capitulo 10. bioseparaciones
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CAPÍTULO 10
BIOSEPARACIONES
BIOSEPARACIONES
Remoción de insolubles
Aislamiento primario
Purificación
Acabado
Introducción
Las operaciones que comprenden los
procesos biotecnológicos se dividen en
operaciones previas (“upstream”) y
operaciones posteriores o bioseparaciones
(“downstream”).
La bioseparación comprende todos los
tratamientos que requiere el caldo de cultivo
para la obtención de producto deseado con
la purificación deseada.
Evolución de los bioprocesos
Se reconocen tres generaciones
Las grandes diferencias estriban en
– El uso o no de células recombinantes
– La concentración al inicio de la bioseparación
– La concentración al final de la bioseparación
– Las técnicas de bioseparación utilizadas
Características de los procesos biotecnológicos
Característica Generación
Primera Segunda Tercera
Período - 1975 1975 - 1985 -
Tipo de células No
recombinantes Recombinantes Recombinantes
Fortaleza de las
células Alta Alta Baja
Conocimiento
de propiedades
básicas
Alto Bajo Bajo
Conocimiento
tecnológico Alto Bajo Bajo
Características de los procesos biotecnológicos
Característica Generación
Primera Segunda Tercera
Producto tipo Antibióticos
Aminoácidos Insulina humana
Factor VIII
tPA
Localización Intra y
Extracelular Intracelular Intracelular
Tamaño Intermedio Macromoléculas Macromoléculas
Actividad al
secretarse Si No No
Pureza deseada Alta Muy alta Muy alta
Similitud con
contaminantes Baja Alta Alta
Valor Bajo Alto Alto
Tarea
Qué son el factor VIII de la sangre y el
agente trombolítico activador del
plasminógeno tisular (tPA)?
El rendimiento y las etapas
Las operaciones de bioseparación deben
seleccionarse con el fin de que el costo sea
mínimo.
Se busca que el rendimiento por paso sea
alto y que el número de pasos sea mínimo
para que el rendimiento global sea alto.
Rendimiento contra número de pasos
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
Número de pasos
% d
e r
en
dim
ien
to
30%
95%
90%
80% 60%
Remoción de insolubles y ruptura celular
Los principales insolubles que se consideran son
células enteras, restos celulares y cuerpos de
inclusión.
La selección de los equipos depende de la célula, la
disponibilidad del equipo, la eficiencia y el costo.
Las operaciones típicas son la filtración (hongos
filamentosos) y la centrifugación (levaduras,
bacterias y células de mamíferos).
Cuando el producto de interés es intracelular es
necesario romper a las células.
Filtración
La filtración es la separación de un sólido de
un fluido por acción de un medio filtrante y
un gradiente de presión.
En los procesos biotecnológicos se utilizan
tres tipos de mecanismos de filtración.
– Filtración de lecho profundo
– Filtración con formación de torta (convencional)
– Filtración por membranas (micro y ultrafiltración)
Fundamentos
La filtración convencional forma parte de un
conjunto de operaciones llamadas
Bioseparaciones Sólido-Líquido (BSL).
Los fundamentos se centran en:
– La filtración como parte de los sistemas de BSL
– El pretratamiento de caldos biológicos
– La teoría de filtración convencional
La filtración como parte de los sistemas de BSL
Un proceso de
separación sólido-
líquido consta
generalmente de una
o más etapas entre
las que se destacan:
Operaciones en los procesos de BSL
En general todos los sistemas mecánicos de
BSL están basados en dos principios que
dan origen a las operaciones de:
– Sedimentación
– Filtración
Sedimentación
En el proceso de sedimentación la
separación se basa en una diferencia de
densidad entre la fase sólida y la fase
líquida. Entre mayor sea esta diferencia la
separación es más fácil. Cuando esto no
ocurre, la diferencia puede ser aumentada
aparentemente aplicando una fuerza
centrífuga o incrementando la densidad de la
partícula mediante coagulación y floculación.
Filtración
En la filtración la separación se logra
utilizando un medio físico que no permite el
paso de sólidos a través del cual el fluido se
hace pasar por medio de un gradiente de
presión.
Pretratamiento de caldos para BSL
Las propiedades de los caldos sujetos a BSL pueden ser mejoradas por medio de pretratamientos físicos, químicos o biológicos con el objeto de facilitar estas operaciones.
– Pretratamiento térmico
– Coagulación y floculación
– Uso de ayudas-filtro
Pretratamiento térmico
El calentamiento de caldos permite reducir su viscosidad, su volumen y romper estructuras gelatinosas que dificultan las operaciones posteriores. En el caso de caldos con células recombinantes esta operación es obligada por cuestiones de seguridad ambiental. Esta operación es de uso limitado cuando se manejan productos termolábiles.
Coagulación y floculación
Debido a que los caldos biológicos presentan partículas muy pequeñas (0.5 a 100 m), los pretratamientos para incrementar el tamaño de partícula facilitan su manejo.
Las partículas coloidales (tamaño en el rango de una micra) no sedimentan fácilmente debido a que por acción de las cargas superficiales forman suspensiones muy estables llamadas soles.
Coagulación
Las soles pueden ser alteradas por medio de agentes químicos. En el proceso de coagulación se emplean electrolitos simples que neutralizan las cargas repulsivas superficiales de las células o partículas, lo que genera fuerzas de atracción que permiten formar partículas más grandes y densas.
Se utilizan derivados de iones polivalentes positivos como fierro, aluminio y calcio.
Floculación
En el proceso de floculación se utilizan sustancias químicas sintéticas de alto peso molecular llamadas polielectrolitos. Estos producen un efecto combinado ya que actúan neutralizando las cargas superficiales y provocan su atrapamiento por medio de las redes que forman.
Se utilizan derivados de la poliacrilamida, polietilenimina y la poliamina.
Mecanismo de floculación
Uso de ayudas-filtro
Estas sustancias se adicionan al caldo de filtración y/o se utilizan como precubierta del filtro. Los AF actúan como adsorbentes de las partículas coloidales mejorando el tamaño de partícula y mejorando la incompresibilidad y permeabilidad de los sólidos de tal manera que se facilite su filtración.
Los AF más utilizados son las tierras de diatomeas y las perlitas.
Teoría de la filtración
La teoría de filtración convencional se deriva
de los estudios de mecánica de fluidos en
medios porosos. La ecuación que describe el
movimiento de fluidos newtonianos a través
de medios porosos fue formulada en 1856
por el geólogo francés D’arcy.
Concepto de filtración
Teoría de la filtración
La aplicación de esta ecuación al caso particular
donde se desprecian los efectos gravitacionales
(lechos cortos) puede ser descrita como:
l
Pkv
Donde:
v es la velocidad superficial del líquido (flujo volumétrico por área de
filtración)
k es la constante de permeabilidad del lecho
P es la caída de presión a través del lecho
l es la profundidad del lecho
Es la viscosidad del fluido
Teoría de filtración
La velocidad de filtrado puede ser descrita en
términos del volumen de filtrado y el área de filtración
como:
dt
dV
Av
1
Combinando ecuaciones y expresando la relación l/k
como una resistencia R:
R
P
dt
dV
A
1
Teoría de filtración
La resistencia puede expresarse como la suma de
dos resistencias en serie:
mt RR
PA
dt
dV
Esta ecuación aplica a soluciones diluidas en régimen
laminar
Tarea
Investigar sobre equipos de filtración
Centrifugación
La separación de sustancias de diferente densidad mediante movimiento giratorio se conoce como centrifugación.
La centrifugación es una de las principales operaciones utilizada para la separación de células de caldos biológicos, especialmente cuando los caldos no son fácilmente filtrables.
Cuando se utiliza la centrifugación la diferencia entre la densidad de los sólidos y el caldo, se incrementa por la acción de las fuerzas centrífugas que se generan por las altas velocidades de rotación de los equipos.
Fundamentos de la centrifugación
El estudio de las BSL por centrifugación está basado
en la teoría de la sedimentación.
La teoría de la sedimentación está basada en la Ley
de Stokes que establece los aspectos básicos del
movimiento de un sólido en un líquido cuando existe
un gradiente de densidad. Los fundamentos se
centran en:
– La Ley de Stokes
– La sedimentación por acción de la gravedad
– La sedimentación por acción de la fuerza centrífuga
– El factor G
La ley de Stokes
La velocidad de sedimentación de una
partícula esférica en un medio continuo para
Reynolds menores a 1 (región de resistencia
viscosa), está descrita por la ley de Stokes.
Se puede suponer que para las
suspensiones diluidas características de los
caldos biológicos esta ley es aplicable.
La ley de Stokes
La ley de Stokes establece que cuando se
aplica una fuerza a una partícula en un
medio continuo ésta se acelera (F = ma),
hasta que alcanza una velocidad a la cual la
resistencia a su movimiento iguala a la
fuerza aplicada.
La ley de Stokes
Las fuerzas que se oponen al movimiento de
partículas puede agruparse en la fuerza de
empuje (principio de Arquímedes) y la fuerza
de arrastre (resistencia de forma y fricción).
Entonces, en el equilibrio
Fuerza de aceleración = fuerza de flotación + fuerza de arrastre
La ley de Stokes
Para el caso de partículas esféricas:
vdadad
p
Lppp3
66
33
Donde:
dp es el diámetro de la partícula
ρp es la densidad de la partícula
a es la aceleración
ρL es la densidad del fluido
μ es la viscosidad del fluido
v∞ es la velocidad terminal de la partícula
La ley de Stokes
Resolviendo para la velocidad terminal:
18
2 adv
p
Se puede expresar la velocidad de
sedimentación de la partícula en dos casos
de interés:
– Sedimentación por acción de la gravedad
– Sedimentación por acción de la fuerza centrífuga
Sedimentación por acción de la gravedad
En varios procesos de BSL la fuerza
impulsora en la sedimentación es la
gravedad. La velocidad de sedimentación por
gravedad de una sustancia, proporciona
información básica necesaria para el diseño
de cualquiera de los procesos de
sedimentación.
18
2 gdv
p
g
Sedimentación centrífuga
En las separaciones centrífugas sólido-
líquido la velocidad de sedimentación es
mayor que en la sedimentación por gravedad
debido a que al girar los equipos producen
una mayor aceleración de las partículas.
18
22 rdv
p
Implicaciones de la ley de Stokes
El diámetro aparente de las bacterias es del orden de diez veces menor que el de las levaduras, por lo que su velocidad de sedimentación es 100 veces menor (dp
2).
Las células contienen más del 70% de agua por lo que su densidad es semejante a la de los caldos lo que ocasiona que Δρ sea pequeña.
Algunos caldos biológicos son muy viscosos propiedad que dificulta la sedimentación.
La velocidad de sedimentación en un equipo centrífugo puede incrementarse si se aumenta la velocidad de rotación o la distancia de sedimentación.
Tarea
Integrar la ecuación que describe la separación
centrífuga diferencial.
18
22 rd
dt
drv
p
Estimar el tiempo de sedimentación relativo de una
partícula celular de 5 μm de diámetro (núcleo) con
respecto al de una partícula de 1 μm de diámetro
(mitocondria), suponiendo que tienen la misma
densidad y están sujetos al mismo campo centrífugo
de acuerdo a la siguiente figura:
Tarea
Tarea
La centrífuga de la figura anterior va a ser utilizada para separar levaduras con 10 μm de diámetro y 1.05 g/cm3 de densidad. Las propiedades del caldo se pueden suponer iguales a las del agua. La distancia del eje de giro a la superficie del líquido en los tubos es R1 = 3 cm y la longitud del tubo es de 10 cm. La centrífuga gira a 400 rpm. Estimar el tiempo para lograr una sedimentación completa de las levaduras en suspensión.
Factor G
En la caracterización y escalamiento de
centrífugas frecuentemente se emplea el
factor G, que es una medida relativa de la
velocidad de sedimentación de una partícula
en un campo centrífugo con respecto a su
velocidad de sedimentación en el campo
gravitacional.
g
rG
2
Tarea
Investigar sobre equipos de centrifugación
Rompimiento de células
Cuando el producto de interés es
intracelular, una vez realizada la cosecha de
células, se hace necesario romper a las
células para la liberación del producto de
interés.
La técnica de rompimiento celular determina
el tamaño de los desechos resultantes y la
influencia que estos tendrán en las
operaciones que se utilicen para su
separación.
Productos que requieren de una ruptura celular
Tipo de producto Ejemplos
Proteínas recombinantes Insulina, proteína A,
proteína G
Enzimas l-asparaginasa, invertasa,
glucocinasa
Vacunas Tetanos, meningitis
Otros DNA, mitocondrias,
esporas, toxinas
Fundamentos
La recuperación de productos intracelulares requiere
del conocimiento de la estructura de las capas
externas que protegen a las células: la membrana y
la pared celular.
Requiere además del conocimiento de los sistemas
que permiten a ciertas células secretar los productos
de interés.
Los métodos más severos involucran el rompimiento
de la célula. Los menos severos alteran la
permeabilidad de la cubierta celular facilitando la
salida del producto de interés.
Estructura de la pared celular
Las paredes celulares de las bacterias son rígidas y porosas debido a que poseen una elevada presión osmótica interna y a que frecuentemente se hallan expuestas a diferentes condiciones ambientales externas.
Las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas poseen un esqueleto peptidoglucano rígido, cuya unidad básica es el disacárido constituido por N-acetil-D-glucosamina y el ácido C-acetilmurámico.
Estructura de la pared celular
En las células Gram-positivas la capa de
peptidoglucano es mucho más gruesa que
en las células Gram-negativas.
Los esfuerzos deben estar encaminados a
romper el esqueleto de peptidoglucano ya
sea atacando a los péptidos o a los enlaces
glucosídicos que mantienen la estructura.
Métodos de rompimiento celular
Método Técnica Principio Ejemplos
Químicos
Choque osmótico Ruptura osmótica de
membrana Ruptura de glóbulos rojos
Disolución lipídica Desestabilización de la pared
celular por solventes orgánicos
Rompimiento de
levaduras por tolueno
Digestión enzimática Digestión de la pared celular M. lysodeikticus tratados
con lisozima
Tratamiento alcalino Solubilización de membrana
por saponificación de lípidos
Mecánicos
Molido en molino de
perlas
Las células son prensadas
entre perlas de vidrio
Tratamiento de
suspensiones celulares a
gran escala
Homogeneización Las células se rompen al pasar
por un orificio pequeño
Tratamiento de
suspensiones celulares a
gran escala
Choque osmótico
Se fundamenta en el fenómeno de ósmosis.
Choque osmótico
El rompimiento celular por choque osmótico
consiste en la carga de un volumen dado de
células dentro de agua pura. La célula se
expande debido a que contiene solutos que
ocasionan un flujo osmótico hacia su interior.
Esta expansión puede conducir a su lisis o
rompimiento. La factibilidad de este método
depende de la resistencia mecánica de las
células de interés.
Disolución lipídica
La extracción por solventes ha sido usada
para la disolución selectiva de ciertos
componentes celulares.
En la técnica de disolución lipídica se añade
a la suspensión celular un volumen de
tolueno. El tolueno es absorbido dentro de
los lípidos de la pared celular, lo que
produce la expansión de la pared y ruptura
de ésta. El contenido celular es liberado.
Digestión enzimática
La digestión enzimática consiste en el empleo de
enzimas que atacan la pared y provocan el
rompimiento celular
Una de las enzimas más utilizada es la lisozima.
Esta enzima rompe el enlace entre el ácido N-
acetilmurámico y la N-acetil glucosamina de la capa
de peptidoglucano provocando el rompimiento de la
pared y de la célula misma. A pH’s menores a 5 las
células no se rompen aún cuando ya no tenga pared
celular, por lo que se deben buscar condiciones de
solubilidad favorable del protoplasma.
Métodos mecánicos
Las técnicas empleadas a gran escala son:
– La molienda húmeda en molinos de perlas
agitados a alta velocidad
– La homogenización a alta presión
La desintegración celular no es una tarea
fácil si se considera la alta resistencia
mecánica de las paredes celulares y el
tamaño tan pequeño de los microorganismos
(1-10 μm).
Tarea
Investigar como funcionan los molinos de
perlas a alta velocidad y los
homogenizadores a alta presión en el
rompimiento celular.
Métodos de permeabilización
Los métodos de permeabilización consisten
en alterar la estructura de la pared y la
membrana celular para facilitar la difusión
del producto hacia el exterior de la célula.
Para esto se utilizan solventes como tolueno
al 5%, detergentes aniónicos, catiónicos o no
iónicos, agentes caotrópicos como guanidina
y urea y agentes quelantes como el EDTA.
Comparación conceptual entre permeabilización y rompimiento
Estructuras químicas de agentes solubilizadores
Métodos de permeabilización
La base de una solubilización efectiva radica
en la estructura del detergente o agente
solubilizante. Estas estructuras tienen una
porción hidrofílica (generalmente iónica) y
una parte hidrofóbica (generalmente un
radical orgánico). Esta estructura permite
interactuar con el agua y con un lípido.
Aislamiento primario
Las técnicas más utilizadas son la extracción
y la adsorción. Estas técnicas permiten
concentrar los productos diluidos de los
caldos biológicos que son obtenidos en la
etapa de separación de sólidos.
Estas técnicas no son muy selectivas
Extracción
La extracción líquido-líquido es una
operación que permite la recuperación de un
soluto de una solución mediante su mezcla
con un solvente.
El solvente de extracción debe ser insoluble
o soluble en grado limitado en la solución
que se va a extraer y el soluto debe
presentar una elevada afinidad por el
solvente de extracción.
Extracción
La extracción líquido-líquido se realiza
básicamente en dos pasos:
– Mezcla íntima del solvente de extracción con la
solución a procesar
– Separación de la mezcla en dos fases líquidas
inmiscibles
Fundamentos
La operación de extracción implica el uso de tres tipos de sustancias cuando menos: el soluto de interés y los componentes puros de cada una de las dos fases.
En base a lo anterior, los fundamentos se centran en: – Tipos de sistemas de extracción líquido-líquido
– Química de la extracción
– Selección del solvente
– Sistemas de dos fases acuosas inmiscibles
Tipos de sistemas de extracción líquido-líquido
Los sistemas de extracción presentan
diferente grado de complejidad de acuerdo a:
– Las fases pueden ser completa o parcialmente
inmiscibles.
– La presencia de otros solutos diferentes al soluto
de interés.
– La naturaleza de las fases, siendo lo tradicional
manejar una fase acuosa y una fase orgánica.
Otros sistemas emplean dos fases acuosas
inmiscibles.
Química de la extracción líquido-líquido
Cuando un soluto es repartido entre dos
fases E y R formando soluciones diluidas, al
alcanzarse el equilibrio los potenciales
químicos del soluto en ambas fases son
iguales:
ER
El potencial químico está dado por:
ER ATEATR lnRlnR 00
Química de la extracción líquido-líquido
Si las soluciones son diluidas
Definiendo el coeficiente de partición
xTEyTR lnRlnR 00
y
xK p
Definiendo el coeficiente de partición
T
ERK p
Rln
00
Propiedades del coeficiente de partición
El coeficiente se define sólo en un punto de equilibrio
El coeficiente varía con el nivel de concentración de equilibrio
Para sistemas diluidos el coeficiente puede considerarse constante e igual a la constante de equilibrio
El coeficiente es constante a un temperatura dada, independientemente de la concentración o presión global del sistema
Un valor alto del coeficiente indica que en el equilibrio la concentración de soluto en el extracto es mayor que en el refinado
Los valores del coeficiente se determinan experimentalmente
Coeficientes de partición
Compuesto Soluto Solvente Kp Observaciones
Aminoácidos
Glicina
Lisina
Ac. Glutámico
n-butanol/agua
n-butanol/agua
n-butanol/agua
0.01
0.20
0.07
25 °C
Antibióticos
Celesticetina
Eritromicina
Novobiocina
Penicilina F
Penicilina K
n-butanol/agua
Amil acetato/agua
Butil acetato/agua
Amil acetato/agua
Amil acetato/agua
110.00
120.00
100.00
0.01
32.00
0.06
12.00
0.10
a pH 7.0
a pH 10.5
a pH 4.0
a pH 6.0
a pH 4.0
a pH 6.0
Proteínas
Glucosa
isomerasa
Catalasa
PEG 1550/fosfato de
potasio
PEG/dextrano crudo
3.0
3.0
Cambios en el solvente
Lo primero que puede hacerse para mejorar
un sistema de extracción es cambiar el
solvente de extracción por uno cuyo potencial
químico estándar esté más próximo a μ0(R).
Puesto que la termodinámica no puede
realizar esto con seguridad se utiliza un
enfoque aproximado que utiliza parámetros de
solubilidad en el cálculo de coeficientes de
partición.
Cambios en el solvente
El coeficiente de partición puede ser expresado como:
A
EAERARp
TV
VVK
Rln
22
Donde:
Vi son los volúmenes molares parciales del solvente pesado, R, el solvente ligero, E, y el soluto A.
δi son los parámetros de solubilidad correspondientes.
Parámetros de solubilidad
Solvente δ (cal1/2 cm-3/2)
Amilacetato 8.0
Disulfuro de carbono 10.0
Tetracloruro de carbono 8.6
Cloroformo 9.2
Ciclohexano 8.2
Tolueno 8.9
Agua 9.4
Cambios en el soluto
Cuando no es factible cambiar el solvente es
necesario ver la posibilidad de realizar
cambios en el soluto. Estos cambios deben
ser de carácter reversible.
– Cambios en el soluto por pares de iones
– Cambios en el soluto por pH
Cambios en el soluto por pares de iones
Los cambios en el soluto dependen del
comportamiento iónico que éste pueda tener.
Si el soluto tiene comportamiento iónico y es
posible encontrar un material que permita
suprimir esta ionicidad sin alterar el soluto,
entonces la unión del soluto a este material
permitirá aumentar la solubilidad del soluto
en el solvente de extracción.
Cambios en el soluto por pares de iones
Los cambios a solutos empleando
contraiones se basan en el hecho de que un
soluto que es iónico en agua, formará un
par-ión sin carga neta en un solvente
orgánico.
Cambios en el soluto por pares de iones
Si de una solución acuosa de cloruro de tetrabutilamonio se extrae el catión utilizando cloroformo, se tiene
3.1
aguaen
cloroformoen
494
494
HCN
HCNK p
Si se agrega acetato de sodio a la solución acuosa y se realiza de nuevo la extracción, se encuentra
132
aguaen
cloroformoen
494
494
HCN
HCNK p
Cambios en el soluto por pares de iones
Puede observarse que en el primer caso se
extrae una solución diluida de par-ión de
N(C4H9)4+Cl – y que en el segundo caso se
obtiene una solución más concentrada de
par-ión de CH3COO – N(C4H9)4+.
El empleo de pares iónicos requiere de la
selección de contraiones solubles en la fase
no polar. Este tipo de sustancias se conoce
como sales grasas.
Contraiones típicos
Ion Estructura química Observaciones
Acetato CH3COO- Simple, poco soluble en
solventes orgánicos
Butirato CH3(CH2)2COO- Más soluble en solventes
orgánicos que el acetato
Tetrabutilamonio (C4H9)4N+ Sólido
Hexadecil-tributilamonio CH3(CH2)15(C4H9)3N+ Puede formar micelas
Perfluor-octanato CF3(CF2)6COO- Puede permanecer iónico
en solventes orgánicos
Dodecanato CH3(CH2)10COO- Puede formar micelas
Linolato CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=(CH2)7COO- Puede formar cristales
líquidos
Tetrafenil-boruro B(C6H5)4- Puede degradarse en
varios solventes
Cambios en el soluto por pH
Algunos productos como las proteínas o los
aminoácidos son sensibles a cambios en el
pH por lo que el conocimiento de las
propiedades ácido-base es sumamente
importante.
Muchos de los solutos que se desean aislar
son ácidos o bases débiles por lo que su
extracción puede ser afectada por cambios
en el pH.
Cambios en el soluto por pH
Un ácido débil puede ionizarse parcialmente en
agua y no ionizarse significativamente en un
solvente orgánico.
El ácido débil RCOOH, en solución acuosa, se
disocia de la siguiente manera:
HCOOCOOH RR
Su constante de disociación es
R
RRa
COOH
HCOOK
R
R
Cambios en el soluto por pH
Cuando este ácido débil se distribuye en dos fases,
una orgánica, E, y una acuosa, R, el coeficiente de
partición aparente se expresa como
Combinando ecuaciones
Ra
ip
H
K
KK
1
RR
Ep
COOCOOH
COOHK
RR
R
Cambios en el soluto por pH
El Ki es el coeficiente de partición intrínseco y se
define como
Puesto que pKa = - log Ka
a
p
i pKpHK
K
1log10
R
Ei
COOH
COOHK
R
R
Cambios en el soluto por pH
Para una base débil: pHpKK
Kb
p
i
1log10
Los cambios en el coeficiente de partición pueden ser usados
también para seleccionar el pH al que debe extraerse
preferentemente un soluto determinado. Para dos solutos A y B
la selectividad de la separación está dada por β, donde:
H
AK
H
BK
BK
AK
a
a
i
i
1
1
Tarea
Se dice que una variación de una unidad positiva entre el pH y el pKa provoca que poco más del 90% de las moléculas se encuentren en la forma ionizada. Por el contrario una variación de una unidad negativa entre el pH y el pKa provoca que poco más de 90% de las moléculas se encuentren en la forma molecular.
Compruebe esta afirmación utilizando la ecuación de Henderson-Hasselbach.
Valores de pKa para solutos biológicos
Compuesto pK1 pK2 pK3
Ácido acético 4.76
H3PO4 2.14
Leucina 2.36 (COOH) 9.6 (αNH3+)
Histidina 1.82 (COOH) 9.17 (αNH3+) 6.0 (grupo R)
Lisina 2.18 (COOH) 8.95 (αNH3+) 10.53 (grupo R)
Gly-Gly 3.06 (COOH) 8.13 (αNH3+)
Gly-Asp 2.81 (COOH) 8.60 (αNH3+) 4.45 (grupo R)
Cefalosporina 3.9 5.3 10.5
Lincomicina 7.6
Penicilamina 1.8
Tarea
En el sistema agua-amilacetato la penicilina
K y la penicilina F tienen valores de Ki de
215 y 131, respectivamente. Sus pKa’s son
de 2.77 y 3.51.
Si se desea recuperar penicilina F,
determinar cómo se alcanza mayor pureza
de producto: si se extrae a pH 3.0 o a pH
4.0.
Selección del solvente
Se toman en cuenta las siguientes consideraciones: – Selectividad. Para cuando se requiere concentrar con cierto
grado de purificación.
– Coeficiente de partición. Mientras mayor sea menor será la cantidad de solvente a utilizar.
– Grado de solubilidad. Mientras más insoluble sea en la alimentación, la extracción será más fácil.
– Facilidad de recuperación (reutilización).
– Densidad. Mientras mayor sea la diferencia de densidad mayor será la separación de fases.
– Tensión superficial. Una tensión superficial alta favorece la coalescencia.
– Estabilidad del soluto. El solvente no debe cambiar al soluto.
– Otras. Inocuo, esterilizable, no-inflamable, barato y disponible.
Tarea
Investigar la solubilidad de diferentes
solventes orgánicos en agua (solventes
inmiscibles con el agua) así como su
densidad.
Extracción en dos fases acuosas inmiscibles
Cuando se opera con sistemas biológicos hay un número limitado de solventes que pueden ser usados en los procesos de extracción ya que algunas moléculas de interés como las proteínas, pueden ser desnaturalizadas por los solventes orgánicos.
La extracción en dos fases acuosas inmiscibles permite preservar la actividad de las biomoléculas.
Extracción en dos fases acuosas inmiscibles
En general los sistemas de dos fases
acuosas se pueden clasificar en dos tipos:
– Los sistemas polímero-polímero
– Los sistemas polímero-sal
Extracción en dos fases acuosas inmiscibles
Los sistemas de dos fases acuosas inmiscibles
polímero-polímero se forman cuando dos
polímeros como el polietilen-glicol (PEG) y el
dextrano (un carbohidrato) se mezclan en
presencia de agua.
En el caso de los sistemas polímero-sal, el
sistema se forma por la mezcla en agua de un
polímero y una sal como el fosfato de potasio.
El hecho común es que ambas fases son acuosas
y el contenido de agua varía entre 85 y 99%.
Extracción en dos fases acuosas inmiscibles
Los sistemas de dos fases se caracterizan
por presentar una baja tensión superficial en
el rango de 0.0001 a 0.1 dina/cm.
Esta baja tensión superficial y el hecho de
que las fases sean acuosas proporciona un
medio ambiente que permite que las
biomoléculas y partículas celulares puedan
repartirse entre las fases conservando su
actividad.
Extracción en dos fases acuosas inmiscibles
La extracción con dos fases acuosas de enzimas y proteínas es atractiva debido a que:
– El escalamiento es sencillo (no hay variación del coeficiente de partición con la escala).
– La transferencia de masa es alta y el equilibrio se alcanza con poca energía de mezclado.
– Se puede realizar en forma continua.
– Los polímeros le confieren estabilidad a las proteínas.
– La separación puede ser selectiva y rápida
– La separación puede efectuarse a temperatura ambiente.
– Es más económica que otros procesos.
Adsorción
La adsorción es una de las operaciones más
utilizadas en la etapa de concentración de
caldos acuosos diluidos. Mediante la
adsorción, las moléculas de un soluto se
concentran en una superficie sólida por la
acción de fuerzas intermoleculares entre el
soluto y el sólido. Debido a la naturaleza de
estas fuerzas el fenómeno es fácilmente
reversible.
Etapas de la adsorción
Fundamentos
Las operaciones de adsorción son utilizadas en
la recuperación de productos biotecnológicos
como aminoácidos, antibióticos, vitaminas y
enzimas.
Por lo anterior es necesario conocer los
fundamentos de la adsorción que se centran en:
– Los tipos de adsorción según el tipo de interacción
– Los tipos de adsorbentes
– Las relaciones de equilibrio
– La cinética de adsorción
Tipos de adsorción según el tipo de interacción soluto-adsorbente
De acuerdo al tipo de interacción del soluto
con el adsorbente, se distinguen cuatro tipos
básicos de adsorción:
– Física
– Iónica
– Hidrofóbica
– Por afinidad
Tipos de adsorción
Tipos de adsorbentes
En el caso de la adsorción física, el
adsorbente más utilizado es el carbón
activado y menor grado la silica gel. También
se utilizan resinas sintéticas derivadas del
estireno-divinilbenceno para la adsorción de
solutos no polares a partir de solventes
polares. Las resinas basadas en ésteres
acrílicos remueven solutos polares de
solventes no polares.
Tipos de adsorbentes
Los adsorbentes más utilizados para
intercambio iónico son sintéticos. Estos
adsorbentes están formados por matrices de
polímero unidos lateralmente. A la matriz se le
unen grupos funcionales que le dan la
capacidad de intercambio iónico.
Estos adsorbentes también son derivados del
estireno-divinilbenceno. También se utilizan
matrices de celulosa activada.
Tipos de adsorbentes
En la adsorción por afinidad el adsorbente
consta de dos partes, el soporte o matriz y el
ligando. El ligando se une a la matriz por
medio de un brazo que evita impedimentos
estéricos.
Las matrices utilizadas son fabricadas de
celulosa, celulosa modificada, poliacrilamida,
dextrano y agarosa.
Relaciones de equilibrio
El análisis de los procesos de adsorción requiere
de datos de equilibrio que se expresan
normalmente como isotermas de adsorción. Las
isotermas son parte esencial para modelar la
adsorción y por lo tanto para el diseño, cálculo de
eficiencias y costos. Las isotermas nos permiten
estimar el grado de purificación que puede ser
alcanzado, la cantidad de adsorbente requerido y
la sensibilidad del proceso respecto a la
concentración del producto.
Isotermas de adsorción más comunes
Isoterma de Freundlich
La isoterma de Freundlich se describe por la ecuación exponencial:
nKyq
Donde
q es la cantidad de soluto adsorbida por cantidad de adsorbente, y es la concentración de soluto en la solución, n es una constante adimensional y K es una constante cuyas unidades dependen de n.
Tanto K como n se determinan experimentalmente.
Isoterma lineal
La isoterma lineal se describe por la siguiente ecuación :
Kyq
Donde
q es la cantidad de soluto adsorbida por cantidad de adsorbente, y es la concentración de soluto en la solución y K es una constante de proporcionalidad que se determina experimentalmente.
Isoterma tipo Langmuir
La isoterma tipo Langmuir se describe por la siguiente ecuación :
yK
yqq
d
o
Donde
qo es la capacidad máxima del adsorbente y Kd es la constante de desorción
Ambas constantes, qo y Kd, se determinan experimentalmente
Tarea
Los datos de equilibrio de la adsorción de albúmina de
suero bovino en Q-sefarosa se presentan en la tabla
y mg/ml q mg/ml
0.05 30.00
0.10 43.70
0.20 56.53
1.00 73.85
2.00 76.81
4.00 78.37
Encontrar la expresión matemática
de la isoterma que mejor ajusta los
datos
Cinética de la adsorción
El estudio de las isotermas de adsorción nos permite determinar el grado de separación que puede ser logrado y la sensibilidad del proceso con respecto a la concentración del soluto. Sin embargo, para el desarrollo del modelo de la adsorción es necesario poder establecer la velocidad de adsorción (mediante el empleo de coeficientes de transferencia de masa) o el tiempo necesario para alcanzar una cierta separación.
Cinética de la adsorción
La velocidad efectiva de la adsorción
depende tanto de las condiciones de
operación (flujo, temperatura, composición y
presión), como de la configuración del
sistema (intermitente, columna, etc.) y del
tamaño del equipo. El estudio de estos
efectos se divide en dos conceptos:
– Los mecanismos de transporte (físicos y químicos)
– Los efectos de mezclado
Mecanismos de transporte
En los procesos de adsorción se utilizan
materiales porosos que ofrecen una gran área
por unidad de volumen.
Las resistencias al movimiento del soluto en
adsorbentes porosos son:
– Resistencia de la película que rodea al adsorbente
– Resistencia a la difusión en el seno del adsorbente
– Resistencia a la difusión dentro del poro
– Resistencia a la reacción en la superficie
Resistencias en la adsorción
Control de la resistencia en la película
Cuando la resistencia de la película es
mucho mayor que la del poro o la de la
reacción de superficie, la velocidad de
adsorción está controlada por el flujo de
soluto a través de la película que rodea al
adsorbente. En este caso la expresión de
velocidad de adsorción puede expresarse
como:
*yyakR L
Control de la resistencia en la película
Donde: – kL es el coeficiente de transferencia de masa
– a es el área del adsorbente por unidad de volumen de lecho
– y es la concentración de soluto en el seno del líquido
– y* es la concentración de soluto en el líquido en equilibrio con la concentración de soluto en el adsorbente
– R es la velocidad de adsorción referida al volumen del lecho
*yyakR L
Control de la resistencia en la película
La resistencia de la película por si misma
rara vez controla la rapidez de la
transferencia de masa, excepto en los casos
en que la partícula de adsorbente es
pequeña y la difusividad en el poro es
grande.
Control de la resistencia en la película
Para sistemas de adsorción en columnas, kL
generalmente se puede correlacionar con
una expresión de la forma:
baCC ScReSh 21
AB
pL
D
dkSh
L
pLdv
Re
ABL
L
D
Sc
Control de la difusión del soluto en el seno del adsorbente
La difusión en la fase sólida del soluto una
vez que ha pasado del seno del líquido a la
fase sólida, se presenta en algunos sólidos
homogéneos permeables como la resinas de
intercambio iónico o en adsorbentes porosos
impregnados con líquido. Considerando una
geometría esférica uniforme el balance de
soluto en la partícula está dado por:
r
q
rr
qD
t
qs
22
2
Control de la difusión del soluto en el seno del adsorbente
Donde:
– Ds es la difusividad efectiva del soluto en la fase
sólida
– r es la coordenada radial al interior de la partícula
– q es la concentración de soluto en la fase sólida
r
q
rr
qD
t
qs
22
2
Control de la difusión del soluto en el seno del adsorbente
Las condiciones frontera son:
r
q
rr
qD
t
qs
22
2
aRr
sr
qaDR
0
0
rr
q
Control de la difusión del soluto en la fase líquida al interior de los poros
Cuando la velocidad de adsorción está
controlada por la difusión del soluto al
interior de los poros de la partícula de
adsorbente, hasta el sitio de adsorción, el
balance de soluto al interior de la partícula
está dado por la expresión:
t
q
r
y
rr
yD
t
yp
1
22
2
Control de la reacción de superficie
Generalmente la reacción de adsorción en la superficie
del adsorbente es mucho más rápida que los otros
mecanismos y rara vez es el mecanismo controlante.
Dos expresiones utilizadas para sistemas de
intercambio iónico son:
– Cinética reversible de primer orden
– Cinética reversible de segundo orden
qkykR 21
qkqqykR o 21
Efectos de mezclado
La velocidad de adsorción efectiva también
puede disminuir por efectos de un mezclado
imperfecto. Esta situación es característica
de columnas largas donde se presentan
irregularidades en el flujo (canalamiento) o
en el mezclado (espacios muertos, difusión
molecular o dispersión axial).
Efectos de mezclado
Uno de los modelos más utilizados para
describir la desviación del comportamiento
ideal del flujo al interior de columnas, es el
modelo de flujo tapón con dispersión, donde
los efectos de la dispersión axial debida a
remolinos y a la difusión molecular, se
agrupan en el concepto del coeficiente
efectivo de dispersión axial.
Modelo de flujo tapón con dispersión
Resistencias combinadas
En la elaboración de un modelo cinético se puede suponer que una resistencia a la transferencia de masa es la controlante, lo cual simplifica la solución matemática del modelo de adsorción. Sin embargo en algunos sistemas, la cinética de adsorción puede ser descrita en forma más adecuada utilizando un modelo donde la combinación de resistencias (por ejemplo película y poro) describen en forma más precisa la cinética,
Resistencias combinadas
Surge entonces el coeficiente global de
transferencia de masa y solo basta fijar si las
resistencia están relacionadas en serie o en
paralelo. Por ejemplo, si se consideran que las
resistencias de película y poro están actuando
en serie se tiene:
pLo kkK
111
Adsorción en lecho fijo
La adsorción en lecho fijo es la operación más
empleada a escala industrial para la concentración de
caldos. Este tipo de operación se efectúa en columnas
empacadas con adsorbente. Por la parte superior de la
columna se alimenta la solución que contiene al soluto
de interés. Durante su paso por la columna el soluto es
adsorbido en el lecho y la solución agotada es obtenida
en el fondo de la misma. Una vez que la concentración
de soluto a la salida alcanza cierta concentración, se
interrumpe la operación y se recupera el soluto
concentrado.
Adsorción en lecho fijo
En la descripción de la adsorción en columna
se utilizan gráficas de la variación de la
concentración de soluto a la salida de la
columna con el tiempo. Estas gráficas son
llamadas curvas de rompimiento.
La forma de esta curva depende del tipo de
equilibrio del sistema y de los mecanismos de
transporte involucrados.
Teoría cinética
Los modelos de columnas de adsorción que
se enmarcan dentro de la teoría cinética se
desarrollan mediante la combinación de
balances de masa, relaciones de equilibrio,
relaciones de transferencia de masa entre
las fases y las condiciones iniciales y de
frontera del sistema.
Balance de soluto en el volumen de una columna de adsorción
Balance de soluto en la fase líquida
Velocidad de acumulación de soluto en la
fase líquida = velocidad de entrada de soluto
por convección – velocidad de salida de
soluto por convección + velocidad de entrada
de soluto por dispersión – velocidad de
salida de soluto por dispersión – velocidad
de adsorción de soluto por el sólido.
Balances de soluto en las fases líquida y sólida
En un sistema isotérmico y despreciando los
efectos radiales este balance puede ser
escrito como:
Rdz
dyv
z
yE
t
y
2
2
El balance de masa del soluto sobre el
adsorbente se puede expresar como:
Rt
q
1