c). Chimica del DNA

i). Forze che influenzano la stabilità della doppia elica del DNA

•interazioni idrofobiche - stabilizzano dentro idrofobiche e fuori idrofiliche

relativamente deboli ma aggiuntive forze di Van de Waals• legami idrofobi – stabilizzano• legami idrogeno - stabilizzano relativamente deboli ma aggiungono e facilitano impilamento• interazioni elettrostatiche - destabilizzano contribuiti primariamente dai fosfati (negativi) interessano interazioni intrafilamento e interfilamento

repulsione può essere neutralizzata da cariche positive (es, ioni Na+ o proteine cariche positivamente)

1

5’

5’3’

3’

Regione del core idrofobica

Fo

sfat

i id

rofo

bic

i

Fo

sfat

i id

rofi

lici

2

Interactions Sovrapposte

Cariche di repulsione

Car

ich

e r

epu

lsio

ne

3

• Le nucleasi idrolizzano i legami fosfodiesterei

Endonucleasi tagliano internamente e possono tagliare suentrambi i lati del fosfato lasciando estremità 5’ fosfato o 3’ fosfato in dipendenza del- la particolare endonucleasi.

Esonucleasi tagliano i nucleotidi terminali

5’

5’3’

3’

es, esonucleasi proofreading

es, endonucleasi restrizione

4

5

ii). Denaturazione del DNA

DNA a doppio-filamento

Regioni ricche A-T denaturano prima

Svolgimento cooperativo dei filamenti del DNA

Separazione dei filamenti e formazione di unsingolo-filamento avvolto a caso

pH estremi o alte temperature

6

100

50

0

7050 90

Temperature oC

Pe

rce

nto

di

ipe

rcro

mic

ità

• curva di melting del DNA

• Tm è la temperatura al punto-medio della transizione

100

50

0

7050 90

Temperature oC

Pe

rce

nto

di

ipe

rcro

mic

ità

• curva di melting del DNA

• Tm è la temperatura al punto-medio della transizione

7

Micrografia elettronica di DNA parzialmente fuso

• regioni ricche in A-T fondono prima, seguite da regioni ricche in G-C

DNA a doppio-filamento, ricco in G-C che non è ancora fuso

Regioni di DNA ricche A-T fondono (si separano) in una bolla a singolo-filamento

8

• Ipercromicità

L’assorbanza a 260 nm di una soluzione di DNA aumenta quando la doppia elica è separata in singoli filamenti.

260

Ass

orb

anza Singolo-filamento

Doppio-filamento

220 300

9

•Composizione media di basi (conteuto G-C) puòessere determinata dalla temperatura melting DNA

50

7060 80

Temperature oC

• Tm è dipendente dal contenuto in G-C del DNAP

erc

en

t o

ip

erc

rom

icit

à

DNA di E. coli,che ha 50% G-C,ha una Tm di 69 o C.

•Composizione media di basi (conteuto G-C) puòessere determinata dalla temperatura melting DNA

50

7060 80

Temperature oC

• Tm è dipendente dal contenuto in G-C del DNAP

erc

en

t o

ip

erc

rom

icit

à

DNA di E. coli,che ha 50% G-C,ha una Tm di 69 o C.

10

11

12

DNA riassociazione (rinaturazione)DNA a doppio-filamento

Denaturazione,DNA asingolo-filamento

Lenta, processo di secondo-ordine avelocità limitante,per trovare sequenze di basi complementari

k2

Più veloce,reazione “zippering” performare lunghemolecole diDNA a doppiofilamento

a). Complessità del DNA cromosomico

13

Cinetiche di riassociazione di DNA (per una singola specie di DNA)

Cot1/2 = 1 / k2 k2 = constante di velocità di secondo-ordine Co =concentrazione di DNA

t1/2 = tempo di metà reazione

Cot1/2

50

100

0

% D

NA

ria

ss

oci

ato

log Cot

Ideale curva (curva Cot) di riassociazione di DNA di secondo-ordine

A metà della reazione (cioè a t ½) il 50% è riassociato Questo punto è il Cot al t ½ cioè quelle condizioni che danno metà della totale rinaturazione14

k2 >>>>>>>>>> k2

110,000

15

10-5 10010-4 10-3 10-1 10410310210-6 10-2 101

101 106102 103 105 1010109108100 104 107

Complessità espressa come coppie di basi (bp)

Cot

1 2 3 4 5

1 = poly(dT)-poly(dA)2 = DNA satellite umano purificato3 = DNA batteriofago T4 4 = DNA genomico di E. coli 5 = DNA umano a singola-copia purificato

Cot1/2

C’è una relazionediretta tra Cot1/2 e la complessità

Tipo di DNA % of Genoma Caratteristiche

Singola-copia (unica) Include la maggior parte dei geni 1

Disseminato attraverso il genoma tra eRipetitivo (intersparso) entro i geni; include sequenze Alu 2

e VNTRs o mini (micro) satelliti

Satellite (tandem) Altamente ripetuto, sequenze a bassa complessità di solito localizzate nei centromeri e telomeri

2 Le sequenze Alu sono circa 300 bp in lunghezza e sono ripetute circa 300,000 volte nel genoma. Esse possono trovarsi negli introni, adiacenti o entro i geni, o in regioni non tradotte.

1 Alcuni geni sono ripetuti da poche a migliaia di volte e così sono presenti nella frazione di DNA ripetitivo

50

100

0

I I I I I I I I I

veloce

intermedio

lento (singola-copia)

17

Cot1/2

Cinetiche di riassociazione di DNA da una miscela di specie di DNA

Cot1/2 = 1 / k2 k2= constante di velocità di secondo-ordineCo = concentrazione DNAt1/2 = tempo di metà reazione

50

100

0

% D

NA

ria

ss

oci

ato

I I I I I I I I I

log Cot

veloce (ripetute)

intermedia (ripetute)

lenta (singola-copia)

DNA genomico umano

Frazioni cinetiche : veloce intermedia lentaCot1/2

Cot1/2

18

Classi di DNA ripetitivo

Ripetizioni Intersparse (disperse) (e.g., Alu sequences)

TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG

Ripetizioni Tandem (e.g., microsatelliti)

GCTGAGG GCTGAGGGCTGAGG

19

Proprietà del genoma umano

Nucleare

• il genoma umano aploide ha ~3 X 109 bp di DNA• DNA a singola-copia comprende ~75% del genoma umano• il genoma umano contiene ~30,000 a 40,000 geni• la maggior parte dei geni sono a singola-copia nel genoma aploide• i geni sono composti da 1 a >75 esoni• i geni variano in lunghezza da <100 a >2,300,000 bp• le sequenze Alu sono presenti attraverso il genoma

Mitocondriale

•genoma circolare di ~17,000 bp• contiene <40 geni

20

5’ 3’

promoter region

esoni (regioni nel box riempite e nonriempite)

introni (tra gli esoni)

regioni tradotte

regione tradotta

mRNA structure

+1

b). Struttura del Gene

21

(esone-introne-esone)n struttura di diversi geni

-globina

HGPRT (HPRT) ipoxantina-guanina

totale = 1,660 bp; 3 esoni = 990 bp; 2 introni

istone

factor VIII

totale = 400 bp; 1 solo esone = 400 bp

totale = 42,830 bp; 9 esoni = 1263 bp

totale = ~186,000 bp; molti esoni = ~9,000 bp

22

Familial hypercholesterolemia• autosomal dominant• LDL receptor deficiency

23

Gene del recettore LDL

Ripetizioni Alu presenti entro gli introni

Ripetizioni Alu in esoni

4

4

4

5

5

5 6

6

6

Alu Alu

AluAlu

X

4 6Alu

crossing over ineguale

1 prodotto ha un esone 5 deleto(l’altro prodotto non è mostrato)

24

25

Struttura genoma umano

Si divide in:

25% GENICO

50% sequenze ripetute

5% Segmenti Duplicati75% INTRAGENICO

45% ripetizioni intersperse

25% DNA spaziatore

1,5% quello che esprime23,5% introni e pseudogeni

Sequenza di nucleotidi simile a un gene ma non in grado di produrre proteine funzionali

26

Nel genoma umano le sequenze ripetute costituiscono almeno il 50% del totale e sono suddivise in 5 classi:• sequenze ripetute derivate da trasposoni (intersperse)• copie inattive di geni• ripetizioni di sequenze semplici (minisatelliti e microsatelliti): (A)n, (CA)n, (CGG)n• duplicazioni segmentali• sequenze ripetute in tandem (centromeri, telomeri, cluster ribosomali)

Il 45% delle ripetizioni intersperse è dato da trasposoni e retrotrasposoni. I trasposoni sono elementi ripetuti in grado di muoversi nel genoma, costituiti tra le 80 e le 3.000 paia di basi Le differenze tra queste due classi risiedono nella differente modalità di inserimento della molecola di DNA: il trasposone copia gli elementi direttamente in DNA,il retrotrasposone utilizza come intermedio una molecola di RNA convertendola in DNA (questo processo, cioè il passaggio da una molecola di RNA ad una di DNA, nel 1975 non sembrava possibile). I RETROTRASPOSONI si dividono in•NON VIRALI LINE S(Long Interdispersed Elements (6-7 kb)SINES ( Short Interdispersed Elements (300-400 bp) ES. Alu •VIRALI RIPETIZIONI LTR (Long Terminal Repeats)Le ripetizioni LTR dei retroasposoni virali sono sequenze ripetute che permettono lo spostamento della molecola di DNA mobile, e rappresentano le porzioni terminali sia destra che sinistra della molecola. 27

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