日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 11

クロマニック テクノロジーズ

長江徳和

常識を超えた常識を超えた新規新規C18C18カラム：カラム：

すべてのピークをシャープに！すべてのピークをシャープに！

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 22

【【緒言緒言】】

カークランドによりHPLCが発明されて以来40年近く経過

するが，この間充填剤は日々改良が進められてきた。

表面多孔性（ペリキュラー）充填剤から全多孔性に，さらに近年再び粒子径を3μm以下にした表面多孔性へと，シリカ系充填基材も変化している。

またシリカ系逆相充填剤はシラノール基の影響を防ぐため，様々なエンドキャッピング技法が開発されてきた。

演者らは従来のエンドキャッピング方法の概念を変え，エンドキャッピング試薬をあらかじめオクタデシルシリル化試薬に結合させたシリル化試薬を開発した。

アミトリプチリンのピーク形状を比較することにより，この試薬で調製した充填剤の残存シラノール基の評価を行った。

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 33

Si

OMeOMe

OSiOSi

OSiCl

MeMe MeMe Me

Me

Si

OMeOMeOH

新規新規C18C18試薬試薬AA（（HMODTS)HMODTS) 特許出願中特許出願中

Si

OMeOMeMeO

ClSi

OSi

OSi

Cl

Me Me MeMe Me Me

Si

OMeOMeOH

H2O＋ ＋

toluene

80℃，4h

toluene

30℃，2h

Step 1 Step 2

ヘキサメチルオクタデシルテトラシラン

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 44

推定されるシリカ表面での結合状態推定されるシリカ表面での結合状態（（Sunniest C18Sunniest C18））

Final TMS

O

Si

OH

Si

Si O

O

OO

SiOOSi

OSi

OSi

SiO O

OO

Si

OSi

O Si

SiO

O

Si

O

Si

Si

OOOO

SiOSiO

OO

O Si

Si

Si

O O

OO

Si

OSi

O SiSiO

OOO

O

O

SiO

Si Si

O

OO

OO

O

Si

OSi

O

Si

SiOHO

O

O Si

O

SiO

SiOO O

O

Si

O H

O

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 55

2929SiSi CPCP--MAS NMRMAS NMR

O

SiO OH

OHSi

Si

O

SiO

O

OH

Si

Si

Si

O

SiO O

OSi

Si

Si

Si

O Si

R

R

R

Si

O

SiO R

RSi

Si

O Si

R

R

OH

Si

O

SiO

O

R

Si

Si

Si

O

SiO R

OHSi

Si

O Si

OH

R

OH

Si

Q2

Q3

Q4

M1

D2D1

T2T1 T3

シリカゲル

Monofunctional C18

Difunctional C18

Trifunctional C18

+ TMS

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 66

Sunniest C18Sunniest C18充填剤の物性充填剤の物性

用いたシリカゲル: 12nm, 340 m2/g, 5 μm

C18試薬結合後の炭素含有量：16.1%

最終エンドキャッピング後の炭素含有量：16.3%

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 77

アミトリプチリンのピーク比較アミトリプチリンのピーク比較ⅠⅠ

N(4)=11,000TF(4)=1.06

N(4)=8,950TF(4)=1.76

N(4)=10,000TF(4)=1.50

N(4)=10,500TF(4)=1.07

O

OH

NH CH3

CH3

メタノールメタノール CHCH33OH, pH7.5, OH, pH7.5, 40 40 ººCC

Sunniest C18 （HMODTS)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Retention time/min

A社C18

B社C181

1

1

2

1

2

2

2

３

３

３

3

４

４

４

４

Sunniest RP-AQUA

N

CH3

CH3

NHCH3

Column size: 4.6x150 mmParticle size: 5μmMobile phase: CH3OH/20mM Phosphate buffer pH7.5=80/20Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil

2 = Propranolol

3 = Nortriptyline

4 = Amitriptyline

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 88

アミトリプチリンのピーク比較アミトリプチリンのピーク比較ⅡⅡ

O

OH

NH CH3

CH3

NHCH3

メタノールメタノール CHCH33OH, pH6.0, 22OH, pH6.0, 22 ººCC

0 2 4 6 8 10 12 14

Retention time/min

N(4)=8,000TF(4)=1.10

N(4)=5,800TF(4)=2.86

N(4)=3,900TF(4)=2.92

N(4)=9,000TF(4)=1.08

Sunniest C18 (HMODTS)

A社C18

B社C181

1

1

2

1

2

2

2

３

３

３

3

４

４

４

４

Sunniest RP-AQUA

Column size: 4.6x150 mmParticle size: 5μmMobile phase: CH3OH/20mM Phosphate buffer pH6.0=80/20Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 22 ºCSample: 1 = Uracil

2 = Propranolol

3 = Nortriptyline

4 = AmitriptylineN

CH3

CH3

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 99

アミトリプチリンのピーク比較アミトリプチリンのピーク比較ⅢⅢ--AA

O

OH

NH CH3

CH3

NHCH3

アセトニトリルアセトニトリル CHCH33CN, pH7.0, 40CN, pH7.0, 40 ººCC

N

CH3

CH3

N(4)=14,000TF(4)=1.16

N(4)=13,800TF(4)=1.24

N(4)=4,300TF(4)=5.24

N(4)=4,000TF(4)=4.33

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Retention time/min

Sunniest C18 (HMODTS)

A社C18

B社C181

1

1

2

1

2

2

2

３

３

３

3

４

４

４

４

Sunniest RP-AQUA

Column size: 4.6x150 mmParticle size: 5μmMobile phase: CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0=60/40Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil

2 = Propranolol

3 = Nortriptyline

4 = Amitriptyline

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 1010

アミトリプチリンのピーク比較アミトリプチリンのピーク比較ⅢⅢ--BB

N

CH3

CH3

Column size: 150 X 4.6 mmParticle size: 5 μmMobile phase: CH3CN/20mM Phosphatebuffer pH7.0=60/40

Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºCSample: Amitriptyline

3,600 7,75Japanese company B3 C18

5,900 3.28 A110,900 2.01Japanese company B2 C18

7,400 3.77 Japanese company I1 C1850 2.23 Japanese company B1 C18

2,100 11.1 Japanese company H1 C189,200 2.52 Japanese company A2 C18

11,500 2.15 Japanese company G2 C188,500 3.07 Japanese company A1 C18

10,000 1.71 Japanese company G1 C1810,000 1.33 W3

6,700 3.44 Japanese company F1 C1810,100 1.59 WS2

11,400 0.99 Japanese company E1 C1810,600 1.97 W1

6,100 2.70 Japanese company D3 C188,300 1.74 S1

8,000 2.92 Japanese company D2 C185,300 3.25 AT

12,000 1.30 Japanese company D1 C1814,200 2.19 D2

11,200 2.01 M13,300 5.19 D1

9,500 1.09 P113,800 1.24 Sunniest RP-AQUA

8,700 2.14Japanese company C1 C1814,000 1.16 Sunniest C18(HMODTS)

NTFColumnNTFColumn

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 1111

溶質の水和状態の変化溶質の水和状態の変化

N+

CH3

CH3

H

H

O H

HOH

HOH

H

OH

N+

CH3

CH3

H

H

O H

HOH

H

OH

N+

CH3

CH3

H

H

O H

HOH

メタノール 40℃

メタノール 22℃

アセトニトリル 40℃

塩基性化合物のカチオンの周りの水和量は

カラム温度が下がるほど下がり，

メタノールよりもアセトニトリルの方が下がる

塩基性化合物のカチオンの周りの水和量が少ない

シラノール基とのイオン交換吸着相互作用が強く働く テーリング

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 1212

シラノール基を残したシラノール基を残したC18C18固定相固定相Sunrise C18Sunrise C18--SACSAC

高吸着性シラノール

O

Si

HO

Si

HO

SiO

O

SiSi

HO

HH

シロキサン結合に変換

O

Si

HO

SiO

O

SiSi Si

OHH

水和したシラノール基はアミトリプチリン（塩基性）をイオン交換相互作用で保持増大させるが，アミトリプチリンをテーリングさせない。

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 1313

酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の分離：分離：pHpHの影響の影響

0 5 10 15 20 25 30 35 40保持時間(min)

カラム：Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm移動相：

アセトニトリル/100mM 酢酸アンモニウム (70:30)流速：1.0 mL/min温度：40 ºC試料：1=ウラシル，2=トルエン, 3=プロプラノロール，

4=ノルトリプチリン，5=アミトリプチリン

pH 6.8

pH 4.1

pH 5.0

pH 5.9

pH 3.5

pH 2.7

N=13,000

N=12,500

N=11,500

N=11,500

N=11,500

1

1

1

1

1

1

2

2

2

2

2

2

3

3

3

3

3

3 4

4

4

4

4

4

5

5

5

5

5

5

アンチカオトロピックイオンであるアンモニウムイオンが安定な水和層を形成

酢酸のみ

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 1414

耐久性の評価耐久性の評価 耐酸性加速試験耐酸性加速試験

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 20 40 60 80 100 120

通液時間（ｈ）

エチ

ルベ

ンゼ

ンの

相対

保持

時間

(%)

Sunniest C18 HNODTS

B社　C18D社　C18E社　C18

耐久性試験条件Column size: 4.6x150 mmMobile phase:

CH3CN/1.0% TFA,pH1=10/90 Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 80 ºC

保持時間測定条件Column size: 4.6x150 mmMobile phase:

CH3CN/H2O=60/40Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºC Sample: 1 = Uracil

2 = Ethylbenzene

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 1515

0 2 4 6 8

Retention time/min

分離特性分離特性ⅠⅠ

0 5 10 15 20 25 30 35

Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm 4.6x150 mmMobile phase: CH3OH/H2O=75/25Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºC Pressure: 5.4 MPaSample: 1 = Uracil,

2 = Caffeine,3 = Phenol,4 = Butylbenzene5 = o-Terphenyl6 = Amylbenzene7 = Triphenylene

標準試料の分離例標準試料の分離例

4

5

6

7

疎水性：分離係数（Amylbenzene/Butylbenzene） = 1.58

水素結合性：分離係数（Caffeine/Phenol） = 0.4１

立体選択性：分離係数（Triphenylene/o-Terphenyl） = 1.43

Retention time/min

1

23

Column: Sunniest C18HMODTS, 5μm 4.6x150 mm

Mobile phase: CH3CN/20mM H3PO4=10/90

Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºC Detection: UV@250nmSample: 1 = 8-Quinolinol

2 = Caffeine

12

金属配位性化合物の分離金属配位性化合物の分離

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 1616

0 2 4 6 8

Retention time/min

分離特性分離特性ⅡⅡ

Column: Sunniest C18HMODTS, 5μm 4.6x150 mm

Mobile phase: CH3OH/H2O=30/70Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºC Detection: UV@250nmSample: 1 = Uracil

2 = Pyridine3 = Phenol

ピリジンとフェノールの分離ピリジンとフェノールの分離

3

2

1

0 2 4 6 8

Retention time/min

分離係数（Pyridine/Phenol） = 0.37

酸性化合物の分離酸性化合物の分離

Column: Sunniest C18HMODTS, 5μm 4.6x150 mm

Mobile phase: CH3CN/0.1% H3PO4=2/98Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºC Detection: UV@210nmSample: 1 = Formic acid

2 = Acetic acid3 = Propionic Acid

321

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 1717

アセトニトリルと酢酸アンモニウムを用いたアセトニトリルと酢酸アンモニウムを用いたアミトリプチリンの分離例アミトリプチリンの分離例

Column: Sunniest C18 HMODTS, 5μm 4.6x150 mmMobile phase: CH3CN/10mM Ammonium acetate pH6.8=40/60

Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil，

2 = Propranolol，

3 = Nortriptyline，

4 = Amitriptyline

NHCH3

N

CH3

CH3

O

OH

NH CH3

CH3

0 1 2 3 4 7 6 7 8 9 10

Retention time/min

1

2

3

4

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 1818

他社との比較他社との比較

Retention time/min

1

0 2 4 6 8 10 12 14

Sunniest C18

Sunniest RP-AQUA

Sunniest C8

E社 C18

F社 C18

G社 C18

H社 C18

N=12,200TF=1.30

N=12,000TF=1.28

N=12,100TF=1.21

N=8,500TF=2.6

N=5,100TF=2.4

N=8,100TF=2.0

N=5,500TF=2.1

Column size: 4.6x150 mmParticle size: 5μmMobile phase: CH3CN/10mMAmmonium acetate pH6.8=40/60Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºCSample: Amitriptyline

N

CH3

CH3

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 1919

カラムからの溶出物の比較（ブリード現象）カラムからの溶出物の比較（ブリード現象）

Column size: 2.0x150 mmMobile phase: A) 0.1% acetic acidB) CH3CN

Gradient:Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%

Flow rate: 0.2 mL/minTemperature: 40 ºC Detection: Corona CAD

Sunniest C18 HMODTS

B社 C18

F社 C18

Retention time/min

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 2020

MSMSを用いたブリードの比較を用いたブリードの比較

Column size: 150 x 2.0 mmMobile phase: A) 0.1% acetic acidB) CH3CN

Gradient:Time: 0min 3min 14.4min 18min 19min%B: 5% 5% 100% 100% 5%

Flow rate: 0.2 mL/minTemperature: 40 ºC MS： ABI API-4000Ionization: Turboionspray (cation)Measurement mode:

Q1 Scan m/z 100-10000.E+00

5.E+07

1.E+08

2.E+08

2.E+08

3.E+08

3.E+08

4.E+08

4.E+08

5.E+08

5.E+08

0 5 10 15 20

Time (min)

Inte

nsi

ty (cps

)

Company B C18

Sunniest C18 HMODTS

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 2121

オクチル基オクチル基(C8,HMOTS)(C8,HMOTS)でも同様に合成でも同様に合成

アミトリプチリンのピーク形状アミトリプチリンのピーク形状

Column: Sunniest C8 HMOTS, 5μm 4.6x150 mmMobile phase: A) CH3CN/20mM Phosphate buffer pH7.0=60/40B) CH3CN/10mM Ammonium acetate pH6.8=40/60Flow rate: 1.0 mL/minTemperature: 40 ºCSample: 1 = Uracil，

2 = Propranolol，

3 = Nortriptyline，

4 = Amitriptyline

NHCH3

N

CH3

CH3

O

OH

NH CH3

CH3

0 1 2 3 4 5 6 7Retention time/min

N(4)=11,700TF(4)=1.09

A

B

1

1

2

2

3

3

4

4N(4)=11,200TF(4)=1.21

日本薬学会第日本薬学会第129129年会年会 2222

【【まとめまとめ】】Sunniest C18, RPSunniest C18, RP--AUQA, C8AUQA, C8エンドキャッピング試薬として用いられるヘキサメチルトリシロキサンをODSに結合させた新規C18試薬（HMODTS)を開発した

HMODTSの官能基はシリカ表面の様々な位置の

シラノール基と結合可能

残存シラノール基を非常に少なくすることが可能

移動相中の有機溶媒や緩衝液などの制限を受けることなく，塩基性化合物のテーリグを少なくできる