos


5.1

5. MATERIAIS E MÉTODOS

Para a realização deste trabalho foram utilizadas células endoteliais isoladas da veia

do cordão umbilical humano (Human Umbilical Vein Endothelial Cells – HUVEC). Os

cordões umbilicais utilizados foram provenientes de fetos saudáveis nascidos após

gestações normais através de partos pélvicos de mães igualmente saudáveis. Os cordões

foram armazenados numa solução tampão contendo (4 mM KCl, 140 mM NaCl, 11 mM D-

glucose [Merck], 10 mM HEPES [Gibco], 1% solução antibiótico-antimicótico [Sigma]). As

células endoteliais foram isoladas entre 24 a 48 horas após o parto. O isolamento foi

efectuado a partir da veia dos cordões umbilicais por tratamento com colagenase (Gibco),

segundo protocolo adaptado de Jaffe et al

CULTURA DE CÉLULAS

62

As HUVEC utilizadas deram origem a 5 linhas celulares independentes que

provieram de 5 culturas celulares diferentes e encontravam-se na quarta passagem, num

estado de 70-80% de confluência, aquando da realização das várias experiências. O meio

de cultura foi substituído por meio controlo (sem adenosina-2,3-dialdeído [ADA]) ou por meio

de teste (ADA 5, 10, 15 e 20 µM), tendo sido recolhidas aliquotas de meio às 12h (100µL)

para análise da libertação de NO, e às 24h (2mL) para análise da libertação de NO e

quantificação de tHcy, ADMA e SDMA.

. As HUVEC sofreram sucessivas passagens

até obtenção do número de frascos necessários para a extracção de RNA, DNA e proteínas

(condições de cultura – Anexo 2). A caracterização das células endoteliais foi realizada

através da utilização de um marcador celular fluorescente específico para as mesmas (Dil-

Ac-LDL) (Anexo 2).

Após 24h de incubação recorreu-se ao Cytotoxicity Detection Kit (Roche Molecular

Biochemicals) para avaliar a citotoxicidade de ADA pela libertação de Lactato

Desidrogenase (LDH) para o meio de cultura (Anexo 2).

5.2 ANÁLISE DA LIBERTAÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO

Os níveis de NO foram quantificados indirectamente através dos seus produtos

estáveis, nitritos, de acordo com a reacção de Griess

63 a partir do meio de cultura. O

reagente de Griess (sulfanilamide e N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride [Sigma-

Aldrich], 1:1) foi adicionado ao meio de cultura formando-se um composto corado. A

absorvência, medida a 550nm (Abs550) (Leitor de Microplacas Asys – Expert Plus), permitiu

quantificar a concentração de nitritos por comparação com a Abs550

de uma solução padrão

de nitrito de sódio diluída em meio de cultura. Os valores resultantes desta quantificação

foram normalizados em função do valor da concentração de proteína total.

| 13

Métodos


5.3

A concentração de proteína, expressa em µmol/mg, foi determinada pelo ensaio do

ácido bicinconínico (BCA) com recurso ao BCA protein assay kit (Pierce). Este método

combina a redução de Cu

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA

2+ a Cu+ pelas proteínas, num meio alcalino, com a detecção por

espectofotometria do produto da reacção colorimétrica entre o cobre reduzido e o BCA. Para

cálculo das concentrações recorreu-se a uma curva padrão com albumina de soro bovino

(BSA)64

5.4

. A mistura reaccional foi exposta a uma incubação a 37ºC durante 30 minutos e

posteriormente determinada a absorvência a 562nm (Leitor de Microplacas Asys – Expert

Plus).

Os níveis de Hcy total, ADMA e SDMA foram quantificados no meio de cultura, após

24h de incubação, por cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa (RP-HPLC)

com detecção fluorimétrica, como descrito anteriormente (Anexo 2). Os cromatogramas

típicos para os tióis e metilargininas encontram-se representados nas figuras 3A e 4A

(Anexo 1)

DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE HOMOCISTEÍNA TOTAL, ADMA E SDMA

65,66

.

5.5 Para determinação de SAM e SAH foram preparados lisados celulares (solução de

lise – Anexo 2) das HUVEC após 24 horas de incubação com os diferentes meios de teste e

controlo. Os lisados foram centrifugados a 7500rpm (Centrífuga Sigma 202 MK Rotor

12045), a 4ºC, durante 10 minutos, para separação do material nuclear e restante meio

intracelular. O sobrenadante (meio intracelular), foi posteriormente desproteinizado por

adição de igual volume de ácido perclórico a 10% e analisado por cromatografia líquida

acoplada a espectrometria de massa em tandem com diluição isotópica, como descrito por

Struys et al

DETERMINAÇÃO DE S-ADENOSILMETIONINA E S-ADENOSILHOMOCISTEÍNA

67

5.6

. A quantificação proteica das amostras foi realizada antes de se proceder à

desproteinização para normalização dos resultados.

A extracção de RNA das HUVEC foi realizada com recurso ao ‘RNeasy Mini kit’

(Qiagen) incluindo um tratamento com DNAse durante o processo (RNase-free DNase set -

Qiagen). Após quantificação do RNA por espectrofotometria a 260 nm (ND-1000 -

NanoDrop) procedeu-se à síntese de cDNA (Anexo 2).

EXTRACÇÃO DE RNA E RT-PCR QUANTITATIVO

Análise por PCR em tempo real – O PCR em tempo real foi realizado no

termociclador 7300 real time pcr system (Applied Biosystems). Para a detecção do produto

formado foi utilizado SYBR Green e foram desenhados primers específicos para o cDNA de

NOS3, PRMT1, DDAH2 e Cav-1 dirigidos para exões distintos de modo a evitar a detecção

| 14

Métodos


de DNA genómico (Anexo 1 - Tabela 1A). Foram ainda utilizados primers específicos para o

cDNA de 3 genes housekeeping: ATP5B, EIF4A2, e UBC.

A reacção de PCR é de 2-passos: 1 ciclo de desnaturação a 95ºC durante 10

minutos e 40 ciclos de uma incubação inicial a 95ºC durante 15 segundos (desnaturação)

seguida de outra a 60ºC durante 1 minuto (hibridação e extensão). Cada reacção é realizada

em triplicado num volume total de 25 µL; sendo constituída por 12,5 µL de SYBR GREEN

PCR Master Mix (Applied Biosystems), primers forward e reverse (numa concentração de

300nM cada) e 30 ng do cDNA de cada amostra.

Foi efectuada uma curva padrão com 5 pontos, com diluições seriadas de 5x,

também em triplicado, do cDNA produzido a partir de uma mistura de RNAs provenientes

das várias condições experimentais. Após a reacção de PCR os dados foram processados a

partir do programa ‘7300 system Software’ (AppliedBiosystems), e a quantificação foi feita

pelo método da curva padrão descrito em Mamic et al 68

5.7

. Foi ainda realizada uma análise

das curvas de desnaturação dos produtos de amplificação para verificar a especificidade da

reacção.

A lise de 4x10

EXTRACÇÃO DE PROTEÍNA E WESTERN BLOT 5

A concentração de proteína foi normalizada para todas as amostras de acordo com

as quantificações obtidas (pelo método descrito em 5.3), utilizando-se sempre a maior

quantidade de proteína possível, num volume de 16 ou 40 µL (14 - 30 mg). Os lisados

celulares foram desnaturados (Anexo 2) e sujeitos a electroforese num gel desnaturante de

poliacrilamida (SDS-PAGE), numa concentração de 7-10% no gel de separação e 4% no gel

de concentração. Foi utilizado o marcador de massas moleculares Prestained SDS-PAGE

Standards Low-Range (BioRad) para confirmação da massa molecular das proteínas. Após

a electroforese as proteínas foram electrotransferidas (240 mA, ≤100V, 45min) para uma

membrana de difluoreto de polivinidileno (PVDF) (Amersham Hybond-P [GE Healthcare])

com recurso ao sistema Mini Trans-Blot cell (Bio-Rad).

células foi efectuada com 250uL Cell Lysis Buffer (CellSignaling). O

lisado foi sonicado em gelo durante 40 segundos (UP100H ultrasonic processor - Hielscher)

e posteriormente centrifugado a 13000g durante 10minutos a 4ºC, para eliminação de

células intactas, núcleos e outro material insolúvel. A concentração de proteína foi

determinada pelo método BCA acima descrito.

As membranas foram expostas a um bloqueio de 3 horas numa solução de tampão

Tris com 0,1% de Tween-20 (TBS-T) contendo 5% de leite magro em pó (solução de

bloqueio). Após 3 lavagens com TBS-T foram incubadas com anticorpos específicos para

eNOS, PRMT1, DDAH2 ou Cav-1, e para a proteína β-actina que foi utilizada como controlo

endógeno (Anticorpos: Anexo 1 – Tabela 2A). As incubações com o anticorpo primário foram

| 15

Métodos


sempre realizadas a 4ºC, durante cerca de 14horas, e após três lavagens com TBS-T as

membranas foram incubadas, à temperatura ambiente, com um anticorpo secundário

associado à enzima Horse Radish Peroxidase (HRP) (Rabbit polyclonal to Goat IgG - H&L

(HRP) [Abcam], numa diluição de 1:5000; peroxidase-conjugated goat anti-mouse antibody

[Bio-Rad], numa diluição de 1:5000) diluído em solução de bloqueio.

5.8 Extracção de DNA e Determinação da Metilação específica

As bandas imuno-

reactivas foram reveladas por quimioluminescência com o reagente de detecção LumiGLO

(Cell Signaling). A análise da densidade das bandas foi efectuada com recurso ao software

Quantity One 4.6 (BioRad).

Para extracção do DNA foi utilizado o pellet nuclear obtido em 5.5. O DNA foi

extraído e purificado com o ‘kit de purificação de DNA genómico’ (Citogene) e

posteriormente quantificado por espectrofotometria a 260nm no ND-1000 (NanoDrop).

Foram utilizados 350ng de DNA para conversão das citosinas desmetiladas em uracilos por

tratamento com bissulfito (EpiTect Bisulfite Kit – Qiagen). Depois de efectuada a

amplificação por PCR os produtos foram sequenciados.

O promotor de NOS3 (GenBank NG_011992) foi subdividido em 4 fragmentos para

se desenharem primers específicos de modo a ser possível a amplificação de toda a região

promotora (Anexo 1 – Figura 6A). Inicialmente foi amplificado o fragmento de -484 a -145

com primers específicos para PCR após tratamento com bissulfito:

Fw:GAGAGAATTTGTATGATTTTAGAGGTT e Rev: AACTCTAAAACCTCAACTCCAC.

O programa de PCR utilizado inicia-se com um ciclo de desnaturação de 5 min a

95ºC ao que se seguem 50 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 45 segundos a 55ºC e 45

segundos a 72ºC; finalmente um ciclo de 7 minutos de extensão a 72ºC. Os produtos de

PCR são posteriormente purificados com recurso ao QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) e

analisados por sequenciação directa pelo método enzimático de Sanger (ABI Prism BigDye

Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) no sequenciador ABI Prism 310 Genetic

Analyzer (Applied Biosystems).

5.9 Todos os valores descritos no texto e figuras estão expressos como média±desvio-

padrão (média±DP). As diferenças estatísticas foram calculadas a partir do teste t-student

para amostras independentes, com valores de p utilizando duas caudas. Significância

estatística foi considerada para valores de p <0,05.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_011992�

| 16

Resultados Caracterização dos Efeitos Provocados pela Acumulação de S-Adenosil-homocisteína na expressão de genes envolvidos

na biodisponibilidade de NO

6.1

6. RESULTADOS

A libertação da enzima lactato desidrogenase (LDH) das células, após incubação

com diferentes concentrações do inibidor de SAH hidrolase - adenosina-2,3-dialdeído (ADA),

foi utilizada como método para avaliar o nível de citotoxicidade desta molécula. Como é

visível na tabela 1, não se observaram variações significativas na presença de diferentes

concentrações de ADA adicionadas ao meio de cultura (5, 10 e 20 µM) relativamente ao

controlo, o que permitiu excluir um potencial efeito tóxico do inibidor usado neste estudo.

AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE ADA

Este ensaio foi confirmado em 4 linhas celulares independentes, pelo menos em

triplicado.

Tabela 1 - Libertação de LDH – Absorvência a 490nm, proporcional à libertação de LDH para o meio extracelular, após 24horas de incubação, de HUVEC com diferentes concentrações de ADA.

Concentração de ADA (µM) 0 (n=3) 5 (n=3) 10 (n=3) 20 (n=3)

Abs 490nm (média±DP) 2,458±0,058 2,517±0,152 2,520±0,045 2,550±0,035

6.2 A libertação de NO foi determinada pela reacção de Griess. Os níveis de nitritos no

meio extracelular foram quantificados após 12 e 24 de incubação com as diferentes

concentrações de ADA.

ANÁLISE DA LIBERTAÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO

Figura 4 - Quantificação da Libertação de nitritos pelas HUVEC para o meio extracelular, para as diferentes concentrações de ADA utilizadas (5, 10 e 20 µM), normalizados pela quantidade de proteína total, após 12 e 24 horas de incubação.

Como é visível na figura 4 as concentrações de NO no meio extracelular diminuíram

com a presença de ADA no meio de cultura. A incubação com ADA conduziu, após 12

horas, a uma diminuição dos níveis de NO sintetizado pelas HUVEC, com significado

estatístico para as concentrações de 10 e 20µM. Após 24 horas de incubação, apenas na

presença de uma concentração de 20 µM de ADA se observou uma diminuição significativa

**** ***

0

0,005

0,01

0,015

0,02

12h 24h

µmol

/ng

[NO2]/[Proteína]

*** P≤0,001* P≤0,05

| 17



* *

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

µmol

/L

Concentração extracelular de Hcy

Ctrl

ADA 5 µM

ADA 10 µM

ADA 20 µM

* P≤0,05

da produção de NO quando comparada com o controlo. Estes ensaios foram sempre

realizados pelo menos em triplicado e em 5 linhas de HUVEC diferentes.

6.3 A presença de ADA no meio de cultura provocou uma diminuição dos níveis de Hcy

extracelular, que se mostrou dependente da

concentração de ADA utilizada (Figura 5). Às

0 horas a presença de Hcy, bem como a de

ADMA e SDMA, deve-se à sua existência no

soro do meio de cultura (Anexo 1 - Tabela

3A). Após 24 horas de incubação,

verificou-se uma diminuição significativa no

export de Hcy para as concentrações de

ADA de 10 e 20µM (Figura 5).

AVALIAÇÃO DO EXPORT DE HOMOCISTEÍNA, ADMA E SDMA

Relativamente às concentrações de ADMA (Figura 6), foi observado um decréscimo

que foi significativo para as concentrações de ADA 10 e 20 µM, quando comparadas com o

controlo. Em relação aos níveis de SDMA não foram observadas variações significativas.

Estes dados resultaram da análise de 4 linhas celulares independentes, pelo menos

em duplicado.

6.4 Como é visível na tabela 2, ao contrário das concentrações de SAM intracelular que

não variaram significativamente com a presença de ADA no meio de cultura, a concentração

de SAH aumentou significativamente (p<0,0001) com as diferentes concentrações de ADA

utilizadas. A razão SAM/SAH, utilizada como marcador da capacidade de metilação da

célula, diminuíu significativamente (p<0,005) para as diferentes concentrações de ADA

utilizadas, quando comparadas com o controlo.

RAZÃO SAM/SAH

* *

0,0

100,0

200,0

300,0

400,0

500,0

ADMA SDMA

nmol

/L

Concentrações extracelulares de ADMA e SDMA

Controlo

ADA 5 µM

ADA 10 µM

ADA 20 µM

* P≤0,05

Figura 6 - Concentrações de ADMA e SDMA extracelulares (nM), para as diferentes concentrações de ADA utilizadas (0, 5, 10 e 20 µM), após 24 horas de incubação.

Figura 5 - Concentrações de tHcy extracelular (µM), para as diferentes concentrações de ADA utilizadas (0, 5, 10 e 20 µM), após 24 horas de incubação.

| 18



Os resultados obtidos para as concentrações de SAM e SAH foram reproduzidos em

3 linhas celulares diferentes.

Tabela 2 - Concentração intracelular de SAM e SAH normalizada pela concentração de proteína solúvel, para as diferentes concentrações de ADA utilizadas (0, 5, 10 e 20 µM), após 24 horas de incubação. Média da razão SAM/SAH.

Ctrl (n=4) 5 (n=4) 10 (n=4) 20 (n=4) SAM (nmol/mg) 201,7 ± 50,3 207,9 ± 19,2 147,3 ± 38,7 203,9 ± 51,4 SAH (nmol/mg) 31,7 ± 3,4 117,4 ± 25,2 158,4 ± 6,4 230,4 ± 37,2

SAM/SAH 6,33 ± 1,26 1,82 ± 0,31 0,94 ± 0,28 0,88 ± 0,08

6.5 Com o objectivo de avaliar o efeito da acumulação de SAH intracelular nos níveis de

transcrição dos genes de interesse foi utilizada a técnica de PCR em tempo real. Os

resultados mostram um aumento significativo dos níveis de mRNA de todos os genes em

estudo (Figura 7).

AVALIAÇÃO DOS NÍVEIS DE TRANSCRIÇÃO

Os resultados foram normalizados relativamente ao gene endógeno utilizado para

controlo das reacções de PCR em tempo real (EIF4A2), que foi seleccionado de entre 3

(ATP5B, EIF4A2, UBC) por ser aquele que apresentou menor variação com as condições

em estudo (diferentes concentrações de ADA) (Anexo 1 – Figura 5A). Assim, a quantificação

de todos os transcritos em estudo foi normalizada relativamente aos níveis de mRNA de

Figura 7 – Gráficos correspondentes aos níveis de mensageiro dos diferentes genes em estudo (NOS3 (A), PRMT1 (B), DDAH2 (C) e Cav-1 (D)) normalizados com EIF4A2, para as diferentes concentrações de ADA utilizadas nas incubações de HUVEC durante 24 horas.

| 19



EIF4A2. Todos os resultados de PCR em tempo real foram realizados em triplicado e

confirmados em 3 linhas celulares diferentes de HUVEC.

I. ENOS -

Em relação à eNOS (Figura 7[A]), enzima directamente responsável

pela síntese de óxido nítrico, verificou-se um aumento significativo nos níveis de RNA

mensageiro com o incremento da quantidade de ADA, aumentando cerca de 40%, 68% e

74%, em relação ao controlo, para as concentrações de ADA 5, 10 e 20µM,

respectivamente,

II. PRMT1 - O aumento de ADA parece promover a transcrição do gene PRMT1;

no entanto, este aumento foi menos acentuado do que o dos restantes transcritos em estudo

(Figura 7[B]). A incubação de 24 horas com ADA 10µM resultou num aumento de 26% do

mRNA, e com ADA 20µM de 41%, em relação ao meio controlo.

III. DDAH2 - Com é visível na figura 7(C), também a transcrição do gene DDAH2

sofreu um aumento significativo, de cerca de 38% e 53% na presença de ADA 10 e 20 µM,

respectivamente.

IV. CAV-1 -

Observaram-se níveis de mRNA de Cav-1 significativamente

aumentados para concentrações superiores de ADA em comparação com o controlo,

aumentando cerca de 62% para a concentração de ADA 10µM e 68% para ADA 20µM

(Figura 7[D]).

6.6 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA

Para avaliar o efeito da acumulação de SAH intracelular, quer ao nível da

transcrição, quer ao nível da tradução, a expressão proteica foi avaliada pela técnica de

Western blot. A expressão da proteína β-Actina foi utilizada como controlo pois a sua

expressão mantém-se na presença das diferentes concentrações de ADA utilizadas

(Figura 8).

Na figura 8 pode ser observado um decréscimo na quantidade de eNOS em

consequência da incubação com ADA. A diminuição parece ser dependente da

concentração de ADA; para a maior concentração utilizada verificou-se um decréscimo de

aproximadamente 25% em relação ao controlo (Figura 8).

Para a PRMT1 verificou-se que a concentração de proteína intracelular não variou

significativamente com as incubações realizadas (Figura 8).

Em relação à proteína DDAH2, como é visível na figura 8, a proteína parece não

apresentar variação sendo apenas detectada, sob a forma de bandas muito ténues, talvez

devido ao facto de esta ter níveis de expressão muito reduzidos sendo difícil a sua detecção

pela técnica utilizada.

| 20



Foi também analisada a expressão de Cav-1 tendo-se observado um aumento

significativo dependente da presença de ADA no meio.

Estes resultados foram também confirmados em 3 linhas celulares diferentes de

HUVEC com ensaios sempre realizados em duplicados (ou triplicados).

eNOS

PRMT1

DDAH2

Cav-1

β-Actina

Figura 8 – Efeito da incubação de HUVEC com ADA na expressão proteica. Análise por Western blot de eNOS, PRMT1, DDAH2, Cav1 e β-actina em HUVEC incubadas durante 24horas com meio controlo (ctrl) ou de teste (concentrações de ADA de 5, 10 e 20 µM)).

6.7 Os resultados preliminares da análise do promotor de NOS3 incidiram sobre a região

de -484 a -145 que possui 6 dinucleótidos CpG (posições: -412, -360, -352, -209, -198,

-194). Os resultados não revelaram qualquer alteração dependente da concentração de

ADA, visto que a região se apresentou sempre completamente desmetilada. Todos os

cromatogramas apresentavam todas as citosinas convertidas em timinas nestes locais, tanto

para a concentração de ADA 20 uM como para o controlo (Anexo 1 – Figura 6A).

ANÁLISE DE METILAÇÃO ESPECÍFICA

Ctrl ADA 5 ADA 10 ADA 20

| 21

Discussão


A Hcy corresponde a um factor de risco considerado emergente e cuja relação com a

disfunção endotelial ainda não se encontra completamente esclarecida. Tendo em conta a

importância da regulação epigenética a todos os níveis da actividade celular e o efeito que a

HHcy pode ter sobre esta, procurou-se neste estudo estabelecer uma relação entre a

hipometilação (resultante da acumulação de SAH) e uma variação dos níveis de óxido

nítrico, por alteração da expressão dos genes que estão envolvidos na sua

biodisponibilidade.

7. DISCUSSÃO

As células endoteliais da veia de cordão umbilical humano (HUVEC) foram o modelo

celular utilizado neste estudo. Estas células são semelhantes às do endotélio vascular

humano adulto e encontram-se bem caracterizadas, sendo por isso frequentemente

utilizadas em estudos de biologia vascular.

Para promover o estado de hipometilação celular interrompeu-se a via da

metabolização de SAH, pela inibição da enzima SAH hidrolase, responsável pela hidrólise

de SAH em adenosina e Hcy (Figura 1). Esta inibição tem como consequência uma

acumulação de SAH, forte inibidor das metiltransferases dependentes de SAM, e a

consequente diminuição do estado de metilação celular. A hipometilação induzida pela

acumulação de SAH pretende simular um estado de HHcy, permitindo excluir outras

possíveis vias de toxicidade relacionadas com a molécula de Hcy. A inibição de SAH

hidrolase foi conseguida com o recurso ao seu inibidor adenosina-2,3-dialdeido (ADA)69,

cujo possível efeito citotóxico foi excluído pelo ensaio de libertação de LDH.

A reacção de Griess, conjuntamente com a utilização de uma curva padrão de nitrato

de sódio, foi o método utilizado para determinar uma concentração aproximada dos nitritos

resultantes da oxidação do NO, permitindo assim inferir sobre a sua variação.

7.1 DIMINUIÇÃO DOS NÍVEIS DE ÓXIDO NÍTRICO

Os resultados revelaram a existência de uma relação consistente e significativa entre

o aumento da concentração de ADA no meio extracelular e uma diminuição da produção de

NO pelas células endoteliais (Figura 4). A diminuição de NO é o ponto de partida para a

disfunção endotelial devido às suas propriedades que condicionam a homeostase do

endotélio. Com efeito, como referido anteriormente, a molécula de NO actua como

vasodilatador e possui muitas outras propriedades que contribuem para que seja

classificado como uma ‘molécula anti-aterosclerótica endógena’, pelo que a sua diminuição

é crucial no desencadear da disfunção do endotélio35

É possível ainda verificar que as diferenças entre os níveis de NO para as várias

concentrações de ADA utilizadas se atenua com o passar do tempo. Após 24 horas de

.

| 22

Discussão


incubação o significado estatístico desta diminuição, em função da concentração de ADA,

passa a estar presente apenas para a maior das concentrações; o mesmo foi observado

passadas 48 horas e às 72 horas deixa de ter uma variação significativa (resultados não

apresentados para 48 e 72 horas). Esta observação poderá ser explicada pelo facto de, no

decorrer do tempo de incubação, o ADA ir sendo metabolizado pela célula.

7.2 R

A quantificação dos níveis de SAM e SAH intracelulares foi efectuada com o

objectivo de confirmar a inibição da SAH hidrolase pelo ADA e, consequentemente, a

acumulação de SAH. Os resultados, apresentados na tabela 2, mostram que o inibidor

utilizado não provoca alterações nos níveis intracelulares de SAM e foi eficaz na promoção

da acumulação de SAH intracelular, indicador de hipometilação celular vulgarmente

utilizado.

AZÃO SAM/SAH E ESTADO DE HIPOMETILAÇÃO

Resultados anteriormente obtidos por Castro et al.70 demonstram uma correlação

significativa entre o aumento intracelular de SAH e a diminuição do estado de metilação

global do DNA genómico.

A inibição da acção da enzima SAH hidrolase provocou uma diminuição na produção

intracelular de Hcy com consequente diminuição do seu export para o meio extracelular

(Figura 5). Com efeito, a acumulação intracelular de Hcy, metabolito potencialmente tóxico

para a célula, é evitada através do export da molécula para o meio extracelular, ou,

alternativamente, através da sua metabolização, pela via da remetilação. Como referido, a

única fonte de produção de Hcy reside na hidrólise de SAH. Assim, a inibição desta reacção

pelo ADA resultou num decréscimo da produção intracelular de Hcy e, consequentemente,

numa diminuição do seu export para o meio extracelular.

7.3 AVALIAÇÃO DO EXPORT DE HOMOCISTEÍNA

Foram igualmente avaliadas as variações nas concentrações de ADMA no meio

extracelular de HUVEC incubadas com diferentes concentrações de ADA. Os resultados

obtidos (Figura 6) mostram que a acumulação intracelular de SAH provocou uma diminuição

significativa nas concentrações de ADMA extracelulares. Com efeito, a produção de ADMA

é dependente da acção das PRMTs de tipo I, que são metiltransferases SAM dependentes.

Assim, os resultados podem ser explicados pelo efeito inibidor que a SAH possui nas

reacções de metilação celular dependentes de SAM, onde se incluem as PRMTs.

7.4 AVALIAÇÃO DO EXPORT DE ADMA E SDMA

A diminuição de ADMA observada permite-nos excluir a possibilidade dos níveis de

NO se encontrarem diminuídos devido a um aumento do principal inibidor endógeno de

eNOS.

| 23

Discussão


A observação de uma diminuição de ADMA num estudo que pretende elucidar a

origem da disfunção endotelial numa situação de HHcy entra em conflito com anteriores

observações de aumento de ADMA circulante em indivíduos com doença vascular35, 71-73. No

entanto, a variação observada pode traduzir um efeito da acumulação de SAH e não

obrigatoriamente o resultado de toda a complexidade que a patologia em causa envolve.

Estudos anteriores mostraram, em casos de doença vascular, uma proteólise aumentada a

nível sistémico74,75

Foram também quantificados os níveis de SDMA; no entanto, não se verificaram

alterações significativas. Esta observação poderá dever-se ao facto de o método utilizado

para quantificação dos resíduos de arginina metilados (RP-HPLC) não ter sensibilidade para

detectar pequenas variações na concentração SDMA, cuja produção é bastante inferior à

produção de ADMA.

. Assim, a metilação de argininas poderá estar diminuída existindo no

entanto, a nível sistémico, uma proteólise aumentada que poderá justificar uma maior

produção de ADMA, responsável pelos níveis circulantes aumentados observados em

indivíduos com doença vascular.

Verificando-se um estado de hipometilação celular global, podemos inferir sobre as

alterações que ocorrem ao nível da transcrição, relacionando-as com uma possível

alteração do padrão de metilação dos genes, ou mesmo das histonas ou dos factores de

transcrição.

7.5 ACUMULAÇÃO DE SAH E REGULAÇÃO DA TRANSCRIÇÃO

Os genes que nos propusemos estudar e que se consideraram de maior relevância

para a regulação dos níveis de NO foram aqueles que codificam para a eNOS (responsável

pela sua síntese), a PRMT1 (responsável pela produção de ADMA), a DDAH2 (responsável

pelo catabolismo do ADMA) e também para a Cav-1, (responsável pela inibição de eNOS

essencialmente ao nível caveolar). Foram também analisados os níveis de mRNA de três

genes housekeeping nomeadamente: ATP5B, EIF4A2, UBC

I.

. O gene que apresentou menor

variação nas várias condições de estudo foi o gene EIF4A2, tendo sido por este motivo

seleccionado como controlo endógeno para a análise dos genes de interesse (Anexo 1 –

Figura 5A). É interessante verificar que os próprios genes housekeeping podem sofrer

alterações no seu padrão de expressão, visto que estamos a condicionar factores

epigenéticos que são extremamente importantes na regulação de todo o genoma.

Com a diminuição dos níveis de NO produzido, concomitantemente com o facto de

não se verificar um aumento da concentração de ADMA, seria espectável uma diminuição

da produção da enzima eNOS que justificasse os valores de NO observados. Verificou-se,

no entanto, um aumento significativo dos níveis de mensageiro de eNOS (Figura 7[A]). O

ENOS

| 24

Discussão


aumento dos níveis de mensageiro é consistente com o facto de o estado de hipometilação

do promotor de um dado gene contribuir para um aumento da taxa da sua transcrição22

O promotor de eNOS é muito rico em dinucleótidos CpG apresentando por isso uma

regulação epigenética por metilação

.

40

Para investigar a existência de uma alteração no padrão de metilação do promotor é

necessário o estudo do estado de metilação específico deste. Iniciou-se esse mesmo estudo

procedendo a uma amplificação do promotor subdividido em quatro regiões distintas para

que pudessem ser analisadas separadamente através da técnica que se baseia no

tratamento com bissulfito, que converte selectivamente as citosinas não metiladas em

uracilos, seguida da amplificação por PCR. O estado de metilação da região do promotor

analisada (-484 a -145) não apresentou diferenças dependentes de ADA. É fundamental a

análise das restantes regiões e, caso não se verifiquem alterações, investigar outras regiões

do gene ou na sua proximidade que apresentem um conteúdo significativo de CpG. Com

efeito, o enhancer presente a montante do promotor é também rico em CpG e encontra-se

parcialmente metilado nos diferentes tipos celulares. Ao contrário da região reguladora a

montante do local de inicio da transcrição que, apesar de rica em dinucleótidos CpG, não se

localiza numa ilha CpG, o gene NOS3 possui uma região que engloba desde o exão 24 até

ao inicio da região 3’ UTR que preenche os critérios de ilha CpG

. Este promotor encontra-se geralmente desmetilado

em células do endotélio pelo que o aumento observado poderá ser resultado de uma

hipometilação ainda mais acentuada, ou numa região diferente do gene.

40

II. PRMT1

.

A proteína arginina metiltransferase 1 do tipo I é aquela que assume o papel mais

relevante na metilação de argininas nas proteínas celulares e consequentemente na

formação de ADMA. Verificou-se que, com o aumento de ADA, o número de transcritos de

PRMT1 aumentou. Tal como para eNOS, o estado de hipometilação determinado pela

acumulação de SAH parece ser determinante para um aumento da transcrição de PRMT1.

III. DDAH2 Também o gene de DDAH2 não foi excepção e a sua transcrição aumentou com a

presença de concentrações crescentes de ADA no meio extracelular, o que poderia ser

indicador de um aumento da hidrólise de ADMA. Contudo, os resultados obtidos ao nível de

expressão proteica não permitiram estabelecer essa associação.

Como referido, para o gene DDAH2 encontra-se descrita e bem caracterizada uma

ilha CpG no seu promotor (em sobreposição com o primeiro exão). Assim, a hipometilação

desta região poderá explicar o aumento da transcrição observado. Estudos de regulação

epigenética de DDAH2 sugerem que o estado de metilação deste promotor influencia a

transcrição por induzir alterações na cromatina61.

| 25

Discussão


IV. Tendo em conta a possível regulação de eNOS por Cav-1 procedeu-se também ao

estudo da sua expressão. Verificou-se que a acumulação de SAH promoveu o aumento dos

níveis de mensageiro de Cav-1. Mais uma vez, o estado de hipometilação induzido provocou

um aumento da transcrição. A hipometilção alterou possivelmente o padrão de metilação

das duas ilhas CpG presentes na região promotora de Cav-1

CAV-1

76

, induzindo o aumento da taxa

de transcrição do gene.

7.6 ANÁLISE DE EXPRESSÃO PROTEICA

A expressão de eNOS encontra-se significativamente diminuída de forma

dependente da concentração de SAH intracelular (Figura 8), facto que está de acordo com a

diminuição dos níveis de NO observados. Esta observação contraria a observação prévia do

aumento obtido ao nível de mRNA. O aumento da transcrição de eNOS, provocado pela

acumulação de SAH, poderá então anteceder uma regulação pós-transcrição de eNOS que

conduza à diminuição da expressão da respectiva proteína e consequentemente da sua

actividade, explicando a diminuição de NO.

I. ENOS

Com efeito, o mensageiro de eNOS poderá estar a ser alvo de regulação por parte

de RNP que, como referido, apresentam um importante papel na sua estabilidade. As RNPs

são geralmente alvo de metilação e, perante um estado de hipometilação celular global, a

sua actividade/função poderá estar afectada. As RNP apresentam diversos papéis na

estabilidade do mRNA desde a trancrição, processamento e export para o citoplasma77.

Considerando o facto de ter sido observado um aumento de mRNA mas não da proteína

correspondente, a regulação pós-transcricional de eNOS por RNPs poderá passar por um

importante papel destas proteínas no export do mRNA do núcleo para o citoplasma. Com

efeito, estudos anteriores referem que a metilação dos resíduos de arginina nas RNPs são

importantes para o seu export para o citoplasma, o que nos permite inferir que em casos de

hipometilação celular este poderá estar afectado77, 78

Alternativamente, a diminuição de eNOS observada pode estar a ser determinada

pela sua localização subcelular. Diversos estudos apontam para a presença da isoforma

endotelial de NOS na mitocôndria; no entanto, a importância desta localização subcelular de

eNOS ou o seu envolvimento na patologia vascular não se encontra esclarecida

.

79,80. Este

facto conduziu-nos à pesquisa de eNOS na fracção celular contida no pellet obtido durante a

extracção de proteína para realização do Western blot (5.7). Com efeito, tal como descrito

por Upadhyay et al. 81, a velocidade de 13000g utilizada é suficiente para depositar as

mitocôndrias. Assim, considerando que o tempo de sonicação pode não ter sido suficiente

para lisar as membranas mitocondriais e que estas podem ter-se depositado durante a

| 26

Discussão


centrifugação, foi realizado um Western blot a partir do pellet ressuspendido em tampão de

lise. Resultados preliminares apresentados em anexo (Anexo 1 – Figura 7A) sugerem

mesmo que possa existir um aumento de eNOS nesta fracção celular. No entanto, é

necessária uma optimização do protocolo para isolamento das mitocôndrias a fim de

confirmar uma possível translocação de eNOS para a mitocôndria em consequência da

acumulação de SAH. É de salientar que eNOS foi encontrada a nível mitocondrial em

associação com Cav-182, que, como descrito no ponto IV, se encontra significativamente

aumentada.

A figura 8 mostra que a acumulação de SAH intracelular não afectou a expressão de

PRMT1 ao nível da proteína. Com efeito, também neste caso devem ser tidas em

consideração possíveis alterações pós-transcrição/tradução de que PRMT1 pode ser alvo e

que podem justificar conservação dos níveis de proteína. No entanto, deve ser tido em conta

que o efeito a nível da transcrição se manifesta mais rapidamente que um efeito pós-

tradução e, deste modo, o tempo de incubação poderá não ter sido o suficiente para se

observarem variações ao nível da tradução.

II. PRMT1

Também em relação a DDAH2, a acumulação de SAH não provocou variação

significativa nos níveis de proteína. Contudo, esta proteína foi muito difícil de detectar,

possivelmente devido aos seus níveis de expressão reduzidos. Na realidade, durante a

reacção de PCR em tempo real foi possível observar uma amplificação mais tardia do cDNA

de DDAH2, pelo que, comparativamente aos restantes genes em estudo, este foi o gene

que apresentou o menor número de transcritos produzidos (dados não apresentados).

Assim, futuramente, pretendemos obter proteína mais concentrada e, tal como para PRMT,

tentar observar a sua variação após um tempo de incubação superior.

III. DDAH2

A proteína Cav-1 é a única cujo aumento de transcrição se correlaciona directamente

com o aumento da produção de proteína. Verificou-se um aumento significativo dos níveis

de Cav-1 dependente da acumulação de SAH, o que poderá contribuir de modo significativo

para a diminuição da produção de NO.

IV. CAV-1

7.7 O aumento da expressão de Cav-1 poderá ser responsável pela inibição da

actividade de eNOS. Esta inibição ocorre por ligação de Cav-1 ao local de ligação da

calmodulina e recrutamento de eNOS para a fracção membranar, impedindo a síntese de

NO. A interacção Cav-1/eNOS deverá ser confirmada por ensaios de imunoprecipitação.

INTERACÇÃO ENOS – CAV-1

| 27

Discussão


Em estudos anteriores observou-se também um aumento de complexos eNOS-Cav1

no citosol em condições de patologia cardiovascular, que revelaram igualmente uma

correlação negativa entre o aumento da quantidade de Cav-1 na fracção citosólica e a

actividade de eNOS83. Assim, o aumento da Cav-1 pode ser indicador de uma inibição da

actividade de eNOS não só ao nível caveolar; efectivamente esta proteína também é

encontrada a nível mitocondrial pelo que, caso se confirme a presença aumentada de eNOS

na mitocôndria, esta poderá estar associada ao recrutamento via Cav-184, 85

O aumento de Cav-1 poderá ainda contribuir para a diminuição de eNOS observada.

Estudos descrevem uma associação entre o aumento de Cav-1 e a indução da degradação

de iNOS pela via do proteossoma, o que poderá ser igualmente válido para a eNOS, na

medida em que se verificou uma correlação negativa entre a expressão de Cav-1 e eNOS

.

86

7.8

.

Os resultados obtidos permitem propor um mecanismo pelo qual a acumulação de

SAH conduzirá à diminuição da biodisponibilidade de NO. Assim, o estado de hipometilação,

promovido pela acumulação de SAH, provocou um aumento significativo nos processos de

transcrição dos quatro genes envolvidos na biodisponibilidade de NO.

EFEITO DA ACUMULAÇÃO DE SAH NA BIODISPONIBILIDADE DE NO

O aumento da transcrição de Cav-1 foi o único que se reflectiu num aumento da

proteína produzida. Mecanismos pós-transcricionais, induzidos pela acumulação de SAH,

que determinam a diminuição de eNOS, juntamente com o efeito inibitório de Cav-1,

poderão explicar a diminuição de NO produzido, condição de partida para a disfunção

endotelial.

Este estudo permitiu estabelecer, pela primeira vez, uma relação entre a Cav-1 e a

disfunção endotelial via acumulação de SAH. A proteína Cav-1 poderá assim apresentar um

papel importante na etiologia da doença vascular associada a HHcy.

A elucidação deste mecanismo poderá ter repercussão no desenvolvimento de novas

estratégias terapêuticas. A indução de um estado de hipometilação celular poderá ser

contrariada por fármacos capazes de induzir metilação. No entanto alterações a nível

epigenético podem determinar efeitos secundários adversos, pois a metilação celular está

também associada a outras patologias, como problemas oncológicos, particularmente no

silenciamento de genes supressores de tumor. Assim, admitindo que a disfunção endotelial

em casos de HHcy é promovida pela diminuição dos níveis de NO, em consequência de

uma inactivação de eNOS por Cav-1, poderá ser delineada uma estratégia no sentido de

promover a re-activação de eNOS. Existem estudos indicadores de que a dissociação de

eNOS da Cav-1 pode ser promovida com recurso ao chaperone molecular heat shock

protein 90 (Hsp90)87. Assim, Hsp90 poderá ser um ponto de partida para o desenvolvimento

de uma terapêutica que minimize os efeitos da HHcy na promoção da disfunção endotelial.

| 28

Conclusão Caracterização dos Efeitos Provocados pela Acumulação de S-Adenosil-homocisteína na expressão de genes


Em conclusão, este estudo permitiu demonstrar que a acumulação intracelular de

SAH conduz, em células endoteliais humanas, a uma diminuição da produção de NO,

considerado a mais potente molécula anti-trombótica endógena. A acumulação de SAH

altera a expressão de diferentes genes, possivelmente devido às alterações epigenéticas

resultantes da inibição da metilação celular que promove. Estudos futuros permitirão

determinar a ocorrência de alterações induzidas pela acumulação de SAH, particularmente

nas regiões promotoras de genes relevantes e em proteínas, cuja actividade pode também

ser condicionada pelo estado de metilação.

8. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS

Verificou-se que, em casos de HHcy, a acumulação de SAH / estado hipometilação

celular não contribui para que a ADMA seja responsável pela redução dos níveis de NO,

pois foi observada uma diminuição da sua produção em consequência da acumulação de

SAH. Paralelamente, foi possível observar que a acumulação intracelular de SAH,

provavelmente através da indução do estado de hipometilação celular, conduz a um

aumento generalizado da transcrição dos genes envolvidos na biodisponibilidade do NO. No

entanto, ao nível da tradução, apenas foram observadas alterações significativas nos níveis

de eNOS e de Cav1, nomeadamente, uma diminuição e aumento, respectivamente.

Propomos que a diminuição da produção de NO observada possa ser explicada por

mecanismos pós-transcrição que determinam uma diminuição de eNOS e pelo aumento da

expressão de Cav1. Como referido, a Cav-1 é uma proteína inibidora da síntese de NO,

sendo responsável pelo recrutamento de eNOS para a caveola, onde esta é funcionalmente

inactiva. Assim, a diminuição da produção endotelial de NO poderá reflectir a baixa

actividade de eNOS; no entanto, tal facto deverá ser confirmado com ensaios de actividade

enzimática.

O modelo proposto neste trabalho para justificar a diminuição dos teores de NO,

como resultado da acumulação intracelular do precursor da Hcy, a SAH, poderá assim

contribuir para a elucidação do binómio HHcy-doença vascular. Seria importante que estes

resultados fossem confirmados através de estudos em células endoteliais provenientes de

artérias de indivíduos hiperhomocisteinémicos para que posteriormente fosse possível o

desenvolvimento de uma estratégia terapêutico-preventiva que permita a redução da

incidência da principal causa de morte, a doença vascular.


| 29

Referências

9. REFERÊNCIAS

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A.1

Figura 1A – Promotor de NOS3 e identificação dos elementos de ligação dos principais factores de transcrição

ANEXO 1

FIGURAS E TABELAS

Figura 2A – Localização da ilha CpG no gene DDAH2.

A.2

Figura 3A – Cromatograma típico de tióis no meio extracelular após 24horas de incubação de HUVEC com meio controlo. O padrão interno utilizado (P.I.) foi cisteamina.

Figura 4A – Cromatograma típico de metilargininas no meio extracelular após 24horas de incubação de HUVEC com meio controlo. O padrão interno utilizado (P.I.) foi monometilarginina.

A.3

Figura 6A – Localização da região do promotor de NOS3 amplificada após tratamento com bissulfito e parte do cromatograma obtido após sequenciação. Na sequência apresentada (parte do cromatograma obtido para a concentração de ADA 20 µM), obtida após o tratamento com bissulfito (em baixo), todas as citosinas presentes na sequência original (em cima) foram convertidas em timina, incluindo dois dinucleotidos CpG (assinalados a preto) o que indica um estado não metilado.

Figura 7A – Efeito da incubação de HUVEC com ADA na expressão proteica. Western blot de eNOS na fracção subcelular obtida após centrifugação a 13000g.

Figura 5A – Expressão dos genes endógenos estudados (UBC, ATP5B e EIF4A2).

Ctrl ADA 5 ADA 10 ADA 20

A.4

Tabela 1A – Sequências dos primers utilizados na reacção de PCR em tempo real para amplificação do cDNA.

Gene Gene ID Primer Forward Primer Reverse NOS3 NM_000603.3 CGTCCCTGTGGAAAGACAAG CACGATGGTGACTTTGGCTA

PRMT1 NM_198319.2 CCAACGCCAAGAACAACC TCAGCGCATCCGGTAGTC DDAH2 NM_013974.1 GGCTTGAAGACGGGGACT TCGGATTTCTTAGTTTTCTTGTTTC CAV1 NM_001753.3 ACAGCCCAGGGAAACCTC GATGGGAACGGTGTAGAGATG ATP5B NM_001686.3 GGCGGTCCATCCTGTCAG GTGGTAGTCCCTCATCAAACT EIF4A2 NM_001967.3 GTGTGAACTGGACCCTGTTG TATTTAACATTCAAACTTCATTAAGACATG

UBC NM_021009.4 GTACCCTGTCTGACTACAACATC GTGATGGTCTTGCCAGTGAG

Tabela 2A – Anticorpos específicos utilizados para Western blot.

Proteína Anticorpo Primário Diluição eNOS Anti Human eNOS antibody [R&D Systems] 1:500

PRMT1 Mouse monoclonal [MAT-B12] to PRMT1 [Abcam] 1:500 DDAH2 Goat polyclonal to DDAH2 [Abcam] 1:500 CAV1 Caveolin 1 antibody [7C8] [Abcam] 1:1000 β-actina Goat polyclonal to beta actin [Abcam] 1:1000

Tabela 3A - Concentração de tHcy, ADMA e SDMA extracelulares (µmol/l), para as diferentes concentrações de ADA utilizadas (5, 10 e 20 µM), após 24 horas de incubação nas culturas de HUVEC.

Meio 0h (n=4) Ctrl (n=2) ADA 5 (n=2) ADA 10 (n=2) ADA 20 (n=2) tHcy (µM) 1,62 ± 0,03 2,21 ± 0,15 1,81 ± 0,11 1,61 ± 0,06 1,56 ± 0,13

ADMA (µM) 169,5 ± 23,4 420,3 ± 29,8 343,0 ± 18,1 294,3 ± 7,1 293 ± 0,2 SDMA (µM) 54,7 ± 3,0 76,7 ± 8,4 75,3 ± 2,6 66,2 ± 2,5 69,8 ± 0,4

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?maps=blast_set&db=allcontig_and_rna&na=1&gnl=ref%7CNM_000603.3%7C&gi=48762674&term=48762674%5Bgi%5D&taxid=9606&RID=AMT998A501N&QUERY_NUMBER=1&log$=nucltop�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?maps=blast_set&db=allcontig_and_rna&na=1&gnl=ref%7CNM_198319.2%7C&gi=150456456&term=150456456%5Bgi%5D&taxid=9606&RID=AMTH1Y7Z01N&QUERY_NUMBER=1&log$=nucltop�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?maps=blast_set&db=allcontig_and_rna&na=1&gnl=ref%7CNM_013974.1%7C&gi=7524353&term=7524353%5Bgi%5D&taxid=9606&RID=AMTKZ7J101N&QUERY_NUMBER=1&log$=nucltop�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?maps=blast_set&db=allcontig_and_rna&na=1&gnl=ref%7CNM_001753.3%7C&gi=15451855&term=15451855%5Bgi%5D&taxid=9606&RID=AMTNZ50301S&QUERY_NUMBER=1&log$=nucltop�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?maps=blast_set&db=allcontig_and_rna&na=1&gnl=ref%7CNM_001686.3%7C&gi=50345985&term=50345985%5Bgi%5D&taxid=9606&RID=AMTSX6WA01N&QUERY_NUMBER=1&log$=nucltop�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?maps=blast_set&db=allcontig_and_rna&na=1&gnl=ref%7CNM_001967.3%7C&gi=83700234&term=83700234%5Bgi%5D&taxid=9606&RID=AMTUJ1T301S&QUERY_NUMBER=1&log$=nucltop�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?maps=blast_set&db=allcontig_and_rna&na=1&gnl=ref%7CNM_021009.4%7C&gi=132626734&term=132626734%5Bgi%5D&taxid=9606&RID=AMTWDZBT01N&QUERY_NUMBER=1&log$=nucltop�

A.5

ANEXO 2

SOLUÇÕES E ESPECIFICAÇÕES DOS MÉTODOS

CONDIÇÕES DE CULTURA CELULAR – As células são cultivadas de acordo com

o protocolo referido, em suportes contendo de gelatina (Merck) para adesão das

células endoteliais. Posteriormente, para manutenção da cultura, é necessária a

renovação do meio de cultura dia sim, dia não. Nas várias passagens as células são

destacadas com auxílio de tripsina (Gibco) a 10% em HBSS (Gibco).

MEIO DE CULTURA: 78% de Meio 199 (Gibco), 10% soro humano (Sigma), 10%

soro fetal de bovino (Gibco), 1% de antibiótico-antimicótico (Sigma), 1% de Glutamina.

Suplementos: 1% factor de crescimento endotelial (Roche) e 0,5% de heparina

(Sigma).

CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS ENDOTELIAIS - As células foram cultivadas em

suportes de 10cm2 cobertos de gelatina (Merck) e incubadas durante 4horas em meio

de cultura suplementado com 200ug/ml de cDil-Ac-LDL (fluorescein isothiocyanate

(Dil)-labeled acetylated LDL [Biomedical Technologies Inc.]) e posteriormente

observadas ao microscópio de fluorescência (Axioskop Zeiss).

TESTE DE CITOTOXICIDADE: A citotoxicidade de ADA for avaliada pela

libertação de LDH. Este teste avalia o estado de integridade da membrana

citoplasmática, baseando-se na redução de NAD+ a NADH, no meio extracelular, pela

enzima LDH. Esta é uma enzima citosólica e cuja acção no meio extracelular se

associa a uma inexistência de integridade membranar e consequentemente à morte

celular. O kit utilizado fornece uma mistura reaccional que permite ainda a formação

de um composto corado dependente da formação de NADH e H+ e cuja densidade

óptica foi determinada a 490nm (Leitor de Microplacas Asys – Expert Plus).

DETERMINAÇÃO DE HCY TOTAL

- As amostras sofrem inicialmente um processo

de redução dos compostos tióis com tri-n-butylphosphine (Sigma), seguido de

desproteinização. Posteriormente, são derivadas com um reagente fluorogénico

específico de tióis, ammonium 7-fluorobenzo-2-oxa-1,3-diazole-4-sulphonate (Sigma),

e os produtos de derivação são então separados por RP-HPLC (cromatograma –

Figura 3A) e detectados por fluorimetria possibilitando a quantificação de Hcy.

A.6

DETERMINAÇÃO DE ADMA E SDMA - Os resíduos de arginina dimetilados,

ADMA e SDMA, foram inicialmente extraídos por troca catiónica em fase sólida

(Waters Oasis MCX 1cc cartridges) e posteriormente convertidos em compostos

estáveis fluorescentes com o-phthalaldehyde (MERCK) e ácido 3-mercaptopropiónico

(MERCK), como descrito anteriormente. Posteriormente procedeu-se à separação, por

RP-HPLC, e detecção, por fluorimetria, de ADMA e SDMA (cromatograma – Figura

4A).

SOLUÇÃO DE LISE: 10 mM HEPES (SIGMA); 1,5 mM MgCl2 (MERCK); 10mM

KCl (MERCK); 1 mM DTT (BioRad); 1mM PMSF (Sigma); 0,1% de Triton-X 100

(Sigma).

REACÇÃO DE TRANSCRIÇÃO REVERSA - A síntese de cDNA foi realizada para

um volume total de 50 µL. 1,5 µg do RNA total isolado foi inicialmente incubado com

750ng de random primers (Invitrogen) e 2,5 nmol de dNTPs a 65ºC durante 5 minutos

para a hibridação. Seguidamente procedeu-se à reacção de transcrição reversa com

incubação de 200 unidades de enzima transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen)

em tampão apropriado e 40 unidades de RNaseOUT. A reacção ocorreu a 42ºC

durante 50 minutos tendo sido terminada por incubação a 70ºC durante 15 minutos. As

incubações foram efectuadas no termociclador Swift Maxi Thermal Cycler (ESCO).

ESPECIFICAÇÕES DA TÉCNICA DE WESTERN BLOT

Desnaturação dos lisados celulares – Os lisados foram desnaturados em

tampão redutor (315,8mM Tris-HCl pH 6,8 com 10,5% SDS; 1,5% de Azul de

Bromofenol; 52,5% de Glicerol) ao qual se adicionou previamente 25% de

β-mercaptoetanol.

caracterizaÇÃo dos efeitos provocados pela acumulaÇÃo de...

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