características microbiológicas e tipificação molecular de...
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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Características Microbiológicas e Tipificação Molecular
de uma Cepa de Providencia stuartii Relacionada a Surto
de Infecção Hospitalar
Ana Carolina Mesquita Rocha
2007
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Características Microbiológicas e Tipificação Molecular
de uma Cepa de Providencia stuartii Relacionada a Surto
de Infecção Hospitalar
Ana Carolina Mesquita Rocha
Dissertação de mestrado apresentada ao Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências (Microbiologia).
Orientadora: Prof. Beatriz Meurer Moreira
Rio de Janeiro
Abril/2007
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Rocha, Ana Carolina Mesquita Características Microbiológicas e Tipagem Molecular de uma Cepa de Providencia stuartii Relacionada a Surto de Infecção Hospitalar. Rio de Janeiro : UFRJ/IMPPG, 2007. 74p Orientador: Beatriz Meurer Moreira
Tese (Mestrado) – UFRJ/Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, 2006. Referências bibliográficas: f.62-74 1. Providencia stuartii 2. ESBL 3. RAPD-PCR 4. CTX-M – I. Moreira, Beatriz
Meurer (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes. III. Título
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A Deus pela oportunidade de viver um dia após o outro. Aos meus pais, Paulo Afonso e Rosa Maria pelos exemplos de perseverança e caráter. Ao meu querido companheiro Helvécio, meu grande incentivador, pela compreensão e estímulo constantes.
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Agradecimentos Às minhas amigas e irmãs Junia e Rosa Paula pela cumplicidade. À Prof. Beatriz Meurer Moreira pela orientação, oportunidade e liberdade de pensamento. A toda a equipe do Laboratório de Epidemiologia Molecular de Infecções Bacterianas e do Laboratório de Patogênese e Resistência de Cocos Gram Positivos pelo compartilhamento de idéias. À Adriana Marcos Vivoni, Adriana Lúcia Pires Ferreira, Luísa Barbosa Gomes dos Santos e Maria Silvana Alves pela amizade. À Semiramis e Sr. Luiz pelo apoio técnico. À Capes – Coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pela concessão de bolsa; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao Ministério da Ciência e Tecnologia (MCT/PRONEX) pelo apoio financeiro. Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes (IMPPG) na pessoa de sua diretora Prof. Agnes Marie Sá Figueiredo; À coordenação do curso de Pós-Graduação do IMPPG, na pessoa de sua coordenadora Prof. Thaís Cristina Soares Souto Padrón À Prof. Ângela Christina Dias de Castro, chefe do Departamento de Microbiologia Médica do IMPPG
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Trabalho realizado no Departamento de Microbiologia Médica do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da prof. Beatriz Meurer Moreira.
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Resumo Características Microbiológicas e Tipagem Molecular de uma Cepa de Providencia
stuartii Relacionada a Surto de Infecção Hospitalar
Ana Carolina Mesquita Rocha
Orientador: Prof. Beatriz Meurer Moreira
Resumo da dissertação de mestrado submetido ao Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de mestre em ciências (Microbiologia)
P. stuartii é um patógeno emergente em infecções nosocomiais. A disseminação de cepas resistentes aos antimicrobianos pode representar um grave problema terapêutico. No presente estudo, foram avaliados aspectos microbiológicos e moleculares de amostras de P. stuartii coletadas de pacientes internados em um hospital privado da cidade de Niterói-RJ, no período de janeiro de 2004 a dezembro de 2005. Durante o estudo, 69 amostras foram obtidas de pacientes internados e uma amostra procedente da superfície de uma sonda utilizada para a realização de ecocardiografia transesofágica. Das 69 amostras iniciais, apenas 63 foram incluídas no estudo pois as 6 amostras restantes não tiveram sua identificação fenotípica confirmada como P. stuartii. As amostras de origem clínica foram isoladas a partir de lavado broncoalveolar (30%), escara de decúbito (27,5%), secreção traqueal (17,5%), ponta de cateter (15%), urina (7,5%) e sangue (2,5%). Todas estas amostras foram inicialmente identificadas como P. stuartii no laboratório de origem pelo sistema automatizado Microscan®. Os objetivos do presente estudo são: 1) confirmar a identificação fenotípica das amostras bacterianas em espécie utilizando métodos convencionais; 2) avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos pelo método de disco difusão de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute e a produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL) pelo método de disco-aproximação; 3) analisar a composição clonal das amostras através da tipagem molecular utilizando as técnicas de RAPD com o iniciador 272 e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE); e, 4) determinar a presença de gene para codificação de ESBL do tipo CTX-M. Todas as 63 amostras avaliadas revelaram a produção de ESBL. As técnicas de RAPD e PFGE permitiram a determinação de um grupo clonal principal e a presença de gene codificador de ESBL do tipo CTX-M foi encontrado em todas as 36 amostras avaliadas. No presente estudo, foram apresentadas evidências de que um único grupo clonal de P. stuartii produtora de ESBL foi responsável por todas as infecções por esta espécie em um hospital. Amostra desse mesmo grupo clonal foi detectada como contaminante em sonda de ecocardiografia transesofágica. Palavras-chave: Providencia stuartii, ESBL, RAPD-PCR, CTX-M.
Rio de Janeiro Abril/2007
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Abstract
Microbiological and Molecular Characteristics of a Providencia stuartii Strain Related to an Outbreak of Hospital Infections
Ana Carolina Mesquita Rocha
Orientador: Prof. Beatriz Meurer Moreira
Abstract da dissertação de mestrado submetido ao Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de mestre em ciências (Microbiologia)
P. stuartii is an emerging nosocomial pathogen. The widespread dissemination of antimicrobial resistant strains can pose a severe therapeutic challenge. In the present study, microbiological and molecular aspects of P. stuartii strains were evaluated. The isolates were obtained from inpatients of a private hospital in Niterói city, Rio de Janeiro, Brazil, from January 2004 to December 2005. During the study, 68 isolates were obtained from inpatients and one isolate was obtained from the surface of a transesophageal echocardiography probe. From these 69 initial samples only 63 were included in the study. The six other were not confirmed as P. stuartii. The clinical isolates were obtained from the following clinical specimens: brochoalveolar lavage (30%), pressure sores (27,5%), tracheal secretions (17,5%), catheter tips (15%), urine (7,5%) and blood (2,5%). All the isolates were initially identified as P. stuartii in the original laboratory by the automated system Microscan. The objectives of the present study were: 1. Confirm the phenotipical samples identification of the isolates using conventional methods; 2. Evaluate the antimicrobial susceptibility using the disc-diffusion method as proposed by the Clinical and Laboratorial Standards Institute; 3. Analyze the clonal composition of the isolates using RAPD-PCR with 272 primer and pulsed field electrophoresis gel (PFGE) techniques; and, 4. Determine the presence of CTX-M type ESBL gene. All the 63 isolates showed ESBL production. RAPD-PCR and PFGE typing revealed the presence of a major clone. The CTX-M type ESBL gene was found in all 36 isolates evaluated. In the present study, we showed that a unique ESBL producing P. stuartii clonal group was responsible for 95% of all infections caused from this specie in one hospital during 24 months. A sample of the same clonal group was found on the surface of a transesophageal echocardiography probe.
Key words: Providencia stuartii, ESBL, RAPD-PCR, CTX-M.
Rio de Janeiro April/2007
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Índice página
1. Intodução
1.1. Histórico do gênero Providencia..............................................................................01
1.2. Aspectos gerais de Providencia stuartii...................................................................05
1.3. Resistência antimicrobiana.......................................................................................08
1.4. Produção de β-lactamases e resistência aos β-lactâmicos........................................10
1.5. Tipificação de cepas.................................................................................................14
1.6. Emergência de P. stuartii produtora de ESBL em um hospital do Rio de Janeiro..17
2. Objetivos.....................................................................................................................24
3. Material e métodos
3.1. Amostras bacterianas................................................................................................25
3.2. Caracterização fenotípica das amostras....................................................................26
3.2.1. Identificação fenotípica do gênero........................................................................26
3.2.1.1. Teste da desaminação oxidativa da fenilalanina.................................................26
3.2.1.2. Teste da produção de ácido sulfídrico (H2S) e da produção de indol em meio
SIM..................................................................................................................................27
3.2.1.3. Teste da descarboxilação da ornitina..................................................................28
3.2.1.4. Teste para detecção da atividade β-galactosidase (ONPG)................................28
3.2.1.5. Teste de susceptibilidade à polimixina B...........................................................29
3.2.2. Identificação fenotípica da espécie .......................................................................30
3.2.2.1. Teste para utilização do adonitol, ramnose e trealose........................................31
3.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos ........................................................31
3.4. Teste para a verificação da produção de ESBL: método de dupla difusão em
ágar..................................................................................................................................32
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3.5. Tipificação molecular das cepas...............................................................................33
3.5.1. ERIC-PCR.............................................................................................................33
3.5.1.1. Extração do DNA bacteriano..............................................................................33
3.5.1.2 Amplificação do DNA.........................................................................................34
3.5.1.3 Eletroforese em gel de agarose............................................................................34
3.5.1.4 Interpretação dos resultados................................................................................35
3.5.2. Análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após
tratamento com enzima de restrição e separação por eletroforese em gel de campo
pulsado
(PFGE).............................................................................................................................35
3.5.2.1. Interpretação dos resultados...............................................................................37
3.6. PCR para a pesquisa de genes codificadores de β-lactamase do tipo CTX-
M......................................................................................................................................37
3.6.1.Extração do DNA bacteriano..................................................................................37
3.6.2.Amplificação do DNA............................................................................................38
3.6.3. Eletroforese em gel de agarose..............................................................................38
3.6.4. Interpretação dos resultados.................................................................................39
4. Resultados
4.1. Amostras bacterianas................................................................................................40
4.2. Caracterização fenotípica das amostras....................................................................40
4.2.1. Identificação fenotípica do gênero........................................................................41
4.2.2. Identificação fenotípica da espécie........................................................................42
4.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos.........................................................42
4.4. Teste para a verificação da produção de ESBL: método de dupla difusão em
10
ágar..................................................................................................................................42
4.5. Tipificação molecular das amostras.........................................................................43
4.5.1 RAPD-PCR............................................................................................................43
4.5.2. Análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após tratamento com
enzima de restrição e separação através de eletroforese em gel de campo pulsado
(PFGE).............................................................................................................................44
4.6. PCR para a pesquisa de genes codificadores de β-lactamase do tipo CTX-M.........45
5. Discussão.....................................................................................................................54
6. Conclusões..................................................................................................................60
7. Referências bibliográficas.........................................................................................61
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Lista de siglas e abreviaturas ATS: Ágar tripticaseína soja ATCC: American Type Culture Collection
°C: graus Celsius
CCIH: Comissão de controle de infecção hospitalar
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA: ácido desoxirribonucléico
dNTP: desoxinucleotídeo 5’-trifosfato
ECGTE: eletrocardiografia transesofágica
ESBL: β-lactamase de espectro estendido
g: grama
HUCFF: Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
IMPPG: Intituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes
Kb: Kilobases
LDG: Leite desnatado + glicerol
LEMIB: Laboratório de Epidemiologia Molecular de Infecções Bacterianas
mm: milímetro
mL: mililitro
μg: micrograma
μL: microlitro
μM: micromolar
ONPG: o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo
pb: pares de bases
PBS: Tampão salina fosfato (phosphate buffer saline)
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PCR: reação da polimerase em cadeia
PFGE: eletroforese em gel de campo pulsado
pH: potencial hidrogeniônico
PsESBL: Providencia stuartii produtora de ESBL
RAPD: polimorfismo de DNA amplificado de forma aleatória (Random Amplified
Polymorfic DNA)
RVM: revascularização do miocárdio
SIM: ágar sulfeto-indol-motilidade
Taq: Thermus aquaticus
TSI: ágar tríplice açúcar-ferro
UCO: Unidade coronariana
UPGMA: unweighted pair group method using arithmetic averages
UTI: Unidade de tratamento intensivo
UTI-B: Unidade de tratamento intensivo-B
UV: ultravioleta
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Lista de ilustrações página Tabela 1. Histórico do gênero Providencia.....................................................................21
Tabela 2. Capacidade de fermentação de carboidratos na diferenciação das espécies do
gênero Providencia..........................................................................................................23
Tabela 3. Classificação de β-lactames de bactérias Gram negativas...............................23
Tabela 4. Percentuais de susceptibilidade de 63 amostras de P. stuartii a doze
antimicrobianos...............................................................................................................46
Figura 1. Percentuais dos diferentes espécimes clínicos das 62 amostras clínicas de P.
stuartii incluídas no estudo..............................................................................................47
Figura 2. Distribuição do número de pacientes com isolamento de P. stuartii produtora
de ESBL ao longo do período de estudo.........................................................................47
Figura 3. Teste fenotípico positivo para a produção de ESBL com distância de 30 mm
centro a centro dos discos de antimicrobianos para a amostra 4A de P. stuartii.............48
Figura 4. Teste fenotípico positivo para a produção de ESBL com distância de 28 mm
centro a centro dos discos de antimicrobianos para a amostra 16A de P. stuartii...........49
Figura 5. Dendrograma realizado a partir dos perfis de bandas obtidos pela técnica de
RAPD-PCR para as 63 amostras de P. stuartii...............................................................50
Figura 6. Análise da composição clonal de cinco diferentes colônias de uma amostra
clínica de P. stuartii (14A)..............................................................................................52
Figura 7. Distribuição temporal dos diferentes genótipos de P. stuartii ........................52
Figura 8. Dendrograma realizado a partir dos perfis de bandas obtidos pela técnica de
PFGE para 16 amostras de P. stuartii .............................................................................53
Figura 9. PCR para a verificação da presença de genes codificadores de ESBLs dos
tipos CTX-M2, CTX-M8 e CTX-M16 em amostras de P. stuartii.................................53
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1. Introdução
1.1 Histórico do gênero Providencia
A taxonomia do gênero Providencia tem sido caracterizada por uma grande
instabilidade. Atualmente, este gênero consiste de cinco espécies: Providencia
alcalifaciens, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia rustigianii e
Providencia heimbachae (Pignato et al, 1999). O gênero Providencia está incluído na
família Enterobacteriaceae e apresenta semelhanças fenotípicas com os gêneros Proteus
e Morganella, também incluídos nessa família. Apesar de tais semelhanças, os três
gêneros, Proteus, Providencia e Morganella não apresentam um grupamento
taxonômico específico. Alguns autores, como Winn e colaboradores (2006), agrupam
de maneira didática estes três gêneros em uma única tribo, Proteeae, a fim de facilitar o
entendimento das características destes microrganismos.
Recentemente, O’Hara, Brenner & Miller (2000) revisaram a taxonomia da tribo
Proteeae. Segundo estes estudiosos, o primeiro relato de um microrganismo relacionado
ao gênero Providencia foi realizado em 1904 por Rettger e colaboradores (Apud
O’Hara, Brenner & Miller 2000), que isolaram um novo agente durante uma epidemia
de cólera em galinhas, para o qual nenhuma nomenclatura foi proposta. Quatorze anos
mais tarde, Hadley e colaboradores (Apud O’Hara, Brenner & Miller 2000) estudaram
estes microrganismos detalhadamente e o denominaram Bacterium rettgeri. Ao longo
dos anos, vários estudos foram sendo realizados sobre microrganismos relacionados ao
gênero Providencia. Um breve histórico da classificação deste gênero conforme
apresentado na revisão de O’Hara, Brenner & Miller (2000) está descrito a seguir e
pode ser encontrado na tabela 1.
15
Em 1920, um grupo de amostras provenientes de intestino humano foi estudado
por Ornstein (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) que as caracterizou como Bacillus
inconstans. Essas amostras seriam posteriormente denominadas como a primeira
descrição de microrganismos do gênero Providencia. Rustigian & Stuart, em 1941,
(Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) designaram como Paracoli anaerogênico
33111 um microrganismo que acabavam de isolar e que apresentava como principal
característica a rápida hidrólise da uréia. Um ano depois, Cope & Kilander (Apud
O’Hara, Brenner & Miller, 2000) publicaram um estudo que incluía 83 microrganismos
atípicos semelhantes bioquimicamente à Shigella paradysenteriae, mas que se
diferenciavam antigenicamente de todas as espécies de Shigella até então conhecidas.
Em 1943, Stuart e Cope (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) concluíram que as
amostras inicialmente identificadas como Paracoli anaerogênico 33111 e Shigella
paradysenteriae se referiam a um mesmo microrganismo. Os autores propuseram que
estes microrganismos fossem incluídos no gênero Proteus, já que eram positivos para os
testes da produção de indol e da hidrólise da uréia. Posteriormente, Stuart e
colaboradores (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) redescreveram estes
microrganismos como Proteus rettgeri. A inclusão de Proteus rettgeri no gênero
Proteus aconteceu mesmo sendo esta nova espécie positiva para a fermentação do D-
adonitol, o que não acontecia para as outras espécies até então existentes neste gênero.
Ainda em 1943, Stuart e colaboradores (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000)
identificaram um novo grupo de microrganismos similar ao Paracoli anaerogênico
33111 descrito em 1941, classificando-o como Paracoli anaerogênico tipo 29911, mas
apesar da similaridade, estes autores não classificaram estes microrganismos como
pertencentes ao gênero Proteus por não responderem a reações com anti-soro específico
16
para este gênero. Em 1944, Gomes (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) descreveu o
microrganismo Eberthella alcalifaciens, que mais tarde se tornaria a amostra tipo do
gênero Providencia.
Em 1951, Kauffmann (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000), estudando os
microrganismos anaerogênicos 29911 de Stuart, os classificou como um novo grupo,
denominado de “grupo Providencia”, que recebeu esta designação devido à cidade de
Providencia onde ele realizou seus estudos. O “grupo Providencia” foi criado para
incluir aqueles microrganismos, que diferentemente daqueles pertencentes ao gênero
Proteus, não eram capazes de decompor a uréia.
Em 1954, Singer e Bar-Chay (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) sugeriram
que o “grupo Providencia” de Stuart fosse incluído no gênero Proteus como Proteus
stuartii, mesmo apresentando teste negativo para a decomposição da uréia. Essa
proposta foi feita devido à similaridade bioquímica entre os microrganismos
anaerogênicos 29911 de Stuart e Proteus rettgeri. Paralelamente, em 1954, Ewing e
colaboradores (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) subdividiram o “grupo
Providencia” em dois subgrupos (A e B) bioquimicamente distintos. Também foi
proposto que o “grupo Providencia” se tratava de um conjunto intemediário de
microrganismos entre as espécies de Proteus morganii e Proteus rettgeri. A única
diferença seria o fato do “grupo Providencia” não realizar a hidrólise da uréia. Porém,
durante 1955, Shaw e Clarke, (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000), utilizando testes
bioquímicos adicionais, reforçaram a correlação entre o “grupo Providencia” e os
microrganismos pertencentes ao gênero Proteus, e sugeriram que o “grupo Providencia”
fosse novamente incluído neste gênero. Eles também afirmaram que a primeira
descrição de um microrganismo relacionado ao “grupo Providencia” foi aquela feita por
17
Ornstein em 1920 (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) onde foram descritos
Bacillus inconstans. Shaw e Clarke (Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000), então,
definiram como a amostra tipo do “grupo Providencia” os microrganismos designados
como Proteus inconstans . Contudo, na mesma revista dessa publicação, Proom (1955)
(Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) inovou e propôs a criação de um novo gênero,
Providencia, para incluir amostras do “grupo Providencia” e de Proteus rettgeri.
Entretanto, o novo gênero Providencia só foi aceito quando Ewing, em 1958 e 1962,
(Apud O’Hara, Brenner & Miller, 2000) revisou a taxonomia da tribo Proteeae e
concluiu que realmente o “grupo Providencia” não poderia ser incorporado ao gênero
Proteus. Apesar da criação deste novo gênero, as amostras de Proteus rettgeri
continuaram sendo incluídas no gênero Proteus e denominadas desta mesma maneira.
Em 1962, uma amostra original de Eberthela alcalifaciens caracterizada por Gomes em
1944 foi estudada por Ewing. Ele demonstrou uma grande similaridade entre essas
amostras e aquelas classificadas no novo gênero Providencia. Como essas amostras se
apresentavam como sendo o primeiro relato de isolamento de microrganismos do
gênero Providencia elas foram classificadas como amostras tipo de Providencia
alcalifaciens. Assim, o antigo subgrupo A de “Providencia” ficou conhecido como
Providencia alcalifaciens e o antigo subgrupo B como Providencia stuartii. Em 1972,
Ewing, Davis e Sikes, subdividiram essas duas espécies em biogrupos, quatro para P.
alcalifaciens e dois para P. stuartii de acordo com algumas características fenotípicas
particulares. A definição deste novo gênero e a identificação dessas novas espécies
permitiu que a taxonomia de outros microrganismos previamente classificados fosse
revisada. Em 1977, por exemplo, Farmer e colaboradores propuseram que o biogrupo 5
de Proteus rettgerii, descrito por Penner e colaboradores (1977), fosse reclassificado
18
como Providencia stuartii urease positiva. Finalmente, num estudo baseado na
hibridização de DNA, publicado por Brenner e colaboradores em 1978, Proteus rettgeri
foi definitivamente classificado como Providencia rettgeri, e o seu biogrupo 5
confirmado como Providencia stuartii. Esta mesma técnica permitiu, em 1983, a
reclassificação do biogrupo 3 de Providencia alcalifaciens em Providencia rustigianii.
Essas quatro espécies de Providencia descritas até então poderiam ser diferenciadas de
acordo com sua habilidade em hidrolisar a uréia e produzir ácido a partir da utilização
de i-inositol, adonitol, D-arabitol, trealose e D-galactose.
Mais tarde, ainda em 1983, Müller propôs uma nova espécie pertencente ao
gênero Providencia, P. friedericiana. Três anos depois, constataram que P.
friedericiana era idêntica a P. rustigianii, cujo nome permanece até hoje. Em 1986,
Muller e colaboradores propuseram novamente uma nova espécie, Providencia
heimbachae, obtida de fezes de pingüins. Esta sim, se tratava de uma nova espécie, que
ficou assim denominada em homenagem a Friederike Heimbach, que caracterizou as
doze amostras originais. Desta maneira, o gênero Providencia ficou definido e suas
espécies caracterizadas.
1.2 Aspectos gerais de Providencia stuartii
As amostras pertencentes à espécie P. stuartii apresentam-se como bastonetes
Gram-negativos e anaeróbios facultativos, que normalmente revelam motilidade a 20-
25°C devido à presença de flagelo peritríqueo. A expressão do flagelo em amostras de
P. stuartii, bem como nas outras espécies do gênero, pode ser inibida quando salicilato
de sódio estiver presente no meio de cultura (Kunin, Hua Hua & Bakaletz, 1995). Este
composto tem a capacidade de impedir a formação da flagelina, principal proteína
19
envolvida na composição do flagelo. Além disso, a motilidade destes microrganismos é
menos evidente a 37°C. Amostras de P. stuartii podem ser facilmente reconhecidas pela
formação de colônias amarelas ou alaranjadas em ágar citrato desoxicolato, devido à
precipitação do hidróxido férrico presente neste meio, que ocorre em conseqüência do
pH alcalino gerado durante seu crescimento (Senior, 2005)
Assim como toda a tribo Proteeae, P. stuartii possui a enzima
responsável pela desaminação oxidativa da fenilalanina, e a enzima triptofanase que
atua no metabolismo do triptofano produzindo indol. A capacidade de desaminação de
aminas aromáticas faz com que esta espécie esteja envolvida no desencadeamento da
síndrome da bolsa urinária púrpura em pacientes cateterizados. (Dealler, Hawkey &
Millar, 1988). Esta síndrome é uma condição incomum onde a bolsa de coleta urinária
em pacientes cateterizados torna-se púrpura devido a presença de microrganismos
capazes de produzir os corantes índigo e indirrubina à partir do polietileno que compõe
o coletor.
Diferentemente dos outros membros da tribo, P. stuartii não requer a presença
de niacina ou ácido pantotênico no meio de cultivo para o seu crescimento. P. stuartii
não fermenta a lactose, pois não apresenta as enzimas permease e β-galactosidase,
necessárias para essa via metabólica. Este microrganismo se apresenta apto para a
utilização do citrato de sódio como fonte exclusiva de carbono. Outras características de
P. stuartii são: capacidade de crescimento na presença de cianeto de potássio, produção
de ácido, mas não de gás, na fermentação da glicose, e fermentação de i-inositol e
trealose. Os testes para a fermentação destes açúcares são utilizados para a
diferenciação entre as espécies existentes no gênero (Dealler, Hawkey & Millar, 1988),
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conforme apresentado na tabela 2. Amostras de P. stuartii não são capazes de
descarboxilar a ornitina ou a lisina (Senior, 2005).
P. stuartii pode ser isolada a partir de espécimes obtidos de garganta,
períneo, axila, fezes, sangue, feridas e principalmente de urina de seres humanos.
Apesar de ser um raro uropatógeno de infecções adquiridas na comunidade, tem
participação importante nas infecções do trato urinário adquiridas no ambiente
hospitalar. (Akbas et al, 1998).
Em um estudo realizado por Akbas e colaboradores em 1998, 428 amostras de
urina de pacientes cateterizados foram avaliadas. Foi relatado que espécies de
Providencia foram o quinto agente em frequência causador de infecções urinárias.
Dentre estas infecções, 80% eram causadas por P. stuartii e apenas 20% por P. rettgeri.
A cateterização prolongada de pacientes promove um aumento na incidência de
infecções do trato urinário cujo prognóstico pode evoluir para bacteremia e morte. A
uropatogenicidade de P. stuartii, pode ser comprovada pelo fato delas apresentarem
fímbrias que se ligam fortemente às células uroepiteliais e ao cateter e por normalmente
se apresentarem resistentes à maioria dos antimicrobianos utilizados na terapêutica
clínica (Warren, 1986).
Outra particularidade das amostras de P. stuartii é sua difícil identificação,
principalmente quando são utilizados “kits” comerciais. Essa dificuldade se dá porque
genes para a fermentação da sacarose ou da lactose, ou ainda genes para a hidrólise da
uréia estão frequentemente localizados em plasmídeos que podem ser perdidos (Senior,
2005). Por exemplo, em 1988, Cornaglia e colaboradores avaliaram a habilidade de
diferentes sistemas de identificação utilizados na Europa em identificar corretamente
espécies de Providencia. Neste estudo, os autores investigaram 145 amostras,
21
comparando a classificação obtida através da utilização de dois sistemas miniaturizados
e três sistemas automatizados com aquela obtida através de testes bioquímicos
convencionais. Quatro dos cinco sistemas avaliados falharam na correta identificação de
P. stuartii em 10,0 a 16,3% das amostras.
A eficácia do sistema automatizado Microscan® foi avaliada por O’Hara e
Miller (2000). Os autores estudaram 475 amostras de bactérias pertencentes à família
Enterobacteriaceae, incluindo 14 amostras de P. stuartii. Duas (14%) dentre as
amostras de P. stuartii não puderam ser identificadas corretamente sem o auxílio de
testes bioquímicos adicionais.
O gênero Providencia contêm antígenos O termoestáveis e antígenos H
termolábeis, comuns às enterobactérias. Em 1979, Penner e colaboradores definiram o
antígeno O 17 como o típico de P. stuartii. Não é de nosso conhecimento a publicação
de outros estudos que descrevam a composição antigênica deste microrganismo.
1.3 Resistência antimicrobiana
A emergência de multirresistência dentre os microrganismos Gram-negativos
patógenos humanos tem se mostrado como um grave problema mundial (Goldmann &
Huskins, 1997). O surgimento da resistência aos antimicrobianos, detectada logo após a
introdução desses agentes na terapêutica clínica, está não somente relacionado a fatores
intrínsecos aos microrganismos, mas também à pressão seletiva exercida pelo uso
intenso e indiscriminado destes agentes (Friedrich, White & Bosso, 1999).
A intensa utilização dos antimicrobianos que é verificada atualmente pode ser
explicada por vários fatores. Dentre eles está o emprego empírico de drogas de amplo
espectro de ação para o tratamento de um número cada vez mais elevado de pacientes
22
gravemente doentes e imunocomprometidos admitidos nos hospitais. Como esses
pacientes são susceptíveis a infecções por uma variedade de patógenos, desenvolveu-se
o hábito da prescrição de antimicrobianos de amplo espectro de ação para o tratamento
empírico de infecções presuntivas (Friedrich, White & Bosso, 1999).
A resistência bacteriana pode ser classificada em dois tipos. Num primeiro grupo
estão incluídos os microrganismos que são originalmente susceptíveis aos
antimicrobianos, mas que após prolongada exposição a eles se tornam resistentes pela
presença de mutação cromossômica ou pela aquisição de plasmídeos ou transposons que
carreiam marcadores de resistência. Num segundo grupo estão incluídos os
microrganismos que apresentam resistência intrínseca a uma variedade de agentes
antimicrobianos (Nikaido, 1994).
Amostras de P. stuartii são intrinsecamente resistentes à ampicilina,
amoxicilina, amoxicilina + ácido clavulânico e cefalosporinas de primeira geração
devido a produção de β-lactamase do tipo AmpC, conforme será discutido no item 1.4.
Estes microrganismos também são intrinsecamente resistentes aos aminoglicosídeos,
com exceção da amicacina, e resistentes à nitrofurantoína, polimixina B e colistina
(Rossi & Andreazzi, 2005).
A resistência natural aos aminoglicosídeos como a gentamicina é conseqüência
da presença de um gene cromossômico que codifica a enzima 2’-N-acetiltransferase
capaz de modificar alguns membros dessa classe de antibióticos. A amicacina não é
afetada por esta enzima e a maioria das cepas se mostra sensível a esta droga (Rather et
al, 1993; Paradise et al, 1998). A resistência à nitrofurantoína é devido à redução ou à
deficiência da atividade da enzima nitrofurantoína redutase-1. Esta enzima é
responsável pela redução dos grupamentos nitritos presentes nas aminas ou seus
23
derivados. As aminas reduzidas interagem com o DNA bacteriano causando a morte
celular (Lorian, 1991). Já as resistências à polimixina B e à colistina não estão bem
esclarecidas, mas sabe-se que estão relacionadas com o conteúdo fosfolipídico da
membrana plasmática destes microrganismos (Lorian, 1991). A resistência encontrada a
outros antimicrobianos ocorre principalmente pela transferência de genes de resistência
através de elementos genéticos móveis, tais como plasmídeos, transposons e integrons.
1.4. Produção de β-lactamases e resistência aos β-lactâmicos
A presença de enzimas capazes de hidrolisar os antibióticos pertencentes à classe
dos β-lactâmicos tem contribuído para o aumento da resistência entre as amostras
bacterianas. Desde o início dos anos 60 quando foram inicialmente descritas, as
amostras de enterobactérias produtoras de β-lactamases têm aumentado em frequência e
se disseminado por todo o mundo, principalmente dentro do ambiente hospitalar
(Medeiros, 1984). Isso fez com que o controle da resistência aos antimicrobianos se
tornasse uma prioridade nos centros de saúde e hospitais. Como parte desse esforço,
vários programas têm sido organizados, tanto em nível nacional como mundiais, para
acompanhar os níveis de resistência aos antimicrobianos.
A primeira β-lactamase foi descrita antes do início do uso terapêutico das
penicilinas, em 1940 (Abraham & Chain,1940, republicado em 1988; Bradford, 2001).
Porém, somente entre os anos 60 e 70, quando penicilinas semi-sintéticas de amplo
espectro de ação e as cefalosporinas de primeira geração começaram a ser usadas na
terapêutica clínica, principalmente contra as bactérias Gram-negativas, que a produção
destas enzimas e suas conseqüências se tornaram mais evidentes (Medeiros, 1997). Foi
neste momento que a disseminação de microrganismos produtores de β-lactamases
24
emergiu como um problema na prática médica. A disseminação das β-lactamases foi
possível porque os genes codificadores para esta enzima podem estar presentes em
plasmídeos e transposons. Nas bactérias Gram-negativas, as β-lactamases mais
comumente encontradas são aquelas classificadas como do tipo TEM e tipo SHV,
isoladas inicialmente a partir de amostras de Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae,
respectivamente (Medeiros, 1984). O esquema de classificação das β-lactamases
correlaciona propriedades bioquímicas, a estrutura molecular e a seqüência de
nucleotídeos dos genes codificadores destas enzimas (Ambler 1980; Bush, Jacoby &
Medeiros,1995; Jacoby & Munoz-Price 2005). Na tabela 3 estão apresentadas algumas
β-lactamases descritas em bactérias Gram-negativas.
Sob a pressão seletiva exercida pelo uso indiscriminado das cefalosporinas nas
décadas de 1980 e 1990 surgiram as β-lactamases de espectro ampliado (ESBLs). Estas
β-lactamases podem ser variações dos tipos iniciais TEM ou SHV e apresentam
atividade melhorada contra β-lactâmicos de espectro estendido (Philippon, Arlet &
Lagrange, 1994; Chanal et al., 1994; Knox, 1995; Petit et al., 1995; Sirot, 1995; Chanal
et al., 1996; Huang et al., 1996; Vakulenko et al., 1999). Dentre as ESBLs descritas, a
do tipo CTX-M tem sido a mais amplamente encontrada entre as bactérias Gram-
negativas (Eisner et al, 2006). Os estudos dos genes que codificam as ESBL têm
revelado que a substituição de um a quatro resíduos de aminoácidos diferentes nas β-
lactamases originais são responsáveis pelo fenótipo resultante (Henquell et al., 1995;
Saves et al., 1995; Stapleton et al., 1995; Bret et al., 1997). Desse modo, a partir de uma
β-lactamase do tipo TEM-1 ou SHV-1 podem surgir mutantes apresentando resistência
à inibição de um composto de maior espectro de ação, que podem ser prontamente
selecionados na presença de cefalosporinas de espectro estendido. As ESBLs são
25
capazes de hidrolisar uma variedade de β-lactâmicos, incluindo as cefalosporinas de
terceira e quarta gerações e os monobactâmicos, mas não são ativas contra as
cefamicinas (como por exemplo, a cefoxitina e o cefotetan) e os carbapenemas (Bush,
Jacoby & Medeiros, 1995; Livermore, 1995). A ação hidrolítica dessas enzimas é
bloqueada pelos inibidores de β-lactamase como o ácido clavulânico, sulbactam e
tazobactam (Menezes & Silva, 2000), com exceção de algumas enzimas de espectro
estendido derivadas de OXA que exibem susceptibilidade moderada aos inibidores de β-
lactamase (Tzouvelekis et al., 2000).
A detecção da produção de ESBL por uma amostra bacteriana em laboratórios
clínicos é realizada por meio de métodos fenotípicos de triagem e confirmatórios.
Atualmente, os especialistas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI,
2005) recomendam a realização de testes de triagem para detecção de amostras de E.
coli, K. pneumoniae, K. oxytoca e amostras de Proteus mirabilis com relevância clínica
suspeitas de produção de ESBL e o teste de disco adição para sua confirmação.
Outra metodologia aceita para a detecção dessas enzimas foi proposta por Jarlier
e colaboradores, em 1988. Essa técnica, conhecida por dupla difusão, é mais facilmente
realizada pelos laboratórios clínicos e requer apenas a precisão na distância entre os
discos de antimicrobianos a serem testados. No entanto a produção simultânea de β-
lactamase do tipo Amp C pode dificultar a detecção de ESBL através destas técnicas.
(Thomson, 2001). O teste para detecção da produção de ESBL baseado no efeito
sinérgico entre um inibidor de β-lactamase e um β-lactâmico é mais confiável para
amostras que não co-produzem β-lactamases resistentes ao inibidor, tais como a AmpC.
Para espécies que produzem β-lactamase do tipo AmpC induzível codificada no
cromossomo, como as espécies de Providencia, a utilização de clavulanato no teste de
26
detecção pode induzir a produção de AmpC em alto nível, produzindo um resultado
falso-negativo. A utilização de tazobactam ou sulbactam como agentes inibidores pode
minimizar a interferência da indução da β-lactamase do tipo AmpC no teste de detecção
de ESBL, pois estes antimicrobianos são indutores menos potentes da AmpC. Outra
opção é a adição de um disco de cefepima no teste, pois a produção de AmpC tem um
efeito mínimo na atividade deste antimicrobiano.
Apesar dos especialistas do CLSI (2005) não recomendarem a realização de teste
fenotípico para a triagem da produção de ESBL em amostras do gênero Providencia,
enzimas deste tipo têm sido frequentemente encontradas em amostras de P. stuartii.
Em 1998, Franceschini e colaboradores purificaram e caracterizaram uma ESBL
codificada por plasmídeo de amostras clínicas de P. stuartii. Estas amostras, obtidas da
urina de pacientes hospitalizados em um hospital de Milão na Itália, continham a β-
lactamase do tipo TEM-60 que lhes conferia resistência aos β-lactâmicos de amplo
espectro incluindo os monobactâmicos.
A presença de ESBL em amostras de P. stuartii obtidas a partir de variados
espécimes clínicos como sangue, urina, escarro, ferida e outros também foi avaliada por
Tumbarello e colaboradores em 2004. O período de estudo incluiu os anos de 1999 a
2002 e 223 amostras de P. stuartii foram obtidas de pacientes internados no Hospital
Universitário da cidade de Roma, Itália. Das 223 amostras, 116 (52%) foram produtoras
de ESBL. As β-lactamases do tipo TEM-52 e TEM-72 foram encontradas
exclusivamente dentre as amostras hospitalares e foram caracterizadas através de
técnicas moleculares. Todas as amostras produtoras de ESBL apresentaram perfil de
resistência semelhante, que incluía os β-lactâmicos (amoxicilina + ácido clavulânico e
cefalotina) e as quinolonas como o ciprofloxacino.
27
Em um estudo mais recente, Aubert e colaboradores (2005) isolaram P. stuartii
produtora de β-lactamase a partir de swab retal e nasal de um paciente admitido em um
hospital de Argélia. Nessas amostras foram encontrados genes codificadores das β-
lactamases dos tipos TEM-2, SHV-2 e VEB-1, todos presentes em um mesmo
plasmídeo conjugativo. O perfil de susceptibilidade incluiu resistência à maioria dos β-
lactâmicos testados e susceptibilidade apenas ao ciprofloxacino, ácido nalidíxico e
rifampicina.
1.5. Tipificação das cepas
A tipificação de cepas bacterianas pode ser de grande auxílio na investigação
epidemiológica das infecções nosocomiais (Tenover et al., 1997). Os sistemas de
tipificação são usados para estudar as variações na composição das populações de
microrganismos e a disseminação de certas linhagens na natureza ou em determinados
grupos de seres humanos. Os objetivos específicos do emprego de técnicas de
tipificação incluem o estudo da genética da população bacteriana, o estudo da
patogênese das infecções, a vigilância epidemiológica das doenças infecciosas e a
investigação de surtos (Struelens et al., 1996; Belkum et al., 2001).
Surtos de doenças infecciosas freqüentemente resultam da exposição a um
agente etiológico por meio de uma fonte comum (Olive & Bean, 1999). Podem ser
definidos como surtos, um aumento temporal na incidência de morbidades infecciosas
numa determinada população ou um aumento temporal na freqüência da colonização
por um dado microrganismo (Struelens et al., 1996). O agente etiológico responsável
por um surto pode ser derivado de uma única célula, cuja progênie é geneticamente
idêntica ou intimamente relacionada ao microrganismo fonte. Em termos
28
epidemiológicos, os microrganismos envolvidos neste tipo de surto apresentam uma
relação clonal, ou seja, eles têm uma origem comum (Olive & Bean, 1999).
Os microrganismos que preservam uma relação clonal são membros de uma
mesma espécie que compartilham fatores de virulência, traços bioquímicos e
características genômicas (Olive & Bean, 1999). Esses microrganismos são
indistinguíveis por uma variedade de testes genéticos (Tenover et al., 1995). Por outro
lado, os microrganismos que pertencem a uma mesma espécie, isolados de diferentes
fontes e regiões geográficas, apresentam diversidade suficiente que permite a sua
diferenciação em cepas (Olive & Bean, 1999).
Os sistemas de tipificação são aplicados primariamente para auxiliar estudos
epidemiológicos, permitindo também a formulação de hipóteses sobre: a extensão da
disseminação epidêmica de clone(s) microbiano(s) em uma população exposta; o
número de clones envolvidos na transmissão e infecção; a identificação de fonte(s) de
contaminação e os veículos de transmissão; a identificação e o monitoramento de
reservatórios de clone(s) epidêmico(s) na população ou no ambiente; e a avaliação da
eficácia de medidas de controle visando conter ou interromper a disseminação de
clone(s) epidêmico(s) (Struelens et al., 1996).
Os métodos de tipificação se dividem em duas amplas categorias: métodos
fenotípicos e métodos genotípicos. Os métodos fenotípicos de tipificação são aqueles
que caracterizam os produtos da expressão de genes com o objetivo de diferenciar
cepas. Porém a expressão destes genes pode sofrer variações baseadas em mudanças nas
condições e fases de crescimento, e ocorrência de mutações simultâneas (Tenover et al.,
1997). A tipificação molecular baseada em características genéticas de microrganismos
pode fornecer informações mais precisas sobre a diversidade dos microrganismos em
29
estudo, embora possa ser afetada por inserções ou deleções de DNA no cromossomo,
ganho ou perda de DNA extracromossômico, ou ainda, mutações randômicas que
podem criar ou eliminar sítios de restrição de endonucleases (Tenover et al., 1997;
Wang et al., 1999). Os sistemas de tipificação molecular podem ser caracterizados em
termos de tipabilidade, reprodutibilidade, poder discriminatório, facilidade de realização
e interpretação. A escolha entre os vários métodos depende de fatores tais como os
objetivos do estudo, o poder discriminatório necessário, os tipos de preparações de
DNA, as condições laboratoriais disponíveis e a habilidade técnica das pessoas do
laboratório (Arbeit, 1995; Tenover et al., 1997).
A interpretação dos dados é um aspecto extremamente importante das técnicas
genotípicas. A presença ou ausência, posição e intensidade de bandas, são dados
relevantes nas análises de comparação (Boer et al., 2000). Tenover e colaboradores
(1995) idealizaram um critério para auxiliar na seleção e interpretação de métodos de
tipificação molecular para estudos epidemiológicos. Embora um método de tipificação
particular possa ter um alto poder discriminatório e boa reprodutibilidade, a
complexidade do método, interpretação dos resultados, bem como os custos envolvidos,
podem estar além das possibilidades do laboratório. Por essa razão, a escolha de um
método de tipificação molecular dependerá das necessidades, do nível de destreza e dos
recursos do laboratório (Olive & Bean, 1999).
Algumas dessas metodologias serão utilizadas no presente estudo para a
avaliação de um surto de infecções por P. stuartii produtora de ESBL que ocorreu em
um hospital da cidade de Niterói, RJ, descrito a seguir.
30
1.6. Emergência de P. stuartii produtora de ESBL em um hospital do Rio de
Janeiro
O hospital envolvido no surto é privado, terciário, de 176 leitos, sendo 68
apartamentos, 48 leitos de enfermaria, 32 de unidade de tratamento intensivo (UTI) de
adultos, 13 de unidade coronariana (UCO), 13 de UTI neonatal e dois pediátricos.
Em janeiro de 2004, a comissão de controle de infecção hospitalar (CCIH) deste
hospital identificou pela primeira vez a ocorrência de infecções por P. stuartii
multirresstente em pacientes inicialmente internados na UTI de adultos B (UTI-B) e na
UCO. Num período de 12 meses (janeiro a dezembro de 2004), 38 pacientes
apresentaram pelo menos uma cultura positiva para P. stuartii. Por tratar-se de um
patógeno incomum dentre os recuperados em espécimes clínicos naquele hospital até o
ano de 2003, foi formulada a hipótese de tratar-se de um surto por este microrganismo.
Outro dado relevante para o levantamento desta hipótese foi o fato das amostras
apresentarem perfil de sensibilidade semelhante com resistência às cefalosporinas de 3ª
e 4ª geração, sendo possivelmente produtoras de ESBL.
A primeira amostra de P. stuartii produtora de ESBL (PsESBL) recuperada em
cultura neste hospital foi isolada de uma paciente transferida de outra instituição em
06/01/04, onde havia permanecido internada por aproximadamente um mês em uma
UTI, tendo recebido antibioticoterapia com carbapenem e glicopetídeo. Em 08/01/04,
foi colhida secreção obtida em aspirado traqueal para investigação de pneumonia, onde
foi recuperada PsESBL. Esta paciente encontrava-se internada na UTI-B deste hospital.
Nos dias 24 e 25/01/05 ocorreram dois novos isolamentos de PsESBL em trato
respiratório inferior, em pacientes internados na UCO, e que haviam sido submetidos a
cirurgia cardíaca. Estes dois pacientes realizaram ecocardiograma transesofágico
31
durante as cirurgias realizadas em 15/01/04 e 21/01/04. Ambos desenvolveram
pneumonia no pós-operatório sendo uma por PsESBL e Pseudomonas aeruginosa e a
outra por PsESBL e K. pneumoniae.
A partir do mês de janeiro de 2004, outros casos de infecção por PsESBL
ocorreram tanto na UCO quanto nas demais UTIs, situadas em outros andares. As
cirurgias cardíacas realizadas durante o período de janeiro a dezembro de 2004 foram
acompanhadas pelo Serviço de Controle de Infecção Hospitalar. Neste período, foram
realizados 91 procedimentos cirúrgicos sendo 66 (72,5%) para revascularização do
miocárdio (RVM), 12 (13%) cirurgias para troca ou implantação de válvula cardíaca, 10
(11%) combinadas (válvula e RVM) e 3 (3,5%) outros procedimentos. Sete pacientes
evoluíram para óbito (7,6%) e quinze desenvolveram pneumonia no pós-operatório
(16,4%). Ficou comprovado que ocorreu um aumento importante no número de
pneumonias em 2004 (16,4%) quando comparado a 2003 (9%). Os membros da CCHI
do hospital decidiram então realizar uma investigação mais detalhada do problema.
Durante o ano de 2004, o tempo transcorrido entre a cirurgia e o diagnóstico de
pneumonia variou de 2 a 10 dias (média 3,9 dias). Do total de 15 pacientes que
desenvolveram pneumonia no pós-operatório de cirurgia cardíaca, nove tiveram
PsESBL recuperada do trato respiratório inferior (lavado broncoalveolar ou aspirado
traqueal). Em sete pacientes foi isolado um segundo microrganismo a partir do
espécime clínico em questão.
Como parte da investigação da ocorrência de pneumonias no pós–operatório de
cirurgia cardíaca causadas por PsESBL, em 29 de dezembro de 2004, foi realizado
rastreamento para avaliar a contaminação microbiológica dos seguintes equipamentos:
circuito de anestesia da sala do centro cirúrgico, lâminas de laringoscópio do centro
32
cirúrgico, válvula e circuito do respirador de transporte da UTI e sonda do equipamento
para ecocardiografia transesofágica (ECGTE), antes e imediatamente após limpeza com
clorexidina degermante e enxágüe em água potável não estéril. A coleta dos espécimes
foi efetuada pela microbiologista responsável pelo laboratório clínico que presta serviço
ao hospital. Uma amostra de PsESBL foi recuperada a partir da sonda do ECGTE. Em
5/01/05 também foi realizada coleta da água da torneira e superfície da pia onde é
realizada a limpeza das sondas do ECGTE para análise microbiológica. Nestas amostras
não foi encontrado crescimento de PsESBL.
Após a identificação da contaminação da sonda do equipamento ECGTE, a
CCIH orientou sobre os procedimentos para a correta desinfecção do equipamento
como por exemplo sua imersão em solução de glutaraldeído (Rutala & Weber, 1999),
seguido de enxágüe final com água destilada estéril. Até então, o aparelho era apenas
lavado com água e sabão degermante (clorexidina), não sofrendo qualquer tipo de
desinfecção.
Desde dezembro de 2004 até dezembro de 2005, não foi mais notificada
pneumonia por PsESBL nos pacientes em pós-operatório de cirurgia cardíaca. Também
não ocorreram mais infecções por este microrganismo na UCO. Entretanto, na UTI-B
amostras de PsESBL continuaram a ser isoladas em pacientes com internação
prolongada, tendo este microrganismo se estabelecido de forma endêmica nesta
unidade.
As amostras de PsESBL obtidas no hospital em estudo foram identificadas no
laboratório de origem apenas através da utilização do sistema automatizado
Microscan®, sem confirmação por métodos bioquímicos de referência (Winn et al,
2006; Mac Faddin, 1976). Além disso, para avaliar a relação clonal entre as amostras de
33
origem clínica e a amostra obtida da sonda do equipamento ECGTE é necessária a
aplicação de técnicas moleculares. A investigação destes aspectos é importante para
enriquecer a descrição de um patógeno que recentemente emergiu no ambiente
hospitalar, contribuindo para os avanços no campo de epidemiologia hospitalar e
controle de infecção (Reingold, 1998).
34
Tabela 1. Histórico do gênero Providencia
Data Autor Evento Observações
1918 Hadley e cols Bacterium rettgeri Primeiro relato de um microrganismo relacionado com
o futuro gênero Providencia
1920 Ornstein Bacillus inconstans Posteriormente denominado como a 1ª descrição de
microrganismo do gênero Providencia
1941 Rustigian & Stuart Paracoli anaerogênico 33111 Novo microrganismo descrito com principal
característica a rápida hidrólise da uréia
1942 Cope & Kilander Shigella paradysenteriae atípica Novo microrganismo provavelmente relacionado ao
Paracoli anaerogênico 33111
1943 Stuart & Cope Paracoli anaerogênico 33111 e Shigella paradysenteriae atípica incluídas no gênero Proteus como um único
microrganismo: P. rettgeri
1943 Stuart e cols Paracoli anerogênico 29911 (não inserido no gênero Proteus)
Semelhante ao Paracoli anaerogênico 33111 mas não
respondiam a reações com anti-soro específico para o
gênero Proteus
1944 Gomes Eberthella alcalifaciens Mais tarde considerada a amostra tipo do gênero
Providencia
1951 Kauffmann Paracoli anaerogênico 29911 de Stuart inserido no Grupo
Providencia
Grupo Providencia criado para incluir microrganismos
relacionados ao gênero Proteus mas que não
decompunham a uréia
1954 Ewing e cols Subdivisão do Grupo Providencia Baseada em perfis bioquímicos distintos
35
Tabela 1. Histórico do gênero Providencia (continuação)
Data Autor Evento Observações
1954 Singer & Bar-Chay Inserção do Grupo Providencia novamente no gênero Proteus
1955 Proom Proposta do gênero Providencia para incluir o Grupo Providencia e Proteus rettgeri
1962 Ewing e cols Aceitação do gênero Providencia
Estes estudiosos através de estudos taxonômicos
concluíram que era necessária a criação de um novo
gênero: Providencia
1962 Ewing e cols Eberthela alcalifaciens redescrita como Providencia alcalifaciens
1978 Brenner e cols Proteus rettgeri renomeado como Providencia rettgeri e seu subgrupo 5 como Providencia stuartii
1983 Hickman-Brenner e cols Descreveram o bigrupo 3 de Providencia alcalifaciens como Providencia rustigianii
1986 Müller e cols Providencia heimbachae Obtida de fezes de pinguins e caracterizadas
originalmente por Friederike Heimbach
Fonte: adaptado de O’Hara, Brenner & Miller, 2000
36
Tabela 2. Capacidade de fermentação de carboidratos na diferenciação das espécies do gênero Providencia
Espécies do gênero Providencia Carboidrato
P. alcalifaciens P. rustigianii P. heimbachae P. stuartii P. rettgeri
Inositol
Adonitol
Arabitol
Trealose
Galactose
-
+
-
-
-
-
-
-
-
+
V(46)
+
+
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
+
+: 90% ou mais amostras são positivas; -: 90% ou mais amostras são negativas; V(46): amostras com prefil variável sendo cerca de 46 % positivas .
Fonte: adaptado de Winn et al, 2006 Tabela 3. Classificação de β-lactames de bactérias Gram-negativas.
Tipo de enzima
Classe molecular
Inibição pelo clavulanato
Exemplos
AmpC
Espectro ampliado
Espectro estendido
Carbapenemase
C
A
D
A
A
D
B
A
D
0
0
+++
+
+++
+++
+
0
+++
+
ACC-1, ACT-1, CFE-1, CMY, DHA-1, FOX, LAT,
MIR-1, MOX-1 e MOX-2.
TEM-1, TEM-2, SHV-1
OXA
TEM, SHV, CTX-M, BES-1, GES/IBC, PER-1,
PER-2, SFO-1, TLA-1, VEB-1, VEB-2
OXA
IMP, VIM, GIM-1, SPM-1
KPC-1, KPC-2, KPC-3
OXA-23, OXA-24, OXA-26, OXA-27, OXA-40,
0XA-48
Fonte: adaptado de Jacoby & Munoz-Price, 2005.
37
2. Objetivos
O presente estudo foi desenhado para caracterizar amostras de P. stuartii que
estiveram envolvidas em um surto de infecção hospitalar ocorrido em um hospital
privado da cidade de Niterói-RJ. Os objetivos foram:
• Confirmar a identificação das amostras bacterianas por meio de métodos
bioquímicos convencionais.
• Avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos das amostras
bacterianas e realizar testes para verificar a produção de ESBL.
• Realizar a tipificação molecular das amostras bacterianas para avaliação de sua
composição clonal.
• Pesquisar a presença de genes para a codificação de β-lactamase do tipo CTX-M.
38
3. Materiais e métodos
3.1. Amostras bacterianas
No presente estudo, foram avaliadas 68 amostras de P. stuartii obtidas de
variados espécimes clínicos de 36 pacientes internados em um Hospital da cidade de
Niterói-RJ, no período de janeiro de 2004 a dezembro de 2005. Uma amostra obtida da
superfície de uma sonda utilizada para ecocardiografia transesofágica também foi
incluída no estudo.
Todas as 69 amostras bacterianas foram previamente classificadas como P.
stuartii pelo laboratório de origem, utilizando-se o sistema automatizado Microscan®.
Após a realização dos testes bioquímicos convencionais para a identificação fenotípica
das amostras, seis delas (8,7%) foram excluídas do estudo, pois não apresentaram
identificação compatível com P. stuartii. Desta maneira, 63 amostras de P. stuartii
foram incluídas no estudo.
As amostras foram estocadas em duplicata, sob a forma de suspensões densas
em solução contendo leite desnatado (Molico - Nestlé, Araçatuba, São Paulo, SP,
Brasil) a 10% (p/v) acrescido de glicerol (Vetec Química e Representações Ltda., Rio
de janeiro, RJ, Brasil) a 10% (v/v) (solução LDG). Para cada amostra foi preparada uma
suspensão densa (obtida a partir de crescimento de 24 horas) diretamente em 1,0 mL de
solução LDG distribuída previamente em tubos plásticos próprios para congelamento
(Inlab, São paulo, SP, Brasil). A seguir, os tubos foram armazenados em freezer numa
temperatura aproximada de 20°C negativos.
39
3.2. Caracterização fenotípica das amostras
Inicialmente, para a realização dos testes convencionais de identificação
fenotípica das amostras, uma única colônia bacteriana de cada amostra foi selecionada e
utilizada. A observação de resultados não esperados fez com que se suspeitasse de
variação na expressão do fenótipo. Esta suspeita pode ser confirmada quando resultados
divergentes foram encontrados no teste da desaminação oxidativa da fenilalanina
quando testadas cinco diferentes colônias de uma mesma amostra. Desta forma foi
estabelecido que, para a realização de todos os testes convencionais de identificação,
seriam levemente tocadas cinco colônias bacterinas de cada amostra para a inoculação
dos diferentes meios de cultura utilizados, a fim de minimizar o aparecimento de atipias
fenotípicas.
3.2.1. Identificação fenotípica do gênero
Para a realização dos testes de identificação, as amostras recuperadas dos
estoques foram semeadas pela técnica de esgotamento em placas de Petri contendo meio
de ágar tripticaseína (ATS - Difco, Sparks, MD, USA) e incubadas em estufa a 35-37°C
durante 18-24 horas. A identificação das amostras foi realizada segundo protocolos
padronizados (Winn et al., 2006; Mac Faddin, 1976).
3.2.1.1. Teste da desaminação oxidativa da fenilalanina
Para a realização do teste, cinco colônias bacterianas foram levemente tocadas
com o auxílio de uma alça bacteriológica e estriadas na superfície do meio de cultura
em tubo de ensaio 13x100 mm contendo meio para desaminação da fenilalanina (Difco
Laboratories, Detroit, MI, USA). Da mesma maneira, também foram testadas
separadamente cinco diferentes colônias de uma mesma amostra para verificar a
40
variação na expressão do fenótipo. Após incubação a 35-37°C por 18-24 horas foi
realizada a leitura do teste adicionando-se cinco gotas de cloreto férrico a 10% (p/v) na
superfície do meio. O desenvolvimento de coloração verde dentro de 1-5 minutos
indicou teste positivo. Foram utilizadas cepas de Proteus mirabillis (coleção do
laboratório de epidemiologia molecular de infecções bacterianas, LEMIB) como
controle positivo e de Escherichia coli (ATCC 25922) como controle negativo.
3.2.1.2. Teste da produção de ácido sulfídrico (H2S) e da produção de indol em
meio SIM
Para a realização do teste, cinco colônias bacterianas foram levemente tocadas
com o auxílio de uma agulha bacteriológica e inoculadas através de picada central, até
um centímetro abaixo da superfície do meio de cultura, em tubo de ensaio 13x100 mm
contendo meio SIM (Oxoid, Basingstone, Hampshire, England). As culturas foram
incubadas a 35-37°C por 18-24 horas em aerobiose. A observação de um precipitado
preto a partir da reação do ferro peptonado (contido no meio) com o H2S também
contido no meio foi indicativo de teste positivo para produção de gás sulfídrico. Após a
leitura do H2S, foram adicionadas ao meio 15 gotas do reagente de Kovacs (10 g de p-
dimetilaminobenzaldeído dissolvidos em 150 ml de álcool isoamílico e posteriormente
acrescidos de 50 mL de ácido clorídrico concentrado), deixando-as escorrer pela parede
interna do tubo. O desenvolvimento de uma cor vermelho-fúcsia brilhante na interface
do reagente e do meio, segundos após a adição do reagente, indicou a presença de indol
e uma prova positiva. Como controle de qualidade do teste da produção de indol foram
utilizadas as amostras E. coli ATCC 25922, como controle positivo, e Klebsiella
pneumoniae ATCC 700603, como controle negativo. Para o teste da produção de H2S
41
foram utilizadas amostras de P. mirabillis (coleção do LEMIB) e K. pneumoniae ATCC
700603 como controles positivo e negativo, respectivamente.
3.2.1.3. Teste da descarboxilação da ornitina
Para a realização do teste, cinco colônias bacterianas foram levemente tocadas
com o auxílio de uma alça bacteriológica e inoculadas em um tubo contendo meio base
para descarboxilação de aminoácidos segundo Möeller (Vetec Química e
Representações Ltda., Rio de Janeiro, RJ, Brasil) acrescido de L-ornitina (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Um outro tubo contendo meio base para
descarboxilação de aminoácidos segundo Möeller, desprovido de aminoácido, foi
utilizado como controle do meio. Após a inoculação, as superfícies dos meios nos tubos
foram recobertas com uma camada de óleo mineral estéril. As culturas foram incubadas
a 35-37ºC, durante 24-48 horas. O desenvolvimento de coloração púrpura foi indicativo
de resultado positivo, demonstrando que houve produção de aminas alcalinas decorrente
da descarboxilação do aminoácido. Enterobacter cloacae Fer003 (coleção do LEMIB)
foi utilizado como controle positivo, e K. pneumoniae ATCC700603 como controle
negativo.
3.2.1.4 Teste para detecção da atividade β-galactosidase (ONPG)
Para a realização deste teste foram utilizados discos de papel de filtro
impregnados com o reagente o-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo (ONPG) (Oxoid,
Basingstone, Hampshire, England). Cinco colônias bacterianas foram levemente tocadas
e inoculadas em 1ml de salina fisiológica em tubo estéril. O disco impregnado foi então
introduzido no tubo de modo que permanecesse em contato com a suspensão bacteriana.
A leitura do teste foi realizada após 20 minutos e em seguida a cada hora até seis horas
42
de incubação a 35-37°C. Os microrganismos negativos após seis horas de incubação
foram reincubados por até 24 horas. O teste negativo foi caracterizado por ausência de
coloração na suspensão bacteriana enquanto o teste positivo foi caracterizado por
aparecimento de coloração amarela na suspensão bacteriana. A leitura dos testes foi
realizada em intervalos de tempo para possibilitar a classificação dos microrganismos
em: fermentadores ativos da lactose (leitura positiva em até 6 horas de incubação),
fermentadores lentos da lactose (leitura positiva entre 7 e 24 horas de incubação) ou não
fermentadores da lactose (leitura negativa com 24 horas de incubação). Como controle
positivo do teste foi utilizada amostra padrão de E. coli ATCC 25922 e como controle
negativo amostra de P. mirabillis (coleção do LEMIB).
3.2.1.5 Teste de susceptibilidade à polimixina B
A susceptibilidade à polimixina B foi avaliada utilizando-se o teste de difusão
em ágar conforme proposto por Gales, Reis e Jones (2001). A partir de culturas
incubadas durante 24 horas a 35-37°C foram preparadas suspensões de cada amostra
bacteriana em salina fisiológica estéril, até a turvação correspondente ao padrão 0,5 da
escala de McFarland. As suspensões bacterianas foram então semeadas, utilizando-se
“swabs” estéreis, na superfície do meio ágar de Mueller-Hinton (Difco, Sparks, MD,
USA). Discos de papel de filtro embebidos com o antimicrobiano polimixina B,
obtidos comercialmente (Oxoid, Basingstone, Hampshire, England), foram aplicados
sobre o meio de cultura. A leitura das zonas de inibição e a interpretação dos
resultados foram realizadas após incubação a 37°C por 16-18 horas seguindo critérios
propostos pelo mesmo grupo de pesquisadores. Para controle do teste foi utilizada
amostra de E. coli ATCC 25922.
43
3.2.2 Identificação fenotípica da espécie
Após a identificação do gênero, foram realizados testes para a utilização de
alguns carboidratos que permitiram a diferenciação das espécies. Para tal, foi utilizado
um protocolo adaptado daquele descrito por Fischer e colaboradores em 1989. Foram
preparadas suspensões de cada amostra bacteriana em salina fisiológica estéril com
turvação correspondente ao padrão 0,5 da escala de McFarland. Dez microlitros dessas
suspensões foram inoculados em meio base para a utilização de carboidratos (Becton
Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, EUA) acrescido de 1% de cada
carboidrato: adonitol (Sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Germany), ramnose (Sigma
Aldrich Chemie, Steinheim, Germany), e trealose (Sigma Aldrich Chemie, Steinheim,
Germany). O azul de bromotimol (Vetec Química e Representações Ltda., Rio de
Janeiro, RJ, Brasil) (0,1g de azul de bromotimol dissolvidos em 20 mL de álcool etílico
a 95% quente e posterior adição de água destilada q.s.p. 100 mL) foi utilizado como
indicador de leitura. Cinco gotas de óleo mineral estéril foram acrescentadas à
superfície do meio após inoculação para que o metabolismo fermentativo das amostras
fosse verificado. A primeira leitura foi realizada após incubação das culturas em
aerobiose por 18-24 horas a 35-37ºC. O desenvolvimento de coloração amarela foi
indicativo de teste positivo enquanto que a manutenção da cor verde original do meio
foi indicativa de teste negativo. As amostras que se apresentaram negativas para a
fermentação dos carboidratos foram reincubadas por um período de até sete dias para
que a possibilidade de utilização tardia dos açúcares fosse verificada.
44
3.2.2.1. Testes para a utilização da ramnose, adonitol e trealose
Primeiramente foram realizados os testes para a utilização da ramnose e do
adonitol. Os resultados obtidos nestes testes serviram de triagem para a realização do
teste da utilização da trealose. Para a verificação da utilização da ramnose e do adonitol
foram utilizadas amostras de Citrobacter koseri (coleção LEMIB) como controle
positivo e de P. mirabilis (coleção LEMIB) como controle negativo. Para a realização
do teste da utilização da trealose foram utilizadas amostras de C. koseri (coleção
LEMIB) como controle positivo e de Morganella morganii (coleção LEMIB) como
controle negativo.
3.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos
A susceptibilidade aos antimicrobianos foi avaliada utilizando-se o teste de
difusão em ágar conforme recomendações do CLSI (2005). A partir de culturas
incubadas durante 24 horas a 35-37°C foram preparadas suspensões de cada amostra
bacteriana em salina fisiológica estéril, até a turvação correspondente ao padrão 0,5 da
escala de McFarland. As suspensões bacterianas foram semeadas, utilizando-se
“swabs” estéreis, na superfície do meio ágar de Mueller-Hinton (Difco, Sparks, MD,
USA). Discos de papel de filtro impregnados com os antimicrobianos (Oxoid,
Basingstone, Hampshire, England) foram aplicados sobre o meio de cultura. Os
seguintes antimicrobianos foram avaliados: amicacina (5μg), amoxicilina-clavulanato
(30μg/10μg), aztreonam (30μg), cefalotina (30μg), cefepime (30μg), cefotaxima
(30μg), cefoxitina (30μg), ceftazidima (30μg), ciprofloxacino (5μg), meropenem (10
μg), piperacilina-tazobactam (10 μg) e sulfametoxazol-trimetoprim (25μg). A leitura
das zonas de inibição e a interpretação dos resultados foram realizadas de acordo com
as recomendações do CLSI (2005) após incubação das placas a 37°C por 16-18 horas.
45
Para o controle do teste foi utilizada a cepa padrão de E. coli ATCC 25922.
3.4. Teste para a verificação da produção de ESBL: método de dupla difusão em
ágar
Para a realização deste teste foi utilizada a metodologia proposta por Jarlier e
colaboradores (1988). A partir de culturas obtidas pela semeadura em ATS e incubação
durante 18-24 horas, foram preparadas suspensões de cada amostra bacteriana em salina
fisiológica estéril, até a turvação correspondente ao padrão 0,5 da escala de McFarland.
As suspensões foram semeadas, utilizando-se “swabs” estéreis, na superfície do meio
ágar de Mueller-Hinton. Os discos contendo os antimicrobianos ceftazidima (30μg),
cefotaxima (30μg), aztreonam (30μg) e cefepima (30μg) foram então colocados a uma
distância de 25 mm, de centro a centro, de um disco contendo amoxicilina (10μg)
associada ao ácido clavulânico (20μg). As placas foram incubadas em estufa a 35°C por
16-18 horas, em aerobiose. A observação de distorção do halo na região de aproximação
de qualquer um dos antimicrobianos com o disco contendo amoxicilina-clavulanato,
indicando sinergismo, foi considerada como indicativo da produção de ESBL pela
amostra bacteriana.
Para controle do teste, foram utilizadas amostras de E. coli ATCC 25922 como
controle negativo e de K. pneumoniae ATCC 700603 como controle positivo.
46
3.5. Tipificação molecular das cepas
As amostras clínicas e a amostra obtida da superfície da sonda foram
investigadas através da técnica de amplificação de fragmentos de DNA em reação em
cadeia da polimerase utilizando-se iniciador para seqüências aleatórias (RAPD-PCR).
Esta técnica também foi utilizada para a análise da similaridade molecular existente
entre as cinco diferentes colônias de quatro amostras aleatórias que apresentaram no
mínimo duas colônias com variação fenotípica para o teste da desaminação oxidativa da
fenilalanina. A técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) foi utilizada
em 15 amostras clínicas e na amostra obtida da superfície da sonda.
3.5.1. RAPD-PCR
O par de iniciadores utilizado para a realização desta técnica foi o primer 272
(5’-AGCGGGCCAA-3’) descrito por Mahenthiralingam e colaboradores em 1996.
3.5.1.1. Extração do DNA bacteriano
O DNA foi extraído por lise térmica. A amostra bacteriana em teste foi semeada
em placa de ATS pela técnica de esgotamento e as culturas foram incubadas a 35-37°C
por 18-24 horas em aerobiose. A partir deste crescimento, uma suspensão bacteriana foi
preparada em tampão salina-fosfato (“phosphate buffer saline” ─ PBS) pH 7,3, num
volume de 2 mL, até a turvação correspondente ao padrão 2,0 da escala de McFarland.
Um mL desta suspensão foi transferido para eppendorf com capacidade de 1,5-2,0 mL e
centrifugado a 30.000 g durante 6 minutos numa temperatura de 4°C. O sobrenadante
obtido foi desprezado e o depósito ressuspenso em 100µL de água bidestilada. Essa
suspensão foi então submetida à fervura por 10 minutos para rompimento das células.
47
Logo após a fervura, o DNA já extraído, foi submetido a banho de gelo e posterior
congelamento a -20°C por um período mínimo de 30 minutos.
3.5.1.2. Amplificação do DNA
As reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 25 µL que
incluiu 22 µL da mistura de reação previamente preparada e 3 µL do sobrenadante
obtido a partir da centrifugação do DNA extraído. A mistura de reação foi preparada
adicionando-se 15,7 µL de água bidestilada, 2,5 µL de tampão de PCR (Biotools,
Madri, Espanha), 1,5 µL de MgCl2, 2,5 µL de solução de dNTPs diluídos, 2,5 µL do
primer diluído e 5U de Taq polimerase (Biotools, Madri, Espanha). Um controle
negativo sem adição do DNA molde foi incluído em cada experimento para que a
contaminação com DNA indesejado fosse descartada. As misturas de reação foram
então submetidas à amplificação que consistiu de um ciclo inicial de dois minutos a
94ºC, seguido de 30 ciclos de um minuto a 94ºC, um minuto a 36ºC e dois minutos a
72ºC e, posteriormente, um ciclo final de dez minutos a 72ºC.
3.5.1.3. Eletroforese em gel de agarose Dez microlitros dos produtos de amplificação obtidos da reação de PCR,
juntamente com 4µL do marcador de corrida, azul de bromofenol, foram aplicados nos
respectivos orifícios do gel de agarose a 1,5% e submetidos à corrida eletroforétrica.
Para tal, foi utilizado tris-borato EDTA (TBE ─ tris 89mM, ácido bórico 89mM e
EDTA 0,05M; pH 8,2) como tampão de corrida que se estendeu por aproximadamente
duas horas e 30 minutos. A corrida eletroforética foi realizada a 50 volts por 10
minutos, passando para 100 volts até que a corrida fosse finalizada. Como padrão de
tamanho de fragmento de DNA foi utilizado “1Kb ladder” (Invitrogen, Carlsbad, CA,
48
EUA). Após o término da corrida, o gel foi corado com brometo de etídio e fotografado
sob luz ultravioleta.
3.5.1.4. Interpretação dos resultados
Os resultados foram interpretados com o auxílio do programa GelCompar II,
versão 4.0 (Applied Maths, Kortrijk, Bélgica) utilizando-se o coeficiente Dice de
similaridade e o método “unweighted pair group method using arithmetic averages”
(UPGMA) para análise dos agrupamentos. A partir do dendrograma obtido foram
selecionadas 15 diferentes amostras clínicas e a amostra obtida da superfície da sonda
para avaliação segundo a técnica de PFGE. O critério de seleção de amostras adotado
baseou-se na observação dos grupos clonais encontrados no RAPD-PCR e procurou
abranger a maior variedade possível de perfis.
3.5.2. Análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após tratamento
com enzima de restrição e separação através de eletroforese em gel de campo
pulsado (PFGE)
Para a realização da PFGE foi utilizada uma metodologia adaptada daquela
proposta por Almeida e colaboradores em 2005.
As amostras foram cultivadas em placas contendo ATS e incubadas a 35ºC-
37ºC durante 16h-18h. Uma suspensão foi preparada a partir do crescimento bacteriano
em 300μL de tampão PIV [NaCl 1M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,6)] de forma a se obter
uma turvação semelhante a da escala 6,0 de McFarland. A esse volume foi misturado
um volume igual de agarose de baixa temperatura de fusão (NuSieve GTG; FMC
BioProducts, Rockland, Maine, EUA) a 1,5% e, após homogeneização, distribuído em
moldes e deixado para solidificar a 4ºC por cerca de 15 min. Os blocos de agarose
foram colocados em 2mL de solução de lise [Tris-HCl 6 mM (pH 7,6); NaCl l M;
49
EDTA 100 mM (pH 7,5); Brij 58 0,5%; lauril sarcosinato de sódio 0,5% e lisozima
1mg/mL] e incubados nesta mistura por 18h-24h a 37ºC. Após esse período, os tubos
foram resfriados a 4ºC e a solução foi substituída por 2mL de solução ESP [EDTA 0,5
M (pH 9 a 9,5); lauril sarcosinato de sódio 1%; proteinase K (0,1 mg/mL)]. Esta mistura
foi incubada por 18h-24h a 500C. A seguir, a solução foi substituída por 2mL de tampão
TE [Tris-HCI 10 mM (pH 7,5); EDTA 0,l mM] e incubada a 35ºC-37ºC por 1 hora.
Esse procedimento foi repetido por 4 vezes antes da submissão dos moldes ao
tratamento enzimático. A seguir, os blocos foram incubados durante 1 hora à
temperatura de 50ºC numa solução contendo 250μL de tampão para a enzima de
restrição (tampão H) a 0,1 mg/mL. Após esse período, os blocos foram submetidos ao
tratamento com solução contendo 20U de Sfi (Boehringer Mannheim’s; M.
Biochemicals; Indianapolis, Indiana, EUA) por 24 horas a 50ºC. A seguir, a solução
contendo enzima foi removida, os blocos lavados em 2 mL de tampão TE, fundidos a
650C, e finalmente aproximadamente 30μL foram aplicados no orifício do gel preparado
com agarose (SeaKen GTG; FMC Bioproducts) na concentração de 1,0% em tampão
TBE 0,5X (Tris 0,05 M, EDTA 1,25 mM e ácido bórico 0,05 M). Os fragmentos de
restrição foram separados num sistema de eletroforese em campo pulsado (CHEF DR
III / BioRad Laboratories, Richmond, California, EUA), utilizando-se um tempo de
pulso crescente de 2 seg a 50 seg, por 23h a 6V/cm, na temperatura de 13ºC. Os géis
com os fragmentos de restrição assim separados foram corados com brometo de etídio
durante 30 min e posteriormente descorados em água destilada também por 30 min. A
seguir, foram observados sob luz U.V. e fotografados.
50
3.5.2.1. Interpretação dos resultados
A interpretação das imagens obtidas nos géis foi realizada através de inspeção
visual seguindo os critérios propostos por Tenover e colaboradores (1995), e pela
metodologia automatizada utilizando o programa GelComparII.
3.6. PCR para a pesquisa de genes codificadores de β-lactamase do tipo CTX-M
Uma amostragem que incluiu 35 amostras clínicas e a amostra obtida da superfície
da sonda foi avaliada utilizando-se o par de primers para CTX-M descrito por Arpin e
colaboradores em 2003 (5’-CGCTTTGCGATGTGCAG-3’ e 5’-
ACCGCGATATCGTTGGT-3’). Para controle positivo do teste foram incluídas uma
amostra de E. coli positiva para a presença de gene codificador de ESBL do tipo CTX-
M2, uma amostra de Enterobacter aerogenes positiva para a presença de gene
codificador de ESBL do tipo CTX-M8 e uma amostra de E. coli positiva para a
presença de gene codificador de ESBL do tipo CTX-M16. As três amostras utilizadas
como controles positivos do teste foram gentilmente cedidas pelo Dr. Jorge Sampaio
(Laboratório Fleury, São Paulo, SP).
3.6.1. Extração do DNA bacteriano
Cada amostra bacteriana foi semeada em placa de ATS pela técnica de
esgotamento e as culturas foram incubadas a 35-37°C por 18-24 horas em aerobiose. A
partir deste crescimento, o DNA bacteriano foi extraído através de lise térmica
conforme descrito no item 3.5.1.1.
51
3.6.2. Amplificação do DNA
As reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 40 µL que
incluiu 35 µL da mistura de reação previamente preparada e 5 µL do sobrenadante
obtido a partir da centrifugação do DNA previamente extraído. A mistura de reação foi
preparada adicionando-se 22 µL de água bidestilada, 2,5 µL de tampão de PCR
(Biotools, Madri, Espanha), 1,5 µL de MgCl2, 2,5 µL de solução de dNTPs diluídos ,
3,0 µL de cada primer diluído e 2,5U de Taq polimerase (Biotools, Madri, Espanha).
Um controle negativo sem adição do DNA molde foi incluído em cada experimento
para que a contaminação com DNA indesejado fosse descartada. As misturas de reação
foram então submetidas à amplificação que consistiu de um ciclo inicial de três minutos
a 95ºC, seguido de 30 ciclos de um minuto a 95ºC, um minuto a 57ºC e um minuto a
72ºC e, posteriormente, um ciclo final de cinco minutos a 72ºC.
3.6.3. Eletroforese em gel de agarose Dez microlitros dos produtos de amplificação obtidos da reação de PCR,
juntamente com 4µL do marcador de corrida, azul de bromofenol, foram aplicados nos
respectivos orifícios do gel de agarose a 1,5% e submetidos à corrida eletroforétrica.
Para tal, foi utilizado TBE como tampão de corrida, que se estendeu por
aproximadamente uma hora e 30 minutos. A corrida eletroforética foi realizada a 50
volts por 10 minutos, passando para 100 volts até que a corrida fosse finalizada. Como
padrão de tamanho de fragmento de DNA foi utilizado “1Kb ladder” (Invitrogen,
Carlsbad, CA, EUA). Após o término da corrida, o gel foi então corado com brometo de
etídio e fotografado sob luz ultra-violeta.
52
3.6.4. Interpretação dos resultados A interpretação dos resultados foi realizada através de inspeção visual e
observação de um fragmento de 550 pb.
53
4. Resultados
4.1. Amostras bacterianas
No presente estudo, foram incluídas 62 amostras de P. stuartii obtidas de
variados espécimes clínicos de 36 pacientes internados em um hospital privado da
cidade de Niterói, RJ. Uma amostra obtida da superfície de uma sonda utilizada para a
realização de ecocardiografia transesofágica também foi avaliada. Dentre os espécimes
clínicos envolvidos 34,0% foram provenientes de lavado broncoalveolar, 21,0% de
secreção traqueal, 16,0% de ponta de cateter, 9,7% de urina, 8,0% de escara de
decúbito, 6,5% de sangue e 4,8% de outros espécimes (figura 1).
Para a verificação da distribuição do número de casos de isolamento de
P. stuartii produtora de ESBL, ao longo do período do estudo, que incluiu os anos de
2004 e 2005, foi considerada uma única amostra de cada paciente. A amostra
selecionada foi aquela obtida do primeiro espécime clínico coletado de cada paciente.
A distribuição do número de casos ao longo do período de estudo revelou uma maior
incidência entre os meses de outubro de 2004 e outubro de 2005. O mês que apresentou
o maior número de casos foi fevereiro de 2005 e nos meses de abril, junho, julho, agosto
e novembro de 2004 e; novembro e dezembro de 2005, não foram registrados casos de
isolamento de P. stuartii produtora de ESBL (Figura 2).
4.2. Caracterização fenotípica das amostras
As 69 amostras foram previamente identificadas no laboratório de origem,
através do sistema automatizado Microscan® e reavaliadas no presente estudo através
54
de testes fenotípicos convencionais. Das 69 amostras bacterianas coletadas para o
estudo apenas 63 (91,3%) tiveram sua identificação confirmada como P. stuartii.
4.2.1. Identificação fenotípica do gênero
Para a identificação fenotípica do gênero o primeiro teste realizado foi o teste da
desaminação oxidativa da fenilalanina. Inicialmente este teste foi realizado tocando-se
levemente uma única colônia bacteriana para a inoculação do meio. Quando o teste foi
realizado desta maneira, seis amostras não apresentaram teste positivo como era
esperado e necessário para a classificação do gênero. Suspeitando-se que se tratava de
variação na expressão do fenótipo, o teste foi novamente realizado utilizando-se cinco
diferentes colônias bacterianas, cada uma delas testada separadamente. Como foi
encontrada variação fenotípica entre as cinco diferentes colônias testadas das seis
amostras inicialmente avaliadas, essa metodologia foi então realizada em todas as
amostras do estudo. Das 63 amostras incluídas no estudo, 41 (65%) apresentaram
variação fenotípica no teste da desaminação oxidativa da fenilalanina. Destas, 21
amostras (51,2%) apresentaram uma das cinco colônias avaliadas negativa para o teste,
16 amostras (39,0%) apresentaram duas das cinco colônias avaliadas negativas para o
teste e quatro amostras (9,8%) apresentaram três das cinco colônias avaliadas negativas
para o teste.
Considerando-se que pode ocorrer variação na expressão do fenótipo para qualquer
gene bacteriano, todos os testes fenotípicos convencionais de identificação foram então
realizados tocando-se levemente cinco colônias bacterianas para inoculação dos meios
de cultura. A partir daí, nenhuma outra variação fenotípica foi observada e todas as
amostras apresentaram-se móveis e com teste positivo para a produção de indol. Os
testes para a produção de H2S, descarboxilação da ornitina e detecção da atividade β-
galactosidase (ONPG) se mostraram negativos para todas as amostras. Todas as 63
55
amostras também foram resistentes à polimixina B.
4.2.2. Identificação fenotípica da espécie
Na realização dos testes para a identificação da espécie bacteriana, todas as 63
amostras identificadas como pertencentes ao gênero Providencia puderam ser
identificadas como pertencentes à espécie P. stuartii, já que se mostraram apenas
fermentadoras da trealose.
4.3. Teste de susceptibilidade aos antimicrobianos
As 63 amostras incluídas no estudo foram avaliadas quanto à susceptibilidade a
12 diferentes antimicrobianos através da técnica de disco difusão em ágar conforme
recomendações do CLSI (2005). Foram encontrados 35 diferentes perfis de resistência..
Todas as amostras se apresentaram sensíveis ao meropenem e resistentes à cefalotina e à
amoxicilina + ácido clavulânico. Duas amostras apresentaram resistência à ceftazidima,
uma amostra apresentou resistência intermediária à amicacina e uma amostra apresentou
resistência total a esse mesmo antimicrobiano. Para os demais antimicrobianos
avaliados os percentuais de resistência variaram e estão representados na tabela 4.
4.4. Teste para a verificação da produção de ESBL: método de dupla difusão em
ágar
Todas as amostras incluídas no estudo foram submetidas ao teste fenotípico para
a detecção da produção de ESBL. Resultados positivos foram encontrados em 58
(92%) das 63 amostras, utilizando-se a técnica descrita por Jarlier e colaboradores em
1988. Entretanto cinco amostras (8,0%) só apresentaram resultado positivo quando a
distância entre os discos dos antimicrobianos foi alterada para 30mm, para duas
56
amostras (Figura 3), e 28mm, para três amostras (Figura 4). A modificação foi feita na
distância centro a centro entre as cefalosporinas de amplo espectro e o disco central
contendo o inibidor. Desta forma, todas as 63 amostras (100%) foram produtoras de
ESBL.
A análise dos perfis de susceptibilidade às cefalosporinas permitiu a verificação
de que 58 das 63 amostras (92%) apresentaram-se resistentes ou com resistência
intermediária para cefotaxima, e apenas duas (3,2%) apresentaram-se resistentes à
ceftazidima. Essa observação permitiu que se suspeitasse de que a ESBL produzida
pelas amostras fosse do tipo CTX-M. À partir daí, foi pesquisada a presença do gene
codificador para esse tipo de ESBL.
4.5. Tipificação molecular das amostras
4.5.1. RAPD-PCR
Todas as 63 amostras de P.stuartii foram avaliadas através de RAPD-PCR com
o propósito de analisar a composição clonal da coleção. Cada amostra apresentou de 8 a
18 bandas nítidas ao RAPD-PCR, variando de 506 a 4072 pb. Os resultados obtidos
foram interpretados com o auxílio do programa GelCompar II, que permitiu a
construção de um dendrograma que pode ser observado na figura 5. Nesta figura
observa-se a existência de três grupos clonais que compartilham mais de 90% de
similaridade genotípica. Foi denominado “a” o grupo clonal principal que detém 60
(95,2%) das 63 amostras e “b” e “c” os grupos clonais secundários nos quais estão
inseridas as demais amostras. No clone “b” estão inseridas duas amostras (3,2%) e no
clone “c” uma única amostra (1,6%). As três amostras clínicas que não foram inseridas
no clone principal “a” e mais 13 amostras, 12 clínicas e a amostra da sonda, foram
selecionadas para avaliação segundo a técnica de PFGE.
57
Na análise por RAPD-PCR também foi incluído o estudo das cinco diferentes
colônias de quatro amostras que apresentavam pelo menos duas colônias com variação
fenotípica no teste da desaminação oxidativa da fenilalanina. Três foram provenientes
de espécimes clínicos e uma da superfície da sonda. Os perfis das cinco colônias de
cada uma destas amostras foram idênticos entre si, conforme mostrado na figura 6.
A classificação das amostras em grupos clonais permitiu a construção de um
gráfico onde pode ser observada a distribuição temporal dos diferentes genótipos de P.
stuartii encontrados no período do estudo (Figura 7). Para a construção do gráfico foi
incluída somente a primeira amostra coletada de cada paciente. Como pode ser
observado na figura 7 o clone principal “a” esteve presente em todo o período do estudo
e os clones secundários, “b” e “c” se concentraram nos meses finais deste período.
4.5.2. Análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após tratamento
com enzima de restrição e separação através de eletroforese em gel de campo
pulsado (PFGE)
Na análise dos perfis de fragmentação do DNA cromossômico após tratamento
com enzima de restrição e separação através de PFGE, pode-se verificar que as 16
amostras avaliadas apresentaram de 4 a 16 bandas que variaram de 48,5 a 388,0 pb.
Com o auxílio do programa Gel Compar II, pode-se construir um dendrograma onde foi
verificada a presença de um grupo clonal principal A e dois outros genótipos B e C
(Figura 8). O percentual de similaridade entre os genótipos foi de 32,23%. O grupo
clonal A incluiu 13 amostras com similaridades entre si maiores do que 90,0%, que
corresponderam a até três diferenças no perfil de bandas. Considerando os critérios
propostos por Tenover e colaboradores em 1995, estas amostras são proximamente
relacionadas. O genótipo B incluiu duas amostras com 80% de similaridade entre si (até
58
três diferenças nos perfis de bandas), e com aproximadamente 32,0% de similaridade
quando comparado com as amostras do grupo clonal A. O genótipo C incluiu uma
amostra com menos de 40,0% de similaridade (mais de sete diferenças nos perfis de
bandas) quando comparado com as amostras do grupo clonal A. As amostras dos
genótipos B e C foram isoladas nos últimos meses do período do estudo.
4.6. PCR para a pesquisa da presença de genes codificadores de β-lactamase do
tipo CTX-M.
Todas as 36 amostras bacterianas avaliadas apresentaram fragmento de 550 pb
correspondente à presença do gene blaCTX-M. Além da presença do fragmento esperado
também pode ser observada a presença de um fragmento de aproximadamente 1000 pb.
Este fragmento também foi encontrado na amostra controle positiva para o gene
codificador de ESBL do tipo CTX-M2 (Figura 9). Este fato permite que se suspeite que
as amostras incluídas no estudo apresentam ESBL do tipo CTX-M2. Porém sua
confirmação só pode ser realizada através do sequênciamento gênico.
59
Tabela 4. Percentuais de susceptibilidade de 63 amostras de P. stuartii a doze antimicrobianos*
Número em cada na categoria (%)
Antimicrobiano resistente sensibilidade
resistência
intermediária
Sulfametoxazol-
trimetoprim 59 (93,6%) 3 (4,8%) 1 (1,6%)
Cefoxitina 50 (79,3%) 11(17,5%) 2 (3,2%)
Ciprofloxacino 51 (81,0%) 5 (8,0%) 7 (11,0%)
Piperacilina-
tazobactam 18 (28,6%) 33 (52,4%) 12 (19,0%)
Cefotaxima 54 (85,7%) 5 (8,0%) 4 (6,3%)
Cefepime 35 (55,5%) 19 (30,2%) 9 (14,3%)
Aztreonam 6 (9,5%) 40 (63,5%) 17 (27,0%)
* Todas as amostras foram sensíveis ao meropenem e resistentes à cefalotina e amoxicilina
+ ác. clavulânico; uma amostra (1,6%) foi resistente à amicacina; uma amostra (1,6%)
apresentou resistência intermediária à amicacina e duas amostras (3,2%) foram resistentes a
ceftazidima.
60
Figura 1. Percentuais dos diferentes espécimes clínicos das 62 amostras clínicas de P. stuartii incluídas no estudo
34,00%
8,00%21,00%
16,00%
9,70%6,50% 4,80%
lavado broncoalveolar
escara de decúbito
secreção traqueal
ponta de cateter
urina
sangue
outros
Figura 2. Distribuição do número de pacientes com isolamento de P. stuartii
produtora de ESBL ao longo do período de estudo
0
1
2
3
4
5
6
jan/04
fev/04
mar/04ab
r/04
mai/04
jun/04
jul/04
ago/0
4se
t/04ou
t/04no
v/04
dez/0
4jan
/05fev
/05
mar/05ab
r/05
mai/05
jun/05
jul/05
ago/0
5se
t/05ou
t/05no
v/05
dez/0
5
nº d
e ca
sos
*
*isolamento da amostra da sonda
61
Figura 3. Teste fenotípico positivo para a produção de ESBL com distância de 30
mm centro a centro dos discos de antimicrobianos para a amostra 4A de P. stuartii
FEP
AMC
CAZ
ATM
CTX
FEP: cefepime; CTX: cefotaxima; ATM: aztreonam; CAZ: ceftazidima; AMC: amoxicilina-clavulanato
62
Figura 4. Teste fenotípico positivo para a produção de ESBL com distância de 28
mm centro a centro dos discos de antimicrobianos para a amostra 16A de P.
stuartii
AMC
CAZ
ATM
FEP
CTX
FEP: cefepime; CTX: cefotaxima; ATM: aztreonam; CAZ: ceftazidima; AMC: amoxicilina-clavulanato
63
Figura 5. Dendrograma realizado a partir dos perfis de bandas obtidos pela
técnica de RAPD-PCR para as 63 amostras de P. stuartii
64
% de similaridade Amostra
“a”, “b” e “c” : grupos clonais
a
c
b
65
Figura 6. Análise da composição clonal de cinco diferentes colônias de uma
amostra clínica de P. stuartii (14A)
1Kb C1 C2 C3 C4 C5 1Kb
1Kb: marcador de tamanho molecular; C1, C2, C3, C4 e C5: colônias 1, 2, 3, 4 e 5 respectivamente.
Figura 7. Distribuição temporal dos diferentes genótipos de P. stuartii
0
1
2
3
4
5
6
jan/04
feb/04
mar/04ap
r/04
may/04
jun/04jul/0
4
aug/04
sep/0
4oct/
04
nov/04
dec/04
jan/05
feb/05
mar/05ap
r/05
may/05
jun/05jul/0
5
aug/05
sep/0
5oct/
05
nov/05
dec/05
Clone "c"Clone "b"Clone "a"
nº d
e ca
sos
66
Figura 8. Dendrograma realizado a partir dos perfis de bandas obtidos pela
técnica de PFGE para 16 amostras de P. stuartii
A. B e C: grupos clonais
% de similaridade amostras
A
B
C
Figura 9. PCR para a verificação da presença de genes codificadores de ESBLs dos
tipos CTX-M2, CTX-M8 e CTX-M16 em amostras de P. stuartii
1Kb 23 27 41 47 72 M2 M8 M16 C- 1Kb
← 550pb
5. Discussão
5. Discussão
1Kb: marcador de tamanho molecular; 23: amostra obtida da sonda; 27, 41, 47, e 72: amostras clínicas; M2: controle (+) para o gene blaCTX-M2; M8: controle positivo para o gene blaCTX-M8; M16: controle positivo para o gene blaCTX-M16; C-: controle negativo da mistura de reação.
67
5. Discussão
A investigação e o estudo dos surtos de infecção hospitalar, além de
contribuírem para a descrição da epidemiologia dessas infecções, fornecem informações
de utilidade para a saúde pública e servem como importantes ferramentas na prevenção
de casos adicionais (Reingold, 1998).
No presente estudo, foram avaliadas 69 amostras de P. stuartii que estiveram em
volvidas em um surto de infecção hospitalar que ocorreu em um hospital privado da
cidade de Niterói, Rio de Janeiro. Todas as 69 amostras foram previamente identificadas
como P. stuartii no laboratório de origem através do sistema automatizado Microscan®.
Das 69 amostras avaliadas apenas 63 (91,3%) foram incluídas no estudo. As demais seis
amostras não tiveram sua identificação fenotípica confirmada como P. stuartii através
dos testes bioquímicos convencionais e por isso foram excluídas do estudo. A eficácia
do sistema automatizado Microscan® na correta identificação de amostras pertencentes
à família Enterobacteriaceae foi motivo de estudo para O’Hara & Miller (2000). Neste
estudo, 14 amostras de P. stuartii foram avalidas e 12 (86%) tiveram a identificação
confirmada em testes bioquímicos. Portanto, o percentual de acerto obtido no sistema
automatizado encontrado no presente estudo pode ser considerado excelente.
Das 63 amostras incluídas no estudo, 62 foram obtidas de variados espécimes
clínicos de pacientes internados no período de janeiro de 2004 a dezembro de 2005 e
uma foi obtida da superfície de uma sonda utilizada para ecocardiografia transesofágica.
Na identificação das amostras através da utilização de métodos bioquímicos
convencionais foram realizados nove diferentes testes. O primeiro realizado foi o teste
da desaminação oxidativa da fenilalanina. Neste teste, amostras pertencentes ao gênero
Providencia bem como aquelas pertencentes aos gêneros Proteus e Morganella
apresentam resultado positivo. Na análise dos resultados obtidos, seis amostras (9,5%)
68
não apresentaram resultado positivo como esperado. Estes resultados levaram à
suspeita de variação na expressão do fenótipo. Tal suspeita foi confirmada quando cinco
diferentes colônias de cada amostra bacteriana foram avaliadas separadamente no teste
da desaminação oxidativa da fenilalanina. Das 63 amostras, 41 (65%) apresentaram
variação fenotípica neste teste. Baseando-se no fato de que a variação na expressão do
fenótipo pode acontecer para qualquer gene e que o percentual encontrado foi elevado,
ficou estabelecido que para a realização de todos os testes convencionais de
identificação fenotípica seriam levemente tocadas cinco diferentes colônias de cada
amostra bacteriana para a inoculação dos meios específicos de cultura. Desta maneira,
não foram encontradas variações fenotípicas em nenhum dos oito testes restantes
realizados. Caso todo o trabalho fosse realizado utilizando-se uma única colônia
bacteriana para a inoculação dos meios, mais de 50% das amostras não teriam sido
identificadas como P. stuartii e teriam sido excluídas do estudo.
A realização de estudos que consideram a ocorrência de variação na expressão
do fenótipo pode contribuir significativamente para a correta identificação dos
microrganismos na rotina laboratorial. Em um estudo realizado por Silva e Rubin em
1977 foram avaliadas 59 amostras de K. pneumoniae. Destas, 18 (31%) apresentaram
variação em testes fenotípicos quando avaliadas cinco diferentes colônias. Os testes para
a produção de indol e utilização de citrato, também incluídos no presente estudo para a
identificação de amostras de P. stuartii, apresentaram variação de 10% e 9%,
respectivamente.
No teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, todas as 63 amostras avaliadas
foram resistentes à cefalotina e à amoxicilina-ácido clavulânico, como esperado para P.
stuartii devido à presença de gene cromossômico de expressão induzível para β-
lactamase do tipo AmpC (Rossi & Andreazzi, 2005). Porém, elevados percentuais de
69
resistência a outros antimicrobianos também foram observados. Todas as amostras
foram produtoras de ESBL, o que as torna resistentes a todos os antibióticos da classe
dos β-lactâmicos com exceção aos carbapenêmicos. Além disso, a resistência a
antimicrobianos não β-lactâmicos também foi freqüente com mais de 84,0% das
amostras resistentes ao ciprofloxacino e sulfametoxazol-trimetoprim. A resistência a
estes antimicrobianos pode ser devida à presença de genes de resistência inseridos no
plasmídeo que codifica a produção de ESBL, conforme descrito em amostras de
Klebsiella spp (Hanson et al, 1999).
Amostras clínicas de P. stuartii multirresistentes já foram relatadas em alguns
estudos como aquele realizado por Tumbarello e colaboradores em 2004 na Itália. Das
223 amostras de P. stuartii avaliadas naquele estudo, 116 (52%) foram produtoras de
ESBL. Esse tipo de resistência é particularmente difícil de ser detectada em amostras de
P. stuartii, já que nenhum critério para a detecção da produção de ESBL foi
estabelecido pelo CLSI para esta espécie. A metodologia para a detecção da produção
de ESBL proposta por Jarlier e colaboradores em 1988, conhecida por dupla difusão,
pode ser facilmente realizada pelos laboratórios clínicos. No entanto, a produção
simultânea de β- lactamase do tipo Amp C pela amostra avaliada pode dificultar a
detecção de ESBL através desta técnica (Thomson, 2001). Todas as 63 amostras
avaliadas foram produtoras de ESBL. Porém, a detecção da produção desta enzima em
cinco amostras só foi possível quando a técnica foi adaptada alterando-se a distância
entre os discos dos antimicrobianos de 25mm para 30mm, para duas amostras e 28mm,
para três amostras. A similaridade nos perfis de susceptibilidade aos antimicrobianos
apresentada pelas amostras foi um primeiro indicativo da possibilidade de relação clonal
entre elas.
Um surto pode ser definido como um aumento temporal na incidência de
70
morbidades infecciosas ou da colonização por um microrganismo numa determinada
população. Quando a exposição a um agente etiológico ocorre por meio de uma fonte
comum, os microrganismos envolvidos no surto representam uma única população
clonal e compartilham características fenotípicas e genotípicas. No caso do presente
estudo, a sonda utilizada para a realização de ecocardiografia transesofágica, foi
responsável pela propagação do número de casos. Tal afirmação foi possível quando
avaliados os resultados obtidos na tipificação molecular das amostras.
Até os dias atuais, apenas dois estudos relatam a avaliação de amostras de P.
stuartii através da utilização de técnicas moleculares. No estudo publicado por
Tumbarello e colaboradores em 2004 foi utilizado um par de iniciadores denominados
REP1R-I e REP2-I. Estes iniciadores apresentam como principal característica a
presença de uma base nitrogenada modificada, a inosina (I). Esta base apresenta como
característica diferencial a capacidade de pareamento com qualquer uma das quatro
bases nitrogenadas principais: citosina (C), guanina (G), timina (T) e adenina (A). Esta
característica facilita o pareamento entre as bases, principalmente em fragmentos de
DNA que apresentam elevado conteúdo de G-C. Entretanto, a utilização de iniciadores
com bases modificadas aumenta consideravelmente o custo do sistema de tipificação.
Em 2005, Yoh e colaboradores estudaram a importância de espécies de
Providencia como causa da diarréia do viajante. Dentre 130 espécimes fecais avaliados,
Providencia sp. foi recuperada de 23. Dentre estas, cinco amostras eram da espécie P.
stuartii que, assim como as outras do gênero, foram avaliadas quanto à sua composição
clonal. A tipificação das amostras foi realizada através da técnica de RAPD-PCR
utilizando-se os primers 3 (5’GTAGACCCGT) e 5 (5’AACGCGCAAC). Os perfis de
bandas encontrados para P. stuartii não foram apresentados no trabalho. Porém, para as
amostras de P. rettgeri apresentadas foram obtidos perfis de bandas que variaram de três
71
a cinco bandas para cada um dos primers utilizados. Este pequeno número de bandas
pode ser insuficiente para a determinação da composição clonal de um grupo de
amostras, conforme sugerido por Tenover e colaboradores (1995).
No presente estudo foi utilizado o primer 272 descrito por Mahenthiralingam e
colaboradores (1996). Este primer apresenta um elevado número de bases citosina e
guanina, o que provavelmente facilitou o pareamento com fragmentos de DNA de P.
stuarti, já que esta bactéria apresenta elevado conteúdo G-C (39–43 mol%) (Senior,
1995). O primer 272 permitiu a obtenção de 8 a 18 bandas, o que certamente permitiu
melhor discriminação entre os tipos clonais.
Na avaliação do dendrograma obtido para os perfis de bandas da tipificação
molecular das amostras pela RAPD-PCR foi encontrado um grupo clonal principal
denominado “a” e dois genótipos secundários, “b” e ”c”. No grupo clonal “a”, foram
inseridas 59 amostras clínicas e a amostra obtida da superfície da sonda. As três
amostras clínicas que não foram inseridas no grupo clonal “a”, 12 amostras clínicas
inseridas neste grupo e a amostra da sonda foram avaliadas segundo a técnica de PFGE.
Até o presente momento não é de nosso conhecimento relatos da utilização desta técnica
em amostras de P. stuartii. No dendrograma obtido a partir dos resultados do PFGE
também foi encontrado um grupo clonal denominado A e dois genótipos, B e C. As
amostras inseridas nos genótipos “a”,”b” e “c” de RAPD-PCR foram inseridas,
respevtivamente, nos genótipos A, B e C da PFGE. A comparação da técnica de RAPD-
PCR com a técnica de PFGE permitiu concluir que a primeira foi satisfatória para a
tipificação molecular de amostras de P. stuartii. Tal observação é de extrema
importância, já que até o momento, são escassos estudos de tipificação molecular de
amostras de P. stuartii.
A análise da distribuição temporal das amostras incluídas nos diferentes
72
genótipos de RAPD-PCR revela que o gupo clonal “a” esteve presente desde a
introdução deste novo patógeno naquele hospital até o final do período de coleta de
amostras para o estudo. Portanto, não pode ser definido se o surto ainda permanece
naquele hospital. Também pode ser observado que os genótipos “b” e “c” surgiram nos
meses finais do período de coleta. É possível que tais genótipos sejam variações do
grupo clonal “a”, ou sejam casos não relacionados ao surto.
73
6. Conclusões
1. A realização do teste fenotípico para a detecção da desaminação oxidativa da
fenilalanina com cinco diferentes colônias de uma mesma amostra de P. stuartii revelou
a existência de variação na expressão do fenótipo para esta enzima em 65% das
amostras incluídas no presente estudo.
2. A tipificação molecular da coleção de P. stuartii produtora de ESBL proveniente de
um surto ocorrido em um hospital privado do Rio de Janeiro comprovou a
contaminação de uma sonda utilizada para ecocardiograma transesofágica com a cepa
do surto.
3. Um único grupo clonal de P. stuartii ocasionou cerca de 90% de todas as infecções
causadas por este microrganismo em 36 pacientes de um hospital durante 24 meses.
4. A realização de RAPD-PCR com o primer 272 foi utilizado para a tipificação
molecular de amostras de P. stuartii com 100% de tipabilidade. Estes resultados foram
corroborados pela avaliação de um grupo das amostras por PFGE.
74
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