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Capitulo 13 DNA:

En los cromosomas hay 30,000 genes cada

uno tiene una función. Tienen 3 x 109 pares

de células.

Nucleótido- Consiste de una azúcar, fosforo y

una base nitrogenada. La azúcar es una

pentosa, fosforo de fosfato y las bases

nitrogenadas (Adenina, Citocina, Guanina,

Timina).

El material genético consiste de una hilera de

nucleótidos, esta hilera está unida a otra por

Puentes de Hidrogeno formando una doble

hélice. El puente de Hidrogeno lo forman la

unión de base complementaria, Adenina se

une a Timina (A=T) y Guanina a Citocina

(G=C). Si en una hilera esta Adenina en la

otra hilera esta Timina y viceversa. Lo mismo

con Guanina y Citocina una base está en una

hilera y la otra en otra hilera. Ambas hileras

contienen la misma información genética.

Reacción de cadenas de Polimerasa- (PCR)

técnica para reproducir una porción de la

hilera de DNA. Esta técnica produce millones

de copias.

Enzima restrictiva- Compuesto químico que

corta el DNA en un lugar en específico.

Impresión de DNA:

Tandem Repeats (TR)- Es una región en el

cromosoma que contiene secuencias de

bases repetidas un número de veces, 30%

del genoma está compuesto de segmentos

repetidos. En humanos tienen el mismo tipo

de repeticiones pero no existe mucha

variación en el número de repeticiones.

Restriction Fragment Length Polimorphisms-

(RFLP)- Son fragmentos de diferentes largos

de par de bases que se producen al cortar el

DNA con una enzima restrictiva. Típicamente

una secuencia medular consiste de 15 a 35

bases de larga y la misma se repite miles de

veces.

En la técnica RFLP la enzima restrictiva corta

los cromosomas en cientos de fragmentos.

Algunos de estos fragmentos van a tener las

secuencias repetidas consecutivas. El DNA se

trata químicamente después de la

Electrophoresis para separar las hileras

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cortadas. El material de DNA se coloca en la

gelatina electrophoretica y se le aplica la

corriente eléctrica para separar los

fragmentos según su tamaño. Los más

pequeños y de menor peso se mueven más

rápido que los más grandes y pesados. Los

fragmentos son transferidos a una

membrana de nylon utilizando una técnica

que se conoce como Southern blotting.

Luego se hace la Hibridización que consiste

en añadir sondas marcadas con el material

radioactivo que contiene la secuencia de

bases complementarias de la secuencia

repetida consecutiva.

Luego la membrana de nylon se coloca

contra una placa de rayos x y se deja exponer

por varios días. Los marcadores radioactivos

hacen que se marquen las bandas en la

placa. Se corren fragmentos de DNA

conocidos para determinar el largo de cada

fragmento. Se van a producir dos (2) bandas

una por cada cromosoma. Un número

limitado de la población va a tener el mismo

fragmento de DNA por lo tanto NO es una

prueba individualizada.

Se utilizan diferentes sondas que reconocen

diferentes segmentos de repeticiones en el

DNA. Aumento la capacidad discriminatoria

haciendo la prueba más individualizada.

Ej. Cuatro sondas con las siguientes

probabilidades:

A= B=

C= D=

Uno en un millardo la probabilidad de otra

persona seleccionada al azar tenga las

mismas bandas.

RFLP- Fue utilizada en el análisis de la

mancha de semen del traje azul de Mónica

Lewinsky. Hubo pareo con la muestra del

Presidente Clinton.

Probabilidad:

Negro- 1.440 x 1012

Blanco- 7.870 x 1012

Hispano (este)- 3.14 x 1012

Hispano (oeste)- 9.43 x x1011

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Reacción de la cadena de Polimerasa (PCR):

Variant Number Tandem Repeat (VNTR)

Short Tándem Repeat (STR)- El número de

bases que se repiten es menor que en VNTR

y el número de repeticiones también es

menor. Son secuencias pequeñas que se

repiten consecutivamente.

En PCR vamos a reproducir un pedazo

pequeño de DNA millones de veces.

Pasos en PCR:

Calentar a 94° C para separar las

hileras de DNA.

Anadir iniciadores y bajar la

temperatura para que se unan al DNA.

Añadir la polimerasa y una mezcla de

nucleótidos (GATC) y calentar a 72° C

para que se reproduzca el STR en las

dos (2) hileras. [el primer ciclo

reproduce cuatro (4) hileras]. 30 ciclos

reproducen 1, 000,000 de copias a 2

minutos por ciclo.

Separación por Electrophoresis.

PCR se usa para producir hileras cortas (200

bases) y estas se degradan menos. Se

necesita menos DNA para PCR. La técnica

amplifica muestras tan pequeñas como 10-9

gramos.

STR- Son abundantes en el genoma humano.

La secuencia de bases que se repiten están

entre tres (3) y siete (7) bases y el largo total

de las repeticiones es menor de 400 bases.

Se utiliza STR de diferentes locus que las

bandas no interfieran una con las otras.

Multiplexing- La técnica que

simultáneamente detecta más de un STR en

un solo análisis. Se producen 2 bandas

identificadas una del padre de tres (3)

repeticiones y una por la madre de cinco (5)

repeticiones por tanto este locus es (3, 5).

Si se utilizan varios locus se va

individualizando la evidencia de DNA.

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Ej. THIO, TPOX y D75820

[Blanco] 0.081 x 0.195 x 0.065= 0.00103=

1/974

El locus Amelogenina en el cromosoma del

sexo. Hay varios STR-Y en el cromosoma Y.

Para mezclar varios varones se pueden usar 6

STR diferentes en el cromosoma Y. El

cromosoma X no dará ninguna banda. STR-Y

da una banda por locus. El locus

Amelogenina da dos (2) bandas para varón y

una para la mujer.

DNA mitocondrial:

El DNA mitocondrial se hereda de la madre

solamente y se encuentra en las

mitocondrias que están en el citoplasma de

la célula. En la célula hay un núcleo con DNA

nuclear y hay entre 500 y 1,000

mitocondrias. Por esta ser abundante se

puede usar cuando el DNA nuclear esta

degenerado. Ej. Cuerpos quemados, troncos

de pelo sin raíz, hueso, dientes etc.

El análisis de mt-DNA es más laborioso y más

costoso. El mt-DNA es circular y consta de

16,569 bases y 37 genes. Hay dos regiones

que tienen hipervariabilidad. HV-1 (342b) y

HV-2 (268b). Mediante PCR se multiplican

estas regiones luego se determina el orden

que aparecen las bases en esta región esto

se conoce como secuenciamiento.

La secuencia de bases se comprara con

aproximadamente 5,000 secuencias

diferentes en el banco de datos para ver su

frecuencia en la población la secuencia

puede ser común, rara o única. El mt-DNA no

tiene la capacidad de discriminación del DNA

nuclear.

Evidencia biológica para DNA:

Se puede hacer un análisis con 250pg si la

célula tiene 7pg de DNA solo se necesitan

0.36 células para análisis. La cantidad tan

baja necesaria permite el análisis en sangre

seca, mancha de semen, en sellos y sobres

tocados con saliva, vasos, latas, goma de

mascar, bandas para el sudor, sabanas, tejido

transferido, guantes, bolígrafos, gorras,

sombreros etc.

Hay que perpetuar la localización de

la evidencia y no afectar posibles

patrones de sangre.

Ropa, toallas, paños, sabanas, etc.

Empacar en bolsas de papel para

evitar hongos.

La sangre se saca con un hisopo

húmedo y se toma muestra control

de al lado.

Toda evidencia debe mantenerse en

nevera o frasco.

Sangre control o tejido epitelial. Ej.

Cepillo de dientes, pelo, navajas.