1

CAPITULO I

MARCO TEORICO 1.1 Liofilización 1.1.1 Historia

Los científicos franceses Bordas y D´Arsonval en 1906 y el americano Shackell en

1909, descubren la aplicación del principio físico de la sublimación, construyendo

un sencillo aparato de liofilización de laboratorio.

El gran impulso de la aplicación industrial de la liofilización, se debe a los trabajos

de E.W Flosdonf y S.Murdd, que trabajando en la escuela de Medicina de la

Universidad de Pennsylvania, liofilizan los primeros productos para uso clínico en

gran escala, principalmente sueros y plasma humano.

Durante la segunda guerra mundial, los bancos de sangre americanos, empiezan

a producir industrialmente plasma humano liofilizado para el ejército.

En esta época, Fleming, Florcy y Cain, descubren y sintetizan la penicilina. El

gran éxito de la desecación del plasma y su buena conservación por liofilización

fue rápidamente aplicado a la penicilina y a continuación a muy diversos

antibióticos, enzimas, sueros y vacunas a fines de prolongar su actividad

terapéutica.

En las dos últimas décadas, se ha ido perfeccionando la técnica del proceso y los

equipos e instalaciones, como apareciendo nuevas aplicaciones de la liofilización

a nivel de investigaciones o de la industria. (7)

1.1.2 Definición

La liofilización es un proceso que consiste en desecar un producto previamente

congelado, lográndose la sublimación del hielo bajo vacío. Es por lo tanto, el paso

2

directo del hielo (sólido) a gas (vapor), sin que en ningún momento aparezca el

agua en su estado líquido. (7)

Es una red sólida, muy frágil y fácilmente redisoluble en agua. Esta operación se

llama: LIOFILIZACIÓN, FREEZE DRYING (en inglés), LYOPHILIZATION (en

francés), GEFRIERTROCKNUNG (en alemán). (5)

1.1.3 Etapas de la Liofilización

Se realiza a temperaturas inferiores a la de solidificación total, o sea, el producto

debe estar congelado a temperaturas entre 10 y 15 ºC bajo cero.

1.1.3.1 Congelación Inicial

Es una operación previa y obligatoria. El tiempo de duración depende de varios

factores como la cantidad, concentración y naturaleza propia del producto.

Una congelación adecuada es la base de que el producto liofilizado presente

óptimas condiciones de aspectos, conservación de sus propiedades originales y

rápida rehidratación.

1.1.3.2 Sublimación ó Desecación Primaria

Es la etapa en la que la mayor parte del agua libre pasa a vapor. Los parámetros

temperatura, presión y tiempo pueden ser modificados independientemente

pero están íntimamente relacionados.

1.1.3.3 Desorción ó Desecación Secundaria

Su misión es eliminar las últimas trazas de vapor de agua, evaporando el agua no

congelada ligada al producto. (7)

3

1.1.4 Ventajas de la técnica de Liofilización

• La temperatura a que es sometida el producto, está por debajo de aquella a la

que muchas sustancias inestables sufren cambios químicos.

• Debido a la baja temperatura que se opera se reduce el peligro de

contaminación microbiana.

• Se eliminan los fenómenos de oxidación, dado que se opera y envasa a alto

vacío.

• La gran porosidad del producto facilita con rapidez la reconstitución por la

adición de agua o del solvente adecuado.

• Al ser despreciable la humedad remanente , el producto puede ser

almacenado por tiempo ilimitado, constituyendo productos de larga estabilidad.

1.1.5 Desventajas de la Liofilización

• Es un proceso costoso.

• Necesidad de personal calificado en la operación y mantenimiento de los

equipos.

• Elevado costo de inversión de las instalaciones y equipos.

1.1.6 Los Equipos

1.1.6.1 Generalidades

Los principales países que producen equipos de liofilización apto para la industria

farmacéutica son:

En América: EE.UU., Canadá y Argentina.

En Europa: La mayoría de los países, especialmente: Suiza, Francia,

Alemania e Inglaterra.

4

En Asia: Japón

1.1.6.2 Formas de Equipos

Bajo “forma” entendemos que la cámara sea:

a) Cilíndrica y horizontal

b) Cilíndrica y vertical

c) Rectangular, con puerta frontal. (5)

5

1.1.6.3 Liofilizador Utilizado

Manejo del equipo de liofilización que cuenta el subproceso de Vacuna Pertussis

del INSTITUTO NACIONAL DE HIGIENE “LEOPOLDO IZQUIETA PÉREZ” DE

GUAYAQUIL.

FIGURA Nº 1

6

1.2 Bordetella Pertussis

1.2.1 Generalidades

El género Bordetella es una bacteria cocobacilar de crecimiento lento.

B. Pertussis fue descrita en 1906 por Bordet y Gengou como agente responsable

de la Coqueluche.

Este género abarca 4 especies conocidas:

• B. Pertussis

• B. parapertussis

• B. bronchiséptica

• B. avium

Y 2 especies recién descritas:

• B. hinzii

• B. holmesii (10)

1.2.2 Habitat

• La B. pertussis patógeno estricto del hombre. Se encuentra en vías

respiratorias superiores, igual que B. parapertussis.

• La B. bronchiséptica se encuentra en perros, gatos, conejos, etc.

Ocasionalmente en el ser humano.

• La B. avium ejerce una acción patógena en las aves. (2)

7

1.2.3 Caracteristicas

• Son cocobacilos gram negativos, en aislamientos primarios.

• En subcultivos, por lo general, son más pleomorfos.

• Son aeróbicos obligados, se desarrollan a 35 – 37º C en atmósfera húmeda.

• No fermentan Hidratos de Carbono

• La B. Pertussis y parapertussis son inmóviles.

• La B. bronchiséptica y B. avium son mótiles.

• Aislamiento primario B. Pertussis requiere carbón, resinas intercambio iónico o

sangre (15 – 20%) para neutralizar efecto inhibidor crecimiento, de ácidos

grasos insaturados, sulfuros, peróxidos y metales pesados.

• B. parapertussis es algo menos exigente, pero requiere igual los medios

selectivos.

• Las otras especies, no son tan exigentes, se desarrollan en los medios de

rutina, como Agar Sangre, Chocolate, Mac Conkey. (2)

1.2.4 Importancia Clínica de B. Pertussis

• B. Pertussis provoca síndrome conocido como Coqueluche, Tosferina o Tos convulsa, es una enfermedad infecciosa y altamente contagiosa. Afecta

predominantemente a niños y tiene evolución prolongada.

• La Bordetella Pertussis se transmite a gotitas de secreciones respiratorias.

• El 50% de los casos denunciados, afectan a lactantes pequeños no vacunados

o parcialmente vacunados.

• En los adultos, por lo general, se presenta tos convulsa asintomático o de

presentación atípica, aprox. 25%. Aunque también ha habido casos de Tos

convulsa con paroxismos de tos, vómitos y encefalopatía. (9)

8

1.2.5 Estructura Antigénica

Bordetella Pertussis produce sustancias biológicamente activas y virulentas, que

desempeña un papel en el origen de la tos convulsa:

• La Toxina Pertussis (TP) también llamada factor sensibilizador a la histamina

o factor promotor de la linfocitosis, factor de virulencia mayor de la B.Pertussis,

ya que existen otras toxinas.

• La Hemoglutinina filamentosa (FHA) adhesina de superficie celular que

posee actividad hemoglutinante (aglutina eritrocitos) por ella se da, la

adherencia a células ciliadas del tracto respiratorio superior.

• La Adenilato ciclasa hemolisina (ACH) esta proteína tiene capacidad de

fijarse a células susceptibles y es traslocada al interior de célula intacta.

• La Citotoxina traqueal (TCT) está compuesta por fragmentos del

peptidoglucano de la pared celular y tiene capacidad de destruir células

epiteliales de la tráquea.

• El Lipopolisacárido (LPS) que se encuentra en la membrana externa de la

pared celular, libera pirógenos hacia los monocitos.

• Las especies de Bordetella poseen antígenos termoestables somáticos,

llamados Aglutinógenos “O” que son comunes a todas ellas.

Además se han descrito 14 aglutinógenos capsulares termolábiles designados

factores.

Estos se asocian con Fimbrias y aparentemente también participan en la fijación

de las bacterias a las células efectoras. (1)

9

1.2.6 Fisiopatología

• La B. Pertussis llega a vías aéreas superiores, se adhiere y multiplica en

epitelio de la tráquea y los bronquios. Altera mecanismos de depuración

mucociliar (primera línea defensa), inhibe funciones fagocíticas y provoca la

necrosis celular.

• Los microorganismos en desintegración liberan endotoxinas, que irritan células

superficiales, originando manifestaciones catarrales y necrosis del epitelo, con

un infiltrado inflamatorio en que predominan linfocitos.

• No hay invasión del torrente sanguíneo.

• En infiltrado inflamatorio, se encuentran abundantes bacterias que producen

exudado purulento; la reacción inflamatoria atraviesa las paredes de la tráquea

y bronquios, originando una peribronquitis, donde se hallan tapones mucosos.

En los alvéolos puede haber hemorragia y edema.

• Los espasmos de tos y la anoxia, pueden originar hemorragias cerebrales

puntiformes, de la nariz, de las conjuntivas, ruptura de los vasos sanguíneos

de la mucosa, aparato digestivo y petequias en la cara y el cuello.

• La encefalitis es una complicación poco frecuente, que es originada por las

endotoxinas del microorganismo. (2)

1.2.7 Manifestaciones Clínicas

Luego de un período de incubación del microorganismo de 7 a 14 días,

comienzan los signos y síntomas de la Tosferina, que comprende 3 fases:

1.2.7.1 Período Invasión ó Catarral

Se caracteriza por síntomas inespecíficos de “resfrío común” o “gripe”. En este

período, (aprox. 1 semana) la enfermedad es muy contagiosa, porque hay una

gran cantidad de bacterias que se eliminan con las secreciones.

10

Al final de esta fase se presenta una tos seca y molesta, no productiva, que se

vuelve persistente.

Los cultivos realizados en esta etapa se asocian con alta probabilidad de positividad.

1.2.7.2 Período Paroxístico

Puede durar 2-4 semanas. Se caracteriza por tos quintosa, que finaliza con el

prolongado estridor inspiratorio, audible al final acceso de tos; además este puede

asociarse con cianosis y vómitos.

Esta etapa puede ser tan severa que, debe recurrirse a la respiración mecánica

intermitente.

Durante la evolución de la enfermedad las complicaciones posibles son: Otitis

media bacteriana, convulsiones, encefalopatía, hernia inguinal y prolapso rectal,

etc.

1.2.7.3 Período Convalecencia

Generalmente comienza entre tercera o cuarta semana después de instalación de

la enfermedad.

Se observa una declinación de la frecuencia y severidad de los accesos de tos, en

unas dos semanas. Aunque podría mantenerse así, unos 3-6 meses más. (1)

1.2.8 Epidemiología de la Coqueluche

• Tosferina sigue siendo enfermedad de importancia mundial, con incidencia

estimada en 60 millones de casos y unas 600.000 muertes por año. En países

desarrollados ha habido disminución de vacunación infantil y por tanto un

aumento de la incidencia de Tosferina.

11

• Esta enfermedad es endémica, presentándose epidemias en ciclos de 3-5

años y difiere de otras infecciones de la infancia, porque los índices de ataque,

morbilidad y mortalidad son significativamente mayores en el sexo femenino,

sin haber una razón para esto.

• No se ha identificado un estado de portación prolongado, pero se han

detectado personas asintomáticas con cultivos positivos, durante brotes

epidémicos.

• Antes de que se desarrolle la vacuna, la tos ferina afectaba en mayor escala a

niños de 1 - 5 años, debido a protección pasiva conferida por los anticuerpos

maternos, la infección a menores de 1 año, estaba reducida a un 20%.

• La vacuna Anti-Tosferina desarrollada con microorganismos enteros, ha sido

la causa de la menor incidencia de la enfermedad, pero en cambio también es

la razón para que haya desplazamiento de la edad pico de incidencia, a

menores de 1 año de edad, en un porcentaje considerable.

• La vacuna confiere una inmunidad limitada de menos de 12 años, por lo que

los adultos poseen muy pocos anticuerpos para la transferencia pasiva al niño,

lo que explica, que los niños menores de 1 año, son el grupo menos protegido.

• De casos comunicados de Tos ferina, el 10-15 % corresponden a personas de

más de 15 años de edad y hay tendencia a que esto se acrecente. (2)

1.2.9 Diagnóstico

Después de la valoración clínica, en que se sospecha Tosferina el diagnóstico de

laboratorio se lo hace en forma directa e indirecta.

1.2.9.1 Diagnóstico Directo

• Debe hacerse durante el Período Catarral y al comienzo del Paroxístico, para

poder recuperar la cepa. La muestra se obtiene por hisopado o por aspiración

de secreciones bronquiales o nasofaríngeas.

12

• CULTIVO en Agar selectivo de Bordet Gengou o de Reagan Lowe con el

agregado de antibiótico, como Meticilina o Cefalexina para inhibir el desarrollo

de la flora normal. La muestra cultivada debe examinarse diariamente durante

5 a 7 días e identificar colonias hemolíticas diminutas, que son de crecimiento

lento.

• Reacción INMUNOFLORESCENCIA directa en extendidos de muestra

nasofaríngea, para detectar B. Pertussis con anticuerpos fluorescentes (F .A),

revela cocobacilos pequeños con fluorescencia periférica de color verde

brillante, antes de que haya crecimiento en cultivo. La interpretación de la

prueba es delicada y algunos investigadores creen que es insensible e

inespecífica.

• La Prueba de F. A. para detectar B. Pertussis debe realizarse junto con el

cultivo, ya que las dos pruebas son complementarias.

• La tinción de Gram, podemos confirmar, simultáneamente la morfología

cocobacilar de los microorganismos, que presentan fluorescencia con el

reactivo por lo que constituye una de las pruebas más importantes, en la

identificación de B. Pertussis.

1.2.9.2 Diagnóstico Indirecto

• Se lo realiza al final del Período Paroxístico y hasta después del Período de

Convalecencia.

• Método ELISA reacciones de Aglutinación con antisueros específicos para

detección de anticuerpos en el suero sanguíneo. Estas pruebas son útiles

desde el punto de vista epidemiológico, para el diagnóstico ayuda poco,

porque la elevación de anticuerpos recién se produce en la tercera semana de

enfermedad.

• Se han desarrollado otros métodos para la identificación del microorganismo o

sus componentes, mediante hibridación con DNA, Reacción en cadena de la

polimerasa (PCR), pero estos métodos no se utilizan en la práctica general.

(2)

13

AÑO 1999 2000 2001 2002 2003TOTAL DE MUESTRAS 42 147 109 42 26NEGATIVOS 25 112 82 42 26POSITIVOS B. PERTUSSIS 17 29 17 - -POSITIVOS B. PARAPERTUSSIS - 6 10 - -

1.2.10 Casos reportados de Coqueluche a nivel local en el INSTITUTO

NACIONAL DE HIGIENE M.T. “L.I.P” DE GUAYAQUIL.

A partir del año 1.999, el Subproceso de Bacteriología-Peste del Instituto Nacional

de Higiene “Leopoldo Izquieta Pérez” de Guayaquil, realiza el Diagnóstico Directo

por método de Cultivo en sospecha de Tosferina.

Inicialmente realizaban el aislamiento de la Bordetella Pertussis en Agar selectivo

de Bordet Gengou. Actualmente lo efectúan con el medio de Reagan Lowe,

obteniendo mejor aislamiento de la Bordetella Pertussis, confirmando la

morfología coco bacilar de los microorganismos con la Tinción de Gram.

Según registros facilitados por esta Fuente, los casos de Bordetella Pertussis son

los siguientes

En lo que va del año 2004 no se han registrado casos positivos de Bordetella

Pertussis.

La edad de mayor incidencia de positivos de B. Pertussis son niños menores de 2

años, rara vez adultos, de posición económica baja. (6)

14

SELLADO

ROTULACION

ENVASE

SUBCERO ( - 40ºC)

LIOFILIZADOR

PUREZA

PUREZA

DESCARTAR SOBRENADANTE

PUREZA

DILUCION Y HOMOGENIZACION

AGITACION EN BASE MAGNETICA

DILUCION Y COSECHA DE BIOMASA

EMULSION VIAL LIOFILIZADO

1ERA SIEMBRA (M. BORDET GENGOU AGAR SANGRE) INCUBACION 35ºC - 37ºC 72 HORAS

2DA SIEMBRA (M. BORDET GENGOU AGAR SANGRE) INCUBACION 35ºC - 37ºC 48 HORAS

MASA BACTERIANA

INOCULACION EN TUBOS CON MEDIO GENGOU BORDET AGAR SANGRE

INCUBACION 35ºC - 37ºC 24 HORAS

CENTRIFUGACION

SELECCION VIAL LIOFILIZADO CEPA MADRE B. PERTUSSIS

OBSERVACION MICROSCOPICA DE CADA

TUBO INOCULADO

ALMACENAMIENTO ( 2º - 8ºC)

SEMILLAS DE TRABAJO

COMPROBACION DE VACIO

1.2.11 Diagrama de Flujo del proceso de Liofilización de Cepa Bordetella

Pertussis utilizadas en producción de Vacuna Pertussis

15

Emulsión vial liofilizado cepa madre Bordetella Pertussis

FIGURA Nº 2

16

Almacenamiento en Cámara Fría (2º C – 8º C) de Cepas Bordetella Pertussis

FIGURA Nº 3

17

1.3 Vacuna Pertussis

La Vacuna Pertussis cumple las regulaciones de la FDA concerniente a

Biológicos. Es una fracción bacteriana estéril o suspensión de bacilo pertussis

muerta (Bordetella pertussis) de una cepa o cepas seleccionadas por su alta

eficiencia antigénica.

Debe contener requisitos de calidad cuyos resultados estén dentro de los límites

de aceptación. Para esto, se realizan diferentes Métodos de Ensayo. Contiene un

preservativo. (4)

1.3.1 Historia de la vacunación

Se inició en 1906 cuando Bordet y Gengou cultivaron por primera vez Bordetella

Pertussis La primera vacuna antipertúsica contenía bacterias inactivadas de

célula entera. Las primeras pruebas clínicas se realizaron en las Islas Faroe en

1923-24, y en 1925 Madsen informó resultados de esta vacunación.

Las siguieron otras en los Estados Unidos, y luego en Inglaterra con diversas

vacunas. Al concluir estas pruebas, se introdujo la vacunación con células

enteras para utilización en gran cantidad de países industrializados, primero en

Estados Unidos, luego en Japón y Europa.

La vacuna antipertúsica se introdujo por primera vez en Estados Unidos en 1948,

y se administró ampliamente en 1953. En Japón, la inmunización masiva

comenzó en los años 50. En Gran Bretaña, las campañas de vacunación masiva

se iniciaron en 1960, mientras que en Francia no comenzaron sino hasta 1966.

(11)

1.3.2 Vacunas Disponibles

1.3.2.1 Célula Entera (Celular)

Esta vacuna antipertúsica está en uso desde la década de 1950.

18

Asociada a los Toxoides Diftérico y Tetánico forman la vacuna triple o D.P.T.

llamada Vacuna Tradicional, razonablemente similar en todo el mundo e induce

una alta eficacia y es bastante segura. (1)

En la actualidad, la vacuna antipertúsica de célula entera se administra en

conjunción con las vacunas antidiftérica, antitetánica, antipoliomielitica inactivada,

polisacárido capsular conjugado de Haemophilus influenzae b y hepatitis b.

Las vacunas de célula entera que se aplican hoy en día están compuestas de

una mezcla de suspensiones bacterianas inactivadas por exposición al calor. (11)

1.3.2.2 Acelular

Las vacunas acelulares, de las que existen diversas formulas, contienen 1 o más

antígenos de virulencia de Bordetella pertussis (si bien siempre contienen el

toxoide preparado en base a la toxina pertúsica). (11)

En 1981, se inició en Japón la vacunación con la nueva vacuna acelular, lo que

despertó numerosas reacciones en todo el mundo, los informes indican resultados

muy positivos.

La vacuna acelular japonesa tradicional contiene toxina de B. Pertussis en forma

de toxoide y hemaglutinina fibrosa. Las vacunas acelulares se introdujeron por

primera vez en Estados Unidos en 1995.

Merecen especial atención, los estudios realizados por el Centro Sclavo en Italia

que ha producido con la manipulación genética de Bordetella resultando mutantes

igualmente inmunogénicas que la toxina nativa, pero que carecen de actividad

tóxica. Estas mutantes se están empleando para desarrollar acelular que no

requiera destoxificación y que seguramente se podrán usar, inclusive para la

vacuna tradicional. (1)

19

1.3.3 Riesgo y Beneficio de las Vacunas Celulares y Acelulares

Es evidente que lo que se procura es una vacuna altamente eficaz con mínimos

efectos colaterales.

Los resultados de distintos trabajos apoyan el concepto de que la vacuna celular

produce reacciones locales de importancia; pero también se debe admitir que

posee muy alta eficacia, induce una buena protección que se estima puede ser

entre el 90-95% y es bastante segura.

En contraste, las vacunas acelulares, que casi no producen efectos colaterales,

presentan una eficacia mucho mas baja. Según investigadores de la Academia de

Medicina Sueca establecieron que la eficacia de estas vacunas varia entre 54 y

69%, es decir el resultado es poco satisfactorio. Otra investigación sueca insiste

que la eficacia de la vacuna acelular disponible en ese país es de 89 a 100%.

Kato y Col, en el Japón, afirman que la vacuna acelular japonesa tiene el 90% de

eficacia. (1)

Es decir, que todavía no se pueden sacar conclusiones de dos estudios que

apoyen la inmunización masiva de los niños con vacunas acelulares.

El costo de las vacunas acelulares es significativamente más alto que el de la

tradicional. (9)

1.3.4 Impacto Mundial de la Vacunación

La pertussis o Tosferina es una infección bacteriana altamente contagiosa: del 90

al 100% de los niños susceptibles contraen la enfermedad al ser expuestos a un

solo sujeto infectado. (11)

20

1.3.5 Vacuna Pertussis Elaborada en el Ecuador

1.3.5.1 Generalidades

En 1945, en el Instituto Nacional de Higiene M.T. “Leopoldo Izquieta Pérez” de

Guayaquil, se inició la producción de las vacunas Tifoidea y Pertussis, del Toxoide

Diftérico y de la vacuna doble de Pertussis Difteria.

En 1966, se construyó un nuevo edificio para la Producción de Biológicos y se

inició la elaboración del Toxoide Tetánico, lo que permitió preparar la Vacuna

Triple bacteriana D.P.T. (Difteria Pertussis Tétanos) de uso oficial en los

programas de inmunización colectiva en el Ecuador. (3)

Utiliza el Método de Producción Estacionario, donde la Bordetella Pertussis crece

en medio sólido (Medio de Cohen y Wheleer`s).

Es una vacuna celular, de una excelente calidad-eficiencia antigénica y seguridad.

Contiene 16 U.O. (Unidades de Opacidad) por dosis.

1.3.5.2 Especificaciones de la Vacuna Pertussis Concentrada

Nombre: Vacuna Pertussis concentrada

Descripción: Suspensión salina blanquecina de células completas de

dos o más cepas de Bordetella Pertussis, las cuales han

sido muertas y destoxificadas con thimerosal en

condiciones adecuadas de temperatura, tiempo y pH

eliminando su toxicidad y manteniendo su

inmunogenicidad.

Aplicación propuesta: Principio activo para la formulación de la vacuna D.P.T.

Formulación: * Bacterias muertas y destoxificadas c.s.p.

* Solución salina 0.85%

* Thimerosal al 0.01%

21

Forma de presentación: Producto granel

Tiempo de vencimiento: 18 meses

Requisitos de calidad

Límites de aceptación Métodos de Ensayo

Esterilidad Ausencia de microorganismos contaminantes

Cultivo directo.

Pureza Presencia solo de coco bacilos gram negativo de Bordetella Pertussis

Microscopia

PH 6.8 a 7.4 Potenciometría

Opacidad (contenido bacteriano)

≥ 250 UO/ml Espectrofometría (Unidades opacidad)

Inocuidad Inocuo, los animales no deben presentar signos de enfermedad o muerte

Prueba biológica .

Toxicidad Específica

Al final de las 72 h. El peso del grupo de ratones no es menor que al momento de la inoculación. Al final de los 7 días el peso promedio ganado por ratón no es menor que el 60% de aquel del grupo control.

Prueba biológica

Potencia No menos de 4 UI/DHS Prueba biológica Contenido de thimerosal

0.005 a 0.02 g % Espectrofotometría

Manipulación: Manipular con cuidado, evitar exposición al ambiente y a altas

temperaturas.

Almacenamiento: De 2º a 8º C.

Transporte: Transportar en cajas termo manteniendo cadena de frío.

22

0

Microscopia

Esterilidad

OPACIDAD

pH

CENTRIFUGACION

ELABORACION DE PRESEMILLA (Incubación 72Horas, 35ºC)

ELABORACION DE SEMILLA (Incubación 72Horas, 35ºC)

SIEMBRA (Incubación 72 horas, 35ºC)

COSECHA (Incubación 72 horas, 35ºC)

TOXICIDAD ESPECIFICA

POTENCIA

CONTENIDO DE THIMEROSAL

PUREZA

IDENTIDAD

PUREZA

PUREZA

DESCARTAR SOBRENADANTE

PUREZA

PUREZA

AUSENCIA B. PERTUSSIS

VIVA

MASA BACTERIANA

SUSPENSIONES INDIVIDUALES

OPACIDAD

OPACIDAD

PUREZA

ESTERILIDAD

INOCUIDAD

PUREZA

pH

ESTERILIDAD

Ph

RECONSTITUCION DE CEPA LIOFILIZADA

(SEMILLA DE TRABAJO)Incubación 72 Horas, 35º C

MUERTE Y DESTOXIFICACION

VACUNA PERTUSSIS

CONCENTRADA

1.3.6 Diagrama de Flujo del proceso de producción de Vacuna Pertussis

23

1.3.7 DESCRIPCIÓN DE LAS ÁREAS DE PRODUCCIÓN

La Vacuna Pertussis concentrada se produce en una área estéril, de gran

asepsia, de atmósfera controlada clasificada como tipos A y B con pisos antipolvo

y liso, paredes y techos de cemento pulido recubiertos de pintura epóxica, puertas

de acero inoxidable, aluminio y vidrio hemérticas y lavables. Esta área posee

sistema de climatización con aire filtrado por filtros HEPA de alta eficiencia y

mesones de trabajo de granito cubiertos con resina epóxica.

1.3.8 EQUIPAMIENTO UTILIZADO

• Autoclave

• Destilador de agua

• Horno

• Balanza Analítica

• Cabina de Bioseguridad Clase II tipo A

• Comprobador de Vacío

• pH metro

• Microscopio

• Centrífuga Refrigerada

• Liofilizador

• Cámara Fría (2º C - 8º C)

• Cuarto incubadora (35º C - 37º C)

24

CAPITULO II

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

2.1 Problema

Al cambiar la presentación de ampollas a viales al liofilizar la Cepa Bordetella

Pertussis hay factores determinantes que facilitarían el proceso de liofilización

para la obtención de un producto de excelente calidad.

2.2 Hipótesis

¿ De qué factores dependerá el proceso de liofilización de la Cepa Bordetella

Pertussis al realizar el cambio de presentación de ampollas a viales?

2.3 Objetivos

General

Contribuir al conocimiento del estudio de los factores determinantes de la calidad

del liofilizado de Bordetella Pertussis en la presentación de viales, en el Instituto

Nacional de Higiene M.T. “Leopoldo Izquieta Pérez” de Guayaquil, período

Enero-Octubre del 2002.

Especificos

• Determinar los factores que influyen en la calidad del liofilizado de la

presentación en viales.

• Evaluar los factores técnicos del proceso de liofilización en viales.

• Correlacionar los proceso técnicos de la producción de la cepa de Bordetella

Pertussis para ampollas y viales.

25

2.4 Variables a Evaluar

Para la interpretación de los datos primarios, se emplearán las siguientes

variables:

Variables Cualitativas

• Aspecto físico del liofilizado.

• Color

• Consistencia

• Pureza

• Prueba de vacío del liofilizado

• Esterilidad del liofilizado

Variables Cuantitativas

• Tiempo de Liofilización

• Temperatura del proceso

• Unidades de medida del vacío

• Humedad

26

CAPITULO III

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizó un estudio de tipo PROSPECTIVO ANALÍTICO sobre los factores

determinantes de la calidad de liofilizado de la cepa Bordetella Pertussis para

ampollas y viales, en el Instituto Nacional de Higiene M.T. “Leopoldo Izquieta

Pérez” de Guayaquil, en el período Enero-Octubre del 2002.

3.1 Universo

Está constituído por todos los lotes de ampollas y viales.

3.2 Muestra

Está constituída por un grupo selectivo de ampollas y viales, obtenidos de los

diferentes lotes elaborados en un tiempo comprendido de 10 meses, de Enero a

Octubre del 2002.

3.3 Criterio de Inclusión de Datos

Se incluyeron dentro de esta investigación:

Liofilizador del Subproceso de Vacuna Pertussis con sus implementos, ampollas y

viales utilizados en los diferentes lotes, cumpliendo con los parámetros a estudiar.

Equipos del Instituto Nacional de Higiene “Leopoldo Izquieta Pérez” de Guayaquil,

durante el periodo Enero-Octubre del 2002.

27

3.4 Criterio de Exclusión

Fueron excluídos en esta investigación los demás liofilizadores que existen en

otros subprocesos del Instituto Nacional de Higiene “Leopoldo Izquieta Pérez” de

Guayaquil.

3.5 Obtención de Datos Primarios

Para la obtención de datos primarios se elaboró una hoja de recolección de datos

donde se incluyen las variables cualitativas y cuantitativas.

Para tal efecto, se revisó el proceso de liofilización de la cepa Bordetella

Pertussis, se ejecutó las corridas necesarias y de los cuales se obtuvieron

resultados que se analizarán mas adelante.

3.6 Procedimiento de Trabajo

• Se correlacionó los procesos técnicos y materiales para la producción de

Bordetella Pertussis tanto en ampollas como en viales.

• Se controló método operativo para el proceso de liofilización.

• Se realizaron liofilizaciones en viales conteniendo el Medio Leche Descremada

al 10% (pruebas de ensayo).

• Se realizó un Lote en el que se obtuvo Liofilizado de cepa Bordetella Pertussis,

en Viales.

• Se determinaron en los Lotes liofilizados: prueba de vacío, esterilidad,

humedad, color, consistencia, morfología y aspecto físico del liofilizado.

• Se reportó los resultados de acuerdo a las pruebas realizadas.

28

3.7 Procesamiento de la Información

Toda la información recogida será procesada en una base de datos,

confeccionada en un sistema de cómputo compatible con el análisis estadístico

básico donde se empleará los sistemas clásicos Microsoft, Epinfo, Word, Excel.

Para ésto, se situaron los datos de cada presentación y sus parámetros en formas

de tablas donde se reflejó todo lo riguroso del estudio.

Una vez analizados los parámetros de las dos presentaciones, se confeccionaron

las tablas # 1 y # 2 donde constan los elementos sobresalientes que

predominaron en cada uno de los datos con el porcentaje significativo, y un

Cuadro Comparativo del proceso de liofilización en viales y ampollas, con las

Ventajas y Desventajas de las dos presentaciones.

3.8 Presentación de la Información

Toda la información será presentada en tablas o gráficos para una mejor

comprensión y análisis del estudio realizado que se obtiene de la recolección de

datos en general, de las dos presentaciones estudiadas e incluídos dentro de la

discusión de los resultados.

3.9 Materiales

Los materiales utilizados en el estudio consistieron en:

3.9.1 Equipos Utilizados

• Liofilizador. Es de procedencia Japonesa, donado al INH ”L.I.P.” de Guayaquil,

en el año 1999

• Cabina de Bioseguridad Clase II Tipo A

• Autoclave

• Destilador de Agua

• Subcero ( -40ºC)

29

• Centrífuga Refrigerada (4ºC)

• Horno

• Horno al Vacío (determinación de humedad)

• Microscopio

• Agitador Magnético

• Comprobador de Vacío

• Mechero de Bunsen

• Cámara Fría ( 2º C - 8º C)

• Cuarto Incubadora ( 35º C - 37º C)

3.9.2 Materiales

• Cepas Bordetella Pertussis (137 – 143)

• Envases: Ampollas (5ml), Viales ( 1ml) estériles

• Tapones de Caucho estériles

• Aros de Aluminio estériles

• Jeringuillas descartables de 3ml

• Agujas largas estériles

• Fiolas estériles

• Tubos estériles

• Placas Portaobjetos estériles

• Cajas de Petri estériles

• Barra Magnética estéril

• Tubos de centrífuga estériles

• Campos de gasa estériles

• Campos de algodón estériles

30

3.9.3 Medios de Cultivo

• Bordet Gengou Agar Sangre

• Leche Descremada al 10%

• Ácido Casamino al 1%

• Ácido Casamino al 1% más Solución Salina 0.85% al 0.4%

• Thioglicolate F. al 2.98%

• Soya Caldo al 3%

3.9.4 Soluciones

• Alcohol 70%

• Fenol 0.5%

• Tinción de Gram

3.9.5 Equipo Utilizado: Liofilizador

Su forma es de ramales o conectores múltiples (manifolds) para Ampollas; y

secador de bandeja cilíndrica para Viales. Estos implementos van ensamblados

al Liofilizador, que a su vez está conectado a una Bomba de Vacío (Fig. Nº 4 y

Fig. Nº 5).

31

Liofilizador para Ampollas, forma de Ramales o Conectores Múltiples (Manifolds)

FIGURA Nº 4

32

Liofilizador para Viales, forma de Campana o Secador de Bandeja Cilíndrica

FIGURA Nº 5

33

3.9.5.1 Especificaciones del Liofilizador

• Marca: Eyela

• Modelo: FDU – 830

• Presión de la Bomba: 6.7 x 10-2 (5x10-4) pa (Torr)

• Temp. de la Cámara de Secado: -80ºC

• Tiempo Requerido de refrigeración: 30Min

• Bomba de Vacío: Pirani Caudal (4-0.004 torr)

• Electricidad: 100 V AC, 50/60 Hz. 20 A, 1 fase.

• Dimensiones Ancho x Diámetro x Altura (mm): 455 x 504 x 901

• Peso Neto: 60 Kg

• Accesorios: Bomba de vacío, Removedor de hielo,

Forma T Manifold (ramales) para

Ampollas y secador de bandeja cilíndrica

para Viales

3.9.5.2 Envases Utilizados

a) Ampollas: Vidrio Neutro, incoloro, de capacidad 5 ml.

b) Viales: Vidrio Neutro, incoloro, de capacidad 1 ml.,

boca 13 mm. Con tapones ranurados, butilo gris.

Y los sellos color Standard de aluminio.

34

SELLADO DE AMPOLLAS

APAGAR EL EQUIPO

ROTULACION

REGISTRO OPTIMO INDICADOR DE VACIO

COLOCACION DE LAS AMPOLLAS (SUBCERO) A LOS RAMALES DEL MANIFOLD

LIOFILIZACION

ACTIVACION UNIDAD DE REFRIGERACION DEL

LIOFILIZADOR

COMPROBACION DE VACIO DE CADA

AMPOLLA

ALMACENAMIENTO ( 2º -8ºC)

3.9.5.3 Calidad de los Envases

• Los dos envases son de vidrio de borosilicato.

• Cumplen con los requisitos Tipo I para la Clase A de la Farmacopea de los

EE.UU.AA. para vidrio Tipo I .

• De alta durabilidad química, pueden esterilizarse repetidamente.

• Transparentes.

3.10 Funcionamiento del liofilizador

3.10.1 Método operativo para Ampollas

35

3.10.1.1 Liofilización en Ampollas

En todos los Lotes estudiados presentan las siguientes características según

variables estudiadas.

Aspecto Físico del Liofilizado

Pastilla compacta con características homogéneas.

Color

La Pastilla obtenida es de color crema.

Consistencia

Pastilla de fácil desprendimiento de las paredes de las ampollas.

Pureza

La observación realizada de la Bordetella pertussis es de morfología satisfactoria,

coco-bacilo gram negativo.

Prueba de vacío del Liofilizado

Se realizó la prueba con el Comprobador de Vacío obteniendo un porcentaje no

satisfactorio de ampollas con vacío.

Esterilidad del producto Liofilizado

La esterilidad la realicé en tubos conteniendo medio thioglicolate 2.98% y caldo

soya triptica al 3%, dando como resultado una esterilidad satisfactoria.

Tiempo del proceso de Liofilización

El tiempo del proceso de liofilización es de 6 horas.

36

Temperatura del proceso

La temperatura que alcanzó en el proceso de liofilización es de - 80ºc.

Unidades de medida de vacio

Dentro de los rangos 4 - 0.004 torr.

Humedad

Dentro de los valores de aceptación, hasta el 3% de humedad.

37

SELLADO DE VIALES

APAGAR EL EQUIPO

ROTULACION

REGISTRO OPTIMO INDICADOR DE VACIO

COLOCACION DE LOS VIALES (SUBCERO) EN LA BANDEJA CILINDRICA

LIOFILIZACION

ACTIVACION UNIDAD DE REFRIGERACION DEL

LIOFILIZADOR

COMPROBACION DE VACIO DE CADA VIAL

ALMACENAMIENTO ( 2º -8ºC)

3.10.2 Método Operativo para Viales

38

3.10.2.1 Liofilización en Viales

Aspecto Físico del Liofilizado

Pastilla compacta con características homogéneas.

Color

La pastilla obtenida es de color crema.

Consistencia

Pastilla de fácil desprendimiento de las paredes del vial.

Pureza

La observación realizada de la Bordetella pertussis es de morfología satisfactoria,

coco bacilo gam negativo.

Prueba de Vacío del Liofilizado

Se realizó la prueba con el Comprobador de Vacío obteniendo un porcentaje alto

de viales con un buen sellado.

Esterilidad del Liofilizado

La esterilidad la realicé en tubos conteniendo medio thioglicolate al 2,98% y caldo

soya triptica al 3%, dando como resultado una esterilidad satisfactoria.

Tiempo de Liofilización

El tiempo del proceso de liofilización es de 6 horas.

Temperatura del Proceso

La temperatura que alcanzó en el proceso de liofilización es de - 80ºc.

39

Unidades de Medida de Vacío

Dentro de los rangos 4 - 0.004 torr.

Humedad

Dentro de los valores de aceptación, hasta el 3% de Humedad.

40

CAPITULO IV

RESULTADOS E INTERPRETACIONES

4.1 Análisis de los Resultados e Interpretaciones

4.1.1 Análisis de las Dos Presentaciones

Después del estudio de las pruebas realizadas en cada presentación con sus

respectivas tablas, dimos origen a la siguiente tabla en la cual obtuvimos los

resultados finales de nuestro estudio.

El Aspecto Físico de las dos presentaciones fue satisfactorio al igual que el

color, consistencia y pureza del producto.

En la Prueba de Vacío se obtuvieron los siguientes resultados:

En Ampollas

• En el Lote Nº 1: 41.66 %

• En el Lote Nº 2: 66.66 %

• En el Lote Nº 3: 75.00 %

• En el Lote Nº 4: 83.33 %

En Viales

• En el Lote Nº 1: 53.84 %

• En el Lote Nº 2: 84.60 %

• En el Lote Nº 3: 96.15 %

• En el Lote Nº 4: 100 %

Demostrando que en la presentación de Viales, fue un alto porcentaje de producto

con vacío.

41

La Esterilidad en las dos presentaciones se los realizó con los Medios de Cultivo

siguientes:

• Thioglicolate F. al 2.98 %

• Soya Caldo Triptica al 3 %

Incubándolos a 35ºC y 26ºC por 14 días y obtuvimos que en las dos

presentaciones esta prueba Pasa el Ensayo (P.E.).

La Determinación de Humedad realizada en las ampollas dieron los siguientes

resultados:

En Ampollas

• En el Lote Nº 1: 2.30 %

• En el Lote Nº 2: 2.30 %

• En el Lote Nº 3: 1.88 %

• En el Lote Nº 4: 2.20 %

En Viales

• En el Lote Nº 1: 3.50 %

• En el Lote Nº 2: 3.00 %

• En el Lote Nº 3: 1.96 %

• En el Lote Nº 4: 2.30 %

Con lo cual podemos determinar que los valores están dentro de los rangos de

aceptación.

El Tiempo y la Temperatura del proceso de Liofilización fue igual en la dos

presentaciones, registrando valores óptimos de las unidades de medidas de vacío

para cada desarrollo.

42

LO

TE

12

34

ASP

ECTO

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RIO

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TISFA

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TISFA

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43

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34

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RIO

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rea

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is 14

3

44

Podemos observar que cada lote consta de 24 ampollas y que durante el proceso

de liofilización se rompen, por lo tanto son descartadas.

Los principales motivos de rotura de las ampollas se dan:

• En la selección de ampollas al ser adaptadas a los ramales del liofilizador.

• En el alargamiento de las ampollas, después del envase, conteniendo el

producto a liofilizar.

1 24 7 29.16%2 24 3 12.50%3 24 4 16.66%4 24 3 12.50%

1lote 29,162lote 12,503lote 16,664lote 12,50

100

LOTE DESCARTADAS PORCENTAJES

LIOFILIZACION EN AMPOLLAS DE CEPA BORDETELLA PERTUSSIS CEPA 137 -143

AMPOLLAS

12,50% 16,66%12,50%

29,16%

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1lote 2lote 3lote 4lote

LOTES

POR

CEN

TAJE

S

45

• En el acoplamiento de las ampollas en forma rápida a los ramales del

liofilizador, para evitar la descongelación del producto (mantenidas en el

subcero a -40º C).

• En el sellado de ampollas con el mechero de bunsen, con llama graduada

como soplete.

• Al retirarlas de los ramales del equipo previo entorchamiento de la ampolla con

el mechero.

Es decir, que se observó un porcentaje algo elevado de riesgo en la manipulación

de las ampollas.

46

Después de la liofilización se comprobó el vacío de las ampollas y podemos

observar que en los primeros lotes es elevado el número de ampollas sin vacío,

mejorando a medida que se han ido ejecutando las corridas del proceso.

1 10 41,66% 7 29,16%2 16 66,66% 5 20,83%3 18 75,00% 2 8,33%4 20 83,33% 1 4,16%

1lote 41,66 29,162lote 66,66 20,833lote 75 8,334lote 83,33 4,16

PORCENTAJEPORCENTAJELOTE

LIOFILIZACION EN AMPOLLAS DE CEPA BORDETELLA PERTUSSIS CEPA 137 -143

AMPOLLAS LIOFILIZADAS

CON VACIO

AMPOLLAS LIOFILIZADAS

SIN VACIO

83,33%

41,66%

75,00%

66,66%

4,16%8,33%

29,16% 20,83%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

1lote 2lote 3lote 4loteLOTES

PO

RC

EN

TAJE

S

47

Se determina la Humedad de cada lote de producto liofilizado y se observó la

eficacia esperada de calidad, siendo los valores de aceptación hasta el 3% de

humedad

1lote 2,3 2lote 2,3 3lote 1,88 4lote 2,2

4 2,20%

DETERMINACION DE HUMEDAD EN AMPOLLAS

LOTE HUMEDAD

1 2,30%2 2,30%3 1,88%

2,2%

1,88%

2,3%2,3%

1

1,2 1,4 1,6 1,8

2

2,2 2,4 2,6 2,8

3

1lote 2lote 3lote 4loteLOTES

PO

RC

EN

TAJE

S

48

Las pruebas de esterilidad se realizaron con los Medios Thioglicolate al 2.98% y

caldo Soya Tríptica al 3% de los productos liofilizados, en tubos a 35ºc y 26º por

14 días.

Siendo la prueba satisfactoria, no presentando crecimiento alguno, dando como

resultado que Pasa el Ensayo.

1lote 1002lote 1003lote 1004lote 100

4 100,00%

2 100,00% 3 100,00%

PRUEBA DE ESTERILIDAD EN AMPOLLAS

LOTE ESTERILIDAD

1 100,00%

100%100%100%100%

0

20

40

60

80

100

120

1lote 2lote 3lote 4lote

LOTES

ESTE

RIL

IDA

D

49

Podemos observar la eficacia en el cambio de presentación, a viales; no hay

riesgos en la manipulación del envase durante el proceso de liofilización.

Pudiendo concluir, que el cambio de presentación es conveniente para la

obtención y conservación de la Cepa Bordetella Pertussis.

1 26 0 100% 2 26 0 100% 3 26 0 100% 4 26 0 100%

1lote 100 2lote 100 3lote 100 4lote 100

LOTE VIALES DESCARTADAS PORCENTAJES

LIOFILIZACION EN VIALES DE CEPA BORDETELLA PERTUSSIS CEPA 143

100% 100% 100% 100%

0

20

40

60

80

100

120

1lote 2lote 3lote 4lote LOTES

PO

RC

EN

TAJE

S

50

En esta tabla podemos observar que existe una variación al obtener los viales

liofilizados con vacío.

En el estudio para el cambio de presentación, a viales, se basó en el uso de 3

gradillas que servían de base.

1lote 53,842lote 84,063lote 96,154lote 100,00

LOTE VIALES LIOFILIZADOS CON VACIO PORCENTAJES

1234

14

LIOFILIZACION EN VIALES DE CEPA BORDETELLA PERTUSSIS CEPA 143

222526

53,84%84,60%96,15%100,00%

100,00%96,15%

84,60%

53,84%

0

20

40

60

80

100

120

1lote 2lote 3lote 4loteLOTES

PO

RC

EN

TAJE

S

51

El Lote # 1 a base de espumaflex, como lo indico en el Anexo Nº 5 encontrando

que el material no era el adecuado para este procedimiento, por lo tanto registra

un alto valor de viales sin vacío.

El Lote # 2 se cambió a una gradilla metálica, algo inestable por su base cuya

superficie no era plana, tal como lo indica el Anexo Nº 6

El Lote # 3 se procedió a cambiar la gradilla metálica con una base estable en

que todos los viales se asientan bien y con ella partimos para realizar el proceso

en producto, según Anexo Nº 7.

Los Lotes 1 - 2 y 3 se hicieron con el Medio de ensayo Leche Descremada al

10%.

El Lote # 4 se lo realizó usando la última gradilla (metálica) y viales con la cepa

Bordetella Pertussis, obteniéndose viales con buen vacío; por lo tanto, tuvimos

un 100% de seguridad en el uso de viales en el proceso de la liofilización.

52

1lote 46,152lote 15,383lote 3,84 4lote 0

3,84%0,00%

34

VIALES LIOFILIZADOS SIN VACIO PORCENTAJES

12410

46,15%15,38%

LIOFILIZACION EN VIALES DE CEPA BORDETELLA PERTUSSIS CEPA 143

LOTE

12

03,84%

15,38%

46,15%

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1lote 2lote 3lote 4lote LOTES

PO

RC

EN

TAJE

S

53

Podemos observar que la humedad obtenida, tanto de los 3 Lotes de ensayo y 1

Lote con producto Liofilizado, su resultado es satisfactorio, siendo los valores de

aceptación hasta el 3% de humedad.

1lote 3,52lote 3,03lote 1,96 4lote 2,3

DETERMINACION DE HUMEDAD EN VIALES

2,30%

1234

LOTE HUMEDAD

3,50%3,00%1,96%

2,3%1,96%

3,0%

3,5%

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

1lote 2lote 3lote 4loteLOTES

PO

RC

EN

TAJE

S

54

En esta tabla se registran los resultados excelentes de la Prueba de Esterilidad de

los productos liofilizados, realizados con los Medios Thioglicolate al 2.98% y

Caldo Soya Tríptica al 3% en tubos a 35 º C y 26 º C por 14 días.

Por lo tanto esta prueba de Esterilidad Pasa el Ensayo (ver Anexo Nº 9).

1lote 1002lote 1003lote 1004lote 100

3 100,00% 4 100,00%

1 100,00% 2 100,00%

PRUEBA DE ESTERILIDAD EN VIALES

LOTE ESTERILIDAD

100% 100% 100% 100%

0

20

40

60

80

100

120

1lote 2lote 3lote 4lote LOTES

ES

TER

ILID

AD

55

4.1.2 Cuadro Comparativo del Proceso de Liofilización en Ampollas y

Viales

Ventajas y Desventajas:

Viales

Las Ventajas en el cambio de presentación son las siguientes:

• No encontramos variaciones en el Aspecto Físico - Color – Consistencia –

Pureza – Esterilidad y Humedad del producto Liofilizado, ni en el Tiempo –

Temperatura y Unidades de Medidas de Vacío del Proceso de Liofilización.

• No tuvimos que cambiar nada en los parámetros del liofilizador, usándolo en las

2 presentaciones. Solamente se adaptó al equipo, el Accesorio específico de su

presentación con su respectivo envase.

• Prueba de vacío: mejores resultados.

• Proceso más rápido y de menor riesgo en su manipulación y conservación.

• El Coste – Producto supera las expectativas de aceptación y ahorro.

Ampollas Las Desventajas en esta presentación son las siguientes:

• Alto porcentaje de pérdidas por rompimiento de las mismas en el proceso de

liofilización:

56

• Selección

• Envase

• Congelación

• Sellado

• Riesgo de manipulación y conservación.

• Riesgo de contaminación del producto liofilizado al iniciar el flujo de producción

con la reconstitución del mismo.

57

CAPITULO V

Conclusiones y Recomendaciones

5.1 Conclusiones

El presente trabajo ha permitido observar el Proceso de Liofilización de la Cepa

Bacteriana Bordetella Pertussis, específicamente los factores determinantes de la

calidad para su presentación en Viales y Ampollas.

Se ha podido realizar una revisión del método operativo de las dos

presentaciones, como también la optimización del proceso de liofilización para

lograr el aseguramiento de su calidad.

La presentación de la Cepa Bordetella Pertussis ha sido en Ampollas con una

excelente calidad. Pero al ser manipuladas se corre el riesgo de contaminación en

la reconstitución de la Cepa al iniciar el Flujo de Producción de vacuna Pertussis y

un alto porcentaje de pérdidas por rompimiento de las mismas en el proceso que

puede suceder en las siguientes etapas:

• En la selección de ampollas que van a ser acopladas herméticamente a los

ramales del liofilizador.

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• Después de envasado el producto a liofilizar, se realiza el alargamiento de la

ampolla utilizando el mechero de Bunsen

• Después del proceso de congelación (subcero) pues deben ser adaptadas a los

ramales, en forma rápida, para evitar su descongelación.

• Al ser selladas con el mechero de Bunsen, con llama graduada como soplete.

• Al retirarlas de los ramales del equipo previo entorchamiento (giro) de la ampolla

con el mechero.

De ahí la importancia en el cambio de presentación, a Viales, obteniendo un

proceso más rápido y de menor riesgo en su manipulación, conservación y

mejorando el Coste-producto del mismo.

Concluyendo, que los resultados obtenidos en los Viales fueron las esperadas,

conservando la calidad-eficiencia antigénica y seguridad de la Cepa Bordetella

Pertussis , no variando al cambiar la presentación.

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5.2 Recomendaciones

Los resultados obtenidos en este trabajo me permiten hacer las siguientes

recomendaciones:

• Cumplir las Buenas Prácticas de Manufactura (B.P.M.) aplicables en el proceso

de Liofilización, para obtener un producto Biológico de excelente calidad.

• Validación del proceso de Liofilización.

• Realizar un mantenimiento constante del Liofilizador.

• Que los envases utilizados en la Liofilización cumplan con las especificaciones

de calidad requerida.