Cara Membuat Buffer Phosphat Membuat PBS dengan pH 7,4; konsentrasi 50 mM, dan volumenya 100 ml. Di leb tersedia NaH2PO4.H2O dan Ha2HPO4.2H2O. Dan tak lupa aquadestilata. Pertama, kita ketahui bahwa H3PO4 mempunyai 3 pKa, pilih pKa yang dekat dengan pH yang akan kita buat. Karena kita akan membuat pH 7,4 maka di pilih pKa yang kedua yaitu 6,9. Kedua, gunakan persamaan Handerson-Haselbach sbb: pH = pKa + [B]/ [A] 7,4 = 6,9 + [B]/ [A] Ketemulah nilai *B+/ *A+ = .. (1) dengan [B] adalah BASA (Na2HPO4), dan [A] adalah ASAM (NaH2PO4). Ketiga, untuk mencari nilai [B] dan [A] gunakan cara berikut: *B+ + *A+ = 0,050 M (50 mM) . (2) Dengan substitusi (1) dan (2) maka akan diperoleh nilai [B] dan [A]. Keempat, volume yang diinginkan adalah 0,1 L (100 ml) - massa Na2HPO4.2 H2O (basa) yang di timbang = [B] x 0,1 x BM (BM: bobot molekul Na2HPO4.2 H2O - massa NaH2PO4.H2O (asam) yang ditimbang = [A] x 0,1 x BM (BM: bobot molekul NaH2PO4.H2O Kelima, timbang masing-masing bahan dan dengan aquadestilata ad100 ml. lalu cek pH.

Berbagai larutan buffer dan cara pembuatan Bicara tentang analisa kimia, salah satu hal yang sedikit merepotkan bagi saya adalah buffer. Buffer atau larutan penyangga adalah larutan yang terdiri dari asam lemah dan garam-nya yang dapat mempertahankan dan menjaga pH. Bidang bioteknologi tidak bisa dipisahkan dari penggunaan larutan ini. Kebutuhan buffer kadang menyulitkan karena hampir setiap analisa membutuhkan kondisi pH tertentu yang relatif stabil. Karena banyaknya macam dan jenis buffer, pemilihan buffer yang akan digunakan menjadi masalah tersendiri. Dalam memilih buffer, yang harus diperhatikan adalah pH optimum serta sifat-sifat biologisnya. Banyak jenis buffer yang mempunyai impact terhadap sistem biologis, aktivitas enzim, substrate, atau kofaktor. Sebagai contoh buffer phosphat akan menghambat aktivitas dari beberapa metabolik enzim termasuk karboksilase, fumarase, dan phosphoglucomutase. Barbiturate menghambat phophorilasi oksidatif. Tris buffer bereaksi dengan amin primer dan memodifikasi transport elektron dan phosphorilasi pada kloroplast. Tris juga menghambat enzim respirasi di mitokondria. Dan masih banyak efek lain yang diberikan buffer. Oleh karena itu pemilihan buffer terkadang menjadi kesulitan yang cukup merepotkan. Oleh karena itu, gunakan konsentrasi buffer serendah mungkin yang masih dapat untuk memaintain pH. Berikut beberapa macam buffer yang kerap digunakan:

A. GLYCINEHCL; PH 2.23.6, PKA = 2.35 Campur 25 ml 0.2 M glycine dan x ml HCl, kemudian encerkan hingga 100 ml dengan air suling. x (ml) pH 22.0 2.2 16.2 2.4 12.1 2.6 8.4 2.8 5.7 3.0 4.1 3.2 3.2 3.4 2.5 3.6

B. SODIUM ACETATE; PH 3.65.6, PKA = 4.76 Mencampurkan 0.1N acetic acid dan 0.1N sodium acetate untuk mencapai pH tertentu. acetic acid sodium acetate pH (ml) (ml) 185 15 3.6 176 24 3.8 164 36 4.0 147 53 4.2 126 74 4.4 102 98 4.6 80 120 4.8 59 141 5.0 42 158 5.2 29 171 5.4 19 181 5.6 C. BUFFERED SALINE (PBS, TBS, TNT, PBT) Larutan buffer saline sering digunakan ketika melakukan eksperiment yang berhubungan dengan immunolocalization. Ada beberapa variasi dari buffer ini, tiga diantaranya sebagai berikut. PBS 20x stock Potassium chloride 4g 53.6 mM 274 mM 29.4 mM 17.5 mM to 1 liter NaCl 160 g Potassium phosphate 4g monobasic Sodium phosphate dibasic 43.2 g (7H2O) DI TBS Potassium chloride 4 g NaCl 160 g Tris buffer (10 mM, pH 7.5) to 1 liter Use TBS when performing immunocytochemical experiments on phosphate-sensitive tissues (photosynthetic tissues typically) PBT 150 mM to 1 liter PBS to vol Tween 20 1% (v/v)

TNT NaCl Tris buffer (100 mM, pH 7.5)

D. CACODYLATE BUFFER; PH 5.07.4, PKA = 6.27 Sodium cacodylate buffer *Na(CH3)2 AsO2 3H2O+ adalah alternatif dari Srensens phosphate buffer. Mempunyai kapasitas buffer yang baik pada range pH 5.07.4. Cacodylate digunakan untuk aplikasi mikroskop elektron sebagai metode untuk menghindari penambahan phosphate saat sample preparasi. Mitochondria dan arganela lainnya dapat rusak jika terkena konsentrasi phosphate berlebih yang terdapat dalam Srensens buffers. Siapkan 0.2 M sodium cacodylate stock solution dalam air (4.28 g/100 ml). Tambahkan x ml 0.2 N HCL per 100 ml cacodylate stock solution, diikuti denga penambahan air demin sampai volume 400 ml hingga diperoleh 0.05 M cacodylate buffer pada pH yang diinginkan. 0.2 M HCl pH 94.0 5.0 90.0 5.2 86.0 5.4 78.4 5.6 69.6 5.8 59.2 6.0 47.6 6.2 36.6 6.4 26.6 6.6 18.6 6.8 12.6 7.0 8.4 7.2 5.4 7.4

E. CITRATE BUFFER; PH 3.06.2, PKA = 6.40 Citrate buffer stock solutions: A: 0.1 M citric acid; B: 0.1 M sodium citrate. Campurkan kedua larutan dengan perbandingan volume dan encerkan dengan air sampai 100 ml untuk membuat pH yang diinginkan. 0.1 M citric acid 0.1 M sodium citrate pH 46.5 43.7 40.0 37.0 35.0 33.0 31.5 28.0 25.5 23.0 20.5 18.0 16.0 13.7 11.8 9.5 7.2 3.5 6.3 10.0 13.0 15.0 17.0 18.5 22.0 24.5 27.0 29.5 32.0 34.0 36.3 38.2 41.5 42.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2

F. SRENSENS PHOSPHATE BUFFER; PH 5.88.0, PKA = 7.20 Campur sejumlah tertentu stock solution dan tambahkan air suling untuk mendapatkan 100 ml larutan Srensens phosphate buffer 0.1 M. Ingat, konsentrasi phosphate yang tinnggi dapat bersifat toksik bagi sel tanaman. Stock solutions: A 0.2 M NaH2PO4 B 0.2 M Na2HPO4 A (ml) 92.0 87.7 81.5 68.5 62.5 56.5 51.0 45.0 39.0 33.0 28.0 23.0 19.0 16.0 8.5 5.3 B (ml) 8.0 12.3 18.5 31.5 37.5 43.5 49.0 55.0 61.0 67.0 72.0 77.0 81.0 84.0 91.5 94.7 pH 5.8 6.0 6.2 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.8 8.0

G. PHOSPHATECITRATE BUFFER; PH 2.28.0, PKA = 7.20/6.40 Untuk membuat 100 ml larutan buffer phosphat-citrate. Stock solutions: 0.2 M dibasic sodium phosphate 0.1 M citric acid 0.2 M Na2HPO4 (ml) 0.1 M citrate (ml) 5.4 7.8 10.2 12.3 14.1 16.1 17.7 19.3 20.6 22.2 23.3 24.8 25.7 44.6 42.2 39.8 37.7 35.9 33.9 32.3 30.7 29.4 27.8 26.7 25.2 24.3

pH 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0

26.7 27.8 29.0 30.3 32.1 33.1 34.6 36.4 40.9 43.6

23.3 22.2 21.0 19.7 17.9 16.9 15.4 13.6 9.1 6.5

5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0

H. BARBITAL BUFFER; PH 6.89.2, PKA = 7.98 Untuk membuat 200 ml larutan buffer. Kedalam 50 ml Sodium barbital 0.2 M, tambahkan x ml 0.2 M HCl. Tambahkan air suling hingga volume 200 ml. 0.2 M HCl (x ml) pH 1.5 9.2 2.5 9.0 4.0 8.8 6.0 8.6 9.0 8.4 12.7 8.2 17.5 8.0 22.5 7.8 27.5 7.6 32.5 7.4 39.0 7.2 43.0 7.0 45.0 6.8 I. TRIS BUFFERS

Solution Tris, 1 M stock

Preparation Tris base DI Dissolve and adjust pH with the following approximate amount of HCl: pH 7.4 pH 7.6 pH 8.0 121.1 g 800 ml; 70 ml, 60 ml, 42 ml

EDTA, 0.5 M

SSC, 20x

Disodium ethylene diamine tetraacetate Adjust pH to approx. 8.0 and stir until dissolved NaCl NaCitrate DI Adjust pH to 7.0 with NaOH then add DI to 1 liter

186.1 g

175.3 g 88.2 g 800 ml

SSPE, 20x

NaCl NaH2PO4 H2O EDTA DI Adjust pH to 174 g 27.6 g 7.4 g 800 ml 7.4 with NaOH then add DI to 1 liter

TE

Tris EDTA Adjust pH using Tris stock solution 10 mM 1 mM

STE (TNE)

Tris NaCl EDTA Adjust pH to 8.0 using Tris stock solution

10 mM 100 mM 1 mM

J. GLYCINE NaOH BUFFER; PH 8.610.6, PKA = 9.78 Stock solutions: 0.2 M glycine 0.2 M NaOH Campur 25 ml glycine stock solution dengan x ml 0.2 M NaOH dan encerkan dengan air suling hingga volume 100 ml. x ml 0.2 M NaOH pH 2.0 8.6 3.0 8.8 4.4 9.0 6.0 9.2 8.4 9.4 11.2 9.6 13.6 9.8 19.3 10.4 22.75 10.6 Demikian beberapa buffer yang bisa dijadikan pilihan untuk digunakan. Perlu diingat, bahwa larutan buffer hanya berfungsi untuk mempertahankan pH. Tidak berarti bahwa pH tidak akan berubah. Perubahan dan gangguan yang cukup besar dalam sistem dapat merubah pH meskipun telah ditambahkan buffer ke dalamnya. Hal ini karena buffer hanya menjaga agar pH tidak terlalu berubah signifikan dengan adanya sedikit perubahan konsentrasi ion hidrogen dalam sistem.