I. Cap 5 MARCO TERICOEl acondicionamiento de los materiales as como la esterilizacin de los mismos es el primer paso en el control microbiolgico de los alimentos, pues de l depender el xito del anlisis.2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOREl calor acta desnaturalizando y coagulando las protenas.2.1.1.- ESTERILIZACIN POR CALOR SECOSe requiere temperaturas elevadas y un periodo ms prolongado de calentamiento que la esterilizacin con vapor. Su uso est limitado primariamente a la esterilizacin de material de vidrio y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor.El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco debido a la desecacin en general, lesin por oxidacin y efectos txicos de los niveles de electrlitos.En ausencia de agua, disminuye el nmero de grupos polares de la cadena peptdica y se requiere ms energa para abrir las molculas, de all la aparente mayor estabilidad del organismo.Se emplea el horno o estufa de esterilizacin, en la que se aplica una temperatura de 160-170C durante 1 hora.

a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de kolhe, esptulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar rpidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriolgico u horno Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170-180C por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material de vidrio.2.1.2ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDOSe usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se encuentran hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del recipiente de esterilizacin, el vapor debe conservarse a una presin de 1000g/cm3 sobre la presin atmosfrica para obtener una temperatura de 121C. Se produce tambin rupturas de cadena nica en el ADN, y la prdida de la viabilidad de las clulas expuestas a calor leve puede correlacionarse con la introduccin de estas rupturas. La lesin de ADN parece ser enzimtica, como resultado de activacin o liberacin de una nucleasa.El calor produce tambin una prdida de la integridad funcional de la membrana y filtracin de pequeas molculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosmico y aparentemente es resultado de la degradacin de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento con calor. Existe tambin degradacin del ARN ribosmico y la prdida de viabilidad de las clulas expuestas a temperaturas elevadas.a) Por Ebullicin. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100C) por 15-35 minutos.b) Vapor de agua sin Presin. Se coloca el material a esterilizar a la accin del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100C; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza para materiales termolbiles como es el caso de algunos medios de cultivo.c) Vapor de agua con Presin. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presin y 121C por 15-20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurizacin o tindalizacin.c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilndrica, paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de: Caldera de material resistente, fondo cncavo cubierta de una camisa metlica cilndrica. Dispositivos para la instalacin de la fuente calorfica (gas, electricidad o vapor de agua). Orificios superiores para purga de gases de combustin. Tapa con vlvula de seguridad, espita, manmetro. Canastilla para colocar el material a esterilizar.

2.2ESTERILIZACIN POR FILTRACINConsiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a esterilizar a travs de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilizacin de sustancias termolbiles. El material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.1.3 ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETAPoseen efectos letales y mutagnicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente bactericida en la regin espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, ste mtodo presenta muchas dificultades tcnicas.II. MATERIALES Y EQUIPO Material de vidrio: pipetas, palcas Petri Erlenmeyer, tubos de ensayo Papel craff, algodn, gasa, tijeras Mechero de Bunsen Horno Pasteur de aire caliente Autoclave

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL4.1 PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZARa) Preparacin de tubos matraces Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilizacin deben llevar sus tapones de algodn respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos, preparados segn el mtodo siguiente: De acuerdo al tapn a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodn de fibra, extendida, rectangular Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra. Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud. Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para drsele la forma de cono truncado, con el dimetro a la medida del recipiente a taponar, el tapn debe entrar en el recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.

Tubos de Ensayo Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel slo la zona de las bocas.

Frascos y Matraces Los frascos y matraces se taponan con algodn, se cubre con papel kraft y se amarra con hilo pabilo. Colocar el nombre del medio de cultivo Rotular la fecha de preparacin.b) Preparacin para proteger las pipetas En el extremo de succin de cada pipeta introducir una porcin de algodn con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado. Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de la pipeta girndose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata con una torsin para protegerla y se rompe el resto de papel sobrante. Anotar con un lpiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilizacin.c) Preparacin de las placas Petri Cortar papel kraft tamao adecuado para cubrir ntegramente las placas petri completas. Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa ponindose esta en el centro, se envuelve la placa tomndose dos extremos opuestos del papel, dndose una vuelta alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan en tringulos, rematndose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa, dndosele una apariencia de paquete de regalo.4.2 ESTERILIZACIN CON CALOR SECOEl procedimiento de esterilizacin por aire caliente slo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal.a) Procedimiento para la esterilizacin en horno Ponga el termostato a l75C y encienda el horno. Si hay un ventilador verifique que est funcionando. Vigile el termmetro. Cuando la temperatura llegue a l75C. sgase calentando durante 60 minutos ms. Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60C. Abra la puerta del horno. El papel empleado para envolver deber de haber tomado un color marrn oscuro, si el color del papel es amarillo plido indicar que el horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido indicar que el horno se ha calentado demasiado.4.3 ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDOa) Procedimiento para la esterilizacin con autoclave Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cercirese que el agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje. Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden aadir indicadores de la esterilizacin, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada. Cierre la tapa de la autoclave, cerciorndose de que la arandela de goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado. Abrir la vlvula de salida del aire. Inicie el calentamiento de la autoclave. Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicar que todo el aire ha sido expulsado de la autoclave. Cierre a continuacin la vlvula de salida del aire. Apritense los sujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperatura ligeramente. Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120C se deber regular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos. Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido. Cuando la temperatura descienda a menos de 80C abra la vlvula de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera del autoclave. Deje enfriar la autoclave y a continuacin retire cuidadosamente la canasta con los utensilios estriles.REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con esto, siempre se requerir una fuente de energa y una fuente no energtica como son las sales, factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energa son necesarias para su desarrollo.

2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGTICOS DE LOS MICROORGANISMOS

A. FUENTES DE CARBONOEn la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azcares en forma de mono o disacridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar azcares ms complejas para obtener energa., como es el caso del almidn.Existen tambin bacterias capaces de utilizar el gas carbnico CO2 hecho que es caracterstico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolittrofas.Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos como fuente de energa: Ejemplo: Cladosporium.Por ltimo, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energa un gran nmero de componentes hidrocarbonados diferentes.

B. FUENTE DE NITROGENOPueden presentarse como protenas completas, que sera el caso de la gelatina o incluso protenas an ms complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas etc.Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que corresponden a pptidos o polipptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son tambin protenas que estn parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal. El bio-Thione, es una denominacin comercial correspondiente a una peptona ppsica de carne.La casena en forma de peptona tripsica de casena se usa para estudiar la formacin de indol por parte de la bacteria debido al alto contenido de triptfano que posee este tipo de peptona. Tambin es utilizada para estudiar la reduccin de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos.La peptona papanica de soja, es una fuente de nitrgeno especialmente para hongos y ciertos grmenes como Neisserias.Otra fuente de nitrgeno serian: nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco, sales de amonio, aminocidos, etc.

2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGTICOS DE LOS MICROROGANISMOS

A. FUENTE DE AZUFRETodos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir de algn aminocido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.

B. FUENTE DE FSFOROEn general, las bacterias que utilizan el fsforo lo suelen hacer en forma de fosfato.

C. IONES METLICOSSon utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.Tambin se encuentra otro tipo de iones metlicos Cobalto, Molibdeno.Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentracin pueden inhibir el crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros. Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous. Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus.

D. FACTORES DE CRECIMIENTOExisten bacterias que an con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta adems una serie de componentes definidos que no son capaces de fabricar por s solas.A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algn tipo de aminocido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases pricas o pirimidinicas, etc.Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos: Agar sangre enriquecido con metionina, cido glutmico y cido nicotinico para el crecimiento de Xanthomonas. El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias hmedas, lisas y grises del Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y est enriquecido con otros cofactores, como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo. Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella pertusis. Se observa colonias en gotas de mercurio brillantes es fcil de apreciar. Agar sangre enriquecido con nitrgeno suplementario y vitaminas del complejo B para el crecimiento del Flavobacterium.

E. FACTORES INHIBIDORESSon componentes que van a impedir el crecimiento de algn tipo de microorganismo por bloqueo de sus procesos metablicos.Los antibiticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.La azida sdica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los Grampositivos.Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.Las sustancias inhibidoras son muy tiles para la identificacin y tipificacin de pruebas bioqumicas de las bacterias.

Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:

Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias Gramnegativas.El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de anilina y van a inhibir el crecimiento de los microorganismos Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las Enterobacterias.Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentracin de sales biliares y citrato de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes.

2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO

Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario: Una composicin de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo. Unas condiciones fsico-qumicas apropiadas. De acuerdo con ello, habra que considerar:A. TEMPERATURA PTIMALos microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categoras siguientes en funcin de los rangos de temperatura de crecimiento. Los psicrfilos crecen bien a 0C y tienen una temperatura ptima o inferior, la mxima es de 20C. Se aslan del rtico y Antrtico. Pueden crecer a 0C, aunque su temperatura ptima sea 20 a 30C y la mxima de casi 35C. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefaccin de alimentos refrigerados. Los Mesfilos, crecen a una temperatura ptima de 20 a 45C, siendo la mnima de 15 a 20C y la mxima de casi 45C. La mayora de los microorganismos pertenecen a esta categora. Las bacterias patgenas para el hombre suelen crecer a una temperatura ptima de 37C. Los termfilos, pueden crecer a una temperatura de 55C o superiores. La temperatura mnima es normalmente de 45C y la ptima es de 55 a 65C. Microorganismos que crecen en fardos de heno, tuberas de agua caliente, aguas termales. Los Hipertermfilos, temperatura ptima de entre 80C y casi 113C, no crecen por debajo de 55C. Microorganismos aislados en zonas calientes del suelo marino.

RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANOMicroorganismoTemperaturas cardinales (C)

MnimaptimaMxima

Bacillus psichrophilusMicrocococcus cryophilusPseudomona fluorescensStaphylococcus aureusEnterococcus faecalisEscherichia coliNeisseria gonorrhoeaeThermoplasma acidophilumBacillus stearthermophilusSulfolobus acidocaldariusPyrococcus abyssiPyrodictium occultumPvrolobus fumariiCandida scottiSaccharomyces cerevisiaeMucor pusillus-10-446.50103045306067829001-321-2323-241025-3030-37373735-365960-6580961051064-152845-5028-30244046444538627585102110113154050-58

B. GRADO DE HUMEDAD Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.En general, cualquier medio slido o lquido requiere cierta proporcin de agua.En medios sin agua es muy difcil el crecimiento bacteriano: de ah que la liofilizacin y cualquier mtodo de deshidratacin, sea un buen medio de conservacin.

C. pHCada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH ptimo de crecimiento. Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5. Los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0 Los alcalfilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5La mayora de las bacterias y protozoos son neutrfilos.La mayora de hongos prefieren medios ligeramente cidos, con valores de pH de 4 a 6.Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismos alterando la membrana plasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras.El pH ptimo en la mayora de los casos es cercano a la neutralidad.Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy cido, a pH prximo a 0. Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8. El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos que se producen por la degradacin de los nutrientes por parte de las bacterias. Es tpico que en la fermentacin glucdica se produzca acidificacin del medio o en la degradacin proteica utilizando la bacteria sales amnicas como fuente de energa se alcalinice el medio.Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro de los lmites fisiolgicos.EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

MicroorganismoLmite inferiorpH ptimoLmite superior

Picrophilus oshimaeThiobacillus thiooxidansSulfolobus acidocaldariusLactobacillus acidophilusStaphylococcus aureusProteus vulgarisEscherichia coliClostridium sporogenesPseudomonas aeuriginosaNitrosomonasBacillus pasteuriiBacillus alcalophilus00.51.04.0-4.64.24.44.45.5-5.85.67.0-7.68.58.50.72.0-3.52.55.8-6.67.0-7.56.0-7.06.0-7.06.0-7.66.6-7.08.0-8.8SD10.6SD6.04.06.89.38.49.08.5-9.08.09.4SD11.5

D. PRESIN OSMTICASe suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que pueden crecer a concentraciones algo superiores.Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotnicos; este hecho es debido a su pared rgida que permite que el agua no penetre en la bacteria y sta se rompa.En las bacterias halfilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de cloruro sdico; Ej: Staphylococus.Como la concentracin osmtica de un hbitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw).

Actividad del AguaAmbienteMicroorganismo

1.00 (agua pura)

0.950.900.850.800.75

0.700.60Sangre

PanJamnSalamiConservasLagos salados Pescado saladoCereales, dulcesChocolateLeche deshidratadaMayora de Gramnegativosno halfilosBacilos Grampositivos, BasidiomycetesCocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, RhizopusStaphylococus, SaccharomycesPenicillumHalobacterium, AspergillusActinosporaAspergillusSaccharomycesXeromyces

E. CONCENTRACION DE OXGENOUn organismo que puede crecer en presencia de oxgeno atmosfrico es AEROBIO, mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor en su presencia.Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto en su presencia como en su ausencia.Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides. Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia.Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energa mediante la respiracin aerobia y deben utilizar vas de fermentacin o respiracin anaerobia para este objetivo.Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son MICROAEROFILOS que son daados por el nivel de oxigeno atmosfrico 20% precisando para su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxgeno.Captulo 6

2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, as como diferentes clasificaciones. De acuerdo con esto y segn criterios se podran dividir en:

2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU PROPORCIN EN AGUA

A. MEDIOS SLIDOSCorresponden a aquellos medios donde la proporcin en agar est siempre por encima del 15%. La importancia, de los medios slidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificacin y visualizacin del crecimiento en colonias, as como su posible identificacin a travs de medios especficos y diferenciales de caracteres, slidos elaboracin de antibiogramas, etc.Ejemplo de medios de cultivo: Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos. Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes. Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus. Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos. Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfologa de las colonias.

B. MEDIOS LQUIDOSTambin denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realizacin de recuentos bacteriolgicos por turbidimetra, especialmente til en levaduras, para la realizacin de inculos, para obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibiticos, cidos lcticos, etc.Ejemplo de medios de cultivo: Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradacin de glucosa. Caldo Peptona, para investigar la produccin de Indol. Caldo Lactosado, para investigar la formacin de cido y gas Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difciles de cultivar.C. MEDIOS SEMISLIDOSSon medios intermedios entre los lquidos y los slidos; su proporcin en agar suele ser inferior al 5% pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semislida. Son tiles para algunas pruebas bioqumicas: Agar SIM, estudiar movilidad, produccin de H2S, Indol. Agar MIO, estudiar movilidad, produccin de Indol y Ornitina.

2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU USO O UTILIZACIN

A. MEDIOS PARA AISLAMIENTOSon medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias aisladas. Estos, segn sea su composicin, se pueden a su vez dividir en:A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOSSon medios a los cuales, como su nombre indica, se les aade adems de los componentes bsicos, uno o varios elementos, como por ejemplo casena soja, triptfano, etc., que facilitan el crecimiento de algn tipo de microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo que buscamos.

A.2. MEDIOS SELECTIVOSSon medios en cuya composicin presentan componentes que impiden el crecimiento de algn tipo bacteriano. Medio Salmonella Shigella, contiene en su composicin sales biliares, citrato de sodio y el verde brillante que inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el grupo coliforme.A.3. MEDIOS DIFERENCIALESCorresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y, lo que es ms caracterstico de este medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que van a crecer en dicho medio, dan una informacin suplementaria y especfica, es decir, diferencial; por ejemplo: El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composicin eosina y azul de metileno que inhiben el crecimiento de los Grampositivos y algunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento de la enterobacterias, que segn utilicen o no la lactosa darn lugar a una coloracin caracterstica para cada tipo de microorganismo.Los medios diferenciales suelen ser tambin selectivos y se usan con fines de aislamiento e identificacin. Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar la Glucosa, Lactosa y Sacarosa, adems si puede producir H2S. Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o desamina el aminocido Lisina. Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono.

B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERALSon medios ya sea en forma lquida o slida que sirven para el cultivo de la mayor parte de las bacterias. Su composicin va a corresponder a una fuente de carbono, una fuente de nitrgeno, sales y agua. Dentro de los medios generales ms empleados tendramos el caldo comn, que est compuesto por extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sdico y agua.

C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPASSon medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante perodos de tiempo relativamente largos mantenindose tales medios generalmente a temperaturas lo suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses.

2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU COMPOSICINA. MEDIOS NATURALESB. MEDIOS SEMISINTTICOSC. MEDIOS SINTTICOSD. MEDIOS COMPLEJOS

2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACINA. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOSB. MEDIOS YA PREPARADOSC. MEDIOS SLIDOS EN PLACA PETRID. MEDIOS SLIDOS EN TUBOD.1. Con Agar InclinadoD.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de FlautaE. MEDIOS LQUIDOS EN TUBOMATERIALES Y REACTIVOS

a. MATERIAL REQUERIDO Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Esptula. Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo.

b. MEDIOS DE CULTIVO Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac ConkeyAgar Sabouraud. Agar LIA . Agar Manitol salado.

I. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1. PREPARACIN Para la preparacin de medios de cultivo se usa agua destilada. El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, segn la cantidad que est indicada en la etiqueta del medio de cultivo. Agregar el medio de cultivo en el matraz, y aadir la mitad del volumen de agua que se requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensin homognea, despus incorporar el agua restante, aprovechando esta adicin para desprender e incorporar al conjunto las partculas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente. Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolucin. Para reconocer que se ha alcanzado una disolucin completa, al agitar no debe adherirse el medio a la pared interna del recipiente; la solucin es viscosa y resbala libremente. Tapar el matraz con el tapn de algodn, envolver con papel Kraft y pabilos.

4.2. ESTERILIZACION Se esterilizar el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario. El tiempo es de 15 minutos a 121C.

4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55C. Previamente hay que remover el medio de cultivo hacindolo oscilar en sentido circular su recipiente para garantizar la homogeneidad del medio. Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan en la posicin deseada: Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado Pico o inclinado Fondo El medio de cultivo se deja solidificar en la posicin lograda. Repartir: En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo: Agar nutritivo Agar Mac Conkey Agar EMB Agar Sabouraud En Tubos: la posicin de pico y fondo (aproximadamente 4 ml) Agar TSI Agar LIA En Tubos: la posicin de pico (aproximadamente 2 a 3 ml) Agar Citrato de Simmons En tubos: la posicin de Fondo (aproximadamente 3 ml) Agar SIM

4.4. ALMACENAMIENTO Los medios de cultivo deshidratados debern conservarse en lugar seco, protegidos contra la luz, a una temperatura de 15C a 30C, y en envases bien cerrados. Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un slo tiempo limitado de conservacin. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservacin es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 8C. Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, debern pre encintarse con cinta adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa.4.5. COMPOSICION Y PREPARACIN DE CADA UNO DE LOS MEDIOS UTILIZADOS AGAR NUTRITIVO ComposicinPeptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 gAgar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 mPreparacin Disolver los ingredientes a bao mara, enfriar y ajustar a pH= 7.2 Autoclavar a 121C por 15 min Descripcin del MedioRequerimiento EnergticoFuente de carbono: AGAR-AGARFuente de nitrgeno: EXTRACTO DE CARNE- PEPTONARequerimiento no EnergticoFuente de azufre: CISTEINA Y METIONINAFuente de fsforo: EXTRACTO DE CARNE Iones metlicos: CLORURO DE SODIOFactores de crecimiento: ____________________Factores de arranque: ______________________Factores inhibidores: PENICILINA Segn su proporcin en agua: AGAR NUTRITIVO EN MEDIO SEMISECO Segn su uso o utilizacin: MEDIO PURO CRECIEMIENTO MICROBIANO POLO OXIDANTE Segn la composicin: MEDIO COMPLETO SEMISINTETICO Segn su presentacin: MEDIO SEMISECO EN UNA PLACA PETRI

AGAR MAC CONKEYComposicinPeptona de casena17.0 g. Rojo neutro0.03 g. Peptona de carne 3.0 g.Cristal violeta 0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares1.5 g. Cloruro de sodio 5.0 gAgar Agar 12.5 g. Agua destilada1000 ml.Preparacin Disolver los ingredientes a bao mara, enfriar y ajustar a pH= 7.0 Autoclavar a 121C por 15 min Repetir en placa petriDescripcin del MedioRequerimiento EnergticoFuente de carbono: PEPTONAFuente de nitrgeno: PEPTONARequerimiento no EnergticoFuente de azufre: PEPTONA DE CASEINA Fuente de fsforo: PEPTONA DE CARNEIones metlicos: CLORURO DE SODIOFactores de crecimiento: NO ESTA PRESENTEFactores de arranque: UTILIZAR LA TECNICA DE PLAUR PLATEFactores inhibidores: CRISTAL DE VIOLETA , ROJO NEUTROSegn su proporcin en agua MEDIO DE CULTIVO SEMI-SOLIDOSegn su uso o utilizacin EN UN MEDIO SELECTIVO Y DIFERENCIAL Segn la composicin EN UN MEDIO SELECTIVO O DEFINIDO Segn su presentacin MEDIO PRESENTADO EN PLACA PETRI AGAR TSIComposicinExtracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de sacarosa,Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa,Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 gAgua destilada, 1000 mlPreparacin Disolver los ingredientes en unos 700ml de H2O en bao mara luego se enrasa a 1000 ml seguidamente se reparte ne los tubos. Autoclavar a 121C por 15 min Descripcin del MedioRequerimiento EnergticoFuente de carbono: SACARPAS, LACTOSA, AGAR-AGARFuente de nitrgeno: PEPTONA, EXTRACTO DE LEVADURA,EXTRACTO DE CARNE,CITRATO DE AMONIORequerimiento no EnergticoFuente de azufre: TIOSULFATO DE SODIOFuente de fsforo: PEPTONAIones metlicos: TIOSULFATO DE SODIO Y CLORURO DE SODIOFactores de crecimiento: NO HAY Factores de arranque: NO HAY Factores inhibidores: ROJO FENOLSegn su proporcin en agua MEDIO DE CULTIVO SEMISOLIDOSegn su uso o utilizacin MEDIO DIFRENCIALSegn la composicin MEDIO SINTETICO Y DIFERENCIALSegn su presentacin EN TUBOS DE ENSAYO FONDO .PICO

MEDIO EMB.

ComposicinFosfato dipotsico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa, sacarosa, caseina, Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 mlPreparacin Disolver los ingredientes a bao mara y luego se agregan los azucares y colorantes y ajustar a pH= 7.0 Autoclavar a 121C por 15 min Descripcin del MedioRequerimiento EnergticoFuente de carbono: LACTOSA, SACAROSA, AGAR-AGARFuente de nitrgeno: PEPTONA, CASEINARequerimiento no EnergticoFuente de azufre: CASEINA, SULFATO DE MAGNESIOFuente de fsforo: FOSFATO DIPOTASICOIones metlicos: SULFATO DE MAGNESIO. FOSFATO DIPOTASICOFactores de crecimiento: NO HAY Factores de arranque: NO HAYFactores inhibidores: AZUL DE METILENOSegn su proporcin en agua MEDIO DE CULTIVO SEMISOLIDOSegn su uso o utilizacin MEDIO DIFERENCIALSegn la composicin MEDIO SINTETICO Y DIFERENCIAL Segn su presentacin. EN TUBO DE ENSAYO FONDO-PICO DE FLAUTA

CALDO LURIA BERTANI (LB)ComposicinExtracto de levadura,5 g. , Cloruro de sodio10.. g. Triptona10gAgua destilada100. mlPreparacin Disolver los ingredientes a bao mara y luego se agregan los azucares y colorantes y ajustar a pH= 7.0 Autoclavar a 121C por 15 minDescripcin del MedioRequerimiento EnergticoFuente de carbono: EXTRACTO DE LEVADURAFuente de nitrgeno: TRIPTONARequerimiento no EnergticoFuente de azufre: NO ESTA PRESENTE Fuente de fsforo: _______________________Iones metlicos: _________________________Factores de crecimiento: ___________________Factores de arranque: _____________________Factores inhibidores: _____________________

II. CUESTIONARIO

1. Defina Ud. los siguientes trminos y mencione 1 ejemplo de microorganismo: Aerobios obligados, Anaerobio facultativo, Anaerobio aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo.

Oxgeno No todos los microorganismos necesitan 02, sin embargo, muchas formas de vida requieren oxgeno para llevar a cabo respiracin aerbica. Los microorganismos que utilizan oxgeno molecular son llamados aerbicos. Estos se clasifican en aerbicos obligados que son los que requieren oxgenos molecular para viviraerbicos facultativos los cuales utilizan el oxgeno molecular cuando est presente, pero en su ausencia continan su crecimiento por la va de fermentacin o respiracin anaerbica, un ejemplo es Escherichia coli. anaerbico obligados que necesitan ausencia de oxgeno molecular para crecer y donde este generalmente es txico, un ejemplo es el gnero Clostridium. Estos microorganismos obtienen el tomo de oxgeno molecular del agua. anaerbicos aerotolerantes los cuales no utilizan el oxgenos molecular para su crecimiento, pero pueden tolerarlo. Los microaeroflicos slo pueden crecer en concentraciones de oxgeno molecular menor a las encontradas en el aire.

2. Cules son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo?

Ser nutritivos. contener los componentes necesarios a los requerimientos del m.o de inters pH adecuado. La mayora requiere pHs neutros, pero algunos no, como Thiobacillus ferroxidans pH=2.0 Ser estril. para garantizar slo el desarrollo del los m.o de inters

3. Cual es al funcin del agar-agar en los medios de cultivo? Elagaroagar-agares unagelatinavegetalde origenmarino. Es unpolisacridosin ramificaciones obtenido de lapared celularde varias especies dealgasde los gnerosGelidium,EuchemayGracilaria, entre otros, resultando, segn la especie, de un color caracterstico. La palabra agar viene delmalayoagar-agar, que significa jalea. Tambin es conocido por los nombres gelosa, gelosina, gelatina vegetal, gelatina china o gelatina japonesa. Esta gelatina ha sido utilizada desde tiempos antiguos en los pases deExtremo Oriente(China, Japn, Corea, etc.) y llevada a Europa hacia la mitad del siglo XIX. En la actualidad se cultiva en muchas zonas

4. Por qu es difcil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw?

5. A qu se denomina medio sinttico o definido? De 3 ejemplos. Medios sintticos: son aquellos que tienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando en un medio de composicin perdectamente definida

6. Qu es un medio complejo?. De 3 ejemplos. Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas con minerales y otras sustancias.Ejm. Extracto de levadura, agar-papa, extracto de maz.En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.

7. Qu es un medio selectivo?. De 3 ejemplos. Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos especficos.Estos medios se enriquecen aadiendo sustancias que inhiban el crecimiento de la flora no deseada. Un buen ejemplo sera el medio TCBS (tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa), especial para aislamiento de especies del gnero Vibrio, en el que la sustancia inhibitoria son las sales biliares

8. Qu es un medio diferencial?. De 3 ejemplos.

Medios diferenciales: contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningn tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos

I. MARCO TEORICO

Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados.Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas: Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca. Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son contaminantes, hacindose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros.2.1. SIEMBRAProcedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo adecuados para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de inoculacin, puedan desarrollarse y multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades:a. Para hacer un aislamiento.b. Para hacer un transplante.AISLAMIENTOPermite la separacin de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra problema. Se requiere un medio slido con gran superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por formacin de colonias separadas. Si se aslan especies distintas, cada colonia tendr caractersticas especiales, la morfologa bacteriana ser tambin distintiva.TRANSPLANTESignifica la separacin previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede ser lquido o slido.Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios especiales, se logra conocer las propiedades culturales y bioqumicas y como resultado la identificacin especfica. Los trasplantes se pueden realizar:1.De lquido a slido.2.De lquido a lquido.3. De slido a slido.4.De slido a lquido.2.2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACIONExisten los siguientes materiales:

ASAS DE SIEMBRAEl asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en asa o recta y en el otro extremo insertado con un mango cilndrico para un uso sencillo.Se utiliza para inoculacin o siembra por estra en medios slidos, presentan un arco bastante cerrado en su extremo cuyo dimetro es ms o menos especfico es decir muchas asas son calibradas y corresponden a un volumen determinado de siembra las ms utilizadas son las de 0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.

HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA)Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo, nicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semislidos y slidos.

ASAS DE DIGRASKYSon asas de vidrio en forma de tringulo ms o menos abierto. Se utiliza para extender el inculo lquido previamente adicionado en la placa, a travs de una pipeta pasteur. Se esteriliza en autoclave, aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.

HISOPOSSe utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra desecacin, deterioro o contaminacin. Sirve para extender la muestra a travs del hisopo en el medio de cultivo. Se suele comercializar ya estril listo para utilizar y desechables.

PIPETASSe pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables por esterilizacin o de plstico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen volmenes especficos), en cuyo caso su aspiracin se realizar con aspiradores para pipeta tipo pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene volmenes graduados son muy utilizados en bacteriologa y cuya aspiracin se realiza con chupetes de goma. Tambin nos encontramos con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un determinado medio de cultivo.2.3. PREPAPACION DE INOCULOSUn inculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de microorganismos problema. As pues, se debe partir, por un lado, de un, cultivo puro y, por otro lado, de una concentracin adecuada de microorganismos problema.Si la muestra no es pura se aplicar distintos mtodos para el aislamiento mediante tcnicas especficas, como es el caso de la siembra por estras en placa o por agotamiento, o la tcnica de la placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento ms o menos separado de los microorganismos. Es muy til usar medios de cultivo enriquecidos especficos y diferenciales que permitan el crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos. De esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como puro.

METODOS DE PREPARACION DE INOCULOSSi la muestra es slida o semislida se tomar siempre con asa de siembra estril. Si la muestra es lquida se tomar con pipeta graduada o pipeta pasteur estril en cantidad suficiente y, en ambos casos se homogenizar2.4. PREPARACIN DE INCULOSSi la muestra es slida o semislida se tomara siempre con asa de siembra estril. Si la muestra es lquida se tomar con pipeta graduada o pipera pasteur estril en cantidad suficiente, y en ambos casos se homogenizar posteriormente en el medio especfico de cultivo.

Si la muestra tomada con asa de siembra estril se adiciona a un medio lquido se homogenizar y se dejar crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para organismos patgenos coincidir con la temperatura corporal, dejndolos crecer aproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesaria la utilizacin de un rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo el medio lquido, aunque esto va a depender de su aplicacin posterior y de la cantidad de inculo que se requiera.Si la muestra se toma con asa de siembra estril y se adiciona en un medio de cultivo slido, se utilizara diferentes tcnicas de siembra y posteriormente se verificar el cultivo, ej. siembra por agotamiento.Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un medio liquido, se homogenizar la mezcla inicial por agitacin y se dejar crecer a una temperatura de 37C por 24 horas. Es importante que los inculos sean siempre jvenes.Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y sta se aade a un medio slido, se extender con el asa de Digrasky, previamente estril a travs de toda la placa incubndose a a temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren tambin cultivos jvenes.

Los medios lquidos pueden ser agua destilada estril, solucin salina estril o caldo de cultivo base.

A veces es necesario partir de un inculo con un nmero aproximados de microorganismos problema. En estos casos, los inculos se establecen en medios lquidos y el nmero de microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparacin de medios lquidos con diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una batera de tubos cada uno de las cuales tiene distinta turbidez segn la concentracin de sulfato brico. Cada tubo corresponder a una determinada concentracin de microorganismos.

2.5. METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MTODOS DE AISLAMIENTO)El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea lquido o slido se denomina siembra o inoculacin.El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra.La siembra del inculo puede realizarse en medio slido o en medio lquido.2.5.1 SIEMBRA DEL INCULO EN EL MEDIO SLIDO Estas siembras pueden darse en placa o en tubo.

2.5.2. SIEMBRA DEL INCULO EN PLACATodo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio slido. Se va descargando gradualmente el inculo, para que en los ltimos planos del medio queden escasas clulas aisladas que en el ambiente nutritivo se irn multiplicando, logartmicamente hasta formar colonias puras.Los mtodos de aislamiento varan segn el dispositivo de siembra y la forma de distribuir el inculo.Cualquiera que sea el mtodo ensayado, aprovechando el mximo de superficie del medio se logra el aislamiento de mayor nmero de cepas microbianas.CLASES DE SIEMBRA Siembra por agotamiento o por estras. Siembra por difusin. Siembra por diseminacin.a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLECon el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se construye una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partir de aqu se realizar movimientos en zig - zag de un extremo a otro de la placa no tomndose en ningn momento nuevos inculos y no levantndose el asa hasta concluir la siembra en toda la placa.

- ESTRIA MLTIPLE Se tomar la muestra problema con el asa de siembra previamente estril y dicho inculo se depositar en el extremo superior de la placa, extendindose de un extremo a otro de sta solo en la parte superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa repetiremos el proceso anterior que nos permitir arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde qued la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma direccin se repite la operacin hasta un total de cuatro o cinco veces, que son los que tienen cabida aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el ltimo tramo se efectuar hacia el interior de la misma.El resultado son colonias cada vez ms separadas como consecuencia de que cada vez que se va arrastrando y separando ms la muestra. Es importante que para separar estas colonias se realice en cada estra un flameado previo del asa de siembra.

- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTESCon un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se dibujan dos lneas perpendiculares que debern cruzarse en el centro de la placa de tal forma que esta queda dividida en cuatro cuadrantes iguales. Se tomar con el asa de siembra estril una cantidad de inculo y se adicionar en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendindose por todo ese cuadrante en forma de zig - zag. Realizamos la misma operacin sin flamear el asa en todos los dems cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema observndose en el ltimo cuadrante las colonias ms aisladas o separadas.- TECNICA DE LOS TRES GIROSSe rotula la placa en forma anloga al caso anterior. Se toma inculo con el asa de platino y se siembra por estra la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90 y volveremos a sembrar una segunda vez. As sucesivamente hasta completar toda la siembre (girando de nuevo la placa 900) sta tcnica no es muy utilizada.

b. SIEMBRA POR DIFUSION (TCNICA DE BARRY)En este mtodo, el medio de cultivo se mezcla con el inculo, al solidificar las colonias crecen en diferentes niveles, los cuales servirn para contaje de colonias.Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a una temperatura de 45 a 50C) en el tubo, en el tubo se adicionar la cantidad de inculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogenizar la muestra en el tubo mediante el vibrador.Una vez, constituida la muestra, se vierte sta en la placa Petri estril y se dejar solidificar, la mezcla tambin se podra realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenizacin en este caso es ms difcil. Esta tcnica es utilizada, por ejemplo, para la determinacin de CMI (concentracin mnima inhibitoria) de un antibitico frente a determinados microorganismos.c. SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).Consiste en adicionar el medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml segn los casos con una pipeta graduada estril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky tambin estril. Esta tcnica se puede utilizar para el recuento de clulas viables, antibogramas, etc.

2.6. SIEMBRA DEL INCULO EN TUBOa. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SLIDO INCLINADOSe toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se aade al tubo desde el fondo de la superficie de sta realizando movimientos ascendentes en zig - zag hasta completar toda la superficie del medio. Este mtodo es utilizado para conservar cepas durante largos perodos, as como para la realizacin de ciertas pruebas bioqumicas como la prueba de ureasa.

b. SIEMBRA POR PICADURASe suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones tambin puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de esta y en posicin central. Esta tcnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semislidos ej. medio de oxidacin - fermentacin de Hugh-Leiffson.

c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA Consiste en la utilizacin de las dos tcnicas anteriormente descritas. Este mtodo se lleva a cabo cuando el medio es slido y est inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estra ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato entre otras.

2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA CELULARESEl empleo de microorganismos en Biotecnologa se fundamente en la obtencin de cultivos puros, que estn constituidos por una nica especie microbiana. La mayora de las aplicaciones en biotecnologa conlleve el uso de cultivos puros.La mayora de los mtodos de obtencin de cultivos puros se basa en algn mtodo de dilucin. El mtodo ms til y prctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las clulas individuales queden separadas una de otras. Cada clula aislada crece ahora para formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las clulas que componen la colonia son la progenie de una nica clula original.Existen varios mtodos para confirmar la pureza de un cultivo:1. Repitiendo la operacin de aislamiento; una colonia aislada procedente de un aislamiento en placa inicial debera dar lugar al repetir la operacin a colonias todas del mismo tipo, y cuya morfologa concuerda con la del aislamiento inicial.2. El examen microscpico de los organismos procedentes de una colonia deberan mostrar un nico tipo celular. Los mtodos diferenciales de tincin Gram, son tiles pare establecer que la colonia una mezcla de tipos microbianos diferentes.Es necesario emplear una tcnica asptica para transferir los cultivos puros y para mantener la esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando aspticamente, el biotecnlogo tome prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la contaminacin o de las soluciones con microorganismos no deseados.

INTRODUCCIN

Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetra mide la entidad de luz transmitida por la suspensin, mientras que la medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometra. Por estos procedimientos se puede estimar el nmero de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensin bacteriana es directamente proporcional a la concentracin de clulas en el cultivo. El espectrofotmetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromtica por medio de un filtro que permite slo el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensin bacteriana es medida por una clula fotoelctrica e inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. Normalmente la multiplicacin bacteriana no se expresa como disminucin de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta ltima es directamente proporcional al nmero de bacterias presentes en la suspensin. La relacin entre la transmitancia y la absorbancia se expresa matemticamente de la siguiente manera:

Absorbancia = 2 - log % de transmitancia

Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelmetro.

Para el manejo prctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy til el uso de matraces con brazo lateral, ya que permite la realizacin de medidas sin necesidad de tomar muestras del cultivo, evitando as el riesgo de contaminacin por la manipulacin.I. OBJETIVOS

1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano.2) Realizar una curva de multiplicacin bacteriana.II. FUNDAMENTO TERICO

Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la clula aumentan en cantidad, en la mayora de organismos el crecimiento continuo hasta que la clula se divide en dos nuevas clulas, proceso denominado fisin binaria. Cada una de las clulas hijas recibe, un cromosoma completo, copias de todas las macromolculas, monmeros e iones inorgnicos.El intervalo para la formacin de dos clulas a partir de una se llama generacin y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generacin o tiempo de duplicacin,na entre los microorganismos, algunos crecen rpidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros requieren de una a tres horas, otros de varias horas o incluso das.3.1. CURVA DE CRECIMIENTOSi se inocula un medio liquido con clulas microbianas, procedentes de un cultivo que ha crecido a saturacin, en el que se ha determinado el nmero de clulas variables por minuto peridicamente y trazamos una grfica de ello, se obtiene una curva de crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases fundamentalmente y son las siguientes:1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptacin, los microorganismos se encuentran desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados hasta alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se reinicie.2. Fase Exponencial.- Llamada fase logartmica, es consecuencia de la divisin celular y las nuevas clulas crecen en progresin geomtrica, se sintetiza nuevo material celular a velocidad constante aumentando la masa en forma exponencial.3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos metablicos txicos. Aqu cesa el crecimiento de una poblacin.4. Fase de Declinacin.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con el microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel sostenido.

III. PARTE EXPERIMENTAL 4.1MATERIALES Y REACTIVOS Cubres Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo Cubetas Caldo Luria Bertani estril Jeringa descartable de 10 cc. Contmetro

Equipo Mechero Bunsen Estufa de incubacin a 37C Microscopio EspectrofotmetroIV. METODOLOGIA 5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDOCurva de Crecimiento.- Las clulas que estn creciendo en un cultivo discontinuo (en un matraz en agitacin) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento: una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las clulas en fase de latencia, que proceden de una alcuota de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida.Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo rpido. La duracin de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y genotipo del inculo, de la temperatura, de la concentracin en nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la aireacin, y de la concentracin de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo.Una vez que las clulas empiezan a crecer rpidamente, se dice que han entrado en la fase de crecimiento logartmica (log) o exponencial. En este estadio las clulas crecen rpidamente, y a diferencia de las clulas de las fases de latencia y estacionaria, la mayora de las clulas se hallan en el mismo estado fisiolgico. La velocidad de crecimiento durante la fase log depende del nivel de nutrientes y de la aireacin de cultivo. La constante de velocidad de crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicacin o tiempo de generacin).Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo y se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el cultivo a la fase estacionaria. En la fase estacionaria las clulas no estn todas en el mismo estado fisiolgico; algunas todava se estn dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morirse. Pero la poblacin total se mantiene constante. Conforme se agota la mayor parte de los nutrientes, el nmero de clulas que mueren sobrepasa al nmero de clulas que se producen, y el cultivo entra en la fase de muerte.

Realizacin (Fig. 1)(Todas las maniobras que se describen a continuacin se deben realizar en condiciones de esterilidad en las proximidades del mechero.)1. Aadir solucin salina estril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 mi) y resuspender las bacterias en la solucin salina por agitacin.2. Tomar 0.5 ml de la suspensin bacteriana con una pipeta estril y aadirlos a un matraz con 50 ml de Caldo Luria Bertani estril.3. Incubar el matraz en un bao termostatado a 37 C, con agitacin (200 rpm).4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540 nm). Ajustar el espectrofotmetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo Caldo Luria Bertani estril antes de cada medida.5. Recoger alcuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubacin y colocadas en refrigeracin hasta su lectura6. Dibujar una curva de multiplicacin con los datos obtenidos, colocando en el eje de abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.