búsqueda de agonistas lxr en plantas colombianas con
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Búsqueda de agonistas LXR en plantas colombianas con potencial terapéutico para
la enfermedad de Alzheimer
(Search for LXR agonists in Colombian plants with therapeutic potential for Alzheimer's disease)
Angie Milena Bustos Rangel
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento Química
Bogotá, Colombia
2021
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Búsqueda de agonistas LXR en plantas colombianas con potencial terapéutico para la enfermedad de Alzheimer
Angie Milena Bustos Rangel
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias - Bioquímica
Director (a):
Adrián Gabriel Sandoval Hernández PhD.
Codirector (a):
Mónica Constanza Ávila Murillo PhD.
Línea de Investigación:
Enfermedades Neurodegenerativas
Grupos de Investigación:
Muerte celular y Grupo de investigación en química de productos naturales
vegetales bioactivos
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento Química
Bogotá, Colombia
2021
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Search for LXR agonists in Colombian plants with therapeutic potential for Alzheimer's disease
Angie Milena Bustos Rangel
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias - Bioquímica
Director (a):
Adrián Gabriel Sandoval Hernández PhD.
Codirector (a):
Mónica Constanza Ávila Murillo PhD.
Línea de Investigación:
Enfermedades Neurodegenerativas
Grupos de Investigación:
Muerte celular y Grupo de investigación en química de productos naturales
vegetales bioactivos
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Departamento Química
Bogotá, Colombia
2021
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5
A todos los que me han permitido crecer a
su lado como persona, estudiante y
profesional.
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Declaración de obra original
Yo declaro lo siguiente:
He leído el Acuerdo 035 de 2003 del Consejo Académico de la Universidad
Nacional. «Reglamento sobre propiedad intelectual» y la Normatividad Nacional
relacionada al respeto de los derechos de autor. Esta disertación representa mi
trabajo original, excepto donde he reconocido las ideas, las palabras, o materiales
de otros autores.
Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación,
he realizado su respectivo reconocimiento aplicando correctamente los esquemas
de citas y referencias bibliográficas en el estilo requerido.
He obtenido el permiso del autor o editor para incluir cualquier material con derechos
de autor (por ejemplo, tablas, figuras, instrumentos de encuesta o grandes
porciones de texto).
Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica,
definida por la universidad.
________________________________
Nombre: Angie Milena Bustos Rangel
Fecha 16/02/2021
7
Agradecimientos
A la Universidad Nacional de Colombia, al programa curricular de la Maestría en
Ciencias – Bioquímica y los grupos de investigación de Muerte celular y el grupo de
química de productos naturales bioactivos (QUIPRONAB), que permitieron mi
formación profesional.
Al Ministerio de Ciencia y Tecnología por la financiación de esta investigación
mediante los proyectos, Bioprospección del potencial terapéutico de extractos
vegetales de las familias Lauraceae y Rutaceae asociados a la actividad
farmacológica de LXR en un modelo murino de enfermedad de Alzheimer y análisis
computacional" -RC-737 DE 2018 y “Evaluación de los mecanismos moleculares
asociados a la activación farmacológica de LXR en modelos de la enfermedad de
Alzheimer y del potencial terapéutico de un extracto de Nectandra reticulata
(Lauraceae)” RC-727 de 2018 .
Al Ministerio de Medio Ambiente por el otorgamiento del Otros N° 21 al Contrato
Marco de Acceso a Recursos Genéticos y sus Productos Derivados N° 121 del 22
de enero de 2016 suscrito entre el Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible y
la Universidad Nacional de Colombia, por medio del cual se ampara el uso para
investigación del material vegetal que hace parte de esta investigación.
A mis directores de tesis Adrián Sandoval y Mónica Ávila y a los profesores que han
acompañado mi proceso de formación profesional.
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Resumen
La enfermedad de Alzheimer es la demencia más común en la población mundial,
tiene una etiología desconocida y no cuenta con un tratamiento efectivo. Se
caracteriza por la agregación del péptido amiloide β y Tau hiperfosforilado, aumento
de radicales libres, desregulación lipídica y exitotoxicidad. Teniendo en cuenta esto,
los receptores X hepáticos, se postulan como una diana terapéutica, ya que son
factores de transcripción que regulan genes encargados de la homeostasis de
colesterol y se asocian con mecanismos de eliminación del péptido amiloide β, una
menor fosforilación de Tau y una menor respuesta inflamatoria, etc. En este trabajo,
se contó con 82 extractos de Angiospermas basales colombianas, a los que se les
evaluó su actividad agonista sobre los receptores nucleares LXR β, actividad
inhibitoria de acetil colinesterasa y actividad antioxidante, seguida de la evaluación
in vivo del efecto protector frente a ambientes tóxicos de paraquat, ceramida y
glutamato. Se encontró que, los extractos de Z. martinicense, Zanthoxylum sp., Z.
rohifolium, N. reticulata, N. membranácea, Nectandra sp., Myristicaceae sp. 1 y
Myristicaceae sp. 2 tienen un efecto agonista sobre LXR β, acompañado de una
actividad antioxidante. Adicionalmente, el extracto etanólico de Myriticaceae sp.2 y
las fracciones de Z. rhoifolium, Z. martinicense y Zanthoxylum sp., mostraron una
marcada actividad inhibitoria de AChE. Por último, Z. rohifolium, disminuye el efecto
de concentraciones tóxicas de glutamato. Lo que deja en evidencia el potencial de
estos extractos naturales para el tratamiento de la EA.
Palabras clave: Enfermedad de Alzheimer, paraquat, ceramida, glutamato,
Myristicaceae, Lauraceae, Rutaceae.
8
Abstract Alzheimer's disease is the most common dementia in the world, has an unknown
etiology and d oes not have effective treatment. It is characterized by the aggregation
of amyloid peptide β and tau hyperphosphorylation, increased free radicals, lipid
deregulation, and excitotoxicity. Considering this, liver X receptors are postulated
as a therapeutic target, as they are transcription factors that regulate genes
responsible for cholesterol homeostasis and are associated with mechanisms of
removal of amyloid peptide β, lower phosphorylation of Tau and lower inflammatory
response, etc. In this work, 82 extracts of basal Angiosperms obtained in Colombia
were counted, which were evaluated for their agonist activity on LXR β nuclear
receptors, continuing with in vitro evaluation of anti-acetylcholinesterase activity and
antioxidant activity, followed by in vivo assessment of the protective effect against
toxic environments of paraquat, ceramide, and glutamate. Finding that extracts from
Z. martinicense, Zanthoxylum sp. Z. rohifolium, N. reticulata, N. membranácea,
Nectandra sp., Myristicaceae sp. 1 and Myristicaceae sp. 2 have an agonist effect
on LXR β, accompanied by antioxidant activity and particularly, the ethanolic extract
of Miriticaceae sp.2 and the fractions of Z. rhoifolium, Z. martinicense and
Zanthoxylum sp., showed a marked inhibitory activity of AChE and Z. rohifolium,
decreases the effect of toxic concentrations of glutamate. Which highlights the
potential of these natural extracts for the treatment of EA.
Keywords: Alzheimer's disease, paraquat, ceramide, glutamate, Myristicaseae,
Lauraceae, Rutaceae.
9
Contenido
Pág.
Resumen ..……………………………………………………………………………… 7
Lista de ilustraciones ……………………………………………………………….. 11
Lista de tablas ………………………………………………………………………… 12
Lista de símbolos ……………………………………………...…………………….. 13
Lista de abreviaturas ………………………………………………………………… 15
Introducción …………………………………………………………………………… 17
1. Capítulo 1: Estado actual del tema ............................................................. 20 1.1. Enfermedad de Alzheimer ................................................................................. 20
1.1.1. Epidemiología y prevalencia de la EA ............................................................. 21 1.2. Marcadores histopatológicos de la EA ............................................................... 21
1.2.1. Placa amiloide ................................................................................................ 22 1.2.2. Placa amiloide y Ovillos neurofibrilares ........................................................... 24 1.2.3. Síntomas y factores de riesgo ......................................................................... 25 1.2.4. Catabolismo de Aβ.......................................................................................... 27
1.3. Hipótesis alrededor de la EA ............................................................................. 29 1.3.1. Hipótesis amiloide ........................................................................................... 29 1.3.2. Hipótesis colinérgica ....................................................................................... 30 1.3.3. Hipótesis del calcio ......................................................................................... 31 1.3.4. Radicales libres y la EA .................................................................................. 32 1.3.5. Alteración lipídica en la EA ............................................................................. 34
1.4. Terapéutica ........................................................................................................... 37 1.4.1. Terapias farmacológicas ................................................................................. 38 1.4.2. Tratamientos no farmacológicos ..................................................................... 39
1.5. Receptores nucleares ............................................................................................ 40 1.5.1. Receptor X Hepáticos y su relación con la EA ................................................ 43
1.6. Uso de productos naturales vegetales con potencial farmacológico en la enfermedad de Alzheimer ............................................................................................ 45
2. Capítulo 2: Efecto agonista de extractos de plantas colombianas sobre los LXRs 52
2.1. Introducción ........................................................................................................... 52 2.2 Estado del Arte: Acción terapéutica de los LXRs .................................................... 55 2.3 Metodología ........................................................................................................... 56
2.3.1. Obtención de extractos ................................................................................... 57 2.3.2. Ensayo de viabilidad celular MTT ................................................................... 57 2.3.3 Ensayo de actividad LXRE-LUC ...................................................................... 58
10
2.4. Resultados y discusión .......................................................................................... 60 2.5. Conclusiones ......................................................................................................... 66
3. Capítulo 3: Caracterización fitoquímica preliminar de los extractos con actividad agonista de LXR. ................................................................................ 67
3.1 Estado del Arte ....................................................................................................... 68 3.2 Metodología ........................................................................................................... 71
3.2.1 Cromatografía en capa fina .............................................................................. 71 3.2.2 Determianción de la capacidad captadora de radicales mediante ensayo de DPPH por bioautografía ............................................................................................ 71 3.2.3 Determinación de la protección de β-caroteno por bioautografía ..................... 72 3.2.4 Cuantificación de Fenoles totales usando el reactivo Folin-Ciocalteu .............. 73 3.2.5 Cuantificación de la capacidad antioxidante usando β-caroteno ...................... 73 3.2.6 Bioautografía para determinación de inhibición de AChE ................................. 74 3.2.7 Cuantificación de la inhibición de AChE ........................................................... 74
3.3. Resultados ............................................................................................................ 76 3.3.1. Evaluación inhibitoria de ACHE ...................................................................... 77 3.3.2. Cuantificación de la actividad inhibitoria de AChE ........................................... 81 3.3.3. Actividad antioxidante por DPPH y β-Caroteno ............................................... 85 3.3.4. Cuantificación de fenoles totales (Folin-Ciocalteu) .......................................... 89 3.3.5. Actividad antioxidante y protectora de β-Caroteno .......................................... 90
3.4. Conclusiones ......................................................................................................... 92
4. Capítulo 4: Efecto neuroprotector de los extractos activos para LXR frente a los agentes neurotóxicos; Paraquat, Glutamato, Ceramida ........................ 93
4.1. Introducción ........................................................................................................... 93 4.1.1 Modelo de estrés oxidativo .............................................................................. 93 4.1.1 Neurotoxicidad inducida por Ceramida ............................................................ 97 4.1.1 Exitoxicidad inducida por glutamato ................................................................. 99
4.2. Estado del Arte .................................................................................................... 101 4.3. Metodología ........................................................................................................ 102
4.3.1 Evaluación in vitro del efecto neuroprotector de extractos activos ................. 102 4.3.2 Cultivo de la línea celular SHSY-5Y ............................................................... 102 4.3.3 Evaluación del efecto toxico del PQ, C2 y glutamato. .................................... 103 4.3.4 Citometría de flujo .......................................................................................... 104 4.3.5. Análisis estadísticos ...................................................................................... 104
4.4. Resultados y discusión ........................................................................................ 104 4.4.1 Evaluación del potencial efecto neuroprotector frente a radicales libres ........ 105 4.4.2 Ceramida ....................................................................................................... 119 4.4.3 Glutamato ...................................................................................................... 129
5. Conclusiones.............................................................................................. 135
6. Recomendaciones ..................................................................................... 136
7. Bibliografía ................................................................................................. 137
11
Lista de Ilustraciones
Ilustración 1-1. Dominios de los receptores nucleares………………….…………………41
Ilustración 1-2. Mecanismo de activación de los receptores nucleares…………………43
Ilustración 2-1. Cotransfección de plásmidos para la evaluación de actividad LXRE-LUC ……………………………………………………………………………………………………...59
Ilustración 2-2. Extractos con actividad agonista sobre LXRβ.…………………………..65
Ilustración 3-1. Reacción de la molécula DPPH con una molécula captadora de radicales libres……………………………………………………………………………………….………71
Ilustración 3-2. Posible formación de radicales libres a partir de una molécula de betacaroteno expuesta a UV……………………………………………………..……………..71
Ilustración 3-3. Reacción de la evaluación de AChE……………………………………...74
Ilustración 3-4. Evaluación de la capacidad inhibitoria de AChE de fracciones y extractos. ………………………………………………………………………………………………………77
Ilustración 3-5. Evaluación en placa de la actividad de AChE usando los extractos etanólicos o fracciones alcaloidales como posibles inhibidores……………………..………83
Ilustración 3-6. Evaluación de la capacidad antioxidante de extractos y fracciones.…..85
Ilustración 3-7. Cuantificación de fenoles totales …………………………………..………88
Ilustración 3-8. Actividad antioxidante y protectora de β-Caroteno ….…………..………90
Ilustración 4-1. Vía citotóxica pro-oxidativa del PQ ……………………..………………….94
Ilustración 4-2. Mecanismo citotóxico del PQ en la mitocondria……………………..……96
Ilustración 4-3. Efecto de la ceramida en la vía amiloidogénica, mitocondria y Tau……98
Ilustración 4-4. Hipótesis de calcio……………………………………………………………99
Ilustración 4-5. Ensayo de neuroprotección evaluado por la variación de la actividad mitocondrial (MTT)………………………………………………………………………………105
Ilustración 4-6. Ensayo de neuroprotección evaluado por la variación de la actividad mitocondrial (MTT)………………………………………………………………………………107
Ilustración 4-7. Evaluación del efecto neuroprotector y antioxidante por citometría de flujo…..……………………………………………………………………………………………110
Ilustración 4-8. Evaluación del efecto neuroprotector y antioxidante por citometría de flujo. ……………………………………………………………………………………………...……..114
Ilustración 4-9. Ensayo de neuroprotección evaluado por la variación de la actividad mitocondrial (MTT)………………………………………………………………………………119
Ilustración 4-10. Ensayo de neuroprotección evaluado por la variación de la actividad mitocondrial (MTT)………………………………………………………………………………121
Ilustración 4-11. Evaluación de la capacidad neuroprotectora frente a ceramida…….123
Ilustración 4-12. Evaluación de la capacidad neuroprotectora frente a ceramida por citometría de flujo………………………………………………………………………………..125
Ilustración 4-13. Ensayo de neuroprotección evaluado por la variación de la actividad mitocondrial (MTT)………………………………………………………………………………129
Ilustración 4-14. Resumen de resultados………………………………………………….132
12
Lista de tablas
Tabla 1-1. Moléculas aisladas de productos naturales con potencial terapéutico para la EA………………………………………………………………………………………….……49
Tabla 2-1. Resultados de la evaluación del potencial agonista de los extractos vegetales sobre la actividad de los LXR’s.la EA…………………………………….……62
Tabla 3-1 Fracciones o extractos agonistas de LXRβ seleccionados.….…….…...75
Tabla 3-2. Resultados de AFP relacionados con la inhibición de AChE …………………77
Tabla 3-3. Resultados del AFP relacionados con la actividad antioxidante……….86
Tabla 4-1. Evaluación de la viabilidad celular, de células SH-SY5Y pretratadas durante 1h y expuestas a PQ 23h.………………………………………………………………………….111
Tabla 4-2. Evaluación de la viabilidad celular, de células SH-SY5Y pretratadas durante 6h y expuestas a PQ 23h…………………………………………………………………………..114
Tabla 4-3. Evaluación de la viabilidad celular, de células SH-SY5Y pretratadas durante 6h y expuestas a PQ 23h ………………………………………………………………………….121
13
Lista de Símbolos
Símbolos Símbolo Término °C
Grados Celsius
kcal / mol Kilo caloría por mol
mL Mililitro
mM Milimolar
µg microgramo
µg/mL Microgramo por mililitro
n Número de replicas
nm nanómetro
ppm Partes por millón
pH Potencial de hidrogeno
p/s Penicilina/streptomisina
p/v Peso sobre volumen
µM Micro molar
g/mL Microgramo por mililitro
µL Microlitro
Aβ amiloide beta
sAPPα soluble amyloid precursor protein
H2O2 Peróxido de hidrogeno O2 Oxígeno
NH3 Amoniaco
14
FeCl3 Cloruro férrico
KNO3 Nitrato de potasio
NO3- Nitrato
CHCl3 Cloroformo
NaCl Cloruro de sodio
H2Odd Agua doble destilada
O2- Ion peróxido
OH- Hidroxilo
H2O2 Peróxido de hidrógeno
CO2 Dióxido de carbono
NO Monóxido de nitrógeno
15
Lista de Abreviaturas Abreviatura Término ADN
Ácido desoxirribonucleico
ACh Acetilcolina
AChIs Acetylcholinesterase inhibitors AFP Análisis fitoquímico preliminar AICD APP intracellular domain
ApoE Apolipoproteína E
ARE Genes protectores conservados de respuesta antioxidante (Antioxidant Response Elements)
ATC Acetiltiocolina BSA Albumina de suero bovino ChAT Enzima acetiltransferasa de colina (choline
acetyltransferase) CREB Vía de supervivencia celular DBD Dominio de unión EA Enfermedad de Alzheimer ECE Enzima convertidora de endotelina FOXO Forkhead box type O GPX Glutatión peroxidasas GWAS, Genome-wide association study iGluR Receptores ionotrópicos de glutamato HSP Disociación de las proteínas de choque térmico IDE Enzima degradadora de insulina (Insulin-degrading
enzyme) KEAP1 Kelchlike ECH associated protein 1 NEP Neprilisina (neutral endopeptidase) Nrf2 Factor nuclear eritroide nuclear factor erythroid-2-related
factor 2 LBD Dominio de unión al ligando LXR Liver X receptors NMDA Ácido N-metil-D-aspártico NMDAR Receptor NMDA NFT Neurofibrillary Tangles PHF Paired helical filaments PPAR Receptores activados por proliferadores peroxisomales PQ Paraquat PrPC proteína priónica celular (Celular Prion Protein) QUIPRONAB Grupo de Investigación Química de Productos Naturales
Vegetales Bioactivos RNs Receptores nucleares
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ROS Especies reactivas de oxígeno Reactive Oxygen Species
RXR Receptor X retinoide SCREBP Elementos reguladores de esteroles (Sterol regulatory
element-binding proteins) SNPs Polimorfismos de nucleótido simple SOD Superóxido dismutasas SPL Sphingophospholipids ZSG Zona subgranular del giro dentado
17
Introducción
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la demencia más común en el mundo, reporta
aproximadamente 50 millones de casos. Se ha establecido que la EA es la sexta
causa de muerte más frecuente en Estados Unidos, además de presentar un
incremento en el porcentaje de mortalidad entre 2000 y 2018 del 146 %. Teniendo
en cuenta que es una enfermedad con una alta incidencia y que presenta un
incremento exponencial, se estima que para 2050 ocasionará gastos en salud
pública superiores a los esperados para las enfermedades cardiovasculares y el
cáncer (Association, 2020).
La EA es una patología neurodegenerativa de etiología desconocida, con un
desarrollo histopatológico caracterizado por la presencia de dos agregados
proteicos neurotóxicos, placas amiloides en el espacio extracelular y ovillos
neurofibrilares (NFT, por sus siglas del inglés Neurofibrillary Tangles) en el citosol,
los cuales desencadenan eventos nocivos para el cerebro que se asocian con
procesos inflamatorios, disrupción de la plasticidad sináptica y muerte neuronal
(Grøntvedt et al., 2018). Respecto al origen de la EA se han planteado múltiples
hipótesis las cuales describen como factores desencadenantes a los péptidos
amiloides, los NFT, la disminución de acetilcolina, entre otras (Bartus et al., 1982;
Hardy, 2002; Ávila, 2000). Actualmente, la hipótesis lipídica toma fuerza en la
comunidad científica postulando que el desarrollo de la EA se asocia a cambios en
la homeostasis lipídica, fundamentada en observaciones realizadas en pacientes
con EA que presentan incrementos en los niveles de colesterol y esfingolípidos,
18
variaciones que pueden estar relacionadas con el factor de riesgo conferido por el
alelo ε4 de la apolipoproteína E (ApoE) (Walker et al., 2000; Riddell et al., 2008;
Zekonyte et al., 2016)
Por otra parte, los receptores X hepáticos (LXR) pertenecen a la superfamilia de los
receptores nucleares (RN), una familia de proteínas que actúa como factor de
transcripción regulado por pequeños ligandos (Apfel et al., 1994a). Los LXR forman
heterodímeros funcionales con los receptores X retinoides (RXR) y se encuentran
unidos a los elementos de respuesta LXR (LXRRE) (Apfel et al., 1994a). Una vez
que el LXR se activa, actúa como regulador de la expresión de cientos de genes
incluyendo a APOE y ABCA1 sobre los cuales incrementa su expresión. Las
proteínas ApoE y el transportador dependiente del ATP de la familia ABC (ABCA1)
son importantes en la homeostasis del colesterol en el cerebro y están involucradas
en diferentes procesos de eliminación del péptido amiloide β (Aβ) (Repa &
Mangelsdorf, 2000; Trousson et al., 2009). Adicionalmente, la activación de LXR
inhibe la expresión de los marcadores proinflamatorios, incrementa el número de
células madre neuronales y la expresión de proteínas de sinapsis, lo cual se asocia
a una mejoría en la cognición de modelos animales de EA (Andersson et al., 2005;
Morales et al., 2008; Sandoval-Hernández et al., 2015).
De acuerdo con lo anterior, en esta investigación se ha realizado una búsqueda
sistemática de agentes químicos con actividad multidiana en la biodiversidad
colombiana contribuyendo a la búsqueda de potenciales tratamientos para
enfermedades neurodegenerativas, en particular la EA. Basado en lo anterior, se
evaluó a través de un screening in vitro el potencial efecto agonista de LXR de 82
extractos de Angiospermas basales colombianas; de los cuales 44 corresponden a
extractos alcaloidales de especies del género Zanthoxylum (Rutaceae),16 extractos
etanólicos de la familia Lauráceae, 11 extractos etanólicos de la familia
Myristicaceae, 11 extractos etanólicos de la familia Piperaceae, sobre LXRβ,
19
obteniendo 10 extractos activos, a 8 de los cuales se les realizó un análisis
fitoquímico preliminar, evaluación del efecto neuroprotector frente a
concentraciones tóxicas de ceramida, glutamato y paraquat.
Se encontró que los extractos o fracciones alcaloidales obtenidos de Z.
martinicense, Zanthoxylum sp. Z. rhoifolium, N. reticulata, N. membranácea,
Nectandra sp., Myristicaceae sp. 1 y Myristicaceae sp. 2, tienen un efecto captador
de radicales libres o antioxidante, de acuerdo con los resultados obtenidos en las
bioautografías con betacaroteno y DPPH·. Adicionalmente, se encontró una
disminución de la muerte celular en la línea celular SH-SY5Y, ocasionada por la
exposición a diferentes concentraciones tóxicas de PQ·.
Sumado a esto, el extracto etanólico de Myriticaceae sp.2 y las fracciones
alcaloidales de Z. rhoifolium, Z. martinicense y Zanthoxylum sp., mostraron una
marcada actividad inhibitoria de AChE y la fracción alcaloidal de Z. rhoifolium,
mostró disminución del efecto tóxico del glutamato. En concordancia con los
resultados obtenidos, en el análisis preliminar se sugiere que las acciones
mostradas por los extractos se deben a la posible presencia de metabolitos con
núcleo alcaloidal y flavonoide, los cuales tienen efecto protector de la supervivencia
celular frente a ambientes altamente tóxicos característicos de la EA (Ahmad et al.,
2016; Cuca & Taborda, 2008; Ji & Zhang, 2008; Paula et al., 2019; E. Plazas et al.,
2019).
Los resultados obtenidos en esta investigación permitirán el desarrollo de futuras
investigaciones con los extractos, particularmente aquellos extractos que han
presentado una actividad agonista de LXRβ. El acercamiento a la caracterización
de la composición química de los extractos activos y su mecanismo de acción
demuestra su potencial farmacológico en el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas.
20
1. Capítulo 1: Estado actual del tema
1.1. Enfermedad de Alzheimer
La EA es un desorden neurodegenerativo que ocasiona daños estructurales en el
cerebro, afectando principalmente la corteza y el hipocampo (Kraepelin, 1896). Es
el tipo de demencia más común en el mundo y su sintomatología se caracteriza por
presentar episodios de pérdida de memoria, cambios de humor, dificultad para
expresarse, realizar tareas cotidianas, desenvolverse en el entorno social y personal
(Association, 2020; Kraepelin, 1896).
Es posible encontrar dos formas de la EA: la de origen temprano (EOAD, siglas del
inglés Early-Onset Alzheimer Disease) y la EA de origen tardío (LOAD, siglas del
inglés Late-Onset Alzheimer Disease). La EOAD de origen familiar se presenta
antes de los 65 años, corresponde al 1%-5% de los casos, su causa está bien
establecida y se debe a mutaciones genéticas determinantes en los genes de
Presenilina 1 (PSEN1), Presenilina 2 (PSEN2) y proteína precursora amiloide
(APP). Por otra parte, LOAD es de carácter esporádico y de etiología desconocida,
se presenta después de los 65 años y corresponde aproximadamente al 95% de los
casos, es considerada de origen multifactorial (Albert et al., 2011; LL et al., 1981;
Sakurai et al., 2012).
21
1.1.1. Epidemiología y prevalencia de la EA
Las demencias que se presentan entre los 65 y 85 años tienen una prevalencia que
tiende a duplicarse cada veinte años. En el caso de la población mayor de 90 años,
la prevalencia a desarrollar demencias tiende a aumentar en un menor tiempo
(Association, 2020; Prince et al., 2013). Adicionalmente, se ha establecido que cerca
del 70 % de las demencias corresponden a la EA y alrededor de 50 millones de
personas en el mundo la presentan. En el 2015 fueron reportados 22,9 millones de
casos en Asia, 10,5 millones de casos en Europa, 4 millones de casos en África y
9.4 millones de casos en América. Con la información mencionada, se proyectó que
en el 2050 aproximadamente 131,5 millones de personas padecerán la EA
(Association, 2020; Martin et al., 2015; Prince et al., 2013).
La incidencia de la EA es de 5 a 8 personas por cada 1000; sin embargo, se prevé
su aumento considerando que la esperanza de vida tiende a ser mayor (Lopez &
Kuller, 2019). Por otra parte, el riesgo de presentar la EA después de los 65 años
se duplica cada cinco años, con un mayor factor de riesgo en mujeres (Association,
2020). Finalmente, por su alta incidencia y prevalencia, la EA genera gastos
elevados en materia de salud pública, por ejemplo, en el 2015 se estimaron costos
de ochocientos dieciocho millones de dólares y en el 2018 los costos se
aproximaron al billón de dólares en el mundo, valor que se duplicaría para el año
2030 (Lopez & Kuller, 2019; Martin et al., 2015).
1.2. Marcadores histopatológicos de la EA
La EA se caracteriza por una pérdida de la densidad neuronal en regiones
específicas del cerebro. Inicialmente, se ve afectada la corteza entorrinal, seguida
por el hipocampo; estas áreas se encuentran estrechamente vinculadas en los
procesos de consolidación de la memoria. A su vez, se produce daño en la
amígdala, lo cual podría afectar la respuesta emocional frente a diferentes
estímulos. Posterior a ello, el proceso degenerativo lleva a la atrofia de la corteza y
22
el hipocampo, mientras que los ventrículos presentan un ensanchamiento que
afecta los tejidos circundantes, lo cual tiene como consecuencia una marcada
incapacidad para realizar tareas diarias, desbalance emocional y deterioro del
lenguaje (Bernard et al., 2014; Duyckaerts et al., 1992; Pearson & Powell, 1989;
Thompson et al., 2004). Adicionalmente, la enfermedad se identifica
histopatológicamente a través de la presencia de dos marcadores: las placas
amiloides formadas por los péptidos de Aβ en el espacio extracelular y los ovillos
neurofibrilares formados por la proteína Tau fosforilada en el espacio intracelular.
En esta etapa, la perdida neuronal se considera irreversible y la disfunción es
evidente (Bernard et al., 2014; Duyckaerts et al., 1992; Pearson & Powell, 1989;
Thompson et al., 2004).
1.2.1. Placa amiloide
Los péptidos Aβ son producto de la degradación proteolítica de APP, de la cual se
han descrito distintas vías, las cuales se diferencian por estar o no implicadas con
la producción de Aβ: la vía amiloidogénica, donde se produce Aβ, y la vía no
amiloidogénica que corresponde con la mayor proteólisis presentada por pacientes
sanos. La vía no amiloidogénica consiste en una proteólisis inicial por la enzima α-
secretasa, lo cual produce el péptido soluble sAPPα en el espacio extracelular y el
fragmento C-terminal (C83) en membrana para su posterior proteólisis por la γ-
secretasa que produce los fragmentos P3 y de dominio intracelular de APP (AICD)
(Nunan & Small, 2000).
Por otro lado, la vía amiloidogénica comienza con la proteólisis mediada por la
enzima β-secretasa, produciendo el fragmento soluble sAPPβ, el cual es liberado al
espacio extracelular posteriormente y permanece el dominio transmembrana de
APP unido al dominio C terminal (C99), que después es fragmentado por la γ-
secretasa, produciendo AICD y el péptido Aβ (Chen et al., 2017; Nunan & Small,
2000). Estos últimos formarán posteriormente los depósitos de Aβ característicos
23
de la EA (Chen et al., 2017). La mayor parte del péptido se encontrará en el
ambiente extracelular y al agregarse genera oligómeros solubles que pueden
difundirse en el cerebro, protofibrillas y fibrillas largas e insolubles, las cuales, al
aumentar su concentración, producen las placas amiloides (Larner, 1999).
Los péptidos Aβ son un grupo de moléculas peptídicas de varias longitudes y pesos
moleculares, desde 38 a 43 aa. Los péptidos más comunes en la corteza cerebral
son de 40 y de 42 aa. Adicionalmente la distribución de los péptidos más tóxicos se
modifica en condiciones patológicas, en condiciones normales, Aβ1-40 se encuentra
aproximadamente un 90% y Aβ1-42 en un 10%; sin embargo, en pacientes EA la
relación cambia a una proporción del 50% (Citron et al., 1996). Aβ1-42 es un péptido
con mayor facilidad de generar diferentes estructuras poliméricas producto de su
agregación, este aumenta su expresión cuando los pacientes presentan las
mutaciones en APP, PSEN1 y PSEN2 (Larner, 1999; Serrano-Pozo et al., 2011).
En 1984 se describió la estructura primaria del péptido amiloide Aβ (Viswanathan &
Greenberg, 2011) y con el paso del tiempo se le han atribuido diferentes funciones
biológicas que no tienen un carácter patológico. Algunas de estas funciones son: su
participación en el proceso de transporte de colesterol, neuroprotección frente al
estrés oxidativo, actividad antimicrobiana y activación de quinasas (C. Cárdenas-
Aguayo et al., 2014; Serrano-Pozo et al., 2011; Soscia et al., 2010). Adicionalmente,
se ha formulado que la producción de péptidos Aβ está involucrada con procesos
fisiológicos necesarios para la sobrevida neuronal, ya que la pérdida o falta de las
enzimas α-secretasa y β-secretasa puede desencadenar alteraciones en su
viabilidad (C. Cárdenas-Aguayo et al., 2014; Plant et al., 2003).
Los efectos del Aβ1-42 varían dependiendo de la concentración y el tiempo de
exposición en cultivos primarios neuronales de corteza e hipocampo de ratones; así,
con exposiciones de 24 h a 48 h del péptido a una concentración de 1-3 µM, se
producía una aparente estimulación de la cantidad de sinapsis y el crecimiento de
24
neuritas de manera bifásica, pero al aumentar el tiempo de exposición a 72 h o usar
una concentración mayor a 3 µM de Aβ1-42, se exacerbaron sus características
tóxicas. Adicionalmente, se determinó que Aβ1-42 se une a espinas postsinápticas y
colocalizaba con la proteína de densidad postsinápticas – 95 (PSD-95), ello sumado
a una disminución en la expresión de los receptores de N-Metil D-Asparto (NMDAR,
siglas del inglés N-Methyl D-Aspartate Receptor): NR1, NR2 y el receptor Ephrin
tipo B2 (EphB2). Lo que permitió concluir que Aβ1-42 conlleva a mecanismos
citotóxicos asociados a la sinapsis neuronal dependientes de su acumulación en el
cerebro, contribuyendo al desarrollo de la EA (N. A. Evans et al., 2008).
1.2.2. Placa amiloide y Ovillos neurofibrilares
En condiciones normales las proteínas Tau hacen parte estructural de los
microtúbulos; se encuentran en el sistema nervioso central (SNC), principalmente
en los axones, junto con la tubulina y contribuye al transporte intracelular (Binder et
al., 1985). En humanos se ha establecido que el gen de la proteína Tau denominado
MAPT (microtúbulo asociado a la proteína tau) se localiza en el cromosoma 17q21,
constituido por 16 exones, tiene 6 isoformas, producto del splicing alternativo de los
exones 2, 3 y 10, los cuales se expresaran en diferentes momentos del desarrollo
(Buée et al., 2000). Estas isoformas están constituidas por dos dominios: en la
ubicación N-terminal está el dominio de proyección y en la C-terminal se encontra
el dominio de unión a microtúbulos (Buée et al., 2000).
La actividad de esta proteína esta modulada por modificaciones postraduccionales,
siendo la fosforilación la más común. Se han descrito alrededor de 79 sitios de
fosforilación en la isoforma más grande de Tau, estos sitios se han relacionado, en
su mayoría, con el grado de afinidad por los microtúbulos (Buée et al., 2000; Lindwall
& Cole, 1984). Las modificaciones postranscripcionales en condiciones patológicas
también pueden ocasionar la perdida de afinidad de Tau por los microtúbulos,
25
facilitando su liberación en el espacio citosólico y ocasionando una mayor
agregación (Meraz-Ríos et al., 2010). En la EA se han caracterizado diferentes
formas de agregación de la proteína Tau, encontrando estructuras como: filamentos
rectos, filamentos helicoidales pareados (PHF, siglas del inglés paired helical
filaments), agregados oligoméricos y NFT (Dani et al., 2019). Las variaciones
conformacionales pueden deberse a múltiples factores que favorecen la
polimerización de la proteína Tau. La importancia de reconocer los tipos de
agregados surge de la relación que tienen estos con el desarrollo patológico de la
EA (Dani et al., 2019). La presencia de NFTs se correlaciona con sintomatología
severa, perdida neuronal y lesiones causadas por Aβ. Sin embargo, es improbable
que estos agregados “maduros” sean las especies toxicas primarias, motivo por el
cual se ha sugerido que la presencia de especies solubles pequeñas como los
oligómeros de Tau o PHF pueden ser más tóxicos, ya que se encuentran presentes
en el cerebro en estadios tempranos de la EA. Además, los oligómeros de Tau están
implicados en el proceso de propagación de la patología Tau en las diferentes
regiones del cerebro asociadas a través de conexiones sinápticas y al daño
sináptico (Dani et al., 2019).
Como consecuencia del proceso descrito anteriormente, se afecta el transporte
axonal retrógrado y anterógrado, la actividad mitocondrial y la plasticidad sináptica,
lo cual se ha sugerido es la causa de la pérdida de funciones neuronales y la muerte
celular (Buée et al., 2000; Jadhav et al., 2015).
1.2.3. Síntomas y factores de riesgo
La EA presenta una serie de cambios en sus síntomas a lo largo de su desarrollo.
Se han evidenciado cambios que inician en la memoria episódica, lo que implica
dificultades para memorizar cosas nuevas y amnesia, al mismo tiempo que se dan
dificultades en la ubicación espacial, dificultades a nivel lingüístico y problemas para
26
desenvolverse en las actividades de la vida cotidiana como comer y vestirse (Albert
et al., 2011; Barrera et al., 2018; Heston et al., 1981; Sakurai et al., 2012).
Las causas de LOAD son consideradas multifactoriales, involucra factores de riesgo
medioambiental y genéticos; dentro de los factores de riesgo medioambientales, se
ha descrito que el principal es la edad. Asimismo, hay alta prevalencia de otras
comorbilidades como la obesidad, la hipertensión o la diabetes, y el aumento en el
deterioro cognitivo. De igual manera, es posible que ciertas actividades en el
entorno de la vida cotidiana estén asociadas como factores indirectos de LOAD,
dentro de las cuales se encuentran el sedentarismo, las dietas altas en azucares y
grasas saturadas, la falta de tareas que exijan actividad mental y el estrés (Medina
et al., 2017; Robinson et al., 2017)
El principal factor de riesgo genético para LOAD es tener el alelo ε4 de APOE (Genin
et al., 2011; Liu et al., 2013; Robinson et al., 2017; Tang et al., 2018).
Adicionalmente, como producto de diferentes estudios de asociación de genoma
completo (GWAS, siglas del inglés Genome-wide association study) en pacientes
con LOAD y controles, se han asociado diferentes polimorfismos de nucleótido
simple (SNPs) con el desarrollo progresivo de la enfermedad, dentro de los cuales
es posible encontrar otros genes con un menor grado de asociación en comparación
con APOE, incluyendo: CLU, CR1, MS4A4A, CD2AP, EPHA1, CD33, PICALM,
TOM40, BIN1, ABCA1. (Robinson et al., 2017).
De forma paralela, y como factores de riesgo para EOAD, se encuentran variantes
genéticas presentes en los genes de la APP, PSEN1 y PSEN2, ubicados en los
cromosomas 21, 14 y 1 respectivamente, con mutaciones que pueden presentarse
de forma autosómica dominante ocasionando un aumento en la producción de Aβ.
(Robinson et al., 2017)
27
1.2.4. Catabolismo de Aβ
En cuanto al metabolismo de Aβ, se han descrito diferentes mecanismos de
eliminación de los péptidos Aβ, siendo las vías más estudiadas aquellas que
involucran la función del proteosoma, la autofagia y vías de proteólisis menores y el
transporte a través de la barrera hematoencefálica (Lahiri et al., 2016; Lam et al.,
2000; Scacchia et al., 2008; Zhang et al., 2013).
En primer lugar, se ha encontrado que el sistema ubiquitina-proteosoma se afectado
por la presencia de una forma mutada de la ubiquitina Ub+1 en cerebros de
pacientes con EA, denominada como Ub+1. De acuerdo con esto, se ha encontrado
en pruebas in vitro que UB+1 es un sustrato necesario para la poli ubiquitinación y
su expresión podría estar asociada a la inhibición del sistema ubiquitina-proteosoma
y derivar en la acumulación de Aβ y NFT, aunque el mecanismo aún no está
completamente descrito (Lam et al., 2000).
En segundo lugar, el sistema de autofagia se encuentra alterado en la EA, lo que
estaría ocasionando un aumento en la agregación de Aβ en el espacio intracelular
y extracelular (Lahiri et al., 2016). De acuerdo con resultados obtenidos en modelos
murinos, se ha sugerido que la autofagia juega un rol importante en los procesos de
eliminación de Aβ, ya que se encargaría de la degradación intracelular y de los
procesos de secreción no degradante de las proteínas integrales de membrana
(Nilsson et al., 2013). Esta vía también es realizada por APP para ser transportada
y procesada, una falla ocasionaría el aumento de Aβ intracelular o su liberación al
espacio extracelular, favoreciendo la formación de placas. Además, es posible que
el Aβ producido sea conducido a través de vías de secreción de eliminación (Lahiri
et al., 2016; Nilsson et al., 2013).
En tercer lugar, las vías de proteólisis menores participan en la eliminación de los
péptidos Aβ, las más estudiadas son las realizadas por la enzima degradadora de
28
insulina (IDE, siglas del inglés Insulin-degrading enzyme), la neprilisina (NEP, siglas
del inglés neutral endopeptidase) y la enzima convertidora de endotelina (ECE)
(Eckman & Eckman, 2005; Lahiri et al., 2016). La IDE se asocia con procesos de
reducción de la agregación de Aβ y retarda el desarrollo de la patología de EA (B.
C. Miller et al., 2003; Vepsäläinen et al., 2008). La IDE y la producción de Aβ tienen
un mecanismo de regulación retrograda, al aumentar la concentración de Aβ,
paralelamente aumenta la IDE (Zhao et al., 2007). La NEP por su parte, es una
endopeptidasa de zinc, neutra, que puede catabolizar los fragmentos de Aβ. se
observó una reducción en los niveles de expresión de NEP en cerebros posmortem
de pacientes con EA, en el giro dentado del hipocampo y el giro temporal medio,
sugiriendo una participación en el desarrollo de EA (Carpentier et al., 2002;
Yasojima et al., 2001). Adicionalmente, se ha descrito que ECE está implicada con
la degradación del péptido Aβ, su actividad peptidasa ha sido demostrada en
cultivos celulares y modelos animales (Scacchia et al., 2008).
Finalmente, se ha observado que la eliminación de Aβ puede ocurrir a través de la
barrera hematoencefálica. Los peptidos Aβ se transportan desde el parénquima
cerebral hasta el torrente sanguíneo, en un mecanismo dependiente de ApoE y de
la proteína asociada con lípidos de baja densidad-1 (LRP1) (Zhang et al., 2013). Se
reportaron los transportadores específicos ABCB1 y ABCG2 como, las bombas de
flujo implicadas en la salida de Aβ a través de la barrera hematoencefálica,
sugiriendo que sus fallas se relacionan con la acumulación y agregación del péptido
Aβ en el cerebro (Zhang et al., 2013).
En conclusión, el cerebro cuenta con múltiples mecanismos de regulación de Aβ, y
se ha sugerido que el desbalance entre la tasa de producción y eliminación, es la
causa más probable de la generación de agregados y de la patología característica
de la EA, es por esto, que los mecanismos que favorecen la eliminación del péptido
Aβ se consideran dianas terapéuticas promisorias.
29
1.3. Hipótesis alrededor de la EA
Desde la descripción del primer caso, se han realizado investigaciones desde
distintas áreas de las neurociencias incluyendo cerebros posmortem, observando
alteraciones morfológicas, histopatológicas y bioquímicas. Se han planteado
diferentes hipótesis acerca del origen de la EA y del deterioro cognitivo, las cuales
a su vez son la base del diagnóstico y de su estrategia de tratamiento.
1.3.1. Hipótesis amiloide
La hipótesis de la cascada amiloide propuesta por Hardy y Higgins (1992), postula
que la acumulación de Aβ es el evento tóxico producto de la vía amiloidogénica, el
cual causa el desarrollo fisiopatológico de la EA, provoca la formación de ovillos
neurofibrilares, la pérdida de densidad celular, los daños vasculares y conduce a la
demencia. (Hardy & Higgins, 1992).
Inicia con factores que ocasionan la acumulación, ya sean genéticos o
multifactoriales que, aumentan la producción y acumulación de Aβ, formando
inicialmente oligómeros que ocasionan daños progresivos en la sinapsis.
Posteriormente se forman las placas seniles, afectando los procesos de sinapsis,
produciendo una respuesta inflamatoria de la microglía reactiva y astrogliosis, las
cuales liberarán interleuquinas, citoquinas, entre otros. Paralelamente se generará
daño neuronal seguido de alteraciones en la homeóstasis iónica neuronal y daño
oxidativo que conlleva a las alteraciones en la actividad de las enzimas quinasas y
fosfatasas que fosforilan la proteína Tau, formando los ovillos neurofibrilares.
Finalmente, se presentará un daño neuronal generalizado, muerte celular que en
conjunto produce la demencia (Hardy & Higgins, 1992).
30
1.3.2. Hipótesis colinérgica
La hipótesis colinérgica de EA surge de los déficits neocorticales de la enzima
acetiltransferasa de colina (ChAT, siglas del inglés choline acetyltransferase) y de
acetilcolina (ACh), disminución en la liberación y captación de ACh, acompañado
por una disminución de las células colinérgicas. Acorde con esto, se postuló que el
evento desencadénante de la EA es dado por la disminución de ACh, lo que conlleva
a la degeneración y muerte de las neuronas colinérgicas y genera todos los eventos
típicos de la EA (R. Bartus et al., 1982).
Los primeros hallazgos establecieron la relación entre las vías colinérgicas y la
aparición de agregados de Aβ y NFT, encontrando que se afecta principalmente el
núcleo Ch4 ubicado en el prosencéfalo basal, seguido de los núcleos en la vía septal
medial; así, hallando un número significativo de NFT en las neuronas del área Ch4
en periodos avanzados de la patología comparado con personas sanas de la misma
edad, lo cual podría ser ocasionado por los daños en células colinérgicas (Deutsch,
1971).
La hipótesis colinérgica, se soporta en la mejora cognitiva encontrada en un modelo
de escopolamina en monos Rhesus, los cuales, al ser tratados con fisostigmina, un
inhibidor de AChE, mejoraron en pruebas de memoria, comparados con el grupo
control y el tratado con escopolamina, un inhibidor competitivo de la ACh. En el caso
del último grupo se generó un déficit cognitivo comparado con los controles (R. T.
Bartus & Johnson, 1976). Consecuentemente, se estableció como principal enfoque
la compensación terapéutica basada en la inhibición de ACh (AChIs, siglas del
inglés Acetylcholinesterase inhibitors) (Deutsch, 1971). Actualmente, los AChIs más
usados son: donepezilo, rivastigmina y galantamina, los cuales no detienen el
progreso de la enfermedad, lo que deja abierta la posibilidad de que se estén
generando daños en las vías colinérgicas previas a la fase sintomática que no se
pueden reparar o que paralelamente estén presentándose alteraciones sistémicas
diferentes que no son afectadas con estos fármacos (Gerretsen & Pollock, 2011).
31
1.3.3. Hipótesis del calcio
El calcio (Ca2+) es un ion que cumple funciones en la supervivencia y función celular,
sujeto a mecanismos de regulación homeostática. Se ha sugerido que el Ca2+ está
alterado en el cerebro de pacientes con EA. La hipótesis explica parcialmente las
causas de la disfunción sináptica, neurodegeneración progresiva y muerte celular
en la EA. Correlaciona las vías de señalización activadas por incremento de calcio
con la hipótesis amiloide a través de estímulo del metabolismo amiloidogénico de
APP por Ca2+ (M. P. Parsons & Raymond, 2014)(LaFerla, 2002) (Pierrot et al.,
2004).
Se ha observado que la disminución de funciones cognitivas que ocurre en la EA es
detectable antes de la perdida neuronal, asociada con modificaciones en el flujo de
ingreso de Ca2+ desde el retículo endoplasmático al espacio intracelular (Jacobsen
et al., 2006). Adicionalmente, se ha descrito que los oligómeros de Aβ1-42 utilizando
como receptor a la proteína priónica celular (PrPC, siglas del inglés Celular Prion
Protein), incrementa el influjo de Ca2+ a través de la activación del receptor de
NMDA (Hamilton et al., 2015).
La vía glutaminérgica está implicada en el flujo de Ca2+ y su actividad sostenida
conocida, conlleva a la entrada masiva de Ca2+ (Choi, 1988) y ocasiona la muerte
de las células neuronales por lo cual se ha denominado exitotoxicidad del glutamato
(Rothman & Olney, 1986). Los NMDAR tienen mayor permeabilidad para iones Ca2+
en comparación con otros receptores ionotrópicos de glutamato (iGluR), el influjo
prolongado de Ca2+ produce disfunción sináptica (Alberdi et al., 2010)(Texidó et al.,
2011). El fármaco memantina se ha utilizado como un tratamiento farmacológico al
ser un antagonista de NMDAR (C. G. Parsons et al., 2017).
32
En estudios realizados con cerebros de pacientes de EA se halla un incremento en
el glutamato extra-vesicular, evidenciando una disminución del transportador de
glutamato vesicular (VGluT) (Hamilton et al., 2015), al mismo tiempo, se encuentra
alterada la función del transportador 2 de aminoácidos excitadores (EAAT2) en los
astrocitos peri sinápticos (Scott et al., 2011). Por otra parte, la afectación de la
maquinaria de liberación de neurotransmisores presinápticos también puede
contribuir a la disponibilidad de glutamato, encontrando que posterior a la
degeneración de las neuronas, el Aβ reduce significativamente la expresión de
proteínas tales como sinaptofisina, sintaxina y sinaptotagmina (Jang et al., 2014).
Los receptores extrasinápticos de glutamato también hacen parte de los procesos
de excitotoxicidad. Su activación desencadena la muerte celular, la cual es reducida
por la acción de la memantina que parece tener una mayor afinidad por este tipo de
receptores en las células neuronales (M. P. Parsons & Raymond, 2014).
Adicionalmente, la activación de NMDAR extrasinápticos ha implicado alteraciones
en vías de señalización importantes para la homeostasis celular, tales como, la vía
de supervivencia celular CREB y la activación de factores de transcripción FOXO,
junto con el aumento de la señalización de estrés oxidativo y la apoptosis (M. P.
Parsons & Raymond, 2014).
1.3.4. Radicales libres y la EA
Los radicales libres son especies químicas con un electrón no apareado, que
pueden generarse biológicamente mediante procesos fisiológicos y patológicos. Las
especies reactivas de oxígeno (ROS, siglas del inglés: Reactive Oxygen Species)
tienen un papel fundamental en múltiples procesos celulares incluyendo la
regulación del ciclo celular, la fagocitosis y la activación enzimática. Sin embargo,
la generación excesiva de ROS conduce a efectos nocivos, entre los cuales se
encuentran el daño al ADN, lípidos y proteínas (Verbon et al., 2012).
33
El mecanismo de regulación celular de la producción de radicales libres es
realizado, en primera medida, por el superóxido dismutasas (SOD), el glutatión
peroxidasas (GPX), glutaredoxinas, tiorredoxinas y catalasas, las cuales son
enzimas antioxidantes que actúan como captadoras de radicales libres (Manoharan
et al., 2016). Dentro de los mecanismos de protección contra el estrés oxidativo se
encuentra la activación del factor 2, relacionado con el factor nuclear eritroide (Nrf2,
siglas del inglés nuclear factor erythroid-2-related factor 2) y regulado
negativamente por su unión con el represor citoplasmático y sensor de estrés
Kelchlike Proteína 1 asociada a ECH (KEAP1, siglas del inglés Kelchlike ECH
associated protein 1). En presencia de electrófilos y oxidantes, KEAP1 permite que
Nrf2 se transloque al núcleo y actúe como factor de transcripción aumentando los
niveles de enzimas antioxidantes (Joshi & A. Johnson, 2012).
En la EA los procesos degenerativos involucran daños mitocondriales que llevan a
la activación de vías proapoptóticas, lo cual puede ser causado por concentraciones
anormales de radicales como el anión superóxido (O2-), el radical hidroxilo [OH]., el
peróxido de hidrogeno (H2O2), el óxido nítrico (NO) y peroxinitrito (ONOO-) mediado
por el estrés oxidativo (Holmström & Finkel, 2014). Estos radicales se producen
adicionalmente por la activación de la microglía, la cual libera el radical O2- con
mayor frecuencia; otra forma es a través de la autofagia mitocondrial (Tönnies &
Trushina, 2017). Por otra parte, se ha observado acumulación de iones de hierro
con Aβ (Fe2+/ Aβ) en el cerebro de los pacientes de EA, sugiriendo la causa del
incremento de radicales [OH]. mediante reacción de Fenton (Cassidy et al., 2020).
El estrés oxidativo se favorece en el cerebro por la naturaleza posmitótica de las
células neuronales y gliales, su alto consumo de oxígeno, bajos niveles de ácidos
grasos poliinsaturados (PUFA), además de tener un potencial antioxidante
insuficiente (Selkoe, 2001). En la EA, se ha evidenciado que el Aβ1-42 induce estrés
oxidativo, incrementa la peroxidación lipídica y reduce los niveles de antioxidantes,
principalmente en el lóbulo temporal, la corteza entorrinal y la región Ca1 del
34
hipocampo, que a su vez son las regiones más susceptibles al estrés oxidativo
(Butterfield & Lauderback, 2002). Los procesos de peroxidación lipídica afectan la
constitución de las membranas celulares, modificando la fluidez, rigidez,
permeabilidad y transporte, generando un daño funcional en las células (Tönnies &
Trushina, 2017).
En resumen, el estrés oxidativo puede ser producido por la oxidación de
macromoléculas, iones metálicos con potencial reductor y por la disfunción
mitocondrial; a su vez, el estrés oxidativo produce facilita los tres mecanismos
mencionados por retro-alimentacion y lleva a incrementos de p-Tau y agregación de
Aβ. En conclusión, el estrés oxidativo se presenta transversalmente en todos los
procesos neurodegenerativos, aumentando la producción de marcadores
histopatológicos en el caso de la EA y daño celular (Cassidy et al., 2020; Islam et
al., 2019; Tobore, 2019).
1.3.5. Alteración lipídica en la EA
En el cerebro, el colesterol es sintetizado por las células gliales por la vía del
mevalonato, debe ser transportado a las células neuronales, para lo cual se exporta
por transportadores lipídicos como ABCA1, ABCA7 y ABCG1 que cargan las
apolipoproteínas como ApoE o ApoJ para formar lipoproteínas de alta densidad
(HDL) para ser excretadas. El HDL extracelular es reconocido por sus receptores
LDLR, LRP1 y SOR1, y endocitado mediante la función de PICALM y BIN1 (Picard
et al., 2018).
Dentro de los argumentos que sustentan la hipótesis de la asociación del
metabolismo del colesterol y LOAD, se encuentra una fuerte asociación entre los
micro dominios de balsas lipídicas, formados en parte por colesterol y el aumento
del procesamiento APP seguido por aumentos de Aβ, aunque a la fecha no se sabe
con claridad si la α-secretasa y la BACE podrían tener una mayor actividad en las
balsas lipídicas, si se ha evidenciado que la γ-secretasa tiene actividad preferente
35
en esta región (Vetrivel & Thinakaran, 2010). Sumado a esto, se ha observado en
modelos knockout de APP un deterioro en las lipoproteínas, disminución de la
concentración de colesterol intracelular y aumentos significativos de transcritos y
proteínas relacionadas con la síntesis e internalización de colesterol (Fong et al.,
2018).
APOE no es el único gen asociado con el riesgo de padecer EA perteneciente al
metabolismo lipídico, estudios de GWAS han demostrado el riesgo de variantes de
genes como: el integrador de puentes 1 (BIN1), CLU (ApoJ), gen de la proteína de
ensamblaje de clatrina que se une a fosfatidilinositol (PICALM), ABCA1, ABCA7,
ABCG y el gen del receptor relacionado con la sortilina o receptor de ApoE (SORL1),
para los cuales no se conocen con claridad los mecanismos moleculares (Picard et
al., 2018; Reed et al., 2014; Xie et al., 2018).
Adicionalmente, el colesterol libre o esterificado por la O-aciltransferasa (SOAT1),
puede ser almacenado y puede convertirse en un oxiesterol como el 25-
hidroxicolesterol o el 24S-hidroxicolesterol, el cual puede salir del cerebro a través
de la barrera hematoencefálica hacia la sangre (Picard et al., 2018). Varios de estos
oxiesteroles son ligandos naturales del receptor nuclear X hepático (LXR) (Sakakura
et al., 2001).
La hipótesis lípidica de EA, también está soportada en la reducción del riesgo de
padecer EA observada en estudios clínicos en pacientes tratados con estatinas,
fármacos inhibidores específicos de β-hidroxi-β-metilglutaril-coenzima A reductasa
(HMG-CoA Reductasa) que inhiben la síntesis de colesterol y reducen la producción
endógena de LDL (Rang, H. P., Dale, M. M., Ritter, J. M., & Moore, 2004).
Adicionalmente las estatinas tienen efectos antinflamatorios, atenuando el daño
causado por la acumulación de Aβ (Picard et al., 2018; Reed et al., 2014; Xie et al.,
2018) (Bales et al., n.d.)(Jick et al., 2000)(Wolozin et al., 2000).
36
En la actualidad, el gen APOE es uno de los más estudiados, debido a su asociación
con los procesos homeostáticos del metabolismo lipídico, principalmente del
colesterol y su relación con la EA. El gen APOE está localizado en el cromosoma
19:44, 905,749-44,909,395, codifica para la proteína ApoE que está formada por
299aa. El gen tiene diferentes isoformas, lascuales se presentan con una frecuencia
alélica y genotípica diferente en la población, predominando los alelos; ε2, ε3 y ε4,
que a su vez dan origen a seis genotipos, tres de tipo homocigoto y tres de tipo
heterocigoto. La frecuencia del alelo ε2 está en un rango de 4%-14%, la del alelo ε3
y ε4 en un 68%-86% y 10%-23% respectivamente (Genin et al., 2011; Lars Ulrik
Gerdes et al., 1992; Liu et al., 2013; Myers et al., 1996; Robinson et al., 2017; Suri
et al., 2013; Tang et al., 2018; Verghese et al., 2012).
Las variaciones alélicas de APOE-ε2, ε3 y ε4 se diferencian por presentar cambios
en los residuos de aminoácidos 112 y 158, obteniendo para cada variación Cys-
112/Cys-158, Cys-112/Arg-158 y Arg-112/Arg-158 respectivamente. Estas
modificaciones afectan sus propiedades estructurales y funcionales (Phillips, 2014;
Verghese et al., 2012; Weisgraber, 1994).
ApoE se expresa en diferentes órganos, principalmente en el hígado y el cerebro.
Esta proteína se encarga del transporte de colesterol y de lípidos esenciales, tareas
fundamentales para el correcto funcionamiento del sistema nervioso central (SNC).
Al mismo tiempo, está implicada en el crecimiento neuronal, plasticidad sináptica y
mantenimiento neuronal; ApoE se localiza como componente de los complejos
lipoproteicos, formados por otras apolipoproteínas, proteínas en plasma y proteínas
en el líquido cefalorraquídeo (LCR)(Liu et al., 2013).
Se ha establecido que el genotipo de APOE ε4 es el mayor factor de riesgo genético
para la LOAD, sin embargo, su mecanismo no se ha determinado con certeza.
Existen evidencias que sugieren que APOE ε4 confiere efectos sutiles en la
cognición a mediados de la edad adulta, antes del periodo prodrómico;
37
paralelamente, se han encontrado evidencias que indican que la implicación de
APOE se presenta con el aumento de los años o que no tiene ninguna asociación
(O’Donoghue et al., 2018).
Pacientes con el genotipo homocigoto de APOE ε4 presentan una aparición de la
sintomatología más temprana en comparación con los pacientes que presentan el
genotipo heterocigoto ε3 o ε4. En población caucásica, se ha identificado que
aproximadamente la mitad de los homocigotos desarrollan la EA a los 85 años en
comparación con los no portadores con el 10 %, confiriendo un riesgo cercano al
30 % a la edad de 75 años y del 50 % en edades mayores (Genin et al., 2011).
La expresión de ApoE ε4 se asocia a una menor efectividad en las vías de
eliminación de Aβ, explicando parcialmente su rol en el desarrollo patológico de la
EA (Bu, 2009; Genin et al., 2011; Liu et al., 2013; Myers et al., 1996; Phillips, 2014;
Suri et al., 2013; Verghese et al., 2012; Weisgraber, 1994). Adicionalmente, estudios
en modelos animales mostraron que la presencia de APOE ε4 se asocia con un
atraso en el desarrollo neuronal y en humanos con la disminución de la densidad
dendrítica y formación anormal de la mielina (Nwabuisi-Heath et al., 2014).
Por otro lado, se ha observado que la expresión de ApoE ε2 tiene una acción
protectora de EA sin ser claro su mecanismo, se ha asociado con la inhibición de la
fosfatidilserina expuesta en la superficie celular con el péptido Aβ, lo cual impediría
la formación de poros conductores de iones involucrados en la desregulación del
Ca2+ (Bezprozvanny & Mattson, 2008).
1.4. Terapéutica
En la actualidad no existe un tratamiento curativo para la EA, sin embargo, se han
desarrollado terapias farmacológicas y no farmacológicas para controlar
parcialmente los síntomas y proporcionar al paciente una mejor condición de vida.
38
1.4.1. Terapias farmacológicas
Acorde con lo publicado en el ALZFORUM, una de las mas reconocidas bases de
datos de la EA en el mundo (https://www.alzforum.org), se han propuesto alrededor
de 254 posibles terapias para el tratamiento de la EA, las cuales se encuentran en
diferentes fases de investigación o ya fueron descartadas. Dentro de este grupo de
posibles terapias se han seleccionado dianas farmacológicas asociadas con la
desregulación de los neurotransmisores, la respuesta inflamatoria, homeostasis del
colesterol y la vía amiloidogénica, entre otras. Con el fin de lograr una mejoría
cognitiva asociada con el desarrollo patológico de la EA se han implementado
terapias de diferentes clases, dentro de las cuales se encuentra el uso de pequeñas
moléculas, inmunoterapia activa y pasiva, modificación dietaría e irrupción de la vía
amiloidogénica (Mucke, 2009).
De las 254 terapias reportadas, 6 han dado los mejores resultados y corresponden
al uso de: donepezilo, galantamina memantina, rivastigmina, suvorexante y tacrina,
8 se encuentran en la fase experimental 4:AVP-923, carvedilol, ácido
docosahexaenoico, ketasina, metilfenildato, prazosina, resveratrol y simvastatina,
19 se encuentran en la fase 3, 10 en la fase intermedia entre la 2 y la 3, 65 en la
fase 2, y 35 en la fase 1, 83 fueron descartadas y 24 están inactivas (Mucke, 2009).
Además, se encuentran alrededor de 226 artículos relacionados con el efecto de
agonistas sobre los receptores nucleares PPAR, 115 sobre los LXR y 80 asociados
a los RXR, evidenciando la importancia que han venido tomando los receptores
nucleares como potenciales estrategias en el tratamiento de la EA (Mucke, 2009).
Particularmente, se dispone de diferentes farmacos cuyo mecanismo es la inhibición
de la acetilcolinesterasa que aumentan la transmisión colinérgica en la hendidura
sináptica, provocando mejoría cognitiva. La tacrina o tetrahidroaminocridina, fue
sintetizada por el científico Adrien Albert y comercializada como el primer inhibidor
de la acetilcolinesterasa, con acción aprobada como agonista colinérgico indirecto,
salió del mercado debido a su efecto hepatotóxico y su baja practicidad en las dosis
39
que se debían suministrar durante el día. El donepezilo fue otro fármaco que
también salió del mercado por los mismos efectos secundarios de la tacrina, a pesar
de mostrar efectos importantes reduciendo la formación de placas seniles tóxicas,
así como la respuesta inflamatoria (Ashford et al., 1989; Jann et al., 2002; Madden
et al., 1995).
Conservando la acción inhibitoria de la enzima acetilcolinesterasa, se usaron los
fármacos donepezilo, rivastigmina (alcaloide obtenido inicialmente de las semillas
de Phisostigma venenosum Balf. F) y galantamina (alcaloide aislado de la Galanthus
woronowii Losinsk), los cuales también producen efectos secundarios, tales como,
alteraciones gastrointestinales, arritmias, calambres musculares, náuseas, entre
otros (Mihailova et al., 1989). Por otra parte, se han evaluado fármacos que buscan
mejorar la neurotransmisión glutaminérgica como la memantina, un antagonista de
los receptores NMDA que retarda el desarrollo de la enfermedad, (Mihailova et al.,
1989).
1.4.2. Tratamientos no farmacológicos
Dentro de los tratamientos no farmacológicos de la enfermedad, está la
rehabilitación psicosocial, con la cual se trabaja con el paciente en su entorno
familiar y social, las habilidades cognitivas que aún prevalecen, lo que puede
generar un retraso de la enfermedad. El objetivo de las sesiones es mejorar las
facultades cognitivo-conductuales, ejercitando la mente y usando la aromaterapia,
musicoterapia y las actividades asistidas por mascotas. Estos métodos, aunque no
son tan efectivos, mejoran la calidad de vida del paciente y los cuidadores, en
conjunto con las terapias farmacológicas (Hermans et al., 2007)(Bottino et al., 2005).
40
1.5. Receptores nucleares
Los receptores nucleares (RNs) son un grupo de proteínas intracelulares, que
interactúan directamente con el ADN y actúan como factores de transcripción
activados por un ligando, regulando de esta forma la expresión de genes específicos
involucrados en diversas funciones fisiológicas de los organismos. (Committee,
1999; R. Evans, 1988).
Los receptores nucleares (RN) son una familia génica de proteínas relacionadas
estructuralmente. Tienen diferentes dominios (Ilustración1-1), el dominio N-terminal
tiene una función reguladora, posee una secuencia variable en cada receptor junto
con la función de activación 1 (AF-1) que tiene una acción independiente de la
presencia del ligando y una baja activación transcripcional. El dominio de unión al
ADN (DBD) es muy conservado, su estructura está basada en dos motivos de dedos
de zinc que interactúan específicamente con el ADN en los denominados elementos
de respuesta. El dominio de bisagra es una región flexible que se encuentra entre
los dominios DBD y LBD. El dominio de unión al ligando (LBD) es muy conservado,
su estructura terciaria se ha denominado sándwich de α-hélices, contiene el sitio de
unión al ligando en su interior. El dominio LBD y DBD permiten que se dé la
dimerización del receptor nuclear, con la capacidad adicional de unirse a
coactivadores y correpresores. El dominio LBD contiene también la función de
activación-2, que trabaja sinérgicamente con la AF-1 y activar de una manera más
especifica la transcripción. Por último, el dominio C-terminal es variable entre los
distintos tipos de receptores nucleares (Klinge, 2000; R. Kumar & Thompson, 1999).
41
Ilustración 1-1. Dominios de los receptores nucleares. Tomada de: (Yang, C., Li, Q., & Li, 2014) A. Ilustración de los dominios AF-1, DBD, hinge, LBD y AF-2 característicos de los RN. B. Estructura tridimensional de los RN, acompañado por la interacción del dominio DBD y el ADN. C. estructura tridimensional de la zona de unión a ligando de los RN. D. Clasificación de los RN de acuerdo con su asociación en monómeros, homodimeros y heterodímeros
Los RN se han clasificado de tres maneras, de acuerdo con su mecanismo de
acción, su grado de homología y sus ligandos (Committee, 1999; Laudet, 1997). De
acuerdo con su mecanismo de acción, se encuentran dos grandes grupos, aquellos
ubicados inicialmente en el citoplasma (denominados de tipo I) y los que se localizan
en el núcleo (denominados de tipo II). Los receptores tipo I, cuando están libres de
ligando, se localizan normalmente en el citoplasma, cuando interactúa con el
ligando, se produce la disociación de las proteínas de choque térmico (HSP), se
42
dimerizan y se translocan al núcleo donde el RN se une al elemento de respuesta
del ADN, generando el complejo de RN-ADN, reclutando proteínas involucradas en
el procese de transcripción. En cuanto al mecanismo de acción de los RN tipo II,
también denominados huérfanos adoptados, se encuentran unidos como
heterodímeros funcionales con el receptor X retinoide (RXR) al elemento de
respuesta en el ADN, que en ausencia de ligando están unidos a complejos
proteicos correpresores, al unirse al ligando se liberan los correpresores y reclutan
por proteínas coactivadoras (Mangelsdorf et al., 1995; Novac & Heinzel, 2004).
Adicionalmente, los receptores tipo III, también llamados receptores huérfanos
debido a que no se conocen sus ligados naturales, poseen un mecanismo de
activación similar a los de tipo I, formando homodímeros; sin embargo, contrario a
los de tipo I, los de tipo III se unen a repeticiones directas del ADN y no a las
repeticiones invertidas. (Mangelsdorf et al., 1995; Novac & Heinzel, 2004)
(Ilustración 1-2).
43
Ilustración 1-2. Mecanismo de activación de los receptores nucleares. Tomada de: (Sever, R., & Glass, 2013) Esta ilustración muestra el mecanismo de de activación de los RN tipo I, II y III, en el caso de los receptores tipo I y II el ligando podria ingresar a la célula y unirse al receptor de estrógeno, liberando a la proteina HSP y permitiendo la formación de un homodímero con características que le permitirán entrar al núcleo y unirse a su elemento de respuesta junto con todos los factores coactivadores transcripcionales. En el caso del tipo II, los ligandos pueden encontrarse extracelular e intracelularmente y deberán atravesar la membrana celular y la membrana nuclear, para entrar en contacto con los RN que se encuentran heterodimerizados con los RXR y permitir un cambio conformacional que conlleva a la salida del comprejo corepresor y la unión del complejo coactivador transcripcional.
1.5.1. Receptor X Hepáticos y su relación con la EA
La subfamilia de receptores X de hígado (LXR) está conformada por dos miembros,
LXRα y LXRβ, los cuales hacen parte los 48 RN identificados en humanos. Estos
44
cumplen una función de regulación transcripcional de genes implicados en el
metabolismo. LXR forma heterodímeros funcionales con RXR, tanto el receptor
LXRα como el LXRβ son dianas farmacológicas activadas por oxiesteroles,
consideradas piezas clave del metabolismo de lípidos y de colesterol, así como de
cumplir funciones asociadas a los procesos inflamatorios (Bourguet et al., 2000).
LXRβ se encuentran expresados de manera ubicua y LXRα se limita a tejidos
metabólicamente activos como el hígado y astrocitos en el cerebro (Bourguet et al.,
2000).
En humanos, LXRα tiene una estructura compuesta por 447 aminoácidos y el LXRβ
tiene 460 aminoácidos, compartiendo una homología del 77 % en las regiones DBD
y LBD (Zelcer et al., 2007). Inicialmente, se agruparon junto con los receptores
huérfanos (Apfel et al., 1994b; Teboul et al., 1995), hasta que se identificaron los
oxiesteroles como ligandos naturales, incluyendo el 24(S)-hidroxicolesterol, 22(R)-
hidroxicolesterol, 24(S) y 25-epoxicolesterol y 27-hidroxicolesterol, entre otros
(Viennois et al., 2012).
Los efectos regulatorios de los LXR se han estudiado a partir de ligandos sintéticos
de LXR; los más estudiados y caracterizados son los T0901317 y GW3965. Estas
moléculas ocasionan hipertrigliceridemia, motivo por el cual no son usados en
humanos, pero sí con fines investigativos, tanto en modelos celulares como
animales (Schultz, 2000)
Los agonistas sintéticos de LXR como la molécula T0901317, disminuyen la
neuroinflamación y reducen los niveles de amiloide-β, generando mejorías
cognitivas (Fitz et al., 2010). La activación LXR en modelos animales y celulares
expuesto a factores inductores de inflamación induce la expresión de varios factores
anti-apoptóticos e inhibe la expresión de factores pro-apoptóticos (Joseph et al.,
2004; Valledor et al., 2004)(Fitz et al., 2010).
45
En el modelo animal 3xTg-AD se observó que un tratamiento de tres meses con
GW3965 aumentó la expresión de ApoE y ABCA1 en el hipocampo y la corteza
cerebral, asociado a reducción de la astrogliosis, aumento de células madre en la
zona subgranular del giro dentado (ZSG) y recuperación de la plasticidad sináptica
de largo plazo en el hipocampo (Sandoval-Hernández et al., 2015). Adicionalmente
un tratamiento de corto término (seis días) en ratones 3xTg-AD de veinticuatro
meses de edad, disminuyó el Aβ en vasos sanguíneos, redujo la astrogliosis,
aumento la expresión de LRP1 y restauró parcialmente la microvasculatura cerebral
(Sandoval-Hernández et al., 2016).
Adicionalmente, el pretratamiento con GW3965 en cultivos primarios neuronales de
hipocampo de ratón protegió las células del efecto tóxico de oligómeros de Aβ (oAβ)
sobre la densidad de las espinas dendríticas maduras, los contactos sinápticos, y la
expresión de proteínas presinápticas y la postsinapticas como VGlut1, SYT1, SV2A,
SHANK2, NMDA, PINK1, ROCKII, además de reducir el clivaje de caspasa-3 (Báez-
Becerra et al., 2018).
1.6. Uso de productos naturales vegetales con potencial farmacológico en la enfermedad de Alzheimer
Durante los últimos 39 años, se han establecido 1602 compuestos con actividad
farmacológica para diferentes enfermedades, 69 productos naturales inalterados, 8
drogas botánicas, 286 derivados de productos naturales y 388 productos sintéticos
que imitan productos naturales (Newman & Cragg, 2020). En el caso de la EA, se
han implementado clínicamente 6 compuestos; de los cuales 1 es una
macromolécula biológica, 1 es un producto natural inalterado, 1 es un derivado de
un producto natural y 3 son moléculas sintéticas que se asemejan a productos
naturales (Dighe et al., 2019; Marco & Carreiras, 2006).
Comercialmente son ampliamente reconocidas dos moléculas obtenidas de
productos naturales, la rivastigmina y la galantamina. La rivastigmina, es un
46
alcaloide, extraído de Phisostigma venenosum Balf. F. y la galantamina extraída de
la Galanthus woronowii Losinsk, actúan como inhibidores de la AChE (Dighe et al.,
2019; Marco & Carreiras, 2006). Explotar el potencial de los extractos naturales
vegetales es clave para el desarrollo farmacológico. Cada día se publican más
investigaciones en el mundo que arrojan resultados in vitro, e in vivo que proponen
más moléculas con un alto potencial terapéutico.
Por otra parte, como se ha mencionado en este documento, los RN, especialmente
los receptores RXR, PPAR y LXR, son dianas terapéuticas que han despertado un
especial interés en la comunidad científica para el tratamiento de EA y otros
desordenes metabólicos e inflamatorios, ya que regulan proteínas implicadas en el
desarrollo de enfermedades como la fibrosis, la diabetes, la dislipidemia y la cirrosis
(Beaven & Tontonoz, 2006; Francis et al., 2003; Joseph et al., 2004; Masoud
Tavazoie, 2018; Muse et al., 2018; Peet et al., 1998; J. Wang et al., 2006). En
consecuencia, la búsqueda de agonistas y antagonistas es de suma importancia, y
en este sentido los productos naturales son una opción importante en tanto son
fuente de compuestos con una amplia diversidad estructural, con esqueletos
inaccesibles por otras vías y con acciones farmacológicas muy promisorias, razón
por la cual es de nuestro interés direccionar nuestros estudios a la minería de
compuestos pertenecientes a los productos naturales (Atanasov et al., 2015; Ji &
Zhang, 2008; Yang et al., 2014).
En el caso de los receptores RXR, la búsqueda de fármacos se ha centrado en
enfermedades metabólicas y cáncer, usando convencionalmente para su
tratamiento el Bexaroteno (Kotani et al., 2010). Ahora bien, los receptores PPAR se
han estudiado para tratar principalmente diabetes y dislipidemias, encontrando lo
fármacos de la familia de las tiazolidinedionas como la rosiglitazone, GW9662,
GW501516 y fibratos (Dressel et al., 2003; Hammarstedt et al., 2005; Keller et al.,
1993; Krentz & Friedmann, 2006; Nissen & Wolski, 2007; Schoonjans et al., 1996).
47
A continuación, se hará un recuento de los productos naturales aislados a partir de
diferentes fuentes con efectos sobre diferentes receptores.
En la investigación desarrollada por Kim y colaboradores, como resultado de la
evaluación de productos naturales marinos agonistas del receptor PPAR, se
mencionan 90 extractos con la capacidad de unirse a las diferentes isoformas del
receptor, evidenciando un porcentaje de activación diferente entre ellos. Acorde
con los resultados reportados, la especie Grateloupia elliptica, (Halymeniaceae)
genera un porcentaje de activación de PPARα del 41,4%, Endarachne binghamiae
(Scytosiphonaceae) activa PPARα en un 47,4% y PPARγ en 39,5%, las algas
pardasdel género Sagassum (Sargassaceae) producen interesantes efectos, es
así que la especie Sargassum siliquastrum produce un porcentaje de activación de
69,2% para PPARγ y Sagassum yezoense genera activación de PPARα y PPARγ
en un 80,5% y 68,8% respectivamente. Del extracto Sagassum yezoense fueron
aislados el ácido sargaquinoico y el ácido sargahidroquinoico, identificados como
los compuestos más activos para PPARα/PPARγ. Estos ácidos tenían una mayor
afinidad de unión por el receptor que el agonista específico: troglitazona (Kim et al.,
2008).
Estructuras de tipo esteroidal y triterpenoidal, como el cicloeucalenona o isómeros
del ergosterol; como el ergostan-4,6,8,22-tetraen-3-ona o el ergostan-6,8,22-trien-
3-ol, mostraron ser agonistas del receptor nuclear LXRα. Estas moléculas fueron
extraídas de diferentes hongos, como los Acremonium sordidulum, Colletotrichum
dematium, Tolypocladium niveum, entre otros y actúan de forma similar a los
esteroles que se encuentran como ligandos naturales del receptor nuclear LXRα
(Ondeyka et al., 2005).
Por otro lado, con el estudio de los compuestos del hongo Pinicillium paxilli se
identificó la paxilina, un alcaloide indólico, que funciona como activador de
LXRα/LXRβ, aumentando como consecuencia la transcripción de genes como
48
ABCA1 y SREBP (Bramlett et al., 2003). La importancia de este estudio radica en
que la paxilina no es un oxiesterol, convirtiéndose en la primera molécula no
esteroidal que activa a los receptores LXR, lo cual amplía las posibilidades de
búsqueda de nuevos ligandos de diferente origen que puedan actuar como
agonistas de estos receptores (Bramlett et al., 2003).
A partir de la especie Magnolia abovata, se aisló el lignano, Honokiol, el cual
demostró activar el heterodímero LXR/RXR (Kotani et al., 2010; D. Wang et al.,
2018). Y a partir de la especie Paeonia lactifolia se aisló el antocianósido,
Paeoniflorina, que mostró ser agonista de LXR al ser evaluada por el ensayo de
luciferasa; al modelar por Docking molecular, se encontró que la paeoniflorina
estaba rodeada principalmente por residuos hidrófobos en el bolsillo de unión de
LXRa, incluidos Phe 255, Leu 258, Ile 293, Leu 297, Phe 313, Leu 329, Ile 337, Val
423, y Leu 426, interactuando principalmente por la generación de puentes de
hidrogeno; esto, junto con otros resultados complementarios, llevó a pensar que
efectivamente se está dando una interacción entre el ligando y el sitio de unión a
LXRα (H. R. Lin, 2013).
Ahora bien, es importante resaltar que hay moléculas extraídas de productos
naturales con actividades neuroprotectoras, actuando favorablemente sobre
diferentes dianas farmacológicas de la EA. Acorde a esto, se ha identificado la
epigalocatequina-3-galato, un tipo de catequina, extraída de Camellia sinensis, tiene
la capacidad de estimular a la α-secretasa (Levites et al., 2003). Mientras que, el
glicosido triterpenoidal Ginsenósido Rg1, extraído de Panax notoginseng y γ-pirona
hispidina, extraída del hongo Phellinus linteus tienen la actividad inhibitoria de
BACE1 (Park et al., 2004; Y. Wang & Du, 2009)
Adicionalmente, se han encontrado evidencias que han mostrado el potencial
antioxidante presentado por los productos naturales vegetales tienen en su
composición como posibles terapias para las enfermedades neurodegenerativas.
49
Algunas de las moléculas identificadas son: la curcumina, un polifenol, extraído de
la Curcuma longa L., molécula que también aumenta la citoquina antiinflamatoria IL-
4, reduce los niveles de Tau fosforilado y de Aβ (Voulgaropoulou et al., 2019). La
Quercetina, un flavonoide, extraído de especies de la familia Fabaceae entre otras,
la cual tiene actividad antioxidante y antiagregante de Aβ (Paula et al., 2019). La
luteonina, un flavonoide, extraído de especies de Briofitas, Pteridofitas, Pinofitas y
Magnoliofitas, es reconocido por su actividad antioxidante, antiinflamatoria, y la
capacidad de reducir la hiperfosforilación de Tau (Kwon, 2017). Finalmente, un
excelente ejemplo de actividad multi diana es dado por la berberina, un alcaloide
isoquinolínico, extraído de Berberis aquifolium Pursh, Berberis bulgaris L., Berberis
cristata G.o Hydrastis canadensis L., entre otras, el cual tiene acción antioxidante,
inhibidor de monoaminoxidasa, de AChE y BChE (Cai, 2016).
Los anteriores estudios muestran el potencial de los productos naturales vegetales
como fuente de sustancias para el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas. En la tabla 1-1 se presentan ejemplos de moléculas extraídas
de productos naturales con un potencial terapéutico para la EA y su diana
terapéutica asociada.
Tabla 1-1. Moléculas aisladas de productos naturales con potencial terapéutico para la EA.
Referencia Diana
terapéutica Fuente
Compuesto
aislado estructura
(Kim et al.,
2008) Agonistas
PPARα/PPARγ
Sagassum
yezoense
ácido
sargaquinoico
(Kim et al.,
2008)
Sagassum
yezoense
ácido
sargahidroquin
oico
(Bramlett et
al., 2003)
activador de
LXRα/LXRβ
Penicillium
paxilli
Paxilina
50
(Ondeyka et
al., 2005)
Activador del
receptor nuclear
LXRα
Acremonium
sordidulum,
Colletotrichum
dematium,
Tolypocladium
niveum,
Ergosterol
(Ondeyka et
al., 2005)
Activador del
receptor nuclear
LXRα
Peróxido de
ergosterol
(Bramlett et
al., 2003)
activador de
LXRα/LXRβ
Penicillium
paxilli
Paneioniflorina
(Kotani et al.,
2010; D.
Wang et al.,
2018)
Activador
delheterodímero
LXR/RXR
Magnolia
abovata Honokiol
(Levites et al.,
2003)
Estimula α-
secretasa
Camellia
sinensis
epigalocatequi
na-3-galato
(Voulgaropoul
ou et al.,
2019)
Antioxidante
Curcuma
longa L
Curcumina
Wang & Du,
2009
Inhibidor de
BASE
Phellinus
linteus
Hispidina
51
(Paula et al.,
2019)
Antioxigante y
anti agregante
de Aβ
Domorphandra
mollis
Quercetina
(Kwon, 2017)
Antioxidante,
Antiinflamatoria,
y capacidad de
reducir la
hiperfosforilació
n de Tau
Especies de
Briofitas,
Pteridofitas,
Pinofita y
Magnoliofita
Luteonina
(Cai, 2016)
Antioxidante,
inhibidor de la
monoaminoxida
sa, de AChE y
BChE.
Berberis
aquifolium
Pursh
Berberina
(Dighe et al.,
2019)
Inhibidor de
AChE
Phisostigma
venenosum
Balf. F.
Rivastigmina
(Marco &
Carreiras,
2006)
Inhibidor de
AChE
Galanthus
woronowii
Losinsk.
Galantamina
52
2. Capítulo 2: Efecto agonista de extractos de plantas colombianas sobre los LXRs
2.1. Introducción
La inexistencia de un tratamiento efectivo para EA, la ha convertido en un problema
de salud pública a nivel mundial (Association, 2020). En la actualidad Existen cinco
fármacos aprobados para tratamiento clínico: la tacrina, la galantamina, el
donepezilo, la rivastigmina y la memantina, la eficacia de estos se ve limitada y
producen efectos secundarios, motivo por el cual se continúa investigando en
nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de la EA (Yiannopoulou &
Papageorgiou, 2013).
Los productos naturales son una excelente fuente de agentes terapéuticos, ya que
contienen una amplia diversidad de moléculas bioactivas (Ahmad et al., 2016; Mir
53
et al., 2019; Ramawat et al., 2009). Se reportó que para el 2001 sólo se habían
estudiado entre el 6%-15% de las plantas con propiedades medicinales, en la
identificación y aislamiento de los metabolitos secundarios con un potencial
farmacológico (Atta-ur-Rahman & Choudhary, 2001).
Dentro de las ventajas de trabajar con productos naturales, se encuentra qua, al ser
sintetizados por organismos vivos, tienen mayores probabilidades de cumplir
funciones biológicas, lo que les permite, por ejemplo, tener moléculas que se unen
a sus posibles receptores con mayor afinidad (Atanasov et al., 2015; Ji & Zhang,
2008). Además, presentan una amplia diversidad química, mayor complejidad
biosintética y propiedades farmacológicas de absorción, distribución, metabolismo,
excreción y toxicidad (Atanasov et al., 2015; Ji & Zhang, 2008).
Los productos sintéticos por su parte, se diferencian de los productos naturales en
su proceso de obtención, ocasionando que se favorezca la generación de
estructuras con un menor número de centros quirales (Hussain et al., 2019; Jan et
al., 2020), generalmente se sintetizan moléculas de bajo peso molecular, largas
longitudes de cadena, un menor número de receptores y donantes de protones,
menos oxígenos y más halógenos, nitrógeno y sulfuro, además de presentar una
gran cantidad de enlaces de rotación libre, pocos anillos, un alto grado de
saturación, etc. Lo que ocasiona, que sean menos específicos por moléculas
biológicas en contraste con los compuestos naturales (Atanasov et al., 2015; Ji &
Zhang, 2008).
Acorde a lo mencionado en el capítulo anterior, en el caso de la EA, en este
momento es importante la búsqueda de compuestos o agentes químicos multidiana,
teniendo en cuenta la complejidad de la patología. Los productos naturales tienen
una acción farmacológica idónea para las necesidades actuales de la EA, por lo que
son de gran interés en la comunidad científica (Atanasov et al., 2015; Atta-ur-
54
Rahman & Choudhary, 2001; Ji & Zhang, 2008; Yiannopoulou & Papageorgiou,
2013).
Como resultado del trabajo independiente y colaborativo entre grupos de
investigación “muerte celular“ y el grupo de investigación “QUIPRONAB”, de la
Universidad Nacional de Colombia, se ha contribuido a la comprensión del rol e
importancia de LXR y RXR en la pato-fisiología de la EA, encontrando, que al activar
estos receptores nucleares, se presenta una mayor expresión de ApoE y ABCA1 en
el hipocampo y la corteza del cerebro, además de mejorar la plasticidad sináptica,
disminuir la neuro inflamación y de recuperar defectos de la microvasculatura en el
hipocampo (Báez-Becerra et al., 2018; Muñoz-Cabrera et al., 2019; Sandoval-
Hernández et al., 2015, 2016).
A partir de un “screening” con 81 extractos de las familias Rutaceae, Lauraceae,
Myristicacea y Piperaceae, se identificaron 13 extractos con la capacidad
antioxidante, y de inhibir la AChE (E. A. Plazas et al., 2018). A partir de este
screening se realizó la evaluación de un grupo pequeño de extractos etanólicos
pertenecientes a las familias Lauraceae, Rutaceae y Myristicaceae, en el que fue
posible determinar que los extractos de las especies Ocotea lanceolata,
Zanthoxylum rohifolium y Nectandra reticulata presentaron actividad agonista de
LXR (Rincón, 2017). Finalmente, el estudio racional de las especies activas de la
familia Rutaceae, condujo al aislamiento de alcaloides isoquinolínicos, a partir del
extracto de raíz de Zanthoxylum rigidum, encontrando que dos alcaloides
benzofenantridinicos, nitidina y avicina, presentaron actividades inhibitorias de
AChE, BChE, monoaminooxidasa, y potencial antiagregante de Aβ1-42 (Plazas
Gonzalez et al., 2020).
Teniendo en cuenta la importancia del receptor nuclear LXR como diana
farmacológica para la EA y los resultados con productos naturales de origen
botánico, en este capítulo se planteó el objetivo de realizar la búsqueda de extractos
55
de plantas colombianas con acción agonista sobre los LXR. A lo largo de este
capítulo se abordan los avances en la búsqueda de ligandos de LXR, seguido de la
metodología que fue implementada en la búsqueda de extractos con actividad
agonista de LXR y los resultados obtenidos.
2.2 Estado del Arte: Acción terapéutica de los LXRs
Desde hace décadas se ha venido estudiando el potencial terapéutico de los LXRs,
sugiriendo su potencial para diferentes enfermedades, incluyendo el cáncer, la
arterosclerosis, las enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson y la EA,
entre otras (Beaven & Tontonoz, 2006; Fitz et al., 2010; Francis et al., 2003; Joseph
et al., 2004; Masoud Tavazoie, 2018; Sandoval-Hernández et al., 2015). Así mismo
continuamente se reportan nuevas moléculas de origen natural con actividad
agonista o antagonista de receptores nucleares incluyendo el LXR (Fouache et al.,
2019). Como se mencinó anteriormente, los productos naturales son una importante
fuente de principios activos, se ha reportado que algunos flavonoides presentan
actividad sobre LXRα y LXRβ, incluyendo alangina, quercetina, apigenina y
naringenina. Específicamente, la quercetina tiene un efecto agonista de las dos
isoformas de LXR, la apigenina es un agonista selectivo de LXRα mientras que la
galangina y la naringenina tienen un efecto antagónico (Fouache et al., 2019).
Además de los estudios en ensayos in vivo, se han realizado estudios in silico
mediante el acoplamiento con las dos isoformas del receptor LXR, con los
flavonoides hibiscetina 3-glucosido, gosipetina, quercetina, luteolina aislados de la
especie Hibiscussa bdariffa. Los estudios de Docking molecular permitieron
determinar que estas moléculas son potenciales agonistas de LXR, observando
56
interacciones hidrófobas y puentes de hidrogeno en el modelo molecular, siendo la
quercetina la molécula con el mejor resultado, presentando valores de energía de
unión de -8.4 kcal / mol, enlazándose por medio del hidrógeno localizado en la Thr
328 y una interacción hidrófoba en Met 312. Lo cual concuerda con los resultados
de los ensayos in vitro, en los que también fue posible evidenciar un mayor potencial
agonista de LXR, mostrando que los flavonoides polifenólicos son potenciales
agonistas de LXR (Susanti, 2019).
Estudios clínicos en pacientes con cáncer en etapas avanzadas con diversidad de
neoplasias refractarias, se observó que el uso de RGX-104, agonista de LXR,
revirtió la evasión inmune, ya que se aumenta la expresión de ApoE y con esto se
disminuye la agregación de las células mieloides inmunosupresoras, lo que hace
que el proceso tumoral sea contenido, sugiriendo el uso de agonistas de LXR como
un tratamiento antitumoral prometedor (Masoud Tavazoie, 2018). En el caso de
enfermedades como la arterosclerosis, se determinó que la perilipina-2, producida
en el tejido adiposo, modula la producción de 27OH-colesterol, produciendo como
consecuencia un aumento en el flujo lipídico por la activación de LXR (Ehrenborg et
al., 2019).
Lo anterior muestra que el uso de moléculas, fracciones o extractos de productos
naturales, son una alternativa farmacéutica, ya que por su complejidad estructural
podrían modular más de un proceso a la vez (Muse et al., 2018).
2.3 Metodología
A continuación, se describen los métodos usados para determinar la actividad
agonista de LXR de 82 extractos vegetales. La metodología requierió del cultivo
celular de las líneas HEK293 derivada de riñón humano y SHSY-5Y derivada de
neuroblastoma humano. Se estandarizó el protocolo de citotoxicidad por ensayo de
MTT, con el cual se determinó la concentración de trabajo para cada extracto y un
57
se estandarizo un ensayo de gen-reportero con luciferina para evaluar la actividad
agonista de LXRβ.
2.3.1. Obtención de extractos
Los extractos de las plantas recolectadas en diferentes lugares de Colombia hacen
parte de la familia de Rutaceae, Myristicaseae, Lauraceae y Piperaceae. En el caso
de los extractos pertenecientes a la familia Rutaceae se trabajó con los extractos
alcaloidales de diferentes órganos de especies del género Zanthoxylum, los cuales
fueron incluidos en este trabajo teniendo en cuenta que trabajos previos realizados
en el grupo de investigación QUIPRONAB, demostraron que estas especies, son
ricas en alcaloides con actividad inhibidora de la enzima AchE (E. A. Plazas et al.,
2018), y antiagregantes de Aβ, considerados potencialmente terapéuticos para EA.
Por otra parte, los demás extractos fueron seleccionados aleatoriamente como parte
de un tamizaje inicial, teniendo en cuenta la gran diversidad estructural de cada uno
de ellos, por lo se presumia que era factible encontrar actividad neuroprotectora
(Plazas Gonzalez et al., 2020).
Los 82 extractos usados en este trabajo fueron obtenidos previamente por el grupo
de investigación QUIPRONAB, 44 son extractos alcaloidales de especies del género
Zanthoxylum (Rutaceae),16 extractos etanólicos de la familia Lauráceae, 11
extractos etanólicos de Myristicaseae, 11 extractos etanólicos de la familia
Piperaceae. Los extractos alcaloidales fueron obtenidos por extracción ácido-base,
y los demás fueron obtenidos por maceración y percolación exhaustiva con etanol
al 96% (E. A. Plazas et al., 2018).
2.3.2. Ensayo de viabilidad celular MTT
El ensayo de MTT, es un método colorimétrico que permite la viabilidad celular de
manera indirecta, al evaluar la actividad metabólica de una enzima mitocondrial.
Está basado en la reacción de reducción del Bromuro de 3-(4,5dimetiltiazol-2-ilo)-
58
2,5-difeniltetrazol (MTT), con un característico color amarillo, en la sal de formazán:
(E, Z)-5-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-1,3-difenilformazano, un compuesto que tiene una
coloración azul morada por acción de las enzimas oxidorreductasas dependientes
de NADH, que se encuentran en el complejo I de la cadena respiratoria, y están
activas en células viables. Las células HEK293 fueron sembradas en cajas de
cultivo de 96 pozos SPL a una densidad aproximada de 10.000 células / pozo en
100µl de medio de mantenimiento a 37 ºC y 5 % de CO2 durante 24 h a una
confluencia del aproximadamente 70 %. Posteriormente, se adicionaron 100 𝜇l de
disolución de los extractos vegetales por cuadriplicado a concentraciones de 250,
125, 75 y 25 mg/ml en medio de mantenimiento celular (1% p/s (Penisilina
100unidades/ml/ steptomisina 100µg/ml), y 2% SFB en DMEM). Se incubó durante
24 h, posteriormente se adicionaron 10 μl de solución de MTT 5 mg/ml en PBS,
durante 4 h, se retiró el medio y se adicionó a cada pozo 100 𝜇l de buffer de lisis
celular conteniendo 40% v/v de dimetil formamida, 5% v/v de ácido acético glacial y
16% p/v de SDS en H2Odd se agitó en un shaker orbital a una velocidad de 65 rpm
por 15 minutos y se realizó la lectura de la absorbancia en un lector de placas
(TekanSunriseTM. Austria) a una longitud de onda de 540 nm.
2.3.3 Ensayo de actividad LXRE-LUC
Para evaluar la actividad agonista de los extractos vegetales, se cultivaron bacterias
previamente transformadas, se purificaron los plásmidos, posteriormente se
transfecto y se evaluó la actividad agonista por la técnica del gen-reportero.
Inicialmente, se trabajó con cepas de bacterias E. coli transformadas previamente
con los plásmidos: LXRE-LUC, pCMX-mLXRβ y pEGRP-N1 (donados por Peter
Tontonoz MD. PhD desde la UCLA), cada grupo de bacterias fue cultivado entre 16
- 18 h, en falcón de 50ml, con 30 ml de medio de cultivo estéril LB (Triptona1% p/v,
Levadura 0,5% p/v, NaCl 0,5% p/v, en H2Odd), posteriormente para controlar el
crecimiento de las bacterias de interés y eliminar bacterias que puedan interferir se
59
adicionó el antibiótico correspondiente a cada plásmido (10 µg/ml de Ampicilina a
las bacterias que contienen a LXRE-LUC, pCMX-mLXRβ y 50µg/ml de Kanamisina
a las bacterias que contienen pEGRP-N1), después se centrifugó a 3500-4000 rpm
durante 20 minutos, se descartó el sobrenadante, se adicionaron 6 ml de H20 libre
de RNAsas y DNAsas, pipeteando suavemente hasta su resuspención completa
(Jaramillo Gomez & Arboleda, 2010), seguido de la aplicación del protocolo de
purificación de plásmidos Zymo PUREPlasmidMiniprep (Cat #). Una vez purificados
los plásmidos, se cuantificaron en el espectrofotómetro (nanodrop ref 3636).
Posteriormente se realizó la transfección de los plásmidos en células HEK293. Las
células fueron sembradas en cajas de 96 pozos, 10.000 células por pozo en 100µl
de medio de mantenimiento a 37ºC y 5% de CO2 durante 24 h. Después se cambió
el medio de cultivo por 50 µl de medio al 1% de SFB, 1% p/s (Penisilina
100unidades/ml/ steptomisina 100µg/ml), en DMEM, paralelamente se prepararon
dos soluciones con un volumen de 50 µl por pozo, cada una. La solución 1, se
preparó con 0,2 µl de lipofectamina por pozo en optimem. La solución 2, contenía
por cada 150.000 células, 0.5µg de LXRE-LUC, 0.1µg depCMX-mLXRβ y 0,025µg
de pEGRP-N1 en Optimem. Pasados 5 minutos a temperatura ambiente, se
transfirió el contenido de la solución 1 a la solución 2 y se incubó a 37 °C durante
30 minutos. Posteriormente, se adicionó a cada pozo 100 µl de la mezcla y se incubó
por 24h, el rendimiento de la transfección se verificó en un microscopio de
fluorescencia. Finalmente, se cambió el medio celular por los extractos preparados
en 1% p/s (Penisilina 100unidades/ml/ steptomisina 100µg/ml), en DMEM a las
concentraciones determinadas previamente con el protocolo de viabilidad celular y
se dejaron actuar durante 24 h, posteriormente se siguió el protocolo del kit de
luciferasa en un paso ref.16196 de thermoscientific (Ilustración 2-1).
60
Ilustración 2-1. Cotransfección de plásmidos para la evaluación de actividad LXRE-LUC. Esta ilustración muestra los plásmidos usados para transfectar las células HEK293, el plásmido pEGFP fue usado para establecer el rendimiento de la transfección y los plásmidos LXR-LUC y pCMX-LXRβ fueron usados para censar la actividad agonista sobre el receptor nuclear LXRβ.
2.4. Resultados y discusión
Las concentraciones de trabajo determinadas mediante el ensayo de MTT en la
línea celular HEK293 (anexo 1) fueron utilizadas en el ensayo de gen-reportero de
actividad agonista LXR-β. Las concentraciones de trabajo fueron determinadas
utilizando como criterio la selección la sub-letalidad de la dosis, siendo la
concentración mas alta en el medio de cultivo que no reduce significativamente la
viabilidad celular.
La Tabla 2 resume los resultados encontrados para cada extracto estudiado,
clasificados por familia, especie y órgano de las plantas, el tipo de extracción
(etanolica o alcaloidal), concentración de trabajo, actividad del reportero (luciferasa)
mostrando la tasa de cambio relativa al control sin tratamiento y la significancia
estadística.
De acuerdo con los análisis estadísticos realizados por medio de la prueba de t de
student, se identificaton 10 extractos de las familias Rutaceae, Myristicaceae y
61
Lauraceae, que mostraron actividad agonista de LXRβ ya que se obtuvieron
diferencias estadísticamente significativas al compararlo con el grupo experimental
de células unicamente expuestas a condiciones de cultivo mas vehiculo; Z.
martinicense (p≤0,01), Zanthoxylum sp. (p≤0,0001) Z. caribaeum (p≤0,01), Z.
rohifolium. (p≤0,0001), Myristicaceae sp.1 (p≤0,0001), Myristicaceae sp.2 (p≤0,05),
N. reticulata (p≤0,0001), N. membranácea (p≤0,0001) y Nectandra sp. (p≤0,0001)
(Tabla 2-1).
Al establecer la tasa de actividad es notable ver que, la molécula GW3965 genera
más del doble de la actividad basal del receptor LXRβ y que los extractos o
fracciones alcaloidales aumentan 0,37 a 0,92 veces la actividad del receptor LXRβ,
lo deja en evidencia el potencial de estas fuentes naturales, ya que presentan un
efecto que es evidente aun contra una molécula pura establecida como agonista
sintética del receptor LXRβ, (Tabla 2-1). En detalle se encontró que, Z. martinicense
aumenta 0,37, Zanthoxylum sp. aumenta 0,57, Z. caribaeum aumenta 0,46, Z.
rohifolium. aumenta 0,6, Myristicaceae sp1. Aumenta 0,44, Myristicaceae sp 2.
Aumenta 0,55, N. reticulata aumenta 0,76, N. membranácea aumenta 0,92 y
Nectandra sp. aumenta 0,54 veces la actividad del receptor LXRβ (Ilustración 2-2).
Como ya se había mencionado, los productos naturales ofrecen una fuente de
moléculas bioactivas diversas, es probable que existan en estos extractos
moléculas con un potencial de afinidad a los LXRβ, y que también actúen en otras
dianas terapéuticas de la EA de manera que serían tratamientos multidiana
(Atanasov et al., 2015; Atta-ur-Rahman & Choudhary, 2001; Ji & Zhang, 2008;
Yiannopoulou & Papageorgiou, 2013). En particular, los extractos del género
Zanthoxylum, presentan moléculas con actividad inhibidora de AChE y moléculas
con actividad antioxidante (E. A. Plazas et al., 2018).
Es importante destacar que, las plantas con actividad agonista sobre los receptores
hepáticos LXR identificadas en este trabajo, pertenecientes a los géneros
62
y/oespecies Z. martinicense, Zanthoxylum sp. Z. caribaeum, Z. rohifolium,
Myristicaceae sp., N. reticulata, N. membranácea y Nectandra sp., no tienen
estudios previos publicados en revistas científicas. Por lo tanto, nuestra contribución
es novedosa y permite el reconocimiento de los productos naturales encontrados
en Colombia como fuentes de metabolitos secundarios con actividades funcionales
importantes para el tratamiento de enfermedades complejas, como lo es la EA
(Ilustración 2-2).
Nuestros resultados sugieren que se deben realizar posteriores evaluaciones de
caracterización de su composición fitoquímica. Así mismo, estos extractos son
agentes químicos que tienen un elevado potencial fitoterapéutico debido a la
complejidad conocida de este género y por lo tanto son potenciales agentes
multidiana útiles en patologías donde la actividad agonista de LXR es considerada
promisoria, incluyendo la EA, los resultados de este capítulo permiten proponer una
evaluación más detallada en modelos biológicos in vitro e in vivo para determinar
en detalle su potencial farmacológico.
Tabla 2-1. Resultados de la evaluación del potencial agonista de los extractos
vegetales sobre la actividad de los LXR’s.
Familia Especie Parte Lugar de
recolección Tipo de extracto
Ensayo de viabilidad (MTT) P. valor Norm.(LXR-
LUC)
C. Viable [𝜇g/ml]
% viabilida
d EEM
Tasa de
actividad+
P valor
Rutaceae
Zanthoxylum schreberi
cz Tena alc.cl 0,1 92,8 2,07 1,03 0,83 ns
cz Tena alc.aq 5 95,61 4,39 0,89 0,56 ns
cz-rz Tena alc.cl 0,1 112,49 25,9
3 1,19 0,23 ns
cz-rz Tena alc.aq 125 90,08 4,06 0,87 0,5 ns
rz Tena alc.cl 125 96,5 2,39 1,04 0,84 ns
rz Tena alc.aq 125 100,89 1,47 1,04 0,83 ns
Zanthoxylum
rhoifolium
cz-rz Viota alc.cl 25 91,88 1,75 0,63 0,07 ns
cz-rz Viota alc.aq 25 91,06 2,11 1,43 0,04 *
63
cz Viota alc.cl 25 89,12 3,51 1,6 <
0,0001
****
cz Viota alc.aq 25 91,13 1,27 0,9 0,5 ns
Zanthoxylum caribaeum
cz Viota alc.cl 25 88,12 2,86 1,07 0,7 ns
cz Viota alc.aq 25 91,21 10,3
7 0,8 0,22 ns
rz Viota alc.cl 25 88,33 2,85 0,96 0,22 ns
rz Viota alc.aq 250 89,11 5,34 1,04 0,84 ns
Zanthoxylum Rigidum
cz Apulo alc.cl 25 95,16 1,37 1,3 0,13 ns
cz Apulo alc.aq 250 93,59 0,68 1,14 0,46 ns
rz Apulo alc.cl 25 88,67 4,86 1,13 0,5 ns
rz Apulo alc.aq 75 89,8 2,58 1,09 0,64 ns
Zanthoxylum martinicense
cz Apulo alc.cl 25 94,65 2,7 1,31 0,12 ns
cz Apulo alc.aq 250 91,57 5,93 0,95 0,81 ns
rz Apulo alc.cl 25 89,41 3,91 1,37 0,01 **
rz Apulo alc.aq 25 86,65 3,42 0,96 0,82 ns
Zanthoxylum.sp
cz Apulo alc.cl 250 88,74 1,68 1,26 0,2 ns
cz Apulo alc.aq 125 95,71 2,7 0,91 0,62 ns
rz Apulo alc.cl 25 96,92 2,5 0,86 0,8 ns
rz Apulo alc.aq 250 98,85 96,3
6 1,57
< 0,000
1 ****
Zanthoxylum caribaeum
cz Viota alc.cl 25 98,53 2,88 0,98 0,9 ns
cz Viota alc.aq 75 99,76 4,71 1,46 0 ***
rz Viota alc.cl 5 92,3 4,78 0,57 0,04 *
rz Viota alc.aq 25 95,98 2,69 1,37 0 **
Zanthoxylum monophylum
cz Arbeláez alc.cl 0,5 98,6 3,91 0,77 0,16 ns
Zanthoxylum quinduense
cz Tena alc.cl 25 98,97 5,35 1,17 0,38 ns
cz Tena alc.aq 75 95,35 2,04 0,91 0,65 ns
Zanthoxylum fagara
cz Tocaima alc.cl 75 96,68 0,48 0,66 0,1 ns
cz Tocaima alc.aq 75 95,39 2,9 1.35 0,44 ns
Zanthoxylum rhoifolium
cz Guayabal de
siquima alc.cl 25 105,85 1,28 1,03 0,87 ns
cz Guayabal de
siquima alc.aq 75 104,15 2,08 0,85 0,09 ns
md Guayabal de
siquima alc.cl 125 100,74 1,24 0,83 0,28 ns
md Guayabal de
siquima alc.aq 75 89,26 2,32 1,18 0,28 ns
cz Santa barbara alc.cl 75 95,21 2,14 1,11 0,57 ns
cz Santa barbara alc.aq 25 95,08 1,83 1,01 0,97 ns
Zanthoxylum schreberi
rz Apulo alc.cl 10 95,61 4,39 0,79 0,19 ns
rz Apulo alc.aq 25 97,46 3,5 0,85 0,34 ns
rz Apulo ais 25 89,77 2,36 0,9 0,61 ns
Lauraceae Ocotea.sp Apulo et 25 93,99 5,01 0,95 0,68 ns
64
Ocotea longifolia
cz Leticia et 75 112,26 1,92 1,36 0,07 ns
Ocotea discolor
hj Charalá et 25 87,83 2,28 1,34 0,1 ns
md Charala et 5 94,33 1,68 0,71 0,15 ns
Ocotea macrophilla
cz La Vega- et 25 109,27 1,26 1,07 0,67 ns
md La Vega- et 25 97,17 1,71 0,87 0,43 ns
Aniba. robusta hj La Vega- et 25 111,11 3,37 1,17 0,37 ns
Cinnamomun. triplinerve
hj Cundinamarc et 75 98,96 1,23 1,36 0,03 *
Rodostemonodphane. laxa
hj Acacias- et 25 95,19 4,44 1,1 0,54 ns
cz Acacias- et 25 109,08 0,66 1,17 0,3 ns
Bleishmedia. costarricensis
sm La Vega- et 5 98,08 0,41 0,81 0,24 ns
md La Vega- et 25 97,69 1,66 1,08 0,61 ns
Nectandra. membranacea
e
hj La Vega-
et 75 94,33 1,81 1,92
< 0,000
1 ****
fl La Vega- et 25 102,96 5,1 1,51 0 **
Nectandra sp. cz Santa
Bárbara- et 25 100,97 8,36 1,54
< 0,000
1 ****
Nectandra reticulata
hj Granada- et 25 98,4 0,28 1,76 <
0,0001
****
Myristicaceae
Virola carinata
ar-fr Granada et 25 81,58 2,24 1,14 0,47 ns
hj Granada et 125 103,21 4,57 0,61 0,05 ns
Virola sebifera md Pto. Lopez et 25 97,89 6,75 0,97 0,83 ns
Myristicaceae sp
hj Leticia et 5 103,8 3,87 0,55 0,03 *
md Leticia et 25 92,4 2,4 1,06 0,78 ns
cz Leticia et 25 95,81 0,35 1,05 0,8 ns
hj Leticia 1 et 25 98,71 3,87 1,44 0,04 *
md Leticia 1 et 25 96,73 1,33 1,19 0,32 ns
cz Leticia 2 et 25 91,98 8,79 0,77 0,03 *
65
hj Leticia 2 et 25 111,29 4,35 1,55 <
0,0001
****
Compsoneura sp
md 33 et 25 97,33 8,31 0,92 0,67 ns
Piperaceae
Piper.arthante p.a 4p et 25 92,98 3,37 0,92 0,61 ns
if 6p et 25 103,28 1,49 1,34 0,09 ns
Piper pessaresanu
m
p.a 8p et 5 110,29 0,77 0,43 0,01 **
Piper holtonii
md Nocaima et 75 93,94 0,82 0,87 0,49 ns
p.a Nocaima et 25 88,43 11,5
7 1,04 0,82 ns
Piper marginatum
p.a Tubacuy- et 75 113,87 2,47 0,61 0,06 ns
Piper elbancoanum
hj Fusagasuga et 5 95,97 7,75 0,66 0,09 ns
Piper arboreum
md 59 et 25 94,33 0,42 1,19 0,33 ns
Piper amalogo hj Tiba et 25 127,6 6,71 1,09 0,57 ns
Piper.sp if 43 et 25 96,61 0,65 0,99 0,96 ns
Piper.sp hj 52 et 5 94,1 1,52 0,93 0,64 ns
cz: corteza, rz: raíz, md: madera, hj: hojas, sm: semillas, fl: flores, ar: arilo, fr: fruto, if: inflorecencias,
p.a: parte aérea; alc.cl: alcaloidal-cloroformo; alc.aq: alcaloidal acuoso, et: etanolico, EEM: error
estándar de la media. Datos representados por la media y el error estándar de la media (SEM),
análisis estadístico realizado por t (de Student), donde se muestran diferencias significativas asi:
*(p≤0,05); **(p≤0,01); ***(p≤0,001); ****(p≤0,0001). + Tasa de actividad: Relación entre la actividad
presentada por los extractos o fracciones alcaloidales sobre el vehículo.
66
Ilustración 2-2. Extractos con actividad agonista sobre LXRβ. Células SHSY-5Y sin exposición a extractos (Vh) y tratadas durante 24horas con la fracción alcaloidal cloroformico de la raíz de Z. martinicense recolectada en Apulo, fracción alcaloidal acuoso de la raiz de Zanthoxylum sp. recolectada en Apulo, fracción alcaloidal cloroformica de la corteza de Z. rohifolium recolectada en Viotá, extracto etanólico de hojas de Myristicaceae sp.1 recolectada en Amazonas, extracto etanolico de hojas de Myristicaceae sp. 2 recolectada en Amazonas. Datos representados por la media y el error estándar de la media (SEM), análisis estadístico realizado por t (de Student), donde se muestran diferencias significativas asi: *(p≤0,05); **(p≤0,01); ***(p≤0,001); ****(p≤0,0001).
2.5. Conclusiones
De los 81 extractos evaluados, 10 de ellos; Z. martinicense, Zanthoxylum sp. Z.
caribaeum, Z. rohifolium, Myristicaceae sp., N. reticulata, N. membranácea y
Nectandra sp. tienen actividad agonista de LXR en ensayos de gen-reportero.
67
3. Capítulo 3: Caracterización fitoquímica preliminar de los extractos con actividad agonista de LXR.
La búsqueda de fuentes alternativas para el tratamiento de la EA converge en los
productos naturales. Puesto que los extractos de Zanthoxylum. martinicense,
Zanthoxylum sp. Zanthoxylum rohifolium, Myristicacea sp., Nectandra reticulata,
Nectandra membranácea y Nectandra sp., fueron preseleccionados en el proceso
de búsqueda de extractos con potencial terapéutico para la EA, debido a que
presentaron un efecto agonista sobre LXRβ, se decidió realizar una serie de pruebas
preliminares en busca de determinar la posible presencia de núcleos característicos
de los metabolitos secundarios presentes en los extractos activos de tal forma que
se pueda correlacionar esta información con la ya existente en relación con los
compuestos que se han identificado para ser usados para el tratamiento de la EA.
Se han reportado diferentes tipos de metabolitos que actúan sobre dianas
terapéuticas de la EA, encontrando: alcaloides con acción multidiana, capaces de
inhibir AChE, antiagregar Aβ y activar LXRα/LXRβ (Bramlett et al., 2003; Dighe et
al., 2019; Marco & Carreiras, 2006; E. A. Plazas et al., 2018; Plazas Gonzalez et al.,
2020); Esteroides y terpenoides agonistas de LXR e inhibidores de la actividad de
BACE (Ondeyka et al., 2005; Park et al., 2004; Y. Wang & Du, 2009); y polifenoles,
con actividad antioxidante ampliamente reportada y efecto sobre la antiagregación
de Aβ (Paula et al., 2019).
68
3.1 Estado del Arte
Como producto del “screening” realizado en el capítulo 2, se encontró que los
extractos etanólicos y las fracciones alcaloidales con potencial terapéutico para la
EA, pertenecían a la familia Rutaceae, Myristicaceae y Lauraceae, tres familias de
plantas que tienen extractos con una actividad agonista sobre LXRβ (Rincón, 2017).
Estas familias se han usado con anterioridad en la medicina tradicional y en
diferentes investigaciones, dejando en evidencia su acción terapéutica (Abo et al.,
2008; Gottlieb, 1979; C. T. Lin et al., 2007).
El género Zanthoxylum, hace parte de la familia Rutaceae, tiene alrededor de 250
especies distribuidas en el mundo, especialmente en regiones tropicales que han
sido usadas en la industria alimentaria, en ornamentación y como medicamento
tradicional (Cuca & Taborda, 2008). Históricamente este género ha sido usado en
la medicina tradicional, como ejemplo de ello a la especie Z. integrifolioumse ha
sido utilizada para tratar las mordeduras de serpiente y para la fiebre; la especie Z.
monophyllum se ha usado para tratar la secreción nasal, ictericia, oftalmia y como
anestésico; la especie Z. liebmannianum, ha sido usada como anti parasitario y
anestésico local; Z. rhoifolium, Z. acutifolium, Z. usambarense, se han usado para
el tratamiento de fiebres a causa de malaria (Cuca & Taborda, 2008). Es importante
destacar que en el género Zanthoxylum se ha observado la presencia de alcaloides
isoquinolínicos, a los cuales se atribuye el potencial como inhibidores de AChE de
muchas de estas especies, y son considerados marcadores quimiotaxonomicos, (E.
A. Plazas et al., 2018), al igual que, los lignanos furofuránicos, limonoides y
cumarinas, sin embargo, se han aislado otros metabolitos que están más
ampliamente distribuidos en otras familias de plantas como, flavonoides, y
triterpenos pentacíclicos.
La familia Myristicaceae, tiene 21 géneros, distribuidos especialmente en trópicos y
selvas húmedas de tierras bajas. En América es posible encontrar en el occidente
69
de la amazonia 5 géneros endémicos, con 90 especies aproximadamente. En
Colombia se han identificado 67 especies distribuidas principalmente en Choco,
Amazonia y en las pendientes de los valles interandinos (Calderón et al., 2007;
Charlotte M. Taylor, 2000; Http://www.theplantlist.org/, 2013). En la familia
Myristicaceae es posible encontrar diversos metabolitos, de los cuales los más
característicos son los lignanos de tipo diarilbutánico, epoxilignano y
arilnaftalénicos. Neolignanos, de tipo 8,4’ –oxyneolignano; terpenos, como el
espatulenol y el limoneno; alcaloides como la N-metiltriptamina; y compuestos fenil
propanoides como la vainillina o el safrol (Cabrera Martinez & Suarez, 2019).
Tradicionalmente se han usado especies de la familia Myristicaceae para tratar
diferentes enfermedades, ejemplo de ello son las especies: Virola surinamensis,
usada para tratar la úlcera, gastritis y cáncer (Hiruma-lima et al., 2009); Virola
oleífera, usada como antiinflammatorio, cicatrizante y como estimulante de la
memoria (Azevedo et al., 1997); y Horsfieldia irya, usada para tratar infecciones
intestinales (Azevedo et al., 1997). Adicionalmente, se han identificado especies con
actividad antioxidante por su contenido de compuestos fenólicos como sucede con
las especies Virola sebifera (Aubl.), Virola venosa y Scyphocephalium ochocoa
(Warb), esta última presenta además acción antiangiogénica, y antiinflamatoria (La
et al., 2018; Rangel et al., 1809; Rezende et al., 2005) Algunas investigaciónes han
evidenciado que especies de la familia Myristicaceae tiene actividad como
inhibidores enzimáticos, tal es el caso de Horfieldia macrobotrys, que inhibe la
enzima α-glucosidasa (Ramadhan & Phuwapraisirisan, 2015), e Iryanthera
juruensis, que actúa sobre la enzima ciclooxigenasa 1 y 2 (Silva, D. et al., 2007).
Es importante destacar que, en la familia de las Myristicaceae, se han reportado
especies con capacidad de inhibir la AChE, como Myristica fragrans Iryanthera
megistophylla, Myristica cinnamomea y Knema laurina (Mariam et al., 2016;
Nadeem et al., 2011; Silva, D. et al., 2007).
70
Finalmente, la familia Lauraceae tiene 52 géneros y aproximadamente 2500 a 3500
especies identificadas y distribuidas principalmente en áreas tropicales y
subtropicales en todo el mundo (Rohwer & Kubitzki, 1993). Se han encontrado
géneros como Aniba, Nectandra, Ocotea, Lincaria y Dicypellium como fuente de
importantes de aceites esenciales (Marques CA., 2001) y muchas especies con una
actividad farmacológica que ha despertado el interés de muchos grupos de
investigación. De acuerdo con lo anterior, es posible encontrar reportes que indican
que la especie Aniba canelilla (Kunth), tiene potencial como antioxidante,
antinociceptiva, antitinflamatoria, cardiomoduladoras, ancioliticas, anti AChE, etc.
Estas actividades son atribuidas a uno de sus componentes principales el 1-nitro-2-
feniletano y metileugenol. (Souza-Junior et al., 2020).
Por otra parte, las especies del género Nectandra como Nectandra amazonum
(Espitia Corredor et al., 2016) Nectandra rigida (Le Quesne et al., 1980), Nectandra
megalopotamica (Ponci et al., 2015; Silva-Filho et al., 2004), Nectandra falcifolia
(Oliveira de Melo et al., 2006), Nectandra cuspidata (Oliveira de Melo et al., 2006) y
Nectandra membranaceae, poseen acción como antiagregante plaquetario,
analgésico, antiinflamatorio, anticancerígeno, antileismanial y antioxidante.
Estudios fitoquimicos llevados a cabo en estas especies han mostrado la presencia
de taninos, alcaloides y catequinas, sugiriendo que son estos metabolitos
secundarios los responsables de la acción, ya que suelen mediar procesos de
eliminación de radicales libres (Moreno et al., 2011).
Los diferentes estudios mencionados anteriormente, demuestran que, los extractos
etanólicos y las fracciones alcaloidales que fueron determinadas como activos,
como ligandos agonistas de LXRβ en el screening realizado en este trabajo de
investigación, probablemente estén compuestos por metabolitos secundarios que
puedan ser importantes frente a otras dianas terapéuticas diferentes de la EA, como
pasa en otras especies de lasmismas familias, lo que les permitiría contribuir a un
futuro tratamiento integral para la misma.
71
3.2 Metodología
Para determinar los posibles tipos de metabolitos secundarios presentes en el
extracto, se realizaron pruebas de coloración sobre CCD con el uso de diferentes
reveladores específicos y generales. Para determinar la relación de estos
metabolitos con algunas de las dianas terapéuticas involucradas en EA, y que han
sido objeto de este estudio, se realizaron pruebas de inhibición de AChE,
determinación de la capacidad antioxidante y captadora de radicales libres sobre
aquellos extractos determinados previamente como agonistas de LXRβ
3.2.1 Cromatografía en capa fina
Los extractos etanólicos, y las fracciones alcaloidales fueron sembrados sobre
cromatofolios de sílica gel 60 F254, los cuales fueron eluídos con la mezcla CHCl3-
MeOH (9:1) (solventes grado R.A), las placas eluidas fueron sometidas a pruebas
con reactivos específicos de coloración; dragendorff, ninhidrina, cloranil en dioxano,
NH3, FeCl3, y a bioensayos en busca de determinar la capacidad de inhibición de
AChE y determinación de actividad antioxidante de las especies seleccionadas.
3.2.2 Determianción de la capacidad captadora de radicales mediante ensayo de DPPH por bioautografía
El ensayo de bioautografía usando 2,2-difenil-1- picrilhidrazilo (DPPH), fue realizado
para determinar si los extractos pueden tener en su composición metabolitos con
capacidad captadora de radicales libres. Después de eluir la placa con la fase móvil
determinada en la sección 3.2.1. se asperjó con una solución de 0,2% de DPPH en
metanol. La placa se examinó a la luz después de 30 min. Los compuestos con
acción captadora de radicales libres aparecieron como manchas de color amarillo
claro sobre un fondo morado, coloración debida a la solución del radical (Takao et
al., 1994). En la ilustración 3-1 se presenta la reacción general llevada a cabo en el
ensayo:
72
Ilustración 3-1. Reacción de la molécula DPPH con una molécula captadora de radicales libres.
3.2.3 Determinación de la protección de β-caroteno por bioautografía
El ensayomediante bioautografía directa, fue realizado para determinar si los
extractos etanólicos y fracciones alcaloides seleccionados generan protección al
inhibir la peroxidación lipídica, teniendo en cuenta que la exposición del
betacaroteno a la luz ultravioleta podría generar radicales libres en posiciones
aleatorias de esta molécula, como se ve en la Ilustración3-2. Una vez la placa fue
eluída con la fase móvil seleccionada, se eliminó el solvente restante y se reveló en
la lámpara UV a longitud de onda larga y corta. Posterior a esto, el cromatograma
desarrollado se asperjó con una solución al 0,05% de β-caroteno en cloroformo, y
se dejó bajo una luz ultravioleta a 365 nm hasta su decoloración completa. Los
compuestos activos permanecieron como manchas amarillo-anaranjadas sobre un
fondo blanco (H. E. Miller, 1971).
Ilustración 3-2. Posible formación de radicales libres a partir de una molécula de betacaroteno expuesta a UV.
73
3.2.4 Cuantificación de Fenoles totales usando el reactivo Folin-Ciocalteu
En consideración a lo reportado en literatura acerca del contenido de compuestos
fenólicos en los diferentes géneros a los cuales pertenecen las especies
seleccionadas por su actividad agonista de LXRβ, se realizó la cuantificación de los
fenoles totales existentes en los extractos de interés. Para esto se prepararon dos
soluciones, la solución 1, fue preparada con 5 mg de extracto a ensayar, en un tubo
eppendorf de 2 mLy se disolvió en 1000 μL de metanol al 95%, posteriormente fue
filtrada haciendo uso de una membrana de 0,22 μm. La solución 2, fue preparada
con 50μL de solución 1 y 200μL de reactivo de Folin Ciocalteu 10% en un tubo
eppendorf de 2 mL, a la mezcla anterior se le agitó durante 1 minuto, se dejó reposar
por 1 minuto más y se agregaron 800 μL de carbonato de sodio 700 mM. Luego de
dejar incubar por 1 hora a temperatura ambiente se transfirieron 200µL de la
solución 2 en una placa de 96 pozos y fue leída la absorbancia a 620 nm por
triplicado.
3.2.5 Cuantificación de la capacidad antioxidante usando β-caroteno
La cuantificación de la capacidad antioxidante se realizó mediante la adaptación del
método de Miller (H. E. Miller, 1971). Este experimento busca medir la capacidad
antioxidante de los extractos o fracciones, al inhibir la peroxidación mediante la
decoloración de una solución de β-caroteno por la oxidación del ácido linoleico. Para
esto se preparó una emulsión stock preparando inicialmente una solución de 500 ul
de β-caroteno 0.02% en CHCl3, el solvente fue removido mediante rotaevaporación,
seguido de la adición de 10 mg ácido linoleico (δ:0,9 mg/ml), 100 mg de tween 20 y
20 ml de agua destilada (previamente aireada por 20 minutos), fue necesario agitar
vigorosamente para homogenizar la emulsión. Finalmente, en una placa de 96
pozos se adicionaron 230 µl de la emulsión y 20 ml del extracto preparado a 5 µg/ml,
la lectura del ensayo se realizó a 450 – 490 nm desde el tiempo 0 hasta completar
74
180 minutos, a una temperatura constante de 50°C, como patrón positivo fue
utilizada fisostigmina.
3.2.6 Bioautografía para determinación de inhibición de AChE
El ensayo de bioautografía usando AChE, fue realizado para determinar si los
extractos pueden tener en su composición moléculas con una acción inhibitoria de
AChE. Para este ensayo se empleó el protocolo adaptado en el grupo de
investigación QUIPRONAB basado en metodologías previamente reportadas
(Marston et al., 2002; Zheng et al., 2009).
Las placas eluídas se asperjaron con los reactivos de la siguiente forma: primero se
asperjó la solución de acetilcolinesterasa de anguila eléctrica (AChE E. C. 3.1.1.7)
a 4 unidades de actividad/ml en solución de buffer fosfato 0,1 M (pH 8 con 0,1% de
albumina de suero bovino BSA), una vez la placa estaba seca, se incubó a 37°C en
cámara húmeda durante 30 minutos. Posteriormente se asperjó la placa
nuevamente con la solución de 2,5 mg/mL de acetato de α-naftilo en etanol, se dejó
secar e incubar a 37°C en cámara húmeda durante 30 minutos. Finalmente asperjó
con solución de Fast Blue B (concentración de 2,5 mg/mL en agua destilada). Los
compuestos activos (inhibidores de AChE) aparecieron como manchas incoloras
contra un fondo purpura. Como control positivo fue usada la berberina.
3.2.7 Cuantificación de la inhibición de AChE
Con el fin de cuantificar la actividad inhibitoria de AChE que podrían presentar las
fracciones alcaloidales y los extractos etanólicos se aplicó el método colorimétrico
de Ellman en placas de 96 pozos. Para este ensayo se empleó el protocolo
adaptado en el grupo de investigación QUIPRONAB basado en metodologías
previamente reportadas, con algunas modificaciones (Plazas et al 2018, Ellman et
al., 1961; Ramsay & Tipton, 2017). Como sustrato se empleó acetiltiocolina (ATCI)
y por medio de una reacción indirecta se determinó la actividad hidrolítica de la
75
enzima. El producto de la hidrólisis del sustrato reacciona con el ácido 5,5’-ditiobis-
2-nitrobenzoico (DTNB) formando como producto ácido 5-tio-2-nitrobenzóico, el
cual posee una alta coloración amarilla. Así que la actividad de las colinesterasas
se determina por seguimiento de la reacción en el tiempo midiendo el aumento de
la absorbancia a 412 nm.
Inicialmente se adicionaron 50 𝜇l de los extractos o fracciones a una concentración
de 100 ppm en PBS 1X, y los controles y blancos la fisostigmina como control
positivo de inhibición a 10 𝜇M en PBS 1X (cercano al 0% de reacción enzimática),
más el control negativo de inhibición con 50 µl PBS 1X (100% de reacción
enzimática) y control de solvente (vehículos), todos ellos adicionados en diferentes
pozos por cuatriplicado. A continuación, se adicionó en cada pozo (excepto en los
de los blancos de los inhibidores y vehículo) 50 μL de la solución de la enzima AChE
1u/ml en PBS 1X con 0,1% de BSA, recién preparada y se incubó la placa durante
30 minutos a 37°C. Finalmente, se realizó la premezcla del sustrato y DTNB en un
tubo Falcon y 5 minutos antes de finalizar el tiempo de incubación, se adicionaron
100 μL de la premezcla de sustrato ATCI 20 mM en DTNB 10 mM en PBS 1X y 0,1
M de NaCl a todos los pozos, e Inmediatamente se dio inicio las lecturas de la
absorbancia a 412 nm durante 30 minutos. En la ilustración 3-3 se presenta la
reacción que se lleva a cabo en el ensayo. Como control positivo fue usada la
berberina.
Ilustración 3-3. Reacción de la evaluación de AChE. Tomada de Marston, A., J. Chromatogr. A, 1218, 2676, 2011
76
3.3. Resultados
De acuerdo con los resultados del capítulo anterior se seleccionaron los extractos y
fracciones con actividad agonista de LXRβ. Los extractos y fracciones
seleccionados pertenecen a las familias Rutaceae (género Zanthoxylum),
Lauraceae (género Nectandra) y Myristicaceae (género sin determinar por falta de
material fértil), como se puede observar en la Tabla 3-1.
Tabla 3-1. Fracciones o extractos agonistas de LXRβ seleccionados.
Código Familia Genero Especie Órgano Fracción o
extracto Lugar de
recolección
1
Rutaceae Zanthoxylum
Z. rhoifolium Lam. Corteza Clorofórmica * Viotá
2 Z. martinicense Raíz Clorofórmica * Apulo
3 Zanthoxylum sp. Raíz Acuosa * Apulo
4
Lauraceae Nectandra
N. membranacea Hojas Etanólico La Vega-
Cundinamarca
5 Nectandra sp. Corteza Etanolico Santa Bárbara-
Santander
6 N. reticulata Hojas Etanolico Granada-
Cundinamarca
7 Myristicaceae
No determinado
Miriticaceae sp. Hojas Etanolico Leticia
8 Miriticaceae sp. Hojas Etanolico Leticia
*Fracciones alcaloidales.
Los anteriores extractos y fracciones agonistas de LXRβ fueron sometidos a
bioautografía directa, para determinar la inhibición de la acetilcolinesterasa (AChE)
y capacidad antioxidante, utilizando cromatoplacas de sílica gel 60 F254 y como fase
móvil CHCl3: MeOH (9:1). Se determinó la inhibición de AChE, y la actividad
antioxidante, las cuales son consideradas dianas terapéuticas importantes en el
desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA). Con el uso de estos bioensayos, en
conjunto con el análisis fitoquímico preliminar (AFP), usando reveladores
específicos para la determinación de la posible presencia de: alcaloides
(dragendorff), aminoácidos (ninhidrina), aminas primarias y secundarias (cloranil en
77
dioxano), y diferentes tipos de compuestos fenólicos (FeCl3, fast blue, vapores de
NH3), se proponen los posibles tipos de compuestos presentes en las zonas de
inhibición observadas en las bioautografias realizadas.
3.3.1. Evaluación inhibitoria de ACHE
Dentro del grupo de compuestos que inhiben la AChE se ha reportado compuestos
nitrogenados, en especial alcaloides (Bramlett et al., 2003; Dighe et al., 2019; Marco
& Carreiras, 2006; E. A. Plazas et al., 2018; Plazas Gonzalez et al., 2020). Por lo
que se realizó la determinación de sustancias con grupos funcionales como aminas
primarias y secundarias, además de aminoácidos y alcaloides, con el fin de
comparar las zonas de inhibición de la AChE en la bioautografía y los posibles
núcleos fitoquímicos responsables de esta actividad.
En la Ilustración 3-4, se observan los resultados obtenidos de la evaluación
inhibitoria de AChE al realizar la bioautografía y el AFP usando los reveladores de
dragendorff, ninhidrina y cloranil en dioxano. En la Tabla 3-2, se indican los Rf de
las zonas de inhibición de AChE relacionadas con los posibles tipos de compuestos
correspondientes.
78
Ilustración 3-4. Evaluación de la capacidad inhibitoria de AChE de fracciones y extractos. En todos los ensayos se utilizaron cromatoplacas de silica gel, la elución de fracciones y extractos se realizó en CHCl3: MeOH (9:1) A. Ensayo de inhibición de AChE, utilizando como control positivo (C+) Berberina. B. Cromatoplaca revelada con reactivo de dragendorff para la determinación de alcaloides, (C+) Berberina. C. Cromatoplaca revelada con ninhidrina para la identificación de aminoácidos, (C+) L-triptofano. D. Cromatoplaca revelada con cloranil en dioxano para la identificación de aminas primarias y secundarias, (C+) L-triptofano.
Tabla 3-2. Resultados de AFP relacionados con la inhibición de AChE
Fracción o
extracto Inhibición AChE
Resultados AFP.
Dragendorff Ninhidrina Cloranil en dioxano
Código Rf AChE Rf Resultado Rf Resultado Rf Resultado
1 0-1 Inhibe 0 Negativo 0,1
Positivo 0,3
Positivo 0,5 0,9
2 0-1 Inhibe 0,8
Positivo _ Negativo
0,8
Positivo 0,3
0,3 0,2
3 0-1 Inhibe 0,8
Positivo _ Negativo 0,3 Positivo 0,3
4 0,7 Inhibe _ Negativo _ Negativo 0,9 Positivo
5 0,7 Inhibe _ Negativo _ Negativo _ Negativo
6 0,1
Inhibe _ Negativo
0,1 Positivo _ Negativo 0,7 Negativo
7 0,7 Inhibe _ Negativo 0,3 Positivo _ Negativo
8 0 No inhibe 1 Positivo
_ Negativo _ Negativo 0,1 Positivo
C+ 0-1 Inhibe 0,35 Positivo 0,1 Positivo 0,1 Positivo
Vh* 0 No inhibe _ Negativo _ Negativo _ Negativo
Controles positivos usados: 1,2 Berberina y 3,4 L-triptofano.
*Vh: blanco o solvente en el que se disolvieron las muestras.
79
En la fracción alcaloidal extraída en cloroformo y agua de las raíces de Z.
martinicense y Zanthoxylum sp respectivamente, se determinaron en los Rf de 0,8
y 0,3 alcaloides, debido a la coloración naranja intensa mostrada en la
cromatoplaca. Al igual que, el etanólico de Myristicaceae sp en el Rf de 0,1. Para la
determinación de la posible presencia del núcleo alcaloidal se utilizó el reactivo de
Dragendorff, por lo que solo se tuvieron en cuenta las manchas de color naranja
como lo muestran las fracciones y extracto antes mencionados, teniendo en cuenta
la coloración del control positivo (C+) de berberina. Dicha coloración naranja se
debe a que el ácido tartárico presente en el reactivo de dragendorff protona el
nitrógeno de los alcaloides, siendo estos generalmente una amina terciaria y en
pocos casos aminas secundarias, posterior a la protonación por medio del nitrato
de bismuto III (Bi(NO3)3) y ioduro de potasio (presentes en el reactivo de
dragendorff) se da la formación de nitrato de potasio (KNO3) y del anión tetrayoduro
de bismuto [BiI4]-, siendo la formación del anión el responsable de la coloración
naranja (Coe & Anderson, 1996; Jork et al., n.d.; Rojsanga et al., 2006), de este
modo se determinó la presencia de alcaloides.
En las fracciones de Z. martinicense y Zanthoxylum sp., los alcaloides determinados
por la prueba de dragendorff pueden ser responsables de la inhibición frente a la
AChE, como se observa en la Ilustración 3-4B y la tabla 3-2 Tabla 2 (E. Plazas et
al., 2019; Zheng et al., 2009). Paralelamente, como se observa en la Ilustración 3-4
en la sección C, la fracción de la corteza de Z. rhoifolium mostró un resultado
positivo ante la prueba de ninhidrina con manchas purpura en los Rf de 0,1 y 0,5, al
igual que el extracto de hojas de N. reticulata con el Rf de 0.1 y el extracto de hojas
de Myristicaceae sp 1. con Rf de 0,3. Con la prueba de ninhidrina se obtienen
resultados positivos para la determinación de compuestos con grupo amino. En este
caso, las manchas purpuras son originadas debido a una cadena de reacciones que
ocurre con la ninhidrina y un grupo amino de las aminas primarias o secundarias
hasta la formación de un complejo coloreado de color purpura. En este sentido, con
80
esta prueba y los resultados observados en la cromatoplaca no se determina el tipo
de amina presente en el aminoácido, dado a que las aminas primarias y secundarias
pueden dar coloraciones purpuras o amarillas intensas, lo cual no es observado en
la cromatoplaca y solo se puede inferir que el color purpura se debe a la detección
de aminoácidos. Esta coloracionse da por formación de una sal de imino entre dos
moléculas de ninhidrina y una de aminoacido (Friedman, 2004; D. Kumar & Rub,
2019). Al comparar los Rf de la fracción Z. martinicense y el extracto de N. reticulata
con los resultados de la bioautografía de la inhibición de AChE, se podría pensar
que en estos extractos existen compuestos con grupos amino, cuya estructura
genera la acción anti AChE que observó en las bioautografias.
En el caso de la prueba de cloranil en dioxano se observan manchas oscuras de
color azul, dada a la reacción de sustitución electrofilica entre el cloranil y la amina,
formándose un complejo de tipo amino- quinona (Dengiz et al., 2016; Pires &
Roseira, 1971). En las fracciones del género Zanthoxylum, los Rf mostrados como
positivos frente a esta prueba en la Tabla 3-2, corresponden a zonas de inhibición
de la AChE por lo que posiblemente estos compuestos son responsables de la
inhibición frente a la enzima, caso contrario del extracto de N. membranacea que
dio positivo en un Rf de 1,0 pero no se observó zona de inhibición.
A partir de los resultados mostrados anteriormente, se determinó que las fracciones
alcaloidales de Z. martinicense y Zanthoxylum sp., tiene más zonas de inhibición
frente a la AChE respecto a la fracción Z. rhoifolium Lam. y los extractos de N.
membranácea, Nectandra sp. N. reticulata y Myristicaceae sp. Estos últimos
presentan un efecto inhibitorio en las zonas con Rf de 0,7, zonas en las que no
fueron detectados el tipo de compuestos mediante los ensayos de coloración
realizados.
Adicionalmente, el encontrar resultados positivos de la fracción alcaloidal,
correspondiente a Z. rhoifolium con los reveladores de cloranil en dioxano y
81
ninhidrina, se pensaría que, cuenta en su composición con grupos nitrogenados
derivados de aminoácidos, particularmente aminas primarias y secundarias, que
podrían estar asociadas a estructuras de alcaloides, ya que, teniendo en cuenta la
composición previamente reportada para este género, puede deberse a la presencia
de alcaloides que no fueron detectados en la prueba de dragendorff (E. Plazas et
al., 2019).
3.3.2. Cuantificación de la actividad inhibitoria de AChE
De acuerdo con los resultados de inhibición AChE obtenidos por bioautografia, se
decidió realizar una cuantificación de esta misma actividad con los extractos o
fracciones alcaloidales por medio de un ensayo colorimétrico de Ellman modificado,
en el cual se midió la actividad de la AChE usando como sustrato ATCI y midiendo
por medio de una reacción colorimétrica indirecta con DTNB la actividad de la AChE.
Con el fin de eliminar posibles lecturas erróneas se realizaron diferentes controles,
en los cuales se contaba con la lectura de absorbancia de los extractos expuestos
únicamente a DTNB, ya que la presencia de un grupo tiol reaccionaria con él,
generando una colación basal en la reacción (Ellman et al., 1961; Ingkaninan et al.,
2003; Mathew and Subramanian, 2014). Adicionalmente se contó con un control
negativo de inhibición (vehículo) y un control positivo de inhibición (fisostigmina).
En la ilustración 3-5, se muestra el porcentaje la actividad de AChE durante 30min
y como medida de está cuantificación, la evaluación de las pendientes obtenidas en
lapsos de 5 minutos durante el tiempo que duró el experimento.
Como resultado de este experimento, se encontró que, la fracción alcaloidal de Z.
rhoifolium y el extracto etanólico de la Myristicaceae sp. mostraron un efecto
inhibitorio de la actividad de AChE (ilustración 3-5 2A y 2E). En los dos casos se ve
una disminución de la actividad de la enzima superior al 65% (ilustración 3-52A y
2E) y el promedio de la pendiente de la curva de actividad AChE presentada por
estos extractos mostró una diferencia significativa con respecto al control de
82
actividad de la enzima sin inhibidor (p≤0.0001) (ilustración 3-5 2B), de forma similar
al resultado presentado por la fisostigmina, implicando esto que, a pesar de tratarse
de mezclas complejas y no de moléculas aisladas, tiene un potencial terapéutico
para la EA desde un enfoque terapéutico asociado a la hipótesis colinérgica.
Sumado a esto, en el tamizaje realizado por E. Plazas et al., 2019 determinó la dosis
que genera una disminución del 50% de la actividad de la enzima AChE de la
fracción alcaloidal de Z. rhoifolium, obteniendo como resultado un LD50 24,39 ± 2,50
µg/ml. Esta dosis es superior a la dosis determinada para inhibidores comerciales
como la Rivastigmina LD50 1,04µg/ml, debido a que no se está evaluando una
molécula activa, sino un grupo de moléculas, que hacen parte de la composición de
la fracción alcaloidal de Z. rhoifolium, pero, con un análisis de composición más
detallado es posible encontrar las moléculas activas con actividad inhibitoria a
concentraciones más bajas (E. Plazas et al., 2019).
Al comparar los resultados que fueron obtenidos producto de la evaluación de la
actividad inhibitoria de AChE usando la técnica de bioautografía y el ensayo de
determinación cuantitativa por el método de Ellman, es posible ver que las muestras
Z. martinicense y Zanthoxylum sp., que mostraron una marcada actividad en la
bioautografía, no presentaron el mismo efecto en el ensayo en placa, lo que puede
deberse a que las muestras en la cromatoplaca se encuentran fraccionadas por
polaridad, lo que permite identificar posibles núcleos que están asociados a la
actividad, mientras que, en el ensayo en placa se encuentran todos los
componentes de los extractos o fracciones juntos, lo que puede enmascarar la
actividad vista en la cromatoplaca, porque es posible que se cuente en la
composición de estas muestras moléculas con una acción antagónica a la inhibición
de AChE o que tengan una concentración muy baja, lo que impide ver su efecto.
Por otra parte, la muestra Myriticaceae sp. 2 presenta una actividad inhibitoria de
AChE estadísticamente significativa en el ensayo de determinación cuantitativa por
el método de Ellman, pero no presenta una actividad inhibitoria de la enzima en la
83
bioautografía. Esto se podría explicar de dos maneras: en primer lugar, es posible
ver que en el punto de siembra se encuentran núcleos alcaloidales con una alta
polaridad, lo que podría deberse a sustituciones altamente polares como los
glicósidos que podrían asociarse a la actividad inhibitoria de AChE, lo que impide
que se dé un desplazamiento en la cromatoplaca con el eluyente empleado y
posiblemente esto ocasionó el enmascaramiento de su actividad inhibitoria. En
segundo lugar, es posible que en el ensayo en placa exista una actividad sinérgica
entre las diferentes moléculas que facilitan la actividad inhibitoria, lo cual en la
bioautografía no ocurre puesto que las muestras se encuentran separadas por
cromatografía en capa fina.
Debido a estos resultados contrastantes, se propone realizar el análisis de los
extractos y fracciones alcaloidales aquí evaluados, después de realizar un proceso
de fraccionamiento riguroso, para poder identificar con mayor precisión los núcleos
que podrían ser causales de la actividad inhibitoria de AChE y paralelamente, la
realización de más pruebas in vitro, con los extractos o fracciones alcaloidales
completas y fraccionadas, con el fin de observar si existe algún comportamiento
sinérgico o no entre las moléculas que los componen.
84
85
Ilustración 3-5.Evaluación en placa de la actividad de AChE usando los extractos etanólicos o fracciones alcaloidales como posibles inhibidores. A. Cuantificación del porcentaje de actividad AChE durante 30 minutos usando las facciones alcaloidales de la familia Rutaceae (códigos 1, 2 y 3), la solución usada como vehículo y fisostigmina como control positivo de la inhibición de AChE. B. Cuantificación de la actividad AChE usando las pendientes de la curva de la gráfica A. C. Cuantificación del porcentaje de actividad AChE durante 30 minutos usando los extractos etanólicos de la familia Lauraceae (códigos 4,5 y 6), la solución usada como vehículo y fisostigmina como control positivo de la inhibición de AChE. D. Cuantificación de la actividad AChE usando las pendientes de la curva de la gráfica C. E. Cuantificación del porcentaje de actividad AChE durante 30 minutos la familia Myristicaceae (códigos 7 y 8), la solución usada como vehículo y fisostigmina como control positivo de la inhibición de AChE. F. Cuantificación de la actividad AChE usando las pendientes de la curva de la gráfica E. Los datos de las gráficas B, D y F representa la pendiente máxima entre intervalo de 5 minutos desde los 0min hasta 30 min. Cada columna muestra los valores de la media y el error estándar de la media (SEM), análisis estadístico realizado por comparación múltiple por ANOVA de una vía, donde se muestran diferencias significativas: *(p≤0,05); **(p≤0,01); ***(p≤0,001); ****(p≤0,0001).
3.3.3. Actividad antioxidante por DPPH y β-Caroteno
Partiendo de la asociación que tiene el incremento de los radicales libres con el
desarrollo de la EA, se buscó evaluar si los extractos y fracciones alcaloidales
podrían tener una capacidad antioxidante que permitiera aumentar el interés en
continuar con ensayos enfocados en la búsqueda de fitofármacos que puedan
disminuir el desarrollo patológico de la EA. En la Ilustración 3-6 se encuentran los
resultados obtenidos con el análisis de la actividad antioxidante de los extractos y
las fracciones seleccionadas previamente.
En la tabla 3-3, se presentan los resultados obtenidos con los ensayos de
determinación de actividad antioxidante mediante bioautografía, y los reveladores
específicos para diferentes tipos de metabolitos fenólicos.
86
Ilustración 3-6. Evaluación de la capacidad antioxidante de extractos y fracciones. En todos los ensayos se utilizaron cromatoplacas de silica gel, la elución de fracciones y extractos se realizó en CHCl3: MeOH (9:1) y como control positivo (C+) quercetina A. Evaluación de actividad antioxidante con DPPH. B. Evaluación de la actividad antioxidante con β-
Caroteno. C. Cromatoplaca revelada con FeCl3. D. Cromatoplaca revelada con fast-blue. E. Cromatoplaca revelada con vapores de NH3 a 365nm. F. Cromatoplaca a 365 nm (revelación con UV). G. Cromatoplaca sin revelar.
87
Tabla 3-3 Resultados del AFP relacionados con la actividad antioxidante.
Actividad antioxidante Reveladores
Código Bioautografía FeCl3 fast blue vapor de NH3
DPPH βcaroteno Rf resultado Rf resultado
Rf resultado
Posibles metabolitos secundarios*
1 positivo positivo _ negativo 0,8 Positivo _ negativo
2 positivo positivo _ negativo _ negativo _ negativo
3 positivo positivo _ negativo _ negativo _ negativo
4 positivo positivo 0,05
positivo 1 Positivo 0,1-0,4
Celeste Isoflavonas
0,5
0,05
5 positivo positivo _ negativo 1 positivo 0,9 Celeste Isoflavonas
0,1
6 positivo positivo 0,05
positivo 0,05 positivo 0,8 Celeste isoflavonas
0,4 Verde Auronas, flavanonas
y flavonoles
7 positivo positivo 0,05
positivo 0,05 positivo _ _ _
8 positivo positivo 0,1 positivo 0,1 positivo 0,3 Celeste Isoflavonas
0,05
positivo
C+ positivo positivo 0,5 positivo 0,5 positivo 0,4 Verde flavonoides
Vh** negativo
negativo _ negativo _ negativo _ _ _
*Posibles metabolitos secundarios, tomado de (Mabry et al., 1970). Control positivo: quercetina **Vh: blanco o solvente en el que se disolvieron las muestras.
En todos los casos, la evaluación de actividad antioxidante con DPPH y β-caroteno
mostró resultados positivos, en ambos casos los extractos mostraron zonas de
inhibición desde Rf de 0,1 a 1, a excepción del extracto 7 Miriticaceae sp que tiene
solamente una zona de inhibición en 0,1 para ambos casos (Ilustración 3-6A y B).
De este modo todos los extractos y fracciones tienen capacidad antioxidante. Los
posibles núcleos responsables de esta actividad son principalmente flavonoides y
alcaloides. Los núcleos de posibles alcaloidales fueron revelados con dragendorff,
88
ninhidrina y cloranil (Ilustración 3-5), lo que nos permite pensar que los resultados
obtenidos en esta investigación concuerdan con otros estudios realizados
previamente en los cuales alcaloides como la 6-acetonildihidroqueleritrina,
queleritrina y dihidroqueleritrina, poseen una marcada actividad antioxidante al ser
evaluados por DPPH (Ibarra Estrada et al., 2011).
Por otro lado, en el caso de los flavonoides, se plantea que acorde con los
resultados obtenidos con los reveladores de fast blue y con vapores de NH3 los
extractos de N. membranacea, N. reticulata, Miriticaceae sp 1. y Miriticaceae sp 2.,
dejan en evidencia la posible presencia de núcleos de flavoniodes en su
composición de acuerdo con Mabry et al 1970. Además de encontrar resultados
positivos en la prueba de FeCl3, con lo que se corroboraria la presencia de núcleos
fenólicos, que podrían estar componiendo estructuralmente a los flavonoides que
estarían actuando como antioxidantes.
En el caso del ensayo con fast- blue (Ilustración 3-6D) las manchas de los extractos
N. membranacea, Nectandra sp, N. reticulata, Miriticaceae sp. 1 y Miriticaceae sp.
2 son de color rojizo, lo cual es positivo para esta prueba debido a que se da la
formación de un complejo rojo debido a la sal de diazonio que se forma en reacción.
Finalmente, al comparar las placas E y F de la Ilustración 3-6, se observa a 365 nm
mayor intensidad y en algunos casos cambios de coloración al revelarse la
cromatoplaca con vapores de amoniaco como se muestra en la Tabla 3-2, debido a
que el amoniaco al interactuar con los fenoles aumenta la densidad electrónica por
ser un donador de electrones y de este modo se aumenta la intensidad del color a
365 nm (Ugaz, 1997). Este ensayo permite inferir que posiblemente dentro de los
fenoles detectados se presentan algunos flavonoides, puesto que se presentan
cambios de coloración cuando se intensifican las manchas a 365 nm (Mabry et al.,
1970; Tenorio, 2016).
89
3.3.4. Cuantificación de fenoles totales (Folin-Ciocalteu)
A partir de la cuantificación de fenoles totales con Folin-Ciocalteu, se encontró
relación con el ensayo de FeCl3 en los extractos de N. membranácea, N. reticulata,
Miriticaceae sp. y Miristicaceae sp. No obstante, los demás extractos y fracciones
también dieron resultados positivos a concentraciones significativamente menores
respecto a las otras muestras (<0,8 µg/ml). Esto se debe a que en las fracciones
alcaloidales es muy improbable la presencia de flavonoides en su composición, lo
que se reafirma mediante los resultados aquí obtenidos, es por esto por lo que se
emplea el método adaptado de H.E. Miller (1971) para corroborar la cuantificación.
En la Ilustración 3-73 se muestran los resultados obtenidos con las 8 muestras.
Ilustración 3-7. Cuantificación de fenoles totales. Extractos y fracciones evaluados a 5000
µg/ml, disueltos en MeOH. Lectura a 620 nm.
E x tra c to s [5 0 0 0 u g /m l]
Co
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en
tra
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ole
s [
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Z. ro
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lata
Myr i
st i
caceae s
p.
Myr i
st i
caceae s
p.
0 .0
0 .8
1 .6
2 .4
3 .2
4 .0
4 .8
5 .6
90
3.3.5. Actividad antioxidante y protectora de β-Caroteno
Por medio de la aplicación del método adaptado de H. E. Miller (1971), se confirmó
la actividad antioxidante de los extractos y fracciones. En la gráfica 3-8, se
encuentran las gráficas del porcentaje de betacaroteno durante 180 minutos y con
el fin de observar mejor el efecto antioxidante de los extractos y fracciones
alcaloidales evaluadas, fue elegido aleatoriamente un tiempo cerca del final del
experimento, donde no se registraban cambios en el porcentaje de β-caroteno. Se
encontró que a los 150 minutos todas las muestras en comparación con el vehículo
protegen al β-caroteno de su oxidación (p≤0,001), comprobando con esto el efecto
antioxidante presentado por las fracciones alcaloidales y los extractos.
Adicionalmente, se evidenció que los extractos o fracciones alcaloidales Z.
rhoifolium Lam, N. membranacea, N. reticulata, Miriticaceae sp.1 y Miriticaceae sp
2. superan incluso el efecto de la quercetina, implicando esto que, los extractos
podrían ser considerados como agentes con un potencial antioxidante muy
prometedor, teniendo en cuenta que se trata de posibles mezclas complejas las que
componen a los extractos o fracciones, con concentraciones menores a las que se
usaron en el control de quercetina, convirtiéndolos en antioxidantes importantes
para el tratamiento de la EA.
Es necesario recalcar que, como ya se ha mencionado a lo largo de este
documento, se presentan aumentos de radicales libres en la EA, lo cual conduce a
un mayor deterioro cognitivo y muerte neuronal, ya que, se vincula directamente con
el aumento de la acumulación de Tau, Aβ, daños mitocondriales, aumento de Ca2+
intracelular, problemas en el RE, desregulación lipídica, entre otras. Implicando que,
los extractos y fracciones evaluados con capacidad antioxidante, podrían disminuir
el impacto del aumento de radicales libres en los pacientes y establecerse como
una un potencial tratamiento para la EA. Ya que, en este punto, se esperaría que
las fracciones y extractos mejoren potencialmente el metabolismo lipídico,
91
aumentando con esto la eliminación de Aβ, inhibiendo AChE y disminuyendo los
radicales libres.
Ilustración 3-8.Actividad antioxidante y protectora de β-Caroteno. A. Cuantificación del %
de β-caroteno durante 180min, adicionando las fracciones alcaloidales de la familia
Rutaceae (códigos 1, 2 y 3), la solución usada como vehículo y quercetina como control
92
positivo. B. Cuantificación del % de β-caroteno usando las fracciones alcaloidales de la
familia Rutaceae a los 150min. C. Cuantificación del % de β-caroteno durante 180min,
adicionando los extractos etanolicos de la familia Lauraceae (códigos 4,5 y 6), la solución usada como vehículo y quercetina como control positivo. D. Cuantificación del % de β-
caroteno usando los extractos etanólicos de la familia Lauraceae a los 150min. E. Cuantificación del % de β-caroteno durante 180min, adicionando los extractos etanólicos
de la familia Myristicaceae (códigos 7 y 8), la solución usada como vehículo y quercetina como control positivo. F. Cuantificación del % de β-caroteno usando los extractos etanólicos
de la familia Myristicaceae a los 150min. Los datos de las gráficas B, D y F, muestran valores representados por la media y el error estándar de la media (SEM), análisis estadístico realizado por comparación múltiple por ANOVA de una vía, donde se muestran diferencias significativas: *(p≤0,05); **(p≤0,01); ***(p≤0,001); ****(p≤0,0001).
3.4. Conclusiones
Los ensayos realizados en este capítulo evidencian que las 8 muestras
seleccionadas por su comportamiento como agonistas de LXRβ, son candidatos a
hacer parte de estudios más completos en torno a su caracterización química. Las
muestras evaluadas mostraron potenciales efectos terapéuticos en la EA, ya que
son agonistas LXR, presentan efecto inhibidos de AChE y un marcado efecto
antioxidante, con lo cual se estaría abarcando tres dianas farmacológicas de interés
para mejorar el desarrollo patológico de la EA. Los resultados de la determinación
preliminar de los posibles núcleos presentes en los extractos activos están de
acuerdo con la quimiotaxonomía del género y con los reportes previos reportados
en la literatura.
93
4. Capítulo 4: Efecto neuroprotector de los extractos activos para LXR frente a los agentes neurotóxicos; Paraquat, Glutamato, Ceramida
4.1. Introducción
La EA se caracteriza por ser una enfermedad compleja, encontrado diferentes
cambios moleculares que generan ambientes tóxicos para las neuronas, lo cual
contribuye a la neurodegeneración y a su vez al deterioro cognitivo. Los cambios
descritos incluyen el aumento de radicales libres generando estrés oxidativo, la
desregulación en la homeostasis de calcio, la acumulación de lípidos citotóxicos y
la formación de agregados de Aβ y Tau, entre otros. Para entender el papel de cada
uno de estos se han desarrollado modelos in vitro e in vivo que han permitido realizar
un acercamiento a los mecanismos celuares y moleculares fisiopatológicos, así
mismo estos modelos han permitido realizar la búsqueda de potenciales agentes
neuroprotectores con potencial terapéutico.
4.1.1 Modelo de estrés oxidativo
En este capítulo se estudió el potencial efecto neuroprotector que presentan los
extractos y fracciones seleccionados en la tabla 3-1, del capítulo 3 en un modelo de
estrés oxidativo celular, para ello se expuso la línea celular neuronal SHSY-5Y al
1,1'-dimetil-4,4'-bipiridio (paraquat - PQ).
94
El PQ ha sido tradicionalmente usado como herbicida, se ha encontrado que actúa
como una neurotoxina que altera los procesos neurofisiológicos y se asocia a
enfermedades como el Parkinson, la EA y el Huntington (Blanco-Ayala et al., 2014;
Elena-Real et al., 2012; Yan et al., 2016). Particularmente, nuestro interés se centra
en el contexto del PQ y la EA. Como ya se ha mencionado anteriormente, el PQ se
encuentra vinculado con el deterioro del funcionamiento mitocondrial,
especialmente asociadas con alteraciones en el flujo de la cadena transportadora
de electrones, generando estrés oxidativo (Blanco-Ayala et al., 2014; Fukushima et
al., 2002). Se considera al estrés oxidativo como un mecanismo transversal en todas
las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la EA, donde el aumento de
radicales libres favorece los mecanismos moleculares patológicos característicos
de la EA. Adicionalmente, un meta-análisis realizado con el objetivo de establecer
la posible relación entre el PQ y la EA, agrupó siete estudios realizados a pacientes
y controles, demostró la asociación positiva con un OR = 1.34 (95% de confianza
intervalo [CI] = 1.08, 1.67; n = 7), concluyendo que la exposición a pesticidas,
incluyendo PQ es un factor de riesgo para desarrollar la EA (Yan et al., 2016).
A partir de su aplicación como herbicida, se han descrito parcialmente los
mecanismos de citotoxicidad en plantas y hongos. Se ha descrito que a partir de la
formación de radicales libres y peroxidación lipídica, se afecta directamente la vía
NADH-citocromo-C reductasa (Bus et al., 1974). En más detalle (Ilistración 4-1), el
PQ pasa por un proceso de reducción y posterior oxidación, que genera elevados
niveles de radicales libres intracelulares. Inicialmente las enzimas NADPH-
citocromo P450 reductasa, NADH ubiquinina oxidorreductasa, xantina oxidasa y el
óxido nítrico sintetasa pueden reducir el PQ, produciendo un radical libre de ⦁PQ
más NADP+, continuando con la oxidación del radical de ⦁PQ y formando el anión
de superóxido (O2)- , lo que permite por acción de la enzima superóxido dismutasa
se forme ROS, en particular peróxido de hidrogeno (H2O2), sumado a la formación
del radical hidroxilo (⦁OH), en presencia de hierro (Fe2+), cobre (Cu2+) y peroxinitrito
95
(ONOO-). Finalmente, el ROS producido reacciona entre otras con membranas
celulares causando peroxidación de lipídica, contribuyendo al estrés oxidativo, GSH
y agotamiento de NADPH (Kato et al., 1976). (Elena-Real et al., 2012) (Clejan &
Cederbaum, 1989) (Ilustración 4-1).
Ilustración 4-1.Vía citotóxica pro-oxidativa del PQ; imagen modificada de (Elena-Real et al., 2012). El PQ es reducido por acción de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial, pasando por una reacción oxidativa que permite la generación de elevados niveles de radicales libres, aumentando inicialmente los niveles del anion superóxido, que llevará a aumentos de peróxido de hidrógeno por catálisis del la superoxidodismutasa, este a su vez hará parte de la reacción de fenton y producirá aumentos del radical hidroxilo, este radical podrá reaccionar posteriormente con lípidos, polipéptidos, proteínas y ácidos nucleicos, especialmente tiamina and guanosina. Paralelamente se activarán mecanismos que buscan disminuir la concentración de los radicales por acción de la catalasa y glutatión.
En modelos animales, aún no se conocen con precisión los mecanismos citotóxicos
del PQ, se ha descrito que las mitocondrias son los organelos que al ser afectados
desencadenan la muerte celular, por ejemplo, células epiteliales alveolares de ratas
96
tratadas con PQ presentaron hinchazón y perdida de la matriz mitocondrial (Witschi
et al., 1977). En síntesis, se ha establecido que el PQ altera la cadena respiratoria
y la membrana mitocondrial al provocando aumentos en la peroxidación lipídica
(Blanco-Ayala et al., 2014; Elena-Real et al., 2012; Fukushima et al., 2002).
El PQ afecta la cadena transportadora de electrones en células de mamíferos,
interactúa principalmente con los complejos I, III y IV que son fuente de electrones.
El complejo I se ha postulado como el sitio principal donde ocurre la reducción del
PQ (Cochemé & Murphy, 2008), el complejo III es inhibido en presencia de PQ
(Rossouw & Engelbrecht, 1978; Yamamoto et al., 1987) y en el complejo IV es
donde se da la reducción del oxígeno y por lo tanto es el lugar donde probablemente
ocurre la peroxidación del PQ y formación del superóxido (Blanco-Ayala et al.,
2014). Adicionalmente, se ha encontrado que el PQ inhibe parcialmente la actividad
de la ATP sintasa, conllevando a una tasa deprimida de la síntesis de ATP (Blanco-
Ayala et al., 2014). La reducción de ATP también se puede explicar a partir del
desacoplamiento de la cadena transportadora de electrones en los complejos I, III y
IV mencionado anteriormente (Blanco-Ayala et al., 2014; Yamamoto et al., 1987;
Yan et al., 2016) (Ilustración 4-2).
Teniendo en cuanta lo mencionado, el PQ es una neurotoxina que actúa a través
de una vía REDOX, el cual teniendo en cuenta su alta solubilidad en solución
acuosa, ha permitido utilizarse como modelo para inducir estrés oxidativo y evaluar
el impacto de los radicales libres tanto in vitro como in vivo.
97
Ilustración 4-2. Mecanismo citotóxico del PQ en la mitocondria. Una vez las moléculas de
PQ ingresan a través de la membrana mitocondrial puede recibir un electrón de los
complejos I, III, IV y producir ⦁PQ. Continuando con la disminución de la actividad de los
complejos de la cadena respiratorio, aumento de radicales libres y peroxidación lipídica.
4.1.1 Neurotoxicidad inducida por Ceramida
Las ceramidas son un grupo de moléculas de carácter lipidico, de la familia de los
esfingolípidos, son intermediarias y centrales de la biosíntesis y catabolismo de
esfingolípidos, actúan como componentes estructurales de las membranas
celulares y como segundos mensajeros de vías importantes en la diferenciación,
crecimiento y apoptosis celular (Cutler et al., 2004b; Filippov et al., 2012b; Xing et
al., 2016). La Ceramida actúa como un potente neurotóxico que se incrementa en
el cerebro durante la EA (Yadav & Tiwari, 2014). Análisis realizados en fluido
cerebro espinal de pacientes con EA y controles, mostraron variaciones
significativas en las concentraciones de esfingolípidos incluyendo esfingomielina,
ceramida e hidroceramida, sugiriendo a estas moléculas como posibles
biomarcadores de la enfermedad. (Fonteh et al., 2015). Estos incrementos se han
98
asociado al aumento de estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, neuroinflamación,
aumentos de Aβ y Tau, daño sináptico y muerte celular, mecanismos implicados
con la progresión de la EA (Cutler et al., 2004b; Filippov et al., 2012b; Xing et al.,
2016).
Se ha descrito un ciclo de regulación entre Aβ y las ceramidas, en el cual uno
promueve la producción del otro, afectando la homeostasis celular y favoreciendo
el desarrollo patológico de la EA (Filippov et al., 2012b; Jazvinšćak Jembrek et al.,
2015; Xing et al., 2016). La ceramida se acumula en balsas lipídicas, promoviendo
la estabilización de 𝛽-secretasa, aumentando la producción de Aβ, generando
mayores niveles de Aβ, activando esfingomielinasas e incrementando la formación
de ceramidas (Filippov et al., 2012a; Jazvinšćak Jembrek et al., 2015; Kosicek &
Hecimovic, 2013).
Una vez la concentración de ceramida se encuentra alterada en la EA se activan
vías de muerte celular, se produce la despolarización y permeabilización
mitocondrial, generación de radicales libres, liberación de citocromo c, y activación
de caspasas (Arboleda et al., 2009). Estos eventos se asocian con incrementos de
Ca2+ intracelular y daños sinápticos (Chaurasia & Summers, 2015; Cruciani-
Guglielmacci et al., 2017; Jazvinšćak Jembrek et al., 2015). Además, se ha
reportado que aumentos de ceramida se asocian con el incremento de PSEN1 en
células APPswe, lo que podría incrementar la proteólisis de APP y formación de Aβ
(Czubowicz et al., 2018) (Ilustración 4-3).
99
Ilustración 4-3. Efecto de la ceramida en la vía amiloidogénica, mitocondria y Tau. A. La esfingomielinasa cataliza la generación de ceramida, conlleva a su acumulación y formación de balsas lipídicas, favorece la actividad proteolítica de gamma-secretasa y BACE-1 sobre APP incrementando Aβ. B. La ceramida produce daño mitocondrial, incrementa la peroxidación lipídica, formación de ROS y perdida del potencial de membrana mitocondrial, asociado con la hiperfosforilacion de Tau. C. La ceramida inhibe la principal vía de supervivencia neuronal PI3K/AKT.
4.1.1 Exitoxicidad inducida por glutamato
La desregulación del glutamato provoca el deterioro de la sinapsis, que conlleva a
disminución en la plasticidad sináptica y el desencadenamiento de la muerte
neuronal (Alberdi et al., 2010; Choi, 1988; Dreses-Werringloer et al., 2008; Hamilton
et al., 2015; LaFerla, 2002; C. G. Parsons et al., 2017). Estas variaciones de
concentración de glutamato en el cerebro se presentan de manera temprana en la
EA, son desencadenados por la acumulación de oAβ en la hendidura sináptica
donde interactúan con receptores presinápticos y postsinápticos, incluyendo los
receptores NMDA y especialmente mGluR5 propiciando la activación de cascadas
de señalización que incrementan el Ca2+, daños en la mitocondria, el retículo
100
plasmático, en las dendritas, un mayor aumento de Aβ y Tau fosforilado (Alberdi et
al., 2010; Choi, 1988; Dreses-Werringloer et al., 2008; Hamilton et al., 2015; LaFerla,
2002; C. G. Parsons et al., 2017). Este mecanismo dependiente de los receptores
de glutamato soporta la hipótesis de calcio en la EA (Ilustración 4-4).
La evaluación del efecto de altas concentraciones de glutamato en células
neuronales se ha realizado en modelos celulares como la línea celular de
neuroblastoma SH-SY5Y, la cual tiene un fenotipo de neuronas maduras, semejante
a neuronas colinérgicas (Datta, 2013). Estableciendo además que, las células SH-
SY5Y expresan receptores de glutamato ionotrópicos y metabotrópicos, haciendo
que estas células sean sensibles a los cambios de concentración en el Ca2+
extracelular (Gao et al., 2008; Naarala et al., 1993).
Ilustración 4-4. Hipótesis de calcio; tomada de (Berridge, 2010). El metabolismo amiloide podría influenciar variaciones de la plasticidad sináptica y la apoptosis celular siguiendo cuatro dos mecanismos. El primero, se da partir de la liberación de Aβ y formación de oligómeros que pueden facilitar el ingreso de Ca2+ a la célula por interacción con la proteína priónica (PrPC) y los receptores de glutamato. El Segundo, es por la liberacion del dominiointracelular de APP (AICD), ya que, remodela las señales de calcio al alterar la
101
expresión de componentes tales como el receptor de ryanodina (RYR) y el buffer de calbindina. Adicionalmente, muestra que es posible que el aumento de las señales de Ca2+ por al presentarse variaciones en RYR y calbindina, afectando el RE y la mitocondria, produciendo finalmente disrupciones en los mecanismos de respuesta sináptica, activando vías apoptóticas y afectando el aprendizaje y la memoria.
En este capítulo se abordaron diferentes contextos tóxicos característicos de la EA,
evaluando la capacidad que tienen los extractos o fracciones con potencial agonista
de LXRβ de proteger la línea celular SH-SY5Y expuesta a PQ, C2, y Glutamato,
toxinas que permiten el desarrollo de modelos in vitro que afectan diferentes
procesos celulares similares encontrados en la patología, como el estrés
mitocondrial y producción de radicales libres, aumento de esfingolípidos,
incrementos lesivos de calcio y fallas sinápticas.
4.2. Estado del Arte
En los últimos años, partiendo del uso de la ceramida como un modelo de inducción
de apoptosis intrínseca, se ha contribuido en la comprensión de procesos que
ocurren en el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas. Encontrando que las
ceramidas afectan de forma directa o indirecta enzimas vitales para la homeostasis
celular, como son las MAPK, PKC, CAPK, CAPP, catepsina D y fosfolipasas
(Jazvinšćak Jembrek et al., 2015).
En cuanto al PQ, este se a usado como modelo de estrés oxidativo teniendo en
cuenta que es un inductor de radicales libres y se ha asociado con enfermedades
neurodegenerativas como el Parkinson y la EA. De acuerdo con la concentración y
el tiempo de exposición al PQ se puede usar de manera crónica o aguda (Cutler et
al., 2004a; Elena-Real et al., 2012; Q. Wang et al., 2016). Un ejemplo, es el efecto
del PQ en pez cebra, el cual incrementa la expresión de genes asociados con el
estrés oxidativo, sugiriéndo que este modelo es apto para la búsqueda de fármacos
protectores frente a radicales libres (Q. Wang et al., 2016).
102
Finalmente, el uso del glutamato como modelo de excitotoxicidad ha permitido la
correlación de diferentes investigaciones en modelos celulares y animales con
alteraciones sinápticas, como la que se presenta en la EA. Su principal aplicación
es en técnicas de evaluación de actividad sináptica por técnicas electrofisiológicas
(Choi, 1988; Hoey et al., 2009; Naarala et al., 1993; Rothman & Olney, 1986).
4.3. Metodología
4.3.1 Evaluación in vitro del efecto neuroprotector de extractos activos
El potencial efecto neuroprotector de los extractos, se evaluó en la línea celular SH-
SY5Y, sobre la cual se realizó el protocolo de neuroprotección contra Caramida y
Paraquat.
4.3.2 Cultivo de la línea celular SHSY-5Y
La línea celular SHSY-5Y fue obtenida de células derivadas de una biopsia de
medula ósea SK-N-SH en 1978, proviene de una mujer de cuatro años de un origen
étnico desconocido y puede diferenciarse como células de neuroblastoma y como
células de tipo epitelial.
La línea celular de SHSY-5Y fue cultivada en el laboratorio del grupo de
investigación en muerte celular. Las células se descongelaron sacando el criovial
del nitrógeno gaseoso y pasándolas de forma inmediata al baño maría a 37°C por
1 minuto hasta que no se observaron cristales que afectaran la integridad celular.
El contenido del criovial se transfirió a 5ml de medio de mantenimiento (SFB 10%,
p/s 1% (Penisilina 100unidades/ml/ steptomisina 100µg/ml), en DMEM-F12) y se
centrifugó a 1000 rpm durante 3 minutos, se eliminó el sobrenadante,
posteriormente se adicionaron 2 ml del medio de mantenimiento al pellet, se
resuspendieron las células, se trasfirió la suspensión celular a un frasco de cultivo
103
de T-75 completando el medio hasta 10 ml. Se realizó el cambio de medio de cultivo
cada tres días o antes si las condiciones celulares lo exigían.
El pasaje del cultivo celular se realizó mediante la obtención de una suspensión
celular por tripsinización y redistribución en nuevas cajas de cultivo. La
tripsinización se realizó retirando el medio de mantenimiento y adicionando 3 ml de
tripsina 1X por caja de T-75 en incubación a 37 °C por 3 minutos. Pasado este
tiempo se verificó la separación celular en el microscopio invertido y se neutralizó la
tripsina adicionando 10 ml de medio de mantenimiento. Posteriormente se
centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos, se eliminó el sobrenadante, el pellet
celular se usó tato para congelamiento o pasaje a nuevas cajas. Finalmente, la
preservación de la línea celular se realizó en medio de congelamiento (65% SFB,
5% DMSO y 30% DMEM) en crioviales de 2,5 ml conteniendo entre 1 – 1,5 millones
de células a -80°C durante un máximo de 2 semanas y posteriormente en tanques
de nitrógeno.
4.3.3 Evaluación del efecto toxico del PQ, C2 y glutamato.
El protocolo de neuroprotección consta de los siguientes pasos, primero, se
siembran 10.000 células por pozo, en una placa de 96 pozos, conteniendo ácido
retinoico a una concentración de 10 µM en medio de cultivo F12, con un 1% de SFB
y 1% de p/s (Penisilina 100unidades/ml/ steptomisina 100µg/ml), y dejando que las
células se diferencien durante 3 días. Segundo, se seleccionan concentraciones de
trabajo teniendo en cuenta los resultados de los ensayos de viabilidad de MTT
(Tabla 2-1). Los extractos se dejan por 1 y 6 horas previo a la adición de la
neurotoxina (PQ, C2 o Glutamato) durante 23 horas. Finalmente se realiza el
protocolo de MTT al igual que en el capítulo 2.
104
4.3.4 Citometría de flujo
Con el fin de realizar un acercamiento a los mecanismos de neuroprotección, se
realizaron ensayos de citometrías de flujo con dos Kits, uno que permite cuantificar
radicales libres y otro que cuantifica la presencia de células apoptóticas y necróticas,
ambos mediante la plataforma Muse Cell Analyzer (Muse-Guava, Luminex). Para
esto: se sembraron 100.000 células por pozo en placas de 12 pozos en medio de
cultivo celular siguiendo el protocolo de neuroprotección, variando la última parte
del ensayo, en el cual una vez se cumplen las 23 horas de exposición a la toxina,
se adiciono a las células 150 uL solución de tripsina-EDTA al 0.5% (Gibco - ref.
15400-054) y se dejó actuar por 3 minutos, seguido a esto se inactivó la tripsina con
350 ul de FBS al 10% y se agregó el medio previamente removido, de esta mezcla
se realizaron dos diluciones, la primera se ajustó a 1x105 – 5x105 células por mL,
para la tinción con Anexina-V y se siguieron los pasos estandarizados del el kit Muse
™ Annexin V Dead Cell (Millipore Ref. MCH100105). La segunda se ajustó a 1x106
– 5x107 células por mL y se siguieron los pasos indicados en el kit Muse ™ Oxidative
stress (Millipore Ref. MCH100111).
4.3.5. Análisis estadísticos
Todos los resultados que fueron obtenidos a lo largo de este documento fueron
analizados utilizando GraphPad Prism versión 7.00 para Windows (GraphPad
Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com).
4.4. Resultados y discusión
Como se mencionó en el capítulo 2 y 3, de 81 extractos fueron seleccionados
aquellos que presentaron actividad agonista LXRβ, que fueron tres fracciones
alcaloidales pertenecientes a las familias Rutaceae (género Zanthoxylum), tres
extractos etanólicos pertenecientes a la familia Lauraceae (género Nectandra) y dos
extractos alcaloidales pertenecientes a la familia Myristicaceae. Posteriormente en
105
el capítulo 3 se caracterizó el efecto antioxidante y actividad inhibitoria frente a
AChE, finalmente en el presente capítulo se evaluó el efecto neuroprotector de las
fracciones y extractos en líneas celulares neuronales SH-SY5Y expuestas a los
neurotóxicos PQ, C2 y Glutamato.
Los extractos y fracciones fueron adicionados al medio celular al inicio del
experimento como pretratamientos de 1 y 6 horas y posteriormente expuestos a PQ,
C2 o Glutamato.
4.4.1Neuroprotección inducida frente al PQ
Fue usado PQ como agente neurotóxico inductor de estrés oxidativo, en la
ilustración 4-5 se muestran los resultados de los ensayos de neuroprotección contra
PQ de la fracción alcaloidal de Z. martinicense (Ilustración 4-5A), y los extractos
etanólicos de Nectandra sp (Ilustración 4-5 B), N. reticulata (Ilustración 4-5 C) y
Myristicaceae sp 1 (Ilustración 4-5 D), que fueron los extractos y fracciones que
protegieron la supervivencia celular frente a PQ.
La fracción alcaloidal de Z. martinicense (Ilustración 4-5A) presentó un efecto
neuroprotector con 1 h de pretratamiento frente a el PQ, reduciendo su efecto tóxico,
impidiendo la disminución de la viabilidad celular de manera estadísticamente
significativa en comparación con las células que solo tenían vehículo y fueron
expuestas a la toxina (F (2, 36) = 11,30; p = 0,0002). El pretratamiento con la fracción
alcaloidal de Z. martinicense a 2,5 𝜇g/ml, aumentó significativamente la viabilidad
de las células expuestas a las concentraciones de 0,1mM, 0,5mM y 1mM de PQ (t
(36) = 2,597; p < 0,05; t (36) = 3,605; p < 0,001; t (36) = 3,295; p < 0,001). Además,
también se encontró un aumento significativo en la viabilidad de las células tratadas
con una concentración de 25 𝜇g/ml de la fracción alcaloidal de Z. martinicense y
expuestas a 0,1 mM de PQ (t (36) = 2,622; p = 0,025).
106
Por su parte, el extracto etanólico de Nectandra sp (2,5 𝜇g/ml) (Ilustración 4-5B),
redujo el efecto tóxico del PQ (0,5mM), disminuyendo la muerte celular en
comparación con las células control expuestas a la toxina (F (2, 36) = 10,42; p =
0.0003; post hoc: t (36) = 3,605; p=0,0019). Así mismo el pretratamiento de N.
reticulata (Ilustración 4-5C) a 2,5 𝜇g/ml mostró un efecto neuroprotector contra el
PQ a 0,5 mM y 1 mM, protegiendo la supervivencia en comparación con el control
PQ (F (2, 36) = 6,328; p = 0,0044). En la prueba post hoc sé evidencio que este
extracto a 2,5 𝜇g/ml presenta un efecto neuroprotector frente al PQ 0,5 mM y 1 mM
(t (36) = 3,801; p = 0,0011 t (36) = 3,728; p = 0,0013). Adicionalmente, el pretratamiento
de N. reticulata 25 𝜇g/ml también disminuyo el efecto del PQ sobre la viabilidad
celular (F(2, 36) = 3,728; p = 0,0109).
107
Ilustración 4-5. Ensayo de neuroprotección evaluado por la variación de la actividad mitocondrial (MTT). A. Células SH-SY5Y pre-tratadas durante una hora (1 h) con la fracción alcaloidal (cloroformo) de Z. martinicense y expuestas a veintitrés horas (23 h) de PQ. B. Células SH-SY5Y pre-tratadas durante una hora (1 h) con el extracto de Nectandra sp. y expuestas a veintitrés horas (23 h) de PQ C. Células SH-SY5Y pre-tratadas durante una hora (1h) con el extracto de N. reticulata. y expuestas a veintitrés horas (23 h) de PQ. D. Células SH-SY5Y pre-tratadas durante una hora (1h) con el extracto de Myristicaceae sp. 1 y expuestas a veintitrés horas (23 h) de PQ. Datos representados por la media y el error estándar de la media (SEM), análisis estadístico realizado por ANOVA de dos vías, donde se muestran diferencias significativas así: *(p≤0,05); **(p≤0,01); ***(p≤0,001); ****(p≤0,0001).
108
Por otro lado, en la ilustración 4-6, se muestran los resultados del pretratamiento de
6h con GW3965 (Ilustración 4-6A), y los extractos etanolicos de Z. rohifolium
(Ilustración 4-6B), Z. martinicense (Ilustración 4-6C) y N. reticulata (Ilustración 4-
6D). Se observaron efectos protectores de la supervivencia en comparación con el
control PQ.
El agonista GW3965 presento un efecto neuroprotector con 6 h de pretratamiento
frente al PQ. La prueba post hoc, mostró que el tratamiento con 5 𝜇M de GW3965,
dismunuyo el porcentaje de células afectadas por la expocición a 0,1 mM y 0,5 mM
(p=0,0369 y p=0,0279). Así mismo, el pretratamiento de 6h con el extracto etanoico
de Z. rohifolium (25 𝜇g/ml) (Ilustración 4-5B), redujo el efecto citotóxico del PQ
(1mM) en cultivo celular (p=0,0013).
Respecto al estracto de Z. martinicense (Ilustración 4-6C), la aplicación del
pretratamiento de 6 h redujo el efecto citotóxico de PQ. En particular el tratamiento
con 2,5 𝜇g/ml de Z. martinicense redujo significativamente redujo el efecto citotóxico
de 0,1 mM, 0,5 mM y 1 mM de PQ (p = 0,0036, p = 0,0019 y p = 0,053).
Finalmente, el pretratamiento de 6 h con el extracto etanoico de N. reticulata
(Ilustración 4-5D), redujo el efecto citotóxico de PQ de manera estadísticamente
significativa en comparación con el control de PQ. El pretratamiento con 25 𝜇g/ml
de N. reticulata redujo efecto citotóxico de del 0,01 mM, 0,5 mM y 1 mM de PQ (p =
0,0061, p=0,0387 y p < 0,0305) y con 2,5𝜇g/ml de N. reticulata, también se observó
un efecto protector de la viabilidad celular frente a 1 mM de PQ (p = 0,0169).
109
Ilustración 4-6. Ensayo de neuroprotección evaluado por la variación de la actividad mitocondrial (MTT). A. Células SH-SY5Y pre-tratadas durante seis horas (6h) con GW3965 y expuestas a veintitrés horas (23 h) de PQ. B. Células SH-SY5Y pre-tratadas durante seis horas (6h) con la fracción alcaloidal (cloroformo) de Z. rohifolium y expuestas a veintitrés horas (23 h) de PQ C. Células SH-SY5Y pre-tratadas durante seis horas (6h) con la fracción alcaloidal (cloroformo) de Z. martinicense y expuestas a veintitrés horas (23 h) de PQ. D. Células SH-SY5Y pre-tratadas durante una seis (6h) con el extracto de N. reticulata expuestas a veintitrés horas (23 h) de PQ. Datos representados por la media y el error estándar de la media (SEM), análisis estadístico realizado por ANOVA de dos vías, donde se muestran diferencias significativas así: *(p≤0,05); **(p≤0,01); ***(p≤0,001); ****(p≤0,0001).
110
Adicional al ensayo de MTT y con el fin de comprobar los efectos neuroprotectores
observados, realizamos citometría de flujo para evaluar directamente la reducción
en los procesos apoptóticos mediante el marcaje de Anexina V y 7AAD, un
marcador de la fosfatidil serina en membranas citosólicas característico de células
en apoptosis y un marcador del ADN usado para medir la integridad de las
membranas citoplasmáticas, marcador de muerte por necrósis.
Adicionalmente, se uso dihidroetidio como marcador de ROS intracelular por
citometría de flujo, ya que es permeable a las células y tiene la capacidad de
reaccionar con aniones superóxido y producir el bromuro de etidio, el cual se
intercala con afinidad al ADN produciendo fluorescencia en la longitud de onda de
los rojos. De esta manera evaluamos este mecanismo neuroprotector asociado al
incremento de radicales libres observado también en el capítulo 3. Las
concentracion usada en este ensayo, fueron las concentraciones que arrojaron los
mejores resultados en el ensayo de neuroproteccion por MTT.
En la Ilustración 4-7 se presentan los histogramas y graficas de barras de las
citometrías de flujo con anexina-V/7AAD y del ensayo ROS en la línea celular SH-
SY5Y. Respecto al efecto del PQ en la línea celular, se observa que las células SH-
SY5Y sin tratamiento presentan un 99,38% de células vivas (Ilustración 4-7A), con
un porcentaje de ROS de 17,91% (Ilustración 4-7M). Cuando las células fueron
tratadas con 0,1 mM, 0,5 mM y 1 mM de PQ se incremento el porcentaje de celulas
en proceso apoptotico a 86,76% 54,19% y 27,70% respectivamente (Ilustración 4-
A-D) evidenciando un efecto dosis dependiente, esta reducción del número de
células sanas se observó por el incremento en el marcaje de anexina V,
demostrando que PQ es un inductor de apoptosis. Así mismo, la reducción de
células vivas se asocia al incremento del numero de células con mayor marcaje de
ROS; 32,61%, 50,58% y 82,98% de manera dosis dependiente (Ilustración 4-7 N-
111
O). Estos resultados indican que el PQ produce muerte celular por apoptosis de
manera dependiente del estrés oxidativo.
Respecto al efecto de los extractos y fracciones alcaloidales de Z. martinicense
seleccionados como pretratamiento de 1 h (Ilustración 4-7E y 7P), Nectandra sp.
(Ilustración 4-7G y 7R), N. reticulata (Ilustración 4-7I y 7T) y el extracto de
Myristicaceae sp.1 (Ilustración 4-7K y 7V). Se confirmó que los extractos o
fracciones alcaloidales usados no reducen la viabilidad celular ni inducen apoptosis,
manteniendo valores de células vivas cercanos al 99% en todos los casos y el
porcentaje de ROS no aumento más del 6% ni disminuyo más del 4%, al ser usadas
como pretratamiento en las células SH-SY5Y (Ilustración 4-7).
En segundo lugar, se confirmó el efecto neuroprotector de los extractos y fracciones
alcaloidales. Al comparar el porcentaje de células sanas después de ser expuestas
a 0,5 mM de PQ, y pretratadas por 1 h con la fracción alcaloidal de Z. martinicense
(Ilustración 4-7F y 7Q), los extractos etanolicos de Nectandra sp. (Ilustración 4-7H
y 7S), N. reticulata (Ilustración 4-7J y 7U) y Myristicaceae sp. 1(Ilustración 4-7L y
7W), observando una disminución del efecto tóxico del PQ en la supervivencia
celular del 21% al 30%, acompañado de una disminución de ROS de hasta un 35%
(Tabla4-1).
112
113
Ilustración 4-7. Evaluación del efecto neuroprotector y antioxidante por citometría de flujo. A-L. Histogramas de células SH-SY5Y vivas, apoptóticas teñidas con anexina V y necróticas teñidas con 7-AAD. M-W. Histogramas de células SH-SY5Y marcadas con dihidroetidio en ausencia de ROS y con bromuro de etidio en células con ROS. Nota: los tratamientos que fueron usados en la línea celular antes de su marcación y lectura fueron: A y M. Células control, cultivadas con vehículo. B y N. Células expuestas a PQ [0,1 mM] durante veintitrés horas (23 h). C y Ñ. Células expuestas a PQ [0,5 mM] durante veintitrés horas (23 h). D y O. Células expuestas a PQ [1 mM] durante veintitrés horas (23 h). E y P. Células expuestas a veinticuatro horas (24 h) con la fracción alcaloidal (cloroformo) de Z. martinicense (2,5 𝜇g/ml). F y Q. Células pretratadas una hora (1 h) con la fracción alcaloidal
(cloroformo) de Z. martinicense (2,5 𝜇g/ml) y PQ [0.5 mM] durante veintitrés horas (23 h). G y R. Células expuestas durante veinticuatro horas (24 h) con el extracto etanoico de Nectandra sp. (2,5 𝜇g/ml).H yS. Células pretratadas durante una hora (1 h) con el extracto etanoico de Nectandra sp. (2,5 𝜇g/ml). y PQ [0,5 mM] durante veintitrés horas (23 h). I y T. Células expuestas durante veinticuatro horas (24h) con el extracto etanólico de N. reticulata (2,5 𝜇g/ml). J y U. Células pretratadas durante una hora (1 h) con el extracto etanólico de
N. reticulata (2,5 𝜇g/ml) y PQ [0,5 mM] durante veintitrés horas (23 h). K y V. Células expuestas durante veinticuatro horas (24 h) con el extracto Myristicaceae sp.1 (25 𝜇g/ml). L y W. Células pretratadas durante una hora (1 h) con el extracto Myristicaceae sp. 1 y PQ [0,5 mM] durante veintitrés horas (23 h). X. Diagrama de barras del porcentaje de células SH-SY5Y vivas resultantes del análisis usando anexina V y 7-AAD Y. Diagrama de barras del porcentaje de células SH-SY5Y marcadas con bromuro de etidio como Ros.
114
Tabla 4-1. Evaluación de la viabilidad celular, de células SH-SY5Y pretratadas durante 1 h
y expuestas a PQ durante 23 h.
Histograma Extracto /Fracción
Concentración Concentració
n PQ
% células vivas
% ROS
A y M - - - 99,38 17,91
B y N - - 0,1 mM 86,76 32,61
C y Ñ - - 0,5 mM 54,19 50,58
D y O - - 1 mM 27,70 82,98
E y P Z. martinicense 2,5 𝜇g/ml - 99,14 21,82
F y Q Z. martinicense 2,5 𝜇g/ml 0,5 mM 75,7 15,32
G y R Nectandra sp. 2,5 𝜇g/ml - 92,1 24,24
H Y S Nectandra sp. 2,5 𝜇g/ml 0,5 mM 80,63 19,18
I Y T N. reticulata 2,5 𝜇g/ml - 97,27 13,63
J Y U N. reticulata 2,5 𝜇g/ml 0,5 mM 84,44 18,65
K Y V Myristicaceae sp.1 25 𝜇g/ml - 94,01 13,04
L Y W Myristicaceae sp.1 25 𝜇g/ml 0,5 mM 76,62 17,03
A continuación, se evaluó el efecto tóxico del PQ sobre la muerte celular y la
producción de ROS en las células SH-SY5Y pretratadas durante 6 h con 25 𝜇g/ml
de la facción alcaloidal de Z. rohifolium y 5 𝜇M de GW3965.
En la Ilustración 4-8 se muestra el efecto de 25𝜇g/ml de la facción alcaloidal de Z.
rohifolium y 5 𝜇M de GW3965 observando que no producen cambios significativos
en la viabilidad celular (Ilustración 4-8E y G). Sin embargo, 25 𝜇g/ml de la facción
alcaloidal Z. rohifolium aumentó el porcentaje de ROS un 13,08% respecto a las
células control tratadas con vehículo, lo que sugiere de la presencia de moléculas
que favorecen el aumento de radicales libres sin afectar la viabilidad celular
(Ilustración 4-8Ñ). Adicionalmente, nuevamente se observó un efecto protector de
25 𝜇g/ml de la facción alcaloidal de Z. rohifolium y 5 𝜇M del GW3965 frente al PQ.
Particularmente, la facción alcaloidal 25 𝜇g/ml Z. rohifolium disminuyó la letalidad
del PQ a 1 mM en un 43,28% asociado a una reducción de ROS en un 62,79%. Por
su parte el GW3965 disminuyo la letalidad del PQ a 0,5 mM y disminuyó el
porcentaje de ROS en un 27,18% (Tabla 4-2).
115
Teniendo en cuenta el conjunto de resultados encontracos hasta esta etapa del
trabajo, en donde los extractos y fracciones alcaloidales evaluados tienen efectos
antioxidantes y disminuyen el efecto citotoxico del PQ. Consideramos que estos
hallazgos son importantes en la búsqueda de agentes químicos con potencial
farmacológico para las enfermedades neurodegenerativas y en particular para la de
EA (Cassidy et al., 2020; Islam et al., 2019; Tobore, 2019).
116
Ilustración 4-8. Evaluación del efecto neuroprotector y antioxidante por citometría de flujo. A-H. Histogramas de células SH-SY5Y vivas, apoptóticas teñidas con anexina V y necróticas teñidas con 7-AAD. I-O. Histogramas de células SH-SY5Y marcadas con
117
Dihidroetidio en ausencia de ROS y con Bromuro de Etidio en células con ROS. Nota: los tratamientos que fueron usados en la línea celular antes de su marcación y lectura fueron: A y I. Células control, cultivadas con vehículo. B y J. Células expuestas a PQ [0.1mM] durante veintitrés horas (23h). C y K. Células expuestas a PQ [0.5mM] durante veintitrés horas (23h). D y L. Células expuestas a PQ [1mM] durante veintitrés horas (23h). E y M.
Células expuestas a veintinueve horas (29h) con GW3965 [5𝜇M]. F y N. Células pretratadas
seis horas (6h) con GW3965 [5mM] y expuestas a veintitrés horas (23 h) de PQ [0.5mM]. G y Ñ. Células expuestas veintinueve horas (29h) con la fracción alcaloidal (cloroformo) de Z. rohifolium (25 𝜇g/ml). H y O. Células pretratadas seis horas (6h) con la fracción alcaloidal
(cloroformo) de Z. rohifolium (25 𝜇g/ml) y expuestas a veintitrés horas (23 h) de PQ [1mM]. P. Diagrama de barras del porcentaje de células SH-SY5Y vivas resultantes del análisis usando anexina V y 7-AAD Q. Diagrama de barras del porcentaje de células SH-SY5Y marcadas con Bromuro de Etidio como Ros.
Tabla 4-2. Evaluación de la viabilidad celular, de células SH-SY5Y pretratadas durante 6 h y expuestas a PQ durante 23 h.
Histograma Extracto /Fracción
Concentración Concentración PQ %
células vivas
% ROS
A y I - - - 99,38 17,91
B y J - - 0,1mM 86,76 32,61
C y K - - 0,5mM 54,19 50,58
D y L - - 1mM 27,70 82,98
E y M GW3965 5𝜇M - 99,06 13,33
F y N GW3965 5𝜇M 0,5mM 65,82 23,40
G y Ñ Z. rohifolium 25𝜇g/ml - 98,72 30,99
H Y O Z. rohifolium 25𝜇g/ml 1mM 70,98 20,19
A modo de conclusión, se demostró que las fracciones o extractos Z. martinicense,
Nectandra sp. N. reticulata y Myristicaceae sp 1., tienen una acción neuroprotectora
frente a los radicales libres provocados por el PQ, en este trabajo no se llegó a
profundizar en los mecanismos exactos, sin embargo se sugiere que podría deberse
a cambios en niveles de expresión de proteínas reguladas por LXR, asociadas con
la respuesta o regulación de radicales libres que disminuyen sus efectos lesivos o
protegen la función mitocondrial. Adicionalmente se demostró en la evaluación
fitiquímica preliminar que estos extractos y fracciones tienen moléculas captadoras
118
de radicales libres y no se descarta la la presencia de moléculas inhibidoras de la
acción del PQ de forma directa.
En el caso del GW3965 y la fracción alcaloidal de Z. rohifolium, además de lo dicho
anteriormente, podríamos pensar que su efecto protector estaría asociado con la
modificación de la expresión de genes que podrían conferirle a la célula una mayor
resistencia los radicales libres generados por el PQ, ya que como es bien sabido, la
molécula de GW3965, al igual que todos los extractos evaluados en este capítulo
actúan como un agonista de los receptores nucleares LXRα y LXRβ, los cuales a su
ves actúan como factores de transcripcional, regulando la expresión de cientos de
genes.
Teniendo en cuenta que el estrés oxidativo se presenta con mayor facilidad en el
cerebro debido a que las neuronas se encuentran en fase post-mitótica,
adicionalmente tienen una alta demanda energética, consumiendo mayores
cantidades de oxígeno y tienen un potencial antioxidante insuficiente, por lo cual
fisiológicamente con el paso del tiempo se da una acumulación de ROS (Selkoe,
2001). Es de esperarse que en patologías como la EA se observen asociaciones
entre el estrés oxidativo y el aumento de Tau y Aβ, además de asociarse con otros
mecanismos que convergen en la perdida funcional y muerte neuronal característica
de la EA (Blanco-Ayala et al., 2014; Fukushima et al., 2002) (Yan et al., 2016)
(Cassidy et al., 2020). Los anteriores procesos fisiopatológicos resaltan la
importancia de encontrar agentes químicos incluyendo extractos y fracciones de
productos naturales como los encontrados en este trabajo de Z. martinicense,
Nectandra sp. N. reticulata y Myristicaceae sp.1 y Z. rohifolium, con potencial
farmacológico para el tratamiento de estas enfermedaes neurodegenerativas que
permitan contrarrestar los efectos de los radicales libres.
Como se mencionó en el capítulo 3, las moléculas responsables de esta actividad
antioxidante podrían tener un núcleo de tipo flavonoide o alcaloide principalmente,
119
con la capacidad de actuar en modelos in vitro. Para tener más certeza de esto y
con el fin de establecer el mecanismo de acción que tienen los extractos o
fracciones, se proyecta la aplicación de diferentes técnicas que permitan elucidar
con mayor seguridad y especificidad de los mecanismos de acción de estos.
Proponiendo la realización del fraccionamiento, purificación y reconocimiento de las
moléculas que puedan estar haciendo parte de estos extractos o fracciones,
información que podría ser usada con herramientas computacionales como el
docking molecular, para establecer posibles interacciones que puedan estar
implicadas con la disminución del impacto generado por el aumento de los radicales
libres, realizar western blot, RT-PCR, PCR, para establecer cambios en la
regulación genética, transcripcional y cambios postraduccionales que puedan estar
implicados, entre otras técnicas de evaluación en modelos in vivo e in vitro.
4.4.2 Neuroprotección inducida frente a la Ceramida
La C2-ceramida (C2) es una molécula de la familia de las ceramidas, conocida como
una ceramida de cadena corta al tener un redical acetilo en su estructura. Esta
molécula es habitualmente usada como agente citotóxico en cultivo celular teniendo
en cuenta su alta solubilidad en solución en relación con otras ceramidas. En la
ilustración 4-9 se muestran los resultados de los ensayos de neuroprotección contra
C2 de las fracciones alcaloidales o extractos de Z. rohifolium (ilustración 4-9 B),
Zanthoxylum sp. (ilustración 4-9 C), Nectandra sp. (ilustración 4-9 D) y
Myristicaceae sp (ilustración 4-9D), usados como pretratamiento por 1h.
Inicialmente, se estudió el efecto del agonista puro GW3965, se observó que el uso
de 0,05 𝜇M de GW3965 protegió significativamente la viabilidad celular contra 10
𝜇M de C2 (P <0,0001). Respecto a la fracción alcaloidal se observó que tanto 0,25
𝜇g/ml como 2,5 𝜇g/ml de Z. rohifolium protegió contra el efecto tóxico de 10 𝜇M de
C2 obteniendo un menor número de células muertas en comparación con control
tratado solo con C2 de manera estadísticamente significativa (P < 0,0001).
120
Por su parte, el tratamiento con 2,5 de 𝜇g/ml de la fracción alcaloidal de Zanthoxylum
sp. disminuyo significativamente el efecto de 10,0 𝜇M de C2 sobre la viabilidiad
celular (P < 0,0001). Así mismo el pretratamiento con 0,25 𝜇g/ml y 2,5 𝜇g/ml del
extracto etanólico de Nectandra sp. produjo un efecto protector frente a 10 𝜇M de
C2, evidenciando cambios estadisticamente significativos en el porcentaje de
células vivas entre las células tratadas en comparación con las células control
tratadas con el vehiculo (P < 0,0001). Finalmente, el tratamiento con 0,25 𝜇g/ml de
extracto de Myristicaceae sp. disminuyó la muerte celular de manera
estadísticamente significativa en comparación con las células expuestas a 10,0 𝜇M
de C2 (P < 0,0001).
121
122
Ilustración 4-9. Ensayo de neuroprotección evaluado por la variación de la actividad mitocondrial (MTT). A. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con GW3965 y expuestas a veintitrés horas (23 h) de Ceramida. B. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con el extracto de Z. rohifolium y expuestas a veintitrés horas (23 h) de Ceramida. C. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con el extracto de Zanthoxylum sp. y expuestas a veintitrés horas (23 h) de Ceramida. D. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con el extracto de Nectandra sp. y expuestas a veintitrés horas (23 h) de Ceramida. E. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con Myristicaceae sp. y expuestas a veintitrés horas (23 h) de Ceramida. Datos representados por la media y el error estándar de la media (SEM), análisis estadístico realizado por ANOVA de dos vías, donde se muestran diferencias significativas así: *(p≤0,05); **(p≤0,01); ***(p≤0,001); ****(p≤0,0001).
Por otro lado, en la ilustración 4-10, se muestran los resultados del efecto del
pretratamiento con la fracción alcaloidal de Zanthoxylum sp. (ilustración 4-10A) y el
extracto etanólico de N. reticulata (ilustración 4-10B). Se observó que el
pretratamiento con 2,5𝜇g/ml y 25𝜇g/ml del extracto alcaloidal de Zanthoxylum sp.
redujo de manera estadísticamente significativa el efecto tóxico de 20 𝜇M de C2
p=0,0014 y p=0,0037) Además, el pretratamienco con 0,25 𝜇g/ml y 2,5 𝜇g/ml del
extracto etanólico de N. reticulata también produjo un efecto neuroprotector frente
a 10 𝜇M de C2, disminuyendo de manera estadísticamente significativasu letalidad
(p=0,033 y p=0,0140).
123
Ilustración 4-10. Ensayo de neuroprotección evaluado por la variación de la actividad mitocondrial (MTT). A. Células SH-SY5Y pretratadas durante seis horas (6h) con el extracto de Zanthoxylum sp. y expuestas a veintitrés horas (23 h) de Ceramida. B. Células SH-SY5Y pretratadas durante seis horas (6h) con el extracto de N. reticulata y expuestas a veintitrés horas (23 h) de Ceramida. Datos representados por la media y el error estándar de la media (SEM), análisis estadístico realizado por ANOVA de dos vías, donde se muestran diferencias significativas así: *(p≤0,05); **(p≤0,01); ***(p≤0,001); ****(p≤0,0001).
En la ilustración 4-11, se encuentran los histogramas y gráficas de barras de las
citometrías de flujo de los experimentos con Anexina V y 7AAD en la línea celular
SH-SY5Y expuesta a C2. Se observa que las células tratadas con diferentes
concentraciones de C2 tienen un efecto iductor de la apoptosis dosis dependiente,
encontrando que las dosis de 2, 10 y 20 𝜇M de C2, producen mayores porcentajes
de muerte celular 25,75%, 70,09% y 96,85% respectivamente (Ilustración 4-11 B-
D). Por otro lado, como se observó anteriormente, los extractos o fracciones
124
alcaloidales no tienen efecto sobre la viabilidad celular a las concentraciones de
trabajo.
A continuación, se usó un pretratamiento de GW3965 de 1 hora, las fracciones
alcaloidales de Z. rohifolium y Zanthoxylum sp y los extractos etanólicos de
Nectandra sp. y Myristicaceae sp., posteriormente, las células fueron expuestas al
efecto tóxico de 10 𝜇M de C2, dando como resultado una disminución del efecto
tóxico de C2, disminuyendo el porcentaje de letalidad hasta un 41%. Confirmando
de esta manera el efecto neuroprotector evidenciado mediante el ensayo de MTT
(Tabla 4-3).
125
126
Ilustración 4-11. Evaluación de la capacidad neuroprotectora frente a ceramida. A-N. Histogramas de células SH-SY5Y vivas, apoptóticas teñidas con anexina V y necróticas teñidas con 7-AAD. A. Células control, cultivadas con vehículo. B. Células expuestas a 2 𝜇M C2 durante 23 h. C. Células expuestas a 10 𝜇M de C2 durante 23 h. D. Células
expuestas a C2 [20𝜇M] durante veintitrés horas (23h). E. Células SH-SY5Y tratadas durante
veinticuatro horas (24 h) con GW3965 [0,05mM]. F. Células SH-SY5Y pretratadas durante
una hora (1h) con GW3965 [0,05mM] y expuestas a veintitrés horas (23 h) de C2 [10𝜇M].
G. Células SH-SY5Y tratadas durante veinticuatro horas (24 h) con la fracción alcaloidal (cloroformo) de Z. rohifolium (0,25𝜇g/ml). H. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con la fracción alcaloidal (cloroformo) de Z. rohifolium (0,25𝜇g/ml) y expuestas a veintitrés horas (23 h) de C2 [10uM]. I. Células SH-SY5Y tratadas veinticuatro horas (24 h) con el extracto alcaloidal (acuoso) de Zanthoxylum sp. (2,5𝜇g/ml) recolectado.J. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con el extracto alcaloidal (acuoso) de
Zanthoxylum sp. (2,5𝜇g/ml) y expuestas a veintitrés horas (23 h) de C2 [10𝜇M]. K. Células
SH-SY5Y tratadas veinticuatro horas (24 h) con extracto etanólico de Nectandra sp. (2,5 𝜇g/ml). L. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con extracto etanólico de
Nectandra sp. (2,5𝜇g/ml). y expuestas a veintitrés horas (23 h) de C2 [10𝜇M]. M. Células
SH-SY5Y tratadas veinticuatro horas (24 h) con extracto etanólico de Myristicaceae sp. 2 (0.25 𝜇g/ml). N. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con extracto etanólico
de Myristicaceae sp.2 (0,25𝜇g/ml) y expuestas a veintitrés horas (23 h) de C2 [10𝜇M]. O.
Diagrama de barras del porcentaje de células SH-SY5Y vivas resultantes del análisis usando anexina V y 7-AAD.
Por otra parte, el pretratamiento de 6 h con el extracto alcaloidal de Zanthoxylum
sp. disminuyó el efecto de 20 𝜇M de C2 un 57,42% en comparación con el control
de células expuestas únicamente a C2. De la misma forma, el pretratamiento de 6
h de N. reticulata aumentó la viabilidad celular un 26,03% rn comparación con el
tratamiento control tratado con C2.
127
Ilustración 4-12.Evaluación de la capacidad neuroprotectora frente a ceramida por citometría de flujo. A-N. Histogramas de células SH-SY5Y vivas, apoptóticas teñidas con
128
anexina V y necróticas teñidas con 7-AAD. Nota: los tratamientos que fueron usados en la línea celular antes de su marcación y lectura fueron: A. Células control, cultivadas con
vehículo. B. Células expuestas a C2 [2𝜇M] durante veintitrés horas (23h). C. Células
expuestas a C2 [10𝜇M] durante veintitrés horas (23h). D. Células expuestas a C2 [20𝜇M]
durante veintitrés horas (23h). E. Células SH-SY5Y tratadas veintinueve horas (29 h) con el extracto alcaloidal (acuoso) de Zanthoxylum sp. F. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con el extracto alcaloidal (acuoso) de Zanthoxylum sp. y expuestas a veintitrés
horas (23 h) de C2 [10𝜇M]. G. Células SH-SY5Y tratadas veintinueve horas (29 h) con
extracto etanólico de N. reticulata (2,5𝜇g/ml).H. Células SH-SY5Y pretratadas durante una hora (1h) con extracto etanólico de N. reticulata (2,5𝜇g/ml) y expuestas a veintitrés horas
(23 h) de C2 [10𝜇M].I. Diagrama de barras del porcentaje de células SH-SY5Y vivas
resultantes del análisis usando anexina V y 7-AAD.
Tabla 4-3. Evaluación de la viabilidad celular, de células SH-SY5Y pretratadas durante 6 h y expuestas a C2 23h.
Grafica Histograma Extracto /Fracción Concentració
n Pretratamiento (h) C2
% células vivas
10
A - - - - 99,38
B - - - 2 𝜇M 74,35
C - - - 10 𝜇M 29,91
D - - - 20 𝜇M 3,15
E GW3965 0,05 mM - - 99,06
F GW3965 0,05 mM 1 10 𝜇M 61,64
G Z. rohifolium 0,25 𝜇g/ml - - 96,72
H Z. rohifolium 0,25 𝜇g/ml 1 10 𝜇M 46,72
I Zanthoxylum sp. 2,5 𝜇g/ml - - 99,38
J Zanthoxylum sp. 2,5 𝜇g/ml 1 10 𝜇M 71,66
K Nectandra sp. 2,5 𝜇g/ml - - 92,01
L Nectandra sp. 2,5 𝜇g/ml 1 10 𝜇M 46,34
M Myristicaceae sp. 0,25 𝜇g/ml - - 72,22
N Myristicaceae sp. 0,25 𝜇g/ml 1 10 𝜇M 40,54
11
E Zanthoxylum sp 0,25 𝜇g/ml - - 99,38
F Zanthoxylum sp 0,25 𝜇g/ml 1 20 𝜇M 60,57
G N. reticulata 2,5 𝜇g/ml - - 97,27
H N. reticulata 2,5 𝜇g/ml 1 10 𝜇M 55,94
Acorde con los resultados, la fracción alcaloidal de Zanthoxylum sp. mostró los
mejores resultados, ya que, protege a las células a altas concentraciones 10 𝜇M y
129
20 𝜇M de C2. Adicionalmente, la fracción alcaloidal de Z. rohifolium y los extractos
etanólicos de Nectandra sp., N. reticulata y Myristicaceae sp.1 mostraron un efecto
neuroprotector frente a concentraciones tóxicas de C2. Lo que puede deberse a
diferentes factores que deben estudiarse en posteriores estudios en detalle. Sin
embargo teniendo en cuenta la evidencia científica alrededor del mecanismo de
acción citotóxico de ejercido por la ceramida en neuronas como agente inductor de
muerte celular, se sugiere que dentro de los componentes de estas fracciones o
extractos podrían estar moléculas que estan ejerciendo su efecto neuroprotector
como consecuencia de la activación de vías de señaización PI3K/AKT y MAPK así
como producto de la actividad del receptor nuclear LXRβ a traves de promover la
integridad y función mitocondrial (Arboleda et al., 2009; Chaurasia & Summers,
2015; Cruciani-Guglielmacci et al., 2017; Jazvinšćak Jembrek et al., 2015).
4.4.3 Neuroprotección inducida frente a la exitotoxicidad del Glutamato
En la ilustración 4-13, se muestran los resultados de las células SH-SY5Y
pretratadas durante 6 h con el extracto de Z. rhoifolium y expuestas 18 h con
diferentes concentraciones de glutamato. Encontrando que la fracción alcaloidal de
Z. rohifolium a concentraciones de 2,5𝜇g/ml y 25𝜇g/ml tiene un efecto protector de
la supervivencia celular frente a concentraciones de 150 mM y 200 mM de glutamato
(p = 0,0041 y p = 0,0007).
Para comprender el mecanismo molecuar con exactitud con el cual la fracción
alcaloidal de Z. rhoifolium ejerce su efecto neuroprotector se requieren de mayores
estudios, sin embargo teniendo en cuenta el conocimiento de otras moléculas que
tienen efectos neuroprotectores frente a la exitotoxicidad del glutamato se sugiere
que el extracto podría presentar a) moléculas con actividad quelante del calcio que
disminuyen su concentración como el EDTA, dimercaprol, succímero y penicilamina
(Pulley and Berger,2003), b) agentes bloqueadores de los receptores de glutamato
130
como el receptor de NMDA, los cuales son inhibidores de la interacción del
glutamato como la memantina (C. G. Parsons et al., 2017),c) o moléculas
antioxidantes que disminuyen el impacto tóxico del glutamato como se evidenció
con las moléculas de vinpocetina, vitamina E e idebenona (Miyamoto et al., 1989).
Trabajos previos realizados en otros grupos de investigación usando en la línea
celular SH-SY5Y, mostraron que las concentraciones de glutamato necesarias para
para producir un efecto citotóxico son elevadas; usando 80mM durante 48 h para el
LD50 en células diferenciadas en comparación con las usadas en células de cultivo
primario de neuronas, iguales a 20-50µm (Nampoothiri et al., 2014). Esto puede
131
deberse a una menor presencia de receptores de glutamato en la superficie de las
células de neuroblastoma diferenciadas.
G lu ta m a to [m M ]
% V
iab
ilid
ad
ce
lula
r (
MT
T)
0100
150
200
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
1 5 0 c o n tro l d e G lu ta m a to
Z . ro h ifo liu m (0 .2 5 u g /m l)
Z . ro h ifo liu m (2 .5 u g /m l)
Z . ro h ifo liu m (2 5 u g /m l)
*
**
Ilustración 4-13. Ensayo de MTT. Células SH-SY5Y pre-tratadas durante 6 h con la facción
de Z. rhoifolium. y 18 h de Glutamato. Datos representados por la media y el error estándar
de la media (SEM), análisis estadístico realizado por ANOVA de dos vías, donde se
muestran diferencias significativas así: *(p≤0,0174); **(p≤0,0007).
Respecto a las diferencias encontradas los resultados de neuroprotección entre los
pretratamientos de 1 h y 6 h, se deben principalmente a que los mecanismos son
de corto o de largo plazo. Los mecanismos de corto plazo se refieren principalmente
a cambios en proteínas preexistentes que serian predominantes a 1 h de
132
pretratamiento, estos se asocian a la modificación postranscripcional de proteínas
que hacen parte de vías de supervivencia celular y de acción antioxidante. Por su
parte los efectos encontrados en los pretratamientos por 6h, implican los
mecanismos de corto y largo plazo que implican cambios de expresión de genes
que estarían asociados a la supervivencia celular. Teniendo en cuenta esto, es
interesante resaltar que, en los resultados obtenidos, se encontró un mayor efecto
protector en pretratamientos de una hora, implicando así que los extractos podrían
estar asociados con cambios postranscripcionales, y que además podrían tener
efectos en la expresión génica al encontrar extractos que también demostraron un
efecto protector después de las 6 horas de pretratamiento.
Otro factor que podría estar asociado con el efecto protector es la farmacocinética
que tengan los compuestos de los extractos o fracciones, los cuales son
desconocidos, pero que seguramente podrían insidir en el mecanismo de protección
conferido por estos. Encontrando, que extractos que muestran un efecto protector
con 1h de pretratamiento, pero no con 6h, podrían tener una cinética que permite
su acción por periodos de tiempo mas cortos y no es posible evidenciar su efecto.
En este trabajo se ha recolectado por medio de diferentes ensayos experimentales,
las fracciones y extractos de las plantas actividad agonista LXRβ, las cuales de
acuerdo con la evidencia tienen moléculas con núcleos de alcaloides y flavonoides
con un elevado potencial para el tratamiento de la EA. Teniendo en cuenta que en
este trabajo se demuestra que son en su mayoría agentes químicos
neuroprotectores en contextos tóxicos bien conocidos, regulando enzimas
involucradas en la homeostasis de la acetilcolina, disminuyendo el efecto de los
radicales libres y el efecto de la exposición a ceramida (Ilustración 4-14). Nuestros
hallazgos son respaldados por diferentes trabajos, que corroboran la potencialidad
de estos núcleos químicos de reducir la progresión de las enfermedades
133
neurodegenerativas. (Gao et al., 2008; Ibarra Estrada et al., 2011; Paula et al., 2019;
E. Plazas et al., 2019; Uddin et al., 2020).
Los efectos de los flavonoides en las enfermedades neurodegenerativas se han
asociado con diferentes acciones en el cerebro, vinculándose con mecanismos que
permiten mejorar el estado no solo de células neuronales, sino células gliales,
además, los flavonoides pueden prevenir disfunciones neuronales y aumentar la
regeneración neuronal (Cai, 2016; Kwon, 2017; Zelcer et al., 2007). Algunos de los
flavonoides con un efecto reductor de la agregación de Aβ, TAU, neuroinflamacion
y daño mitocondrial, entre otros, en diferentes modelos de EA son: quercetina,
naringina, naringenina, epicatenina, catequina, luteonina, diosmina, wogonina, etc.
(Fouache et al., 2019; Huang, 2014; Mir et al., 2019; Paula et al., 2019). Sumado a
esto, se han encontrado flavonoides que tienen un efecto inhibitorio de AChE, lo
cual podría explicar el efecto observado previamente (Barbosa Filho et al., 2006;
Uddin et al., 2020).
El efecto neuroprotector de los flavonoides y alcaloides puede estar vinculado a
múltiples vías. Teniendo en cuenta publicaciones previas, estos metabolitos
secundarios podrían unirse a receptores de tirosina quinasa B (TrkB), acetilcolina
nicotínica, opioides, GABAA, adenosina, testosterona o de estrógeno (Uddin et al.,
2020) o interactual con con muchas cascadas de señalización, dentro de las cuales
se encuentra las vias MAPK, Activación de CREB, via NFκ-β – PKC, PI3K/AKT, a
receptores nucleares LXR (Uddin et al., 2020). Así mismo, los alcaloides se han
asociado con mecanismos de neuroprotección que muestran su efecto como
agentes inhibitorios de AChE, actividad antioxidante y antiagregante del péptido Aβ
(E. Plazas et al., 2019).
Teniendo en cuenta, los resultados presentados en este trabajo, los extractos y
fracciones alcaloidales seleccionadaos ofrecen múltiples beneficios para el
tratamiento de la EA, por lo que se proyectan como potenciales fuentes de
134
moléculas que posiblemente actúan de manera sinérgica en diferentes dianas a la
vez y a los cuales se les deben ser sujetos a mayor investigación para determinar
los mecanismos de acción.
Ilustración 4-14. Resumen de resultados. En esta ilustración es posible encontrar la síntesis de este trabajo, partiendo por 82 extractos de preocuctos naturales vegetales colectadas en Colombia. Inicialmente se determinaron las concentraciones de trabajo usando la técnica de MTT, seguido con la evaluación de la actividad agonista sobre LXRβ, por medio del ensayo de gen reportero. En este punto se determinó que 10 de los extractos evaluados activaron significativamente a LXRβ comparado con el vehículo, teniendo en cuenta lo anterior se continuó con la evaluación del potencial efecto terapéutico de los extractos por medio de la evaluación de la actividad inhibitoria de AChE usando ensayos de bioautografía y en placa, actividad antioxidante con de ensayos de bioautografía, ensayo en tubo y
135
exposición de células a paraquat, actividad protectora frente a ceramida y glutamato por medio de la exposicion de las células a concentraciones toxicas de ceramida y glutamato. Finalmente, en la grafica es posible encontrar los nombres de los extractos que produjeron los mejores resultados en cada una de las evaluaciones realizadas. Como conclusión se menciona que todos los extractos o fracciones alcaloidales seleccionados preliminarmente por la activación de LXR presentan otros efectos protectores frente a diferentes contextos tóxicos identificados en la EA, por lo que pueden ser usados como potenciales fármacos con una acción multidiana en enfermedades complejas como la EA.
5. Conclusiones
Se evaluó la actividad agonista de LXRβ de 81 extractos y fracciones vegetales, de
los cuales, se reportan por primera ves 10 de ellos con actividad actividad agonistas;
Z. martinicense, Zanthoxylum sp. Z. caribaeum, Z. rohifolium, Myristicaceae sp., N.
reticulata, N. membranácea y Nectandra sp.
Producto del tamizaje realizado con 81 extractos, se seleccionaron 8 extractos; Z.
martinicense, Zanthoxylum sp. Z. rohifolium, N. reticulata, N. membranácea,
Nectandra sp., Myristicaceae sp. 1 y Myristicaceae sp. 2, reportando que presentan
actividad neuroprotectora in vitro frente al PQ asicuado a actividad captadora de
radicales libres por la presencia de núcleos alcaloidales y flavonoides.
Se encontró que los extractos etanólicos de Miriticaceae sp. y las fracciones
alcaloidales de Z. rhoifolium, Z. martinicense y Zanthoxylum sp., presentan actividad
inhibitoria de AChE, probablemente por la existencia de núcleos alcaloidales.
Se reporta por primera ves que las fracciones alcaloidales de Zanthoxylum sp. y Z.
rohifolium, junto con los extractos etanólicos de Nectandra sp. y Myristicaceae sp.
2 reducen el efecto citotóxico de la ceramida en células SH-SY5Y.
Se reporta por primera ves que la fracción alcaloidal de Z. rohifolium, disminuye el
efecto tóxico de concentraciones altas de glutamato.
136
En conjunto los resultados permiten concluir que los extractos y fracciones tienen
un elevado potencial terapéutico frente a las enfermedades neurodegenerativas, en
particular la enfermedad de Alzheimer, lo cual sugiere el uso de modelos animales
para demostrar su potencial.
6. Recomendaciones
A lo largo del presente documento fue posible encontrar el potencial terapéutico
presentado por 8 extractos naturales, que mostraron tener un efecto terapéutico en
diferentes dianas terapéuticas clásicamente evaluadas para la EA y principalmente
en el efecto agonista sobre los RN LXRβ, es por esto que se recomienda continuar
con la búsqueda de las moléculas responsables de esta actividad y adicionalmente
realizar pruebas en otros modelos celulares y animales, como es el caso del cultivo
de células de cultivo primario y el uso de modelos animales como el 3XTg-AD que
son ampliamente utilizados, para establecer si los extractos o los componentes que
presentan logran atravesar la barrera hematoencefálica y tener efectos positivos a
nivel de aprendizaje, en pruebas de comportamiento y en mejorar el desarrollo
patológico de la enfermedad. Todo esto enfocado en la búsqueda de un
fitofarmacéutico que pueda tener un efecto multidiana en la EA.
Por otro lado, se sugiere en el caso de la evaluación del efecto exitotóxico del
glutamato que se realice en un modelo de cultivo primario de células neuronales o
137
tejido fresco de cerebro de ratón por técnicas inmunohistoquímicas o de
electrofisiología, buscando de esta forma centrar el trabajo en los mecanismos de
plasticidad sináptica, ya que el estudio de estas variaciones utilizando técnicas
como el MTT que es una medida indirecta de la viabilidad celular, y podrían verse
afectadas por otros procesos que se generen en la célula, como la apertura de
canales de calcio o cambio en el comportamiento de las mitocondrias por la
presencia del glutamato.
7. Bibliografía
Abo, K. A., Fred-Jaiyesimi, A. A., & Jaiyesimi, A. E. A. (2008). Ethnobotanical studies of medicinal plants used in the management of diabetes mellitus in South Western Nigeria. Journal of Ethnopharmacology, 115(1), 67–71. https://doi.org/10.1016/j.jep.2007.09.005
Ahmad, S., Ullah, F., Sadiq, A., Ayaz, M., Imran, M., Ali, I., Zeb, A., Ullah, F., & Shah, M. R. (2016). Chemical composition, antioxidant and anticholinesterase potentials of essential oil of Rumex hastatus D. Don collected from the North West of Pakistan. BMC Complementary and Alternative Medicine, 16(1), 1–11. https://doi.org/10.1186/s12906-016-0998-z
Alberdi, E., Sánchez-Gómez, M. V., Cavaliere, F., Pérez-Samartín, A., Zugaza, J. L., Trullas, R., Domercq, M., & Matute, C. (2010). Amyloid β oligomers induce Ca2+ dysregulation and neuronal death through activation of ionotropic glutamate receptors. Cell Calcium, 47(3), 264–272. https://doi.org/10.1016/j.ceca.2009.12.010
Albert, M. S., DeKosky, S. T., Dicksond, D., Dubois, B., Feldmanf, H. H., Fox, N. C., Gamst, A., Holtzman, D. M., Jagust, W. J., Petersen, R. C., Snyder, P. J., Carrillo, M. C., Thies, B., & Phelps, C. H. (2011). The diagnosis of mild cognitive impairment due to Alzheimer’s disease: Recommendations from the National Institute on Aging- Alzheimer’s Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer’s disease Marilyn. Journal of Alzheimer’s Dement, 7(3), 270–279. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2011.03.008.The
Andersson, S., Gustafsson, N., Warner, M., & Gustafsson, J.-A. (2005). Inactivation of liver X receptor leads to adult-onset motor neuron degeneration in male mice. Proceedings of the National Academy of Sciences, 102(10), 3857–3862. https://doi.org/10.1073/pnas.0500634102
138
Apfel, R., Benbrook, D., Lernhardt, E., Ortiz, M. A., Salbert, G., & Pfahl, M. (1994a). A novel orphan receptor specific for a subset of thyroid hormone-responsive elements and its interaction with the retinoid/thyroid hormone receptor subfamily. Molecular and Cellular Biology, 14(10), 7025–7035. https://doi.org/10.1128/MCB.14.10.7025
Apfel, R., Benbrook, D., Lernhardt, E., Ortiz, M. A., Salbert, G., & Pfahl, M. (1994b). A novel orphan receptor specific for a subset of thyroid hormone-responsive elements and its interaction with the retinoid/thyroid hormone receptor subfamily. Molecular and Cellular Biology, 14(10), 7025–7035. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7892230
Arboleda, G., Morales, L. C., Benítez, B., & Arboleda, H. (2009). Regulation of ceramide-induced neuronal death: Cell metabolism meets neurodegeneration. Brain Research Reviews, 59(2), 333–346. https://doi.org/10.1016/j.brainresrev.2008.10.001
Ashford, J. W., Sherman, K. A., & Kumar, V. (1989). Advances in Alzheimer therapy: Cholinesterase inhibitors. Neurobiology of Aging, 10(1), 99–105. https://doi.org/10.1016/S0197-4580(89)80017-X
Association, A. (2020). World Alzheimer Report 2019. In Alzheimer’s & Dementia (Vol. 16, Issue 3). https://doi.org/10.1002/alz.12068
Atanasov, A. G., Waltenberger, B., Pferschy-Wenzig, E. M., Linder, T., Wawrosch, C., Uhrin, P., Temml, V., Wang, L., Schwaiger, S., Heiss, E. H., Rollinger, J. M., Schuster, D., Breuss, J. M., Bochkov, V., Mihovilovic, M. D., Kopp, B., Bauer, R., Dirsch, V. M., & Stuppner, H. (2015). Discovery and resupply of pharmacologically active plant-derived natural products: A review. Biotechnology Advances, 33(8), 1582–1614. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2015.08.001
Atta-ur-Rahman, & Choudhary, M. I. (2001). Bioactive natural products as a potential source of new pharmacophores. A theory of memory. Pure and Applied Chemistry, 73(3), 555–560. https://doi.org/10.1351/pac200173030555
Azevedo, N. R., Santos, S. C., Miranda, E. G. D. E., Ferri, P. H., Quimica, I. De, Federal, U., Goi, D., & Samambaia, C. (1997). A 2-ACYLCYCLOHEXANE-1,3-DIONE FROM VIROLA OLEIFERA NEUCiRIO. 30, 1375–1377.
Báez-Becerra, C., Filipello, F., Sandoval-Hernández, A., Arboleda, H., & Arboleda, G. (2018). Liver X Receptor Agonist GW3965 Regulates Synaptic Function upon Amyloid Beta Exposure in Hippocampal Neurons. Neurotoxicity Research, 33(3), 569–579. https://doi.org/10.1007/s12640-017-9845-3
Bales, K. R., Du, Y., Holtzman, D., Cordell, B., & Paul, S. M. (n.d.). Neuroinflammation and Alzheimer’s disease: critical roles for cytokine/Abeta-induced glial activation, NF-kappaB, and apolipoprotein E. Neurobiology of Aging, 21(3), 427–432; discussion 451-3.
Barbosa Filho, J. M., Medeiros, K. C. P., Diniz, M. de F. F. M., Batista, L. M., Athayde-Filho, P. F., Silva, M. S., Cunha, E. V. L. da, Almeida, J. R. G. S., & Quintans-Júnior, L. J. (2006). Natural products inhibitors of the enzyme acetylcholinesterase. Revista Brasileira de Farmacognosia, 16(2), 258–285. https://doi.org/10.1590/s0102-695x2006000200021
Bartus, R., Dean, R., Beer, B., & Lippa, A. (1982). The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science, 217(4558), 408–414. https://doi.org/10.1126/science.7046051
Bartus, R. T., & Johnson, H. R. (1976). Short-term memory in the rhesus monkey: Disruption from the anti-cholinergic scopolamine. Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 5(1), 39–46. https://doi.org/10.1016/0091-3057(76)90286-0
Beaven, S. W., & Tontonoz, P. (2006). Nuclear Receptors in Lipid Metabolism: Targeting the Heart of Dyslipidemia. Annual Review of Medicine, 57(1), 313–329. https://doi.org/10.1146/annurev.med.57.121304.131428
Bernard, C., Helmer, C., Dilharreguy, B., Amieva, H., Auriacombe, S., Dartigues, J. F., Allard, M., & Catheline, G. (2014). Time course of brain volume changes in the preclinical phase of Alzheimer’s disease. Alzheimer’s and Dementia, 10(2), 143-151.e1. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2013.08.279
Berridge, M. J. (2010). Calcium hypothesis of Alzheimer’s disease. Pflugers Archiv European Journal of Physiology, 459(3), 441–449. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0736-1
Bezprozvanny, I., & Mattson, M. P. (2008). Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences, 31(9), 454–463. https://doi.org/10.1016/j.tins.2008.06.005
Binder, L. I., Frankfurter, A., & Rebhun, L. I. (1985). The distribution of tau in the mammalian central nervous central nervous. Journal of Cell Biology, 101(4), 1371–1378. https://doi.org/10.1083/jcb.101.4.1371
Blanco-Ayala, T., Andérica-Romero, A. C., & Pedraza-Chaverri, J. (2014). New insights into antioxidant strategies against paraquat toxicity. Free Radical Research, 48(6), 623–640. https://doi.org/10.3109/10715762.2014.899694
Bottino, C. M., Carvalho, I. A., Alvarez, A. M. M., Avila, R., Zukauskas, P. R., Bustamante, S. E., Andrade, F. C., Hototian, S. R., Saffi, F., & Camargo, C. H. (2005). Cognitive rehabilitation combined with drug treatment
139
in Alzheimer’s disease patients: a pilot study. Clinical Rehabilitation, 19(8), 861–869. https://doi.org/10.1191/0269215505cr911oa
Bourguet, W., Vivat, V., Wurtz, J. M., Chambon, P., Gronemeyer, H., & Moras, D. (2000). Crystal structure of a heterodimeric complex of RAR and RXR ligand-binding domains. Molecular Cell, 5(2), 289–298. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10882070
Bramlett, K. S., Houck, K. A., Borchert, K. M., Dowless, M. S., Kulanthaivel, P., Zhang, Y., Beyer, T. P., Schmidt, R., Thomas, J. S., Michael, L. F., Barr, R., Montrose, C., Eacho, P. I., Cao, G., & Burris, T. P. (2003). A natural product ligand of the oxysterol receptor, liver X receptor. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 307(1), 291–296. https://doi.org/10.1124/jpet.103.052852
Bu, G. (2009). Apolipoprotein e and its receptors in Alzheimer’s disease: Pathways, pathogenesis and therapy. Nature Reviews Neuroscience, 10(5), 333–344. https://doi.org/10.1038/nrn2620
Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., & Hof, P. R. (2000). Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Research Reviews, 33(1), 95–130. https://doi.org/10.1016/S0165-0173(00)00019-9
Bus, J. S., Aust, S. D., & Gibson, J. E. (1974). Superoxide- and singlet oxygen-catalyzed lipid peroxidation as a possible mechanism for paraquat (methyl viologen) toxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications, 58(3), 749–755. https://doi.org/10.1016/S0006-291X(74)80481-X
Butterfield, D. A., & Lauderback, C. M. (2002). Lipid peroxidation and protein oxidation in Alzheimer’s disease brain: potential causes and consequences involving amyloid β-peptide-associated free radical oxidative stress 1,2 1Guest Editors: Mark A. Smith and George Perry 2This article is part of a ser. Free Radical Biology and Medicine, 32(11), 1050–1060. https://doi.org/10.1016/S0891-5849(02)00794-3
C. Cárdenas-Aguayo, M. del, C. Silva-Lucero, M. del, Cortes-Ortiz, M., Jimnez-Ramos, B., Gmez-Virgilio, L., Ramrez-Rodrguez, G., Vera- Arroyo, E., Fiorentino-Prez, R., Garca, U., Luna-Muoz, J., & A. Meraz Ros, M. (2014). Physiological Role of Amyloid Beta in Neural Cells: The Cellular Trophic Activity. In Neurochemistry. InTech. https://doi.org/10.5772/57398
Cabrera Martinez, X. A., & Suarez, L. E. C. (2019). METABOLITOS SECUNDARIOS OBTENIDOS DE LA FAMILIA MYRISTICACEAE QUE PRODUCEN INHIBICIÓN ENZIMÁTICA Y ACTIVIDAD BIOLÓGICA.
Cai, Z. (2016). Role of berberine in Alzheimer ’ s disease. 2509–2520. Calderón, E., Cogollo, Á., Velásquez-rúa, C., Velásquez-, C., M., S.-G., García, N., & Toro, J. L. (2007). Libro
rojo de plantas de Colombia: magnoliáceas, miristicáceas y podocapáceas. Carpentier, M., Robitaille, Y., DesGroseillers, L., Boileau, G., & Marcinkiewicz, M. (2002). Declining Expression
of Neprilysin in Alzheimer Disease Vasculature: Possible Involvement in Cerebral Amyloid Angiopathy. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 61(10), 849–856. https://doi.org/10.1093/jnen/61.10.849
Cassidy, L., Fernandez, F., Johnson, J. B., Naiker, M., Owoola, A. G., & Broszczak, D. A. (2020). Oxidative stress in alzheimer’s disease: A review on emergent natural polyphenolic therapeutics. Complementary Therapies in Medicine, 49, 102294. https://doi.org/10.1016/j.ctim.2019.102294
Charlotte M. Taylor, W. D. Á. (2000). Biota Colombiana 1 (1), 2000 Taylor y Devia 106- Myristicacea del Valle del Cauca, Colombia La Familia de Árboles Tropicales Myristicaceae en el Departamento del Valle del Cauca, Colombia. Biota Colombiana, 1(1), 106–108.
Chaurasia, B., & Summers, S. A. (2015). Ceramides - Lipotoxic Inducers of Metabolic Disorders. Trends in Endocrinology and Metabolism, 26(10), 538–550. https://doi.org/10.1016/j.tem.2015.07.006
Chen, G. F., Xu, T. H., Yan, Y., Zhou, Y. R., Jiang, Y., Melcher, K., & Xu, H. E. (2017). Amyloid beta: Structure, biology and structure-based therapeutic development. Acta Pharmacologica Sinica, 38(9), 1205–1235. https://doi.org/10.1038/aps.2017.28
Choi, D. W. (1988). Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron, 1(8), 623–634. https://doi.org/10.1016/0896-6273(88)90162-6
Citron, M., Diehl, T. S., Gordon, G., Biere, A. L., Seubert, P., & Selkoe, D. J. (1996). Evidence that the 42- and 40-amino acid forms of amyloid protein are generated from the -amyloid precursor protein by different protease activities. Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(23), 13170–13175. https://doi.org/10.1073/pnas.93.23.13170
Clejan, L., & Cederbaum, A. I. (1989). Synergistic interactions between nadph-cytochrome P-450 reductase, paraquat, and iron in the generation of active oxygen radicals. Biochemical Pharmacology, 38(11), 1779–1786. https://doi.org/10.1016/0006-2952(89)90412-7
Cochemé, H. M., & Murphy, M. P. (2008). Complex I is the major site of mitochondrial superoxide production by paraquat. Journal of Biological Chemistry, 283(4), 1786–1798. https://doi.org/10.1074/jbc.M708597200
Coe, F. G., & Anderson, G. J. (1996). Screening of medicinal plants used by the Garífuna of Eastern Nicaragua for bioactive compounds. Journal of Ethnopharmacology, 53(1), 29–50. https://doi.org/10.1016/0378-
140
8741(96)01424-9 Committee, N. R. N. (1999). A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Superfamily. Cell, 97(2),
161–163. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)80726-6 Cruciani-Guglielmacci, C., López, M., Campana, M., & le Stunff, H. (2017). Brain ceramide metabolism in the
control of energy balance. Frontiers in Physiology, 8(OCT), 1–8. https://doi.org/10.3389/fphys.2017.00787 Cuca, L. E., & Taborda, M. E. (2008). METABOLITOS AISLADOS DE Zanthoxylum rhoifolium. Revista
Colombiana de Química, 36(1), 5–11. Cutler, R. G., Kelly, J., Storie, K., Pedersen, W. A., Tammara, A., Hatanpaa, K., Troncoso, J. C., & Mattson, M.
P. (2004a). Involvement of oxidative stress-induced abnormalities in ceramide and cholesterol metabolism in brain aging and Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences, 101(7), 2070–2075. https://doi.org/10.1073/pnas.0305799101
Cutler, R. G., Kelly, J., Storie, K., Pedersen, W. A., Tammara, A., Hatanpaa, K., Troncoso, J. C., & Mattson, M. P. (2004b). Involvement of oxidative stress-induced abnormalities in ceramide and cholesterol metabolism in brain aging and Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences, 101(7), 2070–2075. https://doi.org/10.1073/pnas.0305799101
Czubowicz, K., Wójtowicz, S., Wencel, P. L., & Strosznajder, R. P. (2018). The role of ceramide and SEW 2871 in the transcription of enzymes involved in amyloid β precursor protein metabolism in an experimental model of Alzheimer’s disease. Folia Neuropathologica, 56(3), 196–205. https://doi.org/10.5114/fn.2018.78700
Dani, M., Wood, M., Mizoguchi, R., Fan, Z., Edginton, T., Hinz, R., Win, Z., Brooks, D. J., & Edison, P. (2019). Tau Aggregation Correlates with Amyloid Deposition in Both Mild Cognitive Impairment and Alzheimer’s Disease Subjects. Journal of Alzheimer’s Disease, 70(2), 455–465. https://doi.org/10.3233/JAD-181168
Datta, P. K. (2013). Neuronal Cell Culture. Neuronal Cell Culture: Methods and Protocols, 1078, 35–44. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-640-5
Dengiz, C., Prange, C., Gawel, P., Trapp, N., Ruhlmann, L., Boudon, C., & Diederich, F. (2016). Push–pull chromophores by reaction of 2,3,5,6-tetrahalo-1,4-benzoquinones with 4-(N,N-dialkylanilino)acetylenes. Tetrahedron, 72(9), 1213–1224. https://doi.org/10.1016/j.tet.2016.01.017
Deutsch, J. A. (1971). The Cholinergic Synapse and the Site of Memory. Science, 174(4011), 788–794. https://doi.org/10.1126/science.174.4011.788
Dighe, S. N., Mora, E. De, Chan, S., Kantham, S., Mccoll, G., Miles, J. A., Veliyath, S. K., Sreenivas, B. Y., Nassar, Z. D., Silman, I., Sussman, J. L., Weik, M., Mcgeary, R. P., Parat, M., Brazzolotto, X., & Ross, B. P. (2019). Rivastigmine and metabolite analogues with putative Alzheimerâ€TMs disease-modifying properties in a Caenorhabditis elegans model. Communications Chemistry. https://doi.org/10.1038/s42004-019-0133-4
Dreses-Werringloer, U., Lambert, J. C., Vingtdeux, V., Zhao, H., Vais, H., Siebert, A., Jain, A., Koppel, J., Rovelet-Lecrux, A., Hannequin, D., Pasquier, F., Galimberti, D., Scarpini, E., Mann, D., Lendon, C., Campion, D., Amouyel, P., Davies, P., Foskett, J. K., … Marambaud, P. (2008). A Polymorphism in CALHM1 Influences Ca2+ Homeostasis, Aβ Levels, and Alzheimer’s Disease Risk. Cell, 133(7), 1149–1161. https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.05.048
Dressel, U., Allen, T. L., Pippal, J. B., Rohde, P. R., Lau, P., & Muscat, G. E. O. (2003). The peroxisome proliferator-activated receptor beta/delta agonist, GW501516, regulates the expression of genes involved in lipid catabolism and energy uncoupling in skeletal muscle cells. Molecular Endocrinology (Baltimore, Md.), 17(12), 2477–2493. https://doi.org/10.1210/me.2003-0151
Duyckaerts, C., Delaère, P., & Hauw, J.-J. (1992). Alzheimer’s Disease and Neuroanatomy: Hypotheses and Proposals. 144–155. https://doi.org/10.1007/978-3-642-46776-9_15
Eckman, E. A., & Eckman, C. B. (2005). Aβ-degrading enzymes: modulators of Alzheimer's disease pathogenesis and targets for therapeutic intervention. Biochemical Society Transactions, 33(5), 1101 LP – 1105. http://www.biochemsoctrans.org/content/33/5/1101.abstract
Ehrenborg, E., Saliba Gustafsson, P., Pedrelli, M., Gertow, K., Pourteymour, S., Baldassarre, D., Tremoli, E., De Faire, U., Humphries, S. E., Goncalves, I., Orho-Melander, M., Boren, J., Eriksson, P., Magne, J., & Parini, P. (2019). P728Subclinical atherosclerosis and its progression are modulated by perilipin-2 through a feed-forward loop between LXR and autophagy. European Heart Journal, 40(Supplement_1). https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehz747.0332
Elena-Real, C. A., Pasión-Galván, R., Pérez-Artés, M. R., Puerto, M., & Moreno, I. (2012). Posible contribución del paraquat al desarrollo de la enfermedad de Parkinson. Revista de Toxicologia, 29(2), 117–122.
Ellman, G. L., Courtney, K. D., Andres, V., & Featherstone, R. M. (1961). A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology, 7(2), 88–95. https://doi.org/10.1016/0006-2952(61)90145-9
141
Espitia Corredor, J. A., Cuca Suarez, L. E., & Guerrero Pabon, M. F. (2016). ASSESMENT OF PLATELET ANTIAGGREGANT ACTIVITY OF A FRACTION FROM AN ETHANOLIC EXTRACT OF THE BARK OF Nectandra amazonum Nees. Revista Vitae, 23(2), 119–123. https://doi.org/10.17533/udea.vitae.v23n2a04
Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., & Skaper, S. D. (2008). Aβ1–42 reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis. Journal of Neuroscience Methods, 175(1), 96–103. https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2008.08.001
Evans, R. (1988). The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science, 240(4854), 889–895. https://doi.org/10.1126/science.3283939
Filippov, V., Song, M. A., Zhang, K., Vinters, H. V., Tung, S., Kirsch, W. M., Yang, J., & Duerksen-Hughes, P. J. (2012a). Increased ceramide in brains with alzheimer’s and other neurodegenerative diseases. Journal of Alzheimer’s Disease, 29(3), 537–547. https://doi.org/10.3233/JAD-2011-111202
Filippov, V., Song, M. A., Zhang, K., Vinters, H. V., Tung, S., Kirsch, W. M., Yang, J., & Duerksen-Hughes, P. J. (2012b). Increased Ceramide in Brains with Alzheimer’s and Other Neurodegenerative Diseases. Journal of Alzheimer’s Disease, 29(3), 537–547. https://doi.org/10.3233/JAD-2011-111202
Fisher, A., Bezprozvanny, I., Wu, L., Ryskamp, D. A., Bar-Ner, N., Natan, N., Brandeis, R., Elkon, H., Nahum, V., Gershonov, E., LaFerla, F. M., & Medeiros, R. (2016). AF710B, a Novel M1/σ1 Agonist with Therapeutic Efficacy in Animal Models of Alzheimer’s Disease. Neurodegenerative Diseases, 16(1–2), 95–110. https://doi.org/10.1159/000440864
Fitz, N. F., Cronican, A., Pham, T., Fogg, A., Fauq, A. H., Chapman, R., Lefterov, I., & Koldamova, R. (2010). Liver X Receptor Agonist Treatment Ameliorates Amyloid Pathology and Memory Deficits Caused by High-Fat Diet in APP23 Mice. Journal of Neuroscience, 30(20), 6862–6872. https://doi.org/10.1001/archopht.1992.01080240025017
Fong, L. K., Yang, M. M., Chaves, R. dos S., Reyna, S. M., Langness, V. F., Woodruff, G., Roberts, E. A., Young, J. E., & Goldstein, L. S. B. (2018). Full-length amyloid precursor protein regulates lipoprotein metabolism and amyloid- clearance in human astrocytes. Journal of Biological Chemistry, 293(29), 11341–11357. https://doi.org/10.1074/jbc.RA117.000441
Fonteh, A. N., Ormseth, C., Chiang, J., Cipolla, M., Arakaki, X., & Harrington, M. G. (2015). Sphingolipid metabolism correlates with cerebrospinal fluid beta amyloid levels in Alzheimer’s disease. PLoS ONE, 10(5), 1–22. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0125597
Fouache, A., Zabaiou, N., De Joussineau, C., Morel, L., Silvente-Poirot, S., Namsi, A., Lizard, G., Poirot, M., Makishima, M., Baron, S., Lobaccaro, J. M. A., & Trousson, A. (2019). Flavonoids differentially modulate liver X receptors activity—Structure-function relationship analysis. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 190(April), 173–182. https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2019.03.028
Francis, G. A., Fayard, E., Picard, F., & Auwerx, J. (2003). Nuclear Receptors and the Control of Metabolism. Annual Review of Physiology, 65(1), 261–311. https://doi.org/10.1146/annurev.physiol.65.092101.142528
Friedman, M. (2004). Applications of the Ninhydrin Reaction for Analysis of Amino Acids, Peptides, and Proteins to Agricultural and Biomedical Sciences. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(3), 385–406. https://doi.org/10.1021/jf030490p
Fukushima, T., Tanaka, K., Lim, H., & Moriyama, M. (2002). Mechanism of cytotoxicity of paraquat. Environmental Health and Preventive Medicine, 7(3), 89–94. https://doi.org/10.1265/ehpm.2002.89
Gao, M., Zhang, W. cui, Liu, Q. shan, Hu, J. juan, Liu, G. tao, & Du, G. hua. (2008). Pinocembrin prevents glutamate-induced apoptosis in SH-SY5Y neuronal cells via decrease of bax/bcl-2 ratio. European Journal of Pharmacology, 591(1–3), 73–79. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2008.06.071
Genin, E., Hannequin, D., Wallon, D., Sleegers, K., Hiltunen, M., Combarros, O., Bullido, M. J., Engelborghs, S., De Deyn, P., Berr, C., Pasquier, F., Dubois, B., Tognoni, G., Fiévet, N., Brouwers, N., Bettens, K., Arosio, B., Coto, E., Del Zompo, M., … Campion, D. (2011). APOE and Alzheimer disease: A major gene with semi-dominant inheritance. Molecular Psychiatry, 16(9), 903–907. https://doi.org/10.1038/mp.2011.52
Gerretsen, P., & Pollock, B. G. (2011). Drugs with anticholinergic properties: A current perspective on use and safety. Expert Opinion on Drug Safety, 10(5), 751–765. https://doi.org/10.1517/14740338.2011.579899
Gottlieb, O. R. (1979). Chemical studies on medicinal myristicaceae from Amazonia. Journal of Ethnopharmacology, 1(4), 309–323. https://doi.org/10.1016/S0378-8741(79)80001-X
Grøntvedt, G. R., Schröder, T. N., Sando, S. B., White, L., Bråthen, G., & Doeller, C. F. (2018). Alzheimer’s disease. Current Biology, 28(11), R645–R649. https://doi.org/10.1016/j.cub.2018.04.080
Hamilton, A., Zamponi, G. W., & Ferguson, S. S. G. (2015). Glutamate receptors function as scaffolds for the regulation of β-amyloid and cellular prion protein signaling complexes. Molecular Brain, 8(1), 1–9. https://doi.org/10.1186/s13041-015-0107-0
Hammarstedt, A., Andersson, C. X., Rotter Sopasakis, V., & Smith, U. (2005). The effect of PPARgamma ligands
142
on the adipose tissue in insulin resistance. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids, 73(1), 65–75. https://doi.org/10.1016/j.plefa.2005.04.008
Hampel, H., Mesulam, M. M., Cuello, A. C., Khachaturian, A. S., Vergallo, A., Farlow, M. R., Snyder, P. J., Giacobini, E., & Khachaturian, Z. S. (2019). Revisiting the Cholinergic Hypothesis in Alzheimer’s Disease: Emerging Evidence from Translational and Clinical Research. The Journal of Prevention of Alzheimer’s Disease, 6(1), 2–15. https://doi.org/10.14283/jpad.2018.43
Hardy, J., & Higgins, G. (1992). Alzheimer’s disease: the amyloid cascade hypothesis. Science, 256(5054), 184–185. https://doi.org/10.1126/science.1566067
Hermans, D., Htay, U. H., & Cooley, S. J. (2007). -Non-pharmacological interventions for wandering of people with dementia in the domestic setting. Cochrane Database of Systematic Reviews. https://doi.org/10.1002/14651858.CD005994.pub2
Hiruma-lima, C. A., Maria, L., Beatriz, A., Almeida, A. De, Pietro, L. De, Campaner, L., Vilegas, W., Regina, A., & Souza, M. (2009). Antiulcerogenic action of ethanolic extract of the resin from Virola surinamensis. 122, 406–409. https://doi.org/10.1016/j.jep.2008.12.023
Hoey, S. E., Williams, R. J., & Perkinton, M. S. (2009). Synaptic NMDA Receptor Activation Stimulates -Secretase Amyloid Precursor Protein Processing and Inhibits Amyloid- Production. Journal of Neuroscience, 29(14), 4442–4460. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.6017-08.2009
Holmström, K. M., & Finkel, T. (2014). Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 15(6), 411–421. https://doi.org/10.1038/nrm3801
Http://www.theplantlist.org/, P. on the I. (2013). The Plant List (2013). Version 1.1. http://www.theplantlist.org Huang, C. (2014). Natural modulators of liver X receptors. Journal of Integrative Medicine, 12(2), 76–85.
https://doi.org/10.1016/S2095-4964(14)60013-3 Hussain, F., Khan, Z., Jan, M. S., Ahmad, S., Ahmad, A., Rashid, U., Ullah, F., Ayaz, M., & Sadiq, A. (2019).
Synthesis, in-vitro α-glucosidase inhibition, antioxidant, in-vivo antidiabetic and molecular docking studies of pyrrolidine-2,5-dione and thiazolidine-2,4-dione derivatives. Bioorganic Chemistry, 91(May), 103128. https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2019.103128
Ibarra Estrada, E., Pacheco Sánchez, M., García Mateos, R., San Miguel Chávez, R., Ramírez Valverde, G., & Soto Hernández, R. M. (2011). ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE ALCALOIDES DE Erythrina americana Miller. Revista Fitotecnia Mexicana, 34(4), 241-246. https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=610/61020797003
Islam, B. ul, Jabir, N. R., & Tabrez, S. (2019). The role of mitochondrial defects and oxidative stress in Alzheimer’s disease. Journal of Drug Targeting, 27(9), 932–942. https://doi.org/10.1080/1061186X.2019.1584808
Jacobsen, J. S., Wu, C. C., Redwine, J. M., Comery, T. A., Arias, R., Bowlby, M., Martone, R., Morrison, J. H., Pangalos, M. M., Reinhart, P. H., & Bloom, F. E. (2006). Early-onset behavioral and synaptic deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(13), 5161–5166. https://doi.org/10.1073/pnas.0600948103
Jadhav, S., Cubinkova, V., Zimova, I., Brezovakova, V., Madari, A., Cigankova, V., & Zilka, N. (2015). Tau-mediated synaptic damage in Alzheimer’s disease. Translational Neuroscience, 6(1), 214–226. https://doi.org/10.1515/tnsci-2015-0023
Jan, M. S., Ahmad, S., Hussain, F., Ahmad, A., Mahmood, F., Rashid, U., Abid, O. ur R., Ullah, F., Ayaz, M., & Sadiq, A. (2020). Design, synthesis, in-vitro, in-vivo and in-silico studies of pyrrolidine-2,5-dione derivatives as multitarget anti-inflammatory agents. European Journal of Medicinal Chemistry, 186, 111863. https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2019.111863
Jang, B. G., In, S., Choi, B., & Kim, M. (2014). Beta-amyloid oligomers induce early loss of presynaptic proteins in primary neurons by caspase-dependent and proteasome-dependent mechanisms. NeuroReport, 25(16), 1281–1288. https://doi.org/10.1097/WNR.0000000000000260
Jann, M. W., Shirley, K. L., & Small, G. W. (2002). Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of cholinesterase inhibitors. [Review] [100 refs]. Clinical Pharmacokinetics.41(10):719-39, 41(New Zealand PT-Journal Article PT-Research Support, Non-U.S. Gov’t PT-Review LG-English), 719–739. https://doi.org/10.2165/00003088-200241100-00003
Jaramillo Gomez, J. A., & Arboleda, G. (2010). Analisis del efecto del gen DJ-1 frente a C2-Ceramida, 6-Hidroxidopamina y rotenona y su relación con la via PI3K/AKT en un modelo de neuronas mesencefalicas / Effect analysis of DJ-1 gene front to C2-Ceramide, 6-Hidroxidopamine and rotenone and its relat [Universidad Nacional de Colombia]. http://www.bdigital.unal.edu.co/2712/
Jazvinšćak Jembrek, M., Hof, P. R., & Šimić, G. (2015). Ceramides in Alzheimer’s Disease: Key Mediators of Neuronal Apoptosis Induced by Oxidative Stress and A β Accumulation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2015. https://doi.org/10.1155/2015/346783
143
Ji, H. F., & Zhang, H. Y. (2008). Multipotent natural agents to combat Alzheimer’s disease. Functional spectrum and structural features. Acta Pharmacologica Sinica, 29(2), 143–151. https://doi.org/10.1111/j.1745-7254.2008.00752.x
Jick, H., Zornberg, G. L., Jick, S. S., Seshadri, S., & Drachman, D. A. (2000). Statinsandtheriskofdementia. 356, 1627–1631. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(00)03155-X
Jork, H., Funk, W., Fischer, W., Wimmer, H., & & Burns, D. T. (n.d.). Thin-layer chromatography. Reagents and detection methods. Physical and chemical detection methods: fundamentals, reagents. In 1990 (Vol. 1a).
Joseph, S. B., Bradley, M. N., Castrillo, A., Bruhn, K. W., Mak, P. A., Pei, L., Hogenesch, J., O’connell, R. M., Cheng, G., Saez, E., Miller, J. F., & Tontonoz, P. (2004). LXR-dependent gene expression is important for macrophage survival and the innate immune response. Cell, 119(2), 299–309. https://doi.org/10.1016/j.cell.2004.09.032
Joshi, G., & A. Johnson, J. (2012). The Nrf2-ARE Pathway: A Valuable Therapeutic Target for the Treatment of Neurodegenerative Diseases. Recent Patents on CNS Drug Discovery, 7(3), 218–229. https://doi.org/10.2174/157488912803252023
Kato, R., Iwasaki, K., & Noguchi, H. (1976). Stimulatory effect of FMN and methyl viologen on cytochrome P-450 dependent reduction of tertiary amine N-oxide. Biochemical and Biophysical Research Communications, 72(1), 267–274. https://doi.org/10.1016/0006-291X(76)90989-X
Keller, H., Dreyer, C., Medin, J., Mahfoudi, A., Ozato, K., & Wahli, W. (1993). Fatty acids and retinoids control lipid metabolism through activation of peroxisome proliferator-activated receptor-retinoid X receptor heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 90(6), 2160–2164. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8384714
Kim, S.-N., Choi, H. Y., Lee, W., Park, G. M., Shin, W. S., & Kim, Y. K. (2008). Sargaquinoic acid and sargahydroquinoic acid from Sargassum yezoense stimulate adipocyte differentiation through PPARalpha/gamma activation in 3T3-L1 cells. FEBS Letters, 582(23–24), 3465–3472. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2008.09.011
Klinge, C. M. (2000). Estrogen receptor interaction with co-activators and co-repressors☆. Steroids, 65(5), 227–
251. https://doi.org/10.1016/S0039-128X(99)00107-5 Kosicek, M., & Hecimovic, S. (2013). Phospholipids and Alzheimer’s disease: Alterations, mechanisms and
potential biomarkers. International Journal of Molecular Sciences, 14(1), 1310–1322. https://doi.org/10.3390/ijms14011310
Kotani, H., Tanabe, H., Mizukami, H., Makishima, M., & Inoue, M. (2010). Identification of a naturally occurring rexinoid, honokiol, that activates the retinoid X receptor. Journal of Natural Products, 73(8), 1332–1336. https://doi.org/10.1021/np100120c
Kraepelin, E. (1896). Psychiatrie - Ein Lehrbuch für Studierende und Ärzte. Journal of the American Medical Association, 5, 789–814. https://doi.org/10.1001/jama.1939.02800520075036
Krentz, A. J., & Friedmann, P. S. (2006). Type 2 diabetes, psoriasis and thiazolidinediones. International Journal of Clinical Practice, 60(3), 362–363. https://doi.org/10.1111/j.1368-5031.2005.00765.x
Kumar, D., & Rub, M. A. (2019). Study of the reaction of ninhydrin with tyrosine in gemini micellar media. RSC Advances, 9(38), 22129–22136. https://doi.org/10.1039/C9RA03557E
Kumar, R., & Thompson, E. B. (1999). The structure of the nuclear hormone receptors. Steroids, 64(5), 310–319. https://doi.org/10.1016/S0039-128X(99)00014-8
Kwon, Y. (2017). Luteolin as a potential preventive and therapeutic candidate for Alzheimer ’ s disease. Experimental Gerontology, 95, 39–43. https://doi.org/10.1016/j.exger.2017.05.014
La, J. De, Ndong, C., Sima-obiang, C., Ondo, J. P., Ndong-atome, G. R., & Abessolo, F. O. (2018). inflammatory and antioxidant activities of Scyphocephalium ochocoa Warb . ( Myristicaceae ), medicinal plant from Gabon. July.
LaFerla, F. M. (2002). Calcium dyshomeostasis and intracellular signalling in alzheimer’s disease. Nature Reviews Neuroscience, 3(11), 862–872. https://doi.org/10.1038/nrn960
Lahiri, D. K., Greig, N. H., Pappolla, M. A., & Sambamurti, K. (2016). Ab protein clearance and degradation (ABCD) Pathways and their Role in Alzheimer ’ s Disease. 12(1), 32–46.
Lam, Y. A., Pickart, C. M., Alban, A., Landon, M., Jamieson, C., Ramage, R., Mayer, R. J., & Layfield, R. (2000). Inhibition of the ubiquitin-proteasome system in Alzheimer ’ s disease. National Academy of Sciences, 97(18), 9902–9906. https://doi.org/10.1073/pnas.170173897
Larner, A. J. (1999). Hypothesis: amyloid beta-peptides truncated at the N-terminus contribute to the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging, 20(1), 65–69. https://doi.org/10.1016/S0197-4580(99)00014-7
Lars Ulrik Gerdes, Klausen, I. C., Sihm, I., Faergeman, O., & Vogler, G. P. (1992). Apolipoprotein E
144
polymorphism in a Danish population compared to findings in 45 other study populations around the world. Genetic Epidemiology, 9(3), 155–167. https://doi.org/10.1002/gepi.1370090302
Laudet, V. (1997). Evolution of the nuclear receptor superfamily: early diversification from an ancestral orphan receptor. Journal of Molecular Endocrinology, 19(3), 207–226. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9460643
Le Quesne, P. W., Larrahondo, J. E., & Raffaul, R. F. (1980). Antitumor plants X Constituents of Nectandra rigida”. J Nat Prod, 43, 353–359.
Leinenga, G., & Götz, J. (2015). Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Science Translational Medicine, 7(278), 278ra33-278ra33. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aaa2512
Levites, Y., Amit, T., Mandel, S., & Youdim, M. B. H. (2003). Neuroprotection and neurorescue against Aβ toxicity and PKC‐dependent release of non‐amyloidogenic soluble precursor protein by green tea polyphenol (‐)‐epigallocatechin‐3‐gallate. The FASEB Journal, 17(8), 1–23. https://doi.org/10.1096/fj.02-0881fje
Lin, C. T., Chu, F. H., Tseng, Y. H., Tsai, J. B., Chang, S. T., & Wang, S. Y. (2007). Bioactivity Investigation of Lauraceae Trees Grown in Taiwan. Pharmaceutical Biology, 45(8), 638–644. https://doi.org/10.1080/13880200701538708
Lin, H. R. (2013). Paeoniflorin acts as a liver X receptor agonist. Journal of Asian Natural Products Research, 15(1), 35–45. https://doi.org/10.1080/10286020.2012.742510
Lindwall, G., & Cole, R. D. (1984). Phosphorylation affects the ability of tau protein to promote microtubule assembly. Journal of Biological Chemistry, 259(8), 5301–5305.
Liu, C. C., Kanekiyo, T., Xu, H., & Bu, G. (2013). Apolipoprotein e and Alzheimer disease: Risk, mechanisms and therapy. Nature Reviews Neurology, 9(2), 106–118. https://doi.org/10.1038/nrneurol.2012.263
LL, H., AR, M., Anderson, V., & White, J. (1981). Dementia of the alzheimer type: Clinical genetics, natural history, and associated conditions. Archives of General Psychiatry, 38(10), 1085–1090. http://dx.doi.org/10.1001/archpsyc.1981.01780350019001
Lopez, O. L., & Kuller, L. H. (2019). Epidemiology of aging and associated cognitive disorders : Prevalence and incidence of Alzheimer ’ s disease and other dementias. In Geriatric Neurology (1st ed., Vol. 167). Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-804766-8.00009-1
Mabry, T. J., Markham, K. R., & Thomas, M. B. (1970). The Systematic Identification of Flavonoids. In The Systematic Identification of Flavonoids. https://doi.org/10.1007/978-3-642-88458-0
Madden, S., Spaldin, V., & Park, B. K. (1995). Clinical Pharmacokinetics of Tacrine. Clinical Pharmacokinetics, 28(6), 449–457. https://doi.org/10.2165/00003088-199528060-00003
Mangelsdorf, D. J., Thummel, C., Beato, M., Herrlich, P., Schütz, G., Umesono, K., Blumberg, B., Kastner, P., Mark, M., Chambon, P., & Evans, R. M. (1995). The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell, 83(6), 835–839. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8521507
Manoharan, S., Guillemin, G. J., Abiramasundari, R. S., Essa, M. M., Akbar, M., & Akbar, M. D. (2016). The Role of Reactive Oxygen Species in the Pathogenesis of Alzheimer ’ s Disease , Parkinson ’ s Disease , and Huntington ’ s Disease : A Mini Review. 2016. https://doi.org/10.1155/2016/8590578
Marco, L., & Carreiras, C. (2006). Galanthamine , a Natural Product for the Treatment of Alzheimer ’ s Disease. 105–111.
Mariam, S., Wahab, A., Sivasothy, Y., Yee, L. S., Litaudon, M., Mohamad, J., & Awang, K. (2016). Natural Cholinesterase Inhibitors from Myristica cinnamomea. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2016.05.046
Marques CA. (2001). Importância econômica da Família Lauraceae Lindl. Floresta e Ambiente, 8, 195–206. Marston, A., Kissling, J., & Hostettmann, K. (2002). A rapid TLC bioautographic method for the detection of
acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitors in plants. Phytochemical Analysis, 13(1), 51–54. https://doi.org/10.1002/pca.623
Martin, P., Anders, W., Maëlenn, G., Gemma-Claire, A., Yu-Tzu, W., & Matthew, P. (2015). Informe Mundial sobre Alzheimer 2015 Las consecuencias de la demencia análisis de prevalencia, incidencia, coste y tendencias. Psicothema, 16, 297–302.
Masoud Tavazoie. (2018). The LXR/ApoE pathway regulates the innate immune system in cancer. Proceedings of the AACR Special Conference on Tumor Immunology and Immunotherapy. https://doi.org/10.1158/2326-6074.TUMIMM18-IA11
Medina, M., Khachaturian, Z. S., & Rossor, M. (2017). Toward common mechanisms for risk factors in Alzheimer ’ s syndrome. 3, 571–578. https://doi.org/10.1016/j.trci.2017.08.009
Meraz-Ríos, M. A., León, K. I. L.-D., Campos-Peña, V., & Anda-Hernández, M. A. D. R. M.-L. (2010). Tau Oligomers and Aggregation in Alzheimer’s Disease. Jurnal of Neurochemistry, 1353–1367.
145
https://doi.org/https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2009.06511.x Mihailova, D., Yamboliev, I., Zhivkova, Z., Tencheva, J., & Jovovich, V. (1989). Pharmacokinetics of
Galanthamine Hydrobromide after Single Subcutaneous and Oral Dosage in Humans. Pharmacology, 39(1), 50–58. https://doi.org/10.1159/000138571
Miyamoto, M., Murphy, T.H., Schnaar, R.L., Coyle, J.T., 1989. Antioxidants protect against glutamate-induced cytotoxicity in a neuronal cell line. J. Pharmacol. Exp. Ther. 250.
Miller, B. C., Eckman, E. A., Sambamurti, K., Dobbs, N., Chow, K. M., Eckman, C. B., Hersh, L. B., & Thiele, D. L. (2003). Amyloid- peptide levels in brain are inversely correlated with insulysin activity levels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(10), 6221–6226. https://doi.org/10.1073/pnas.1031520100
Miller, H. E. (1971). A simplified method for the evaluation of antioxidants. Journal of the American Oil Chemists Society, 48(2), 91–91. https://doi.org/10.1007/BF02635693
Mir, N. T., Saleem, U., Anwar, F., Ahmad, B., Ullah, I., Hira, S., Ismail, T., Ali, T., & Ayaz, M. (2019). Lawsonia inermis markedly improves cognitive functions in animal models and modulate oxidative stress markers in the brain. Medicina (Lithuania), 55(5). https://doi.org/10.3390/medicina55050192
Morales, J. R., Ballesteros, I., Deniz, J. M., Hurtado, O., Vivancos, J., Nombela, F., Lizasoain, I., Castrillo, A., & Moro, M. A. (2008). Activation of Liver X Receptors Promotes Neuroprotection and Reduces Brain Inflammation in Experimental Stroke. Circulation, 118(14), 1450–1459. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.108.782300
Moreno, S. R. F., Carvalho, J. J., Nascimento, A. L., Pereira, M., Caldas, L. Q. A., & Bernardo-Filho, M. (2011). Effects of a nectandra membranacea extract on labeling of blood constituents with technetium-99m and on the morphology of red blood cells. World Academy of Science, Engineering and Technology, 51(3), 752–756. https://doi.org/10.5281/zenodo.1333194
Mucke, L. (2009). Q & A Alzheimer ’ s disease. 461(October), 895–898. Muñoz-Cabrera, J. M., Sandoval-Hernández, A. G., Niño, A., Báez, T., Bustos-Rangel, A., Cardona-Gómez, G.
P., Múnera, A., & Arboleda, G. (2019). Bexarotene therapy ameliorates behavioral deficits and induces functional and molecular changes in very-old Triple Transgenic Mice model of Alzheimer´s disease. PLoS ONE, 14(10), 1–22. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223578
Muse, E. D., Yu, S., Edillor, C. R., Tao, J., Spann, N. J., Troutman, T. D., Seidman, J. S., Henke, A., Roland, J. T., Ozeki, K. A., Thompson, B. M., McDonald, J. G., Bahadorani, J., Tsimikas, S., Grossman, T. R., Tremblay, M. S., & Glass, C. K. (2018). Cell-specific discrimination of desmosterol and desmosterol mimetics confers selective regulation of LXR and SREBP in macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 115(20), E4680–E4689. https://doi.org/10.1073/pnas.1714518115
Myers, R. H., Schaefer, E. J., Wilson, P. W. F., D’Agostino, R., Ordovas, J. M., Espino, A., Au, R., White, R. F.,
Knoefel, J. E., Cobb, J. L., McNulty, K. A., Beiser, A., & Wolf, P. A. (1996). Apolipoprotein E ∈4 association with dementia in a population-based study: The Framingham Study. Neurology, 46(3), 673–677. https://doi.org/10.1212/WNL.46.3.673
Naarala, J., Nykvist, P., Tuomala, M., & Savolainen, K. (1993). Excitatory amino acid-induced slow biphasic responses of free intracellular calcium in human neuroblastoma cells. FEBS Letters, 330(2), 222–226. https://doi.org/10.1016/0014-5793(93)80278-3
Nadeem, M., Wai, K., Abas, F., Ahmad, S., Adnan, S., Shah, A., Choudhary, M. I., & Hj, N. (2011). Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters New class of acetylcholinesterase inhibitors from the stem bark of Knema laurina and their structural insights. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 21(13), 4097–4103. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2011.04.065
Nampoothiri, M., Reddy, N. D., John, J., Kumar, N., Kutty Nampurath, G., & Rao Chamallamudi, M. (2014). Insulin Blocks Glutamate-Induced Neurotoxicity in Differentiated SH-SY5Y Neuronal Cells. Behavioural Neurology, 2014, 1–8. https://doi.org/10.1155/2014/674164
Newman, D. J., & Cragg, G. M. (2016). Natural Products as Sources of New Drugs from 1981 to 2014. Journal of Natural Products, 79(3), 629–661. https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.5b01055
Newman, D. J., & Cragg, G. M. (2020). Natural Products as Sources of New Drugs over the Nearly Four Decades from 01/1981 to 09/2019. Journal of Natural Products, 83(3), 770–803. https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.9b01285
Nilsson, P., Loganathan, K., Sekiguchi, M., Matsuba, Y., Hui, K., Tsubuki, S., Tanaka, M., Iwata, N., Saito, T., & Saido, T. C. (2013). Report A b Secretion and Plaque Formation Depend on Autophagy. CellReports, 5(1), 61–69. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2013.08.042
Nissen, S. E., & Wolski, K. (2007). Effect of rosiglitazone on the risk of myocardial infarction and death from cardiovascular causes. The New England Journal of Medicine, 356(24), 2457–2471.
146
https://doi.org/10.1056/NEJMoa072761 Novac, N., & Heinzel, T. (2004). Nuclear Receptors: Overview and Classification. Current Drug Target -
Inflammation & Allergy, 3(4), 335–346. https://doi.org/10.2174/1568010042634541 Nunan, J., & Small, D. H. (2000). Regulation of APP cleavage by alpha-, beta- and gamma-secretases. FEBS
Letters, 483(1), 6–10. https://doi.org/10.1016/S0014-5793(00)02076-7 Nwabuisi-Heath, E., Rebeck, G. W., LaDu, M. J., & Yu, C. (2014). ApoE4 delays dendritic spine formation during
neuron development and accelerates loss of mature spines in vitro. ASN Neuro, 6(1), 21–28. https://doi.org/10.1042/AN200130043
O’Donoghue, M. C., Murphy, S. E., Zamboni, G., Nobre, A. C., & Mackay, C. E. (2018). APOE genotype and cognition in healthy individuals at risk of Alzheimer’s disease: A review. Cortex, 104, 103–123. https://doi.org/10.1016/j.cortex.2018.03.025
Oliveira de Melo, J., Truiti, M. da C. T., Muscará, M. N., Bolonheis, S. M., Dantas, J. A., Caparroz-Assef, S. M., Cuman, R. K. N., & Bersani-Amado, C. A. (2006). Anti-inflammatory Activity of Crude Extract and Fractions of Nectandra falcifolia Leaves. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 29(11), 2241–2245. https://doi.org/10.1248/bpb.29.2241
Ondeyka, J. G., Jayasuriya, H., Herath, K. B., Guan, Z., Schulman, M., Collado, J., Dombrowski, A. W., Kwon, S. S., McCallum, C., Sharma, N., MacNaul, K., Hayes, N., Menke, J. G., & Singh, S. B. (2005). Steroidal and Triterpenoidal Fungal Metabolites as Ligands of Liver X Receptors. The Journal of Antibiotics, 58(9), 559–565. https://doi.org/10.1038/ja.2005.76
Park, I., Lee, H., & Kim, S. (2004). A b -Secretase ( BACE1 ) Inhibitor Hispidin from the Mycelial Cultures of Phellinus linteus. 10–13. https://doi.org/10.1055/s-2004-815491
Parsons, C. G., Danysz, W., & Parsons, C. G. (2017). The NMDA receptor antagonist memantine as a symptomatological and neuroprotective treatment for Alzheimer ’ s disease ... The NMDA receptor antagonist memantine as a symptomatological and neuroprotective treatment for Alzheimer ’ s disease : preclinical e. International Journal of Geriatric Psychiatry, 18(September 2003), S23–S32. https://doi.org/10.1002/gps.938
Parsons, M. P., & Raymond, L. A. (2014). Extrasynaptic NMDA Receptor Involvement in Central Nervous System Disorders. Neuron, 82(2), 279–293. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2014.03.030
Paula, P.-C., Angelica Maria, S.-G., Luis, C., & Gloria Patricia, C.-G. (2019). Preventive Effect of Quercetin in a Triple Transgenic Alzheimer’s Disease Mice Model. Molecules, 24(12), 2287. https://doi.org/10.3390/molecules24122287
Pearson, R. C. A., & Powell, T. P. S. (1989). The Neuroanatomy of Alzheimer’s Disease. Reviews in the Neurosciences, 2(2), 101–122. https://doi.org/10.1515/REVNEURO.1989.2.2.101
Peet, D. J., Turley, S. D., Ma, W., Janowski, B. A., Lobaccaro, J. M., Hammer, R. E., & Mangelsdorf, D. J. (1998). Cholesterol and bile acid metabolism are impaired in mice lacking the nuclear oxysterol receptor LXR alpha. Cell, 93(5), 693–704. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9630215
Phillips, M. C. (2014). Apolipoprotein e isoforms and lipoprotein metabolism. IUBMB Life, 66(9), 616–623. https://doi.org/10.1002/iub.1314
Picard, C., Julien, C., Frappier, J., Miron, J., Théroux, L., Dea, D., Breitner, J. C. S., & Poirier, J. (2018). Alterations in cholesterol metabolism–related genes in sporadic Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging, 66, 180.e1-180.e9. https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2018.01.018
Pierrot, N., Ghisdal, P., Caumont, A. S., & Octave, J. N. (2004). Intraneuronal amyloid-β1-42 production triggered by sustained increase of cytosolic calcium concentration induces neuronal death. Journal of Neurochemistry, 88(5), 1140–1150. https://doi.org/10.1046/j.1471-4159.2003.02227.x
Pires, L. M., & Roseira, A. N. (1971). The solvent effect in the use of chloranil as a reagent in the identification of aromatic amines on silica gel thin-layers. Journal of Chromatography A, 56, 59–67. https://doi.org/10.1016/S0021-9673(00)97777-X
Plant, L. D., Boyle, J. P., Smith, I. F., Peers, C., & Pearson, H. a. (2003). The production of amyloid beta peptide is a critical requirement for the viability of central neurons. J Neurosci, 23(13), 5531–5535. https://doi.org/23/13/5531 [pii]
Plazas, E. A., Avila, M. C., Delgado, W. A., Patino, O. J., & Cuca, L. E. (2018). In vitro Antioxidant and Anticholinesterase Activities of Colombian Plants as Potential Neuroprotective Agents. Research Journal of Medicinal Plants, 12(1), 9–18. https://doi.org/10.3923/rjmp.2018.9.18
Plazas, E., Casoti R, R., Murillo, M. A., Da Costa, F. B., & Cuca, L. E. (2019). Metabolomic profiling of Zanthoxylum species: Identification of anti-cholinesterase alkaloids candidates. Phytochemistry, 168(April). https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2019.112128
Plazas Gonzalez, E., Hagenow, S., Avila Murillo, M., Stark, H., & Cuca Suarez, L. (2020). Isoquinoline alkaloids from the roots of Zanthoxylum rigidum as multi-target inhibitors of cholinesterase, monoamine oxidase A
147
and Aβ1-42 aggregation. Bioorganic Chemistry, 98(January), 103722. https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.103722
Ponci, V., Figueiredo, C., Massaoka, M., de Farias, C., Matsuo, A., Sartorelli, P., & Lago, J. (2015). Neolignans from Nectandra megapotamica (Lauraceae) Display in vitro Cytotoxic Activity and Induce Apoptosis in Leukemia Cells. Molecules, 20(7), 12757–12768. https://doi.org/10.3390/molecules200712757
Prince, M., Bryce, R., Albanese, E., Wimo, A., Ribeiro, W., & Ferri, C. P. (2013). The global prevalence of dementia: A systematic review and metaanalysis. Alzheimer’s and Dementia, 9(1), 63–75. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2012.11.007
Pulley, M.T., Berger, A.R., 2003. Toxic Peripheral Neuropathies, in: Office Practice of Neurology:Second Edition. Elsevier Inc., pp. 616–625. https://doi.org/10.1016/B0-44-306557-8/50100-3
Ramadhan, R., & Phuwapraisirisan, P. (2015). Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters New arylalkanones from Horsfieldia macrobotrys , effective antidiabetic agents concomitantly inhibiting a -glucosidase and free radicals. BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, 83, 6–10. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2015.08.069
Ramawat, K. G., Dass, S., & Mathur, M. (2009). Herbal Drugs: Ethnomedicine to Modern Medicine. Herbal Drugs: Ethnomedicine to Modern Medicine. https://doi.org/10.1007/978-3-540-79116-4
Ramsay, R., & Tipton, K. (2017). Assessment of Enzyme Inhibition: A Review with Examples from the Development of Monoamine Oxidase and Cholinesterase Inhibitory Drugs. Molecules, 22(7), 1192. https://doi.org/10.3390/molecules22071192
Rang, H. P., Dale, M. M., Ritter, J. M., & Moore, P. K. (2004). Distúrbios neurodegenerativos. In Farmacologia (Vol. 7).
Rangel, K., Fernandes, P., Bittercourt, P. S., Duarte, A., Souza, L. De, Queiroz, A., Souza, L. De, Moura, F., Lima, E. S., Domingo, L., Acho, R., Cássia, R. De, Nunomura, S., Teixeira, A. F., Henrique, H., & Koolen, F. (1809). ( Myristicaceae ) and evaluation of their antioxidant and enzyme inhibition potential. 49(1), 48–53.
Reed, B., Villeneuve, S., Mack, W., DeCarli, C., Chui, H. C., & Jagust, W. (2014). Associations between serum cholesterol levels and cerebral amyloidosis. JAMA Neurology, 71(2), 195–200. https://doi.org/10.1001/jamaneurol.2013.5390
Repa, J. J., & Mangelsdorf, D. J. (2000). The Role of Orphan Nuclear Receptors in the Regulation of Cholesterol Homeostasis. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 16(1), 459–481. https://doi.org/10.1146/annurev.cellbio.16.1.459
Rezende, K. R., Davino, S. C., & Barros, S. B. M. (2005). Natural Product Research : Formerly Natural Product Letters Antioxidant activity of aryltetralone lignans and derivatives from Virola sebifera ( Aubl .). November 2014, 37–41. https://doi.org/10.1080/14786410412331302118
Riddell, D. R., Zhou, H., Atchison, K., Warwick, H. K., Atkinson, P. J., Jefferson, J., Xu, L., Aschmies, S., Kirksey, Y., Hu, Y., Wagner, E., Parratt, A., Xu, J., Li, Z., Zaleska, M. M., Jacobsen, J. S., Pangalos, M. N., & Reinhart, P. H. (2008). Impact of Apolipoprotein E (ApoE) Polymorphism on Brain ApoE Levels. Journal of Neuroscience, 28(45), 11445–11453. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.1972-08.2008
Rincón, E. V. (2017). Generación de un modelo in vitro para evaluar la actividad agonista de extractos naturales, obtenidos de plantas de las familias de Lauraceas y Myristicaceas , sobre los receptores X del hígado (LXRs) ESTEFANIA VALENCIA RINCÓN. 13–15.
Robinson, M., Lee, B. Y., & Hane, F. T. (2017). Recent Progress in Alzheimer’s Disease Research, Part 2: Genetics and Epidemiology. Journal of Alzheimer’s Disease : JAD, 57(2), 317–330. https://doi.org/10.3233/JAD-161149
Rohwer, J. G., & Kubitzki, K. (1993). Ecogeographical Differentiation in Nectandra (Lauraceae), and its Historical Implications. In Botanica Acta (Vol. 106, Issue 1). https://doi.org/10.1111/j.1438-8677.1993.tb00342.x
Rojsanga, P., Gritsanapan, W., & Suntornsuk, L. (2006). Determination of Berberine Content in the Stem Extracts of Coscinium fenestratum by TLC Densitometry. Medical Principles and Practice, 15(5), 373–378. https://doi.org/10.1159/000094272
Rossouw, D. J., & Engelbrecht, F. M. (1978). The effect of paraquat on the respiration of lung cell fractions. South African Medical Journal = Suid-Afrikaanse Tydskrif Vir Geneeskunde, 54(26), 1101–1104. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/746468
Rothman, S. M., & Olney, J. W. (1986). Glutamate and the pathophysiology of hypoxic–ischemic brain damage. Annals of Neurology, 19(2), 105–111. https://doi.org/10.1002/ana.410190202
Sakakura, Y., Shimano, H., Sone, H., Takahashi, A., Inoue, K., Toyoshima, H., Suzuki, S., & Yamada, N. (2001). Sterol Regulatory Element-Binding Proteins Induce an Entire Pathway of Cholesterol Synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications, 286(1), 176–183. https://doi.org/10.1006/bbrc.2001.5375
148
Sakurai, H., Hanyu, H., & Iwamoto, T. (2012). Toward defining the preclinical stages of Alzheimer’s disease. Journal of Tokyo Medical University, 70(3), 332–333. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2011.03.003.Toward
Sandoval-Hernández, A. G., Buitrago, L., Moreno, H., Cardona-Gómez, G. P., & Arboleda, G. (2015). Role of Liver X Receptor in AD Pathophysiology. PLOS ONE, 10(12), e0145467. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0145467
Sandoval-Hernández, A. G., Restrepo, A., Cardona-Gómez, G. P., & Arboleda, G. (2016). LXR activation protects hippocampal microvasculature in very old triple transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters, 621, 15–21. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2016.04.007
Scacchia, R., Gambinab, G., Broggiob, E., Ruggeric, M., & Corbo, R. M. (2008). C-338A polymorphism of the endothelin-converting enzyme (ECE-1) gene and the susceptibility to sporadic late-onset Alzheimer’s disease and coronary artery disease. Disease Marker, 24(3), 175–179. https://doi.org/http://dx.doi.org/10.1155/2008/578304
Schoonjans, K., Peinado-Onsurbe, J., Lefebvre, A. M., Heyman, R. A., Briggs, M., Deeb, S., Staels, B., & Auwerx, J. (1996). PPARalpha and PPARgamma activators direct a distinct tissue-specific transcriptional response via a PPRE in the lipoprotein lipase gene. The EMBO Journal, 15(19), 5336–5348. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8895578
Schultz, J. R. (2000). Role of LXRs in control of lipogenesis. Genes & Development, 14(22), 2831–2838. https://doi.org/10.1101/gad.850400
Scott, H. A., Gebhardt, F. M., Mitrovic, A. D., Vandenberg, R. J., & Dodd, P. R. (2011). Glutamate transporter variants reduce glutamate uptake in Alzheimer ’ s disease. NBA, 32(3), 553.e1-553.e11. https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2010.03.008
Serrano-Pozo, A., Frosch, M. P., Masliah, E., & Hyman, B. T. (2011). Neuropathological Alterations in Alzheimer Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 1(1), a006189–a006189. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a006189
Sever, R., & Glass, C. K. (2013). Signaling by nuclear receptors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 5(3), a016709. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a016709
Silva-Filho, A. A., Silva, M. L. A. e, Carvalho, J. C. ., & Bastos., J. K. (2004). “Evaluation of analgesic and anti-inflammatory activities of Nectandra megapotamica (Lauracea) in mice and rats.” J Pharm Pharmacol, 56, 1179.
Silva, D., Z., Y., Santos, L., Bolzani, V., & Nair, M. (2007). Lipoperoxidation and Cyclooxygenases 1 and 2 Inhibitory Compounds from Iryanthera juruensis. J. Agric. Food Chem., 55(7), 2569–2574. https://doi.org/10.1021/jf063451x
Soscia, S. J., Kirby, J. E., Washicosky, K. J., Tucker, S. M., Ingelsson, M., Hyman, B., Burton, M. A., Goldstein, L. E., Duong, S., Tanzi, R. E., & Moir, R. D. (2010). The Alzheimer’s disease-associated amyloid β-protein is an antimicrobial peptide. PLoS ONE, 5(3), 1–10. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0009505
Souza-Junior, F. J. C., Luz-Moraes, D., Pereira, F. S., Barros, M. A., Fernandes, L. M. P., Queiroz, L. Y., Maia, C. F., Maia, J. G. S., & Fontes-Junior, E. A. (2020). Aniba canelilla (Kunth) Mez (Lauraceae): A Review of Ethnobotany, Phytochemical, Antioxidant, Anti-Inflammatory, Cardiovascular, and Neurological Properties. Frontiers in Pharmacology, 11(May), 1–14. https://doi.org/10.3389/fphar.2020.00699
Suri, S., Heise, V., Trachtenberg, A. J., & Mackay, C. E. (2013). The forgotten APOE allele: A review of the evidence and suggested mechanisms for the protective effect of APOE e2. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 37(10), 2878–2886. https://doi.org/10.1016/j.neubiorev.2013.10.010
Susanti, E. (2019). In silico analysis of bioactive compounds of Hibiscus sabdariffa as potential agonists of LXR to inhibit the atherogenesis process. AIP Conference Proceedings, 2108(June). https://doi.org/10.1063/1.5109983
Takao, T., Kitatani, F., Watanabe, N., Yagi, A., & Sakata, K. (1994). A Simple Screening Method for Antioxidants and Isolation of Several Antioxidants Produced by Marine Bacteria from Fish and Shellfish. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 58(10), 1780–1783. https://doi.org/10.1271/bbb.58.1780
Tang, Y., Lutz, M. W., & Xing, Y. (2018). A systems-based model of Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia, August, 1–4. https://doi.org/10.1016/j.jalz.2018.06.3058
Teboul, M., Enmark, E., Li, Q., Wikström, A. C., Pelto-Huikko, M., & Gustafsson, J. A. (1995). OR-1, a member of the nuclear receptor superfamily that interacts with the 9-cis-retinoic acid receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92(6), 2096–2100. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/359232
Tenorio, M. (2016). Flavonoids extracted from orange peelings tangelo (Citrus reticulata x Citrus paradisi) and their application as a natural antioxidant in sacha inchi (Plukenetia volubilis) vegetable oil. Scientia Agropecuaria, 7(4), 419–431. https://doi.org/10.17268/sci.agropecu.2016.04.07
Texidó, L., Martín-Satué, M., Alberdi, E., Solsona, C., & Matute, C. (2011). Amyloid β peptide oligomers directly
149
activate NMDA receptors. Cell Calcium, 49(3), 184–190. https://doi.org/10.1016/j.ceca.2011.02.001 Thompson, P. M., Hayashi, K. M., Sowell, E. R., Gogtay, N., Giedd, J. N., Rapoport, J. L., De Zubicaray, G. I.,
Janke, A. L., Rose, S. E., Semple, J., Doddrell, D. M., Wang, Y., Van Erp, T. G. M., Cannon, T. D., & Toga, A. W. (2004). Mapping cortical change in Alzheimer’s disease, brain development, and schizophrenia. NeuroImage, 23(SUPPL. 1), 2–18. https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2004.07.071
Tobore, T. O. (2019). On the central role of mitochondria dysfunction and oxidative stress in Alzheimer’s disease. Neurological Sciences, 40(8), 1527–1540. https://doi.org/10.1007/s10072-019-03863-x
Tönnies, E., & Trushina, E. (2017). Oxidative Stress, Synaptic Dysfunction, and Alzheimer’s Disease. Journal of Alzheimer’s Disease, 57(4), 1105–1121. https://doi.org/10.3233/JAD-161088
Trousson, A., Bernard, S., Petit, P. X., Liere, P., Pianos, A., El Hadri, K., Lobaccaro, J.-M. A., Said Ghandour, M., Raymondjean, M., Schumacher, M., & Massaad, C. (2009). 25-hydroxycholesterol provokes oligodendrocyte cell line apoptosis and stimulates the secreted phospholipase A2 type IIA via LXR beta and PXR. Journal of Neurochemistry, 109(4), 945–958. https://doi.org/10.1111/j.1471-4159.2009.06009.x
Uddin, M. S., Kabir, M. T., Niaz, K., Jeandet, P., Clément, C., Mathew, B., Rauf, A., Rengasamy, K. R. R., Sobarzo-Sánchez, E., Ashraf, G. M., & Aleya, L. (2020). Molecular Insight into the Therapeutic Promise of Flavonoids against Alzheimer’s Disease. Molecules (Basel, Switzerland), 25(6). https://doi.org/10.3390/molecules25061267
Ugaz, O. L. S. de. (1997). Colorantes naturales (Pontificia). Valledor, A. F., Hsu, L.-C., Ogawa, S., Sawka-Verhelle, D., Karin, M., & Glass, C. K. (2004). Activation of liver X
receptors and retinoid X receptors prevents bacterial-induced macrophage apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(51), 17813–17818. https://doi.org/10.1073/pnas.0407749101
Vepsäläinen, S., Hiltunen, M., Helisalmi, S., Wang, J., van Groen, T., Tanila, H., & Soininen, H. (2008). Increased expression of Aβ degrading enzyme IDE in the cortex of transgenic mice with Alzheimer’s disease-like neuropathology. Neuroscience Letters, 438(2), 216–220. https://doi.org/10.1016/j.neulet.2008.04.025
Verbon, E. H., Post, J. A., & Boonstra, J. (2012). The influence of reactive oxygen species on cell cycle progression in mammalian cells. Gene, 511(1), 1–6. https://doi.org/10.1016/j.gene.2012.08.038
Verghese, P. B., Castellano, J. M., & Holtzman, D. M. (2012). Roles of Apolipoprotein E in Alzheimer’s Disease and Other Neurological Disorders. Lancet Neurology, 10(3), 241–252. https://doi.org/10.1016/S1474-4422(10)70325-2.Roles
Vetrivel, K. S., & Thinakaran, G. (2010). Membrane rafts in Alzheimer’s disease beta-amyloid production. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids, 1801(8), 860–867. https://doi.org/10.1016/j.bbalip.2010.03.007
Viennois, E., Mouzat, K., Dufour, J., Morel, L., Lobaccaro, J.-M., & Baron, S. (2012). Selective liver X receptor modulators (SLiMs): what use in human health? Molecular and Cellular Endocrinology, 351(2), 129–141. https://doi.org/10.1016/j.mce.2011.08.036
Viswanathan, A., & Greenberg, S. M. (2011). Cerebral amyloid angiopathy in the elderly. Annals of Neurology, 70(6), 871–880. https://doi.org/10.1002/ana.22516
Voulgaropoulou, S. D., Amelsvoort, T. A. M. J. Van, Prickaerts, J., & Vingerhoets, C. (2019). The e ff ect of curcumin on cognition in Alzheimer ’ s disease and healthy aging : A systematic review of pre-clinical and clinical studies. Brain Research, 1725(August), 146476. https://doi.org/10.1016/j.brainres.2019.146476
Walker, L. C., Pahnke, J., Madauss, M., Vogelgesang, S., Pahnke, A., Herbst, E. W., Stausske, D., Walther, R., Kessler, C., & Warzok, R. W. (2000). Apolipoprotein E4 promotes the early deposition of Aβ42 and then Aβ40 in the elderly. Acta Neuropathologica, 100(1), 36–42. https://doi.org/10.1007/s004010051190
Wang, D., Dong, X., & Wang, C. (2018). Honokiol Ameliorates Amyloidosis and Neuroinflammation and Improves Cognitive Impairment in Alzheimer ’ s Disease Transgenic Mice. September, 470–478. https://doi.org/10.1124/jpet.118.248674
Wang, J., Einarsson, C., Murphy, C., Parini, P., Björkhem, I., Gåfvels, M., & Eggertsen, G. (2006). Studies on LXR- and FXR-mediated effects on cholesterol homeostasis in normal and cholic acid-depleted mice. Journal of Lipid Research, 47(2), 421–430. https://doi.org/10.1194/jlr.M500441-JLR200
Wang, Q., Liu, S., Hu, D., Wang, Z., Wang, L., Wu, T., Wu, Z., Mohan, C., & Peng, A. (2016). Identification of apoptosis and macrophage migration events in paraquat-induced oxidative stress using a zebrafish model. Life Sciences, 157, 116–124. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2016.06.009
Wang, Y., & Du, G. (2009). Ginsenoside Rg1 inhibits b -secretase activity in vitro and protects against A b -induced cytotoxicity in PC12 cells. 11(7), 604–612. https://doi.org/10.1080/10286020902843152
Weisgraber, K. H. (1994). Apolipoprotein E: structure-function relationships. Advances in Protein Chemistry, 41(6), 853–872. https://doi.org/10.1016/S0065-3233(08)60642-7
Witschi, H., Kacew, S., Hirai, K., & Côté, M. G. (1977). In vivo oxidation of reduced nicotinamide-adenine
150
dinucleotide phosphate by paraquat and diquat in rat lung. Chemico-Biological Interactions, 19(2), 143–160. https://doi.org/10.1016/0009-2797(77)90027-8
Wolozin, B., Kellman, W., Ruosseau, P., Celesia, G. G., & Siegel, G. (2000). Decreased prevalence of Alzheimer disease associated with 3-hydroxy-3-methyglutaryl coenzyme A reductase inhibitors. Archives of Neurology. https://doi.org/10.1001/archneur.57.10.1439
Xie, T., Akbar, S., Stathopoulou, M. G., Oster, T., Masson, C., Yen, F. T., & Visvikis-Siest, S. (2018). Epistatic interaction of apolipoprotein E and lipolysis-stimulated lipoprotein receptor genetic variants is associated with Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging, 69, 292.e1-292.e5. https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2018.04.013
Xing, Y., Tang, Y., Zhao, L., Wang, Q., Qin, W., Zhang, J. L., & Jia, J. (2016). Plasma Ceramides and Neuropsychiatric Symptoms of Alzheimer’s Disease. Journal of Alzheimer’s Disease, 52(3), 1029–1035. https://doi.org/10.3233/JAD-151158
Yadav, R. S., & Tiwari, N. K. (2014). Lipid Integration in Neurodegeneration: An Overview of Alzheimer’s Disease. Molecular Neurobiology, 50(1), 168–176. https://doi.org/10.1007/s12035-014-8661-5
Yamamoto, T., Anno, M., & Sato, T. (1987). Effects of paraquat on mitochondria of rat skeletal muscle. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Comparative Pharmacology, 86(2), 375–378. https://doi.org/10.1016/0742-8413(87)90098-3
Yan, D., Zhang, Y., Liu, L., & Yan, H. (2016). Pesticide exposure and risk of Alzheimer’s disease: A systematic review and meta-analysis. Scientific Reports, 6(February), 1–9. https://doi.org/10.1038/srep32222
Yang, C., Li, Q., & Li, Y. (2014). Targeting nuclear receptors with marine natural products. Marine Drugs, 12(2), 601–635. https://doi.org/10.3390/md12020601
Yang, C., Li, Q., & Li, Y. (2014). Targeting nuclear receptors with marine natural products. Marine Drugs, 12(2), 601–635. https://doi.org/10.3390/md12020601
Yasojima, K., Akiyama, H., McGeer, E. G., & McGeer, P. L. (2001). Reduced neprilysin in high plaque areas of Alzheimer brain: a possible relationship to deficient degradation of β-amyloid peptide. Neuroscience Letters, 297(2), 97–100. https://doi.org/10.1016/S0304-3940(00)01675-X
Yiannopoulou, K. G., & Papageorgiou, S. G. (2013). Current and future treatments for Alzheimer’s disease. Therapeutic Advances in Neurological Disorders, 6(1), 19–33. https://doi.org/10.1177/1756285612461679
Zekonyte, J., Sakai, K., Nicoll, J. A. R., Weller, R. O., & Carare, R. O. (2016). Quantification of molecular interactions between ApoE, amyloid-beta (Aβ) and laminin: Relevance to accumulation of Aβ in Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease, 1862(5), 1047–1053. https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2015.08.025
Zelcer, N., Khanlou, N., Clare, R., Jiang, Q., Reed-Geaghan, E. G., Landreth, G. E., Vinters, H. V., & Tontonoz, P. (2007). Attenuation of neuroinflammation and Alzheimer’s disease pathology by liver x receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(25), 10601–10606. https://doi.org/10.1073/pnas.0701096104
Zhang, W., Xiong, H., Callaghan, D., Liu, H., Jones, A., Pei, K., Fatehi, D., Brunette, E., & Stanimirovic, D. (2013). Blood-brain barrier transport of amyloid beta peptides in efflux pump knock-out animals evaluated by in vivo optical imaging. Fluids and Barriers of the CNS. https://doi.org/10.1186/2045-8118-10-13
Zhao, Z., Xiang, Z., Haroutunian, V., Buxbaum, J. D., Stetka, B., & Pasinetti, G. M. (2007). Insulin degrading enzyme activity selectively decreases in the hippocampal formation of cases at high risk to develop Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. https://doi.org/10.1016/j.neurobiolaging.2006.05.001
Zheng, X., Zhang, Z., Chou, G., Wu, T., Cheng, X., Wang, C., & Wang, Z. (2009). Acetylcholinesterase inhibitive activity-guided isolation of two new alkaloids from seeds of Peganum nigellastrum Bunge by an in vitro TLC- bioautographic assay. Archives of Pharmacal Research, 32(9), 1245–1251. https://doi.org/10.1007/s12272-009-1910-x