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B r .J . P h a r m a c .( 1 9 7 4 ) , 5 0 , 4 0 9 - 4 1 7

BIOASSAY OFOXYTOCINON THESUPERFUSEDMAMMARY GLANDOF THE MOUSE,USING AN AUTOMAT ICAPPARATUSI . C . A . F .ROBINSON& J . M . WALKERD e p a r t m e n to f P h a r m a c o l o g y ,S o u t h P a r k sR o a d ,O x f o r d ,OXI 3QT

1 A s e n s i t i v eme thod o f a s s a y i n g o x y t o c i n us i ng t h e s u p e r f u s e d mouse mammary g l a n d i sd e s c r i b e d . T h e m e t h o di s s h o w n t o b e r e l i a b l e ,a c c u r a t e a n d p r e c i s e .A s s a y s a r e p e r f o r m e da u t om a t i c a l l ya n d t h e p r e p a r a t i o ni s s t a b l ef o ra t l e a s t1 8 h o u r s .2 T h e p r e p a r a t i o n i s r e l a t i v e l yi n s e n s i t i v et o b r a d y k i n i n , h i s t a m i n e , 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ,a n g i o t e n s i n , p r o s t a g l a n d i n F 2 a ,a d r e n a l i n e a n d n o r a d r e n a l i n e . The c o n t r a c t i o n s p r o d u c e db ya c e t y l c h o l i n e ca n b e a b o l i s h e d b y a t r o p i n e w i t h o u t t h e s e n s i t i v i t yt o o x y t o c i nb e i n g a f f e c t e d .3 Va s o p r e s s i nh a s a v a r i a b l ea c t i v i t yon t h e p r e p a r a t i o n ; i t s p o t e n c y ca n b e a s h i g h a s o n e - f i f t ht h a to f o x y t o c i n .4 I t i s c o n c l u d e dt h a t t h i sm e t h o dcompares f a v o u r a b l yw i t h o t h e r p u b l i s h e dm e t h o d s .

I n t r o d u c t i o n

B i o a s s a y s b a s e d o n t h e r e s p o n s e o f mamma r yt i s s u et o o x y t o c i n h a v e b ee n d e v e l o p e d b y anumber o f w o r k e r s , u s i n g t i s s u ef r o m v a r i o u ss p e c i e sb o t h i n v i v o a n d i n v i t r o( s e eF i t z p a t r i c k&Ben t l e y, 1 9 6 8 , f o rr e f e r e n c e s ) ,b u t s u p e r f u s i o no ft h i so r g a nh a s n o t b e e n d e s c r i b e d .

We h a v e d e v e l o p e d a m e t h o do f s u p e r f u s i n gas t r i po f mous e mamma r y g l a n d ,w h i c hh a s c e r t a i na d v a n t a g e so v e r e x i s t i n ga s s a y s .I t h a s b e e n d e m o n -s t r a t e dt o t h e P h y s i o l o g i c a lS o c i e t y( R o b i n s o n&Wa l k e r , 1 9 7 3 ) .

M e t h o d s

P r e p a r a t i o n

M i c e ( T u c k N o . 1 s t r a i n )a r e u s e d d u r i n g m i d -l a c t a t i o n ,t h e l i t t e rh a v i n gb e e n r e m o v e df r o mt h em o t h e r 3 h b e f o r e s t a r t i n gt h e a s s a y t o a l l o w t h emamma r y g l a n d s t o become e n g o r g e dw i t h m i l k .

U n d e r l i g h te t h e r a n a e s t h e s i a ,a c u t i s m a d ea l o n g t h e l i n eo f t h e l ow e r t e a t son o n e s i d e ,a n dt h e mamma r y g l a n d m a s s s u p p l y i n g t h e s e t e a t s i se x p o s e d . A p i e c eo f t h i s t i s s u ei s c u t ou t , p l a c e do n a c o r k b o a r d i n a p o o l o f Ty r o d e s o l u t i o n a n dt r i m m e dt o a t h i n s t r i pm e a s u r i n ga p p r o x im a t e l y4 0 x 3 x 3 mm . T h e s t r i pi s s u s p e n d e df r o m as t r a i ng a u g e t r a n s d u c e r ( D e v i c e sST. 0 1 , mo d i f i e df o rh i g h s e n s i t i v i t y )s o t h a tc o n t r a c t i o n s may b er e c o r d e d b y m e a n s o f a n a m p l i f i e rw i t h a h i g h

f r e q u e n c yf i l t e r( D e v i c e sS . 1 )o n a p o t e n t i o m e t r i cr e c o r d e r ( S e r v o s c r i b eRE 5 1 1 ) . T h e l o w e r e n d o ft h e t i s s u ei s f i x e d b y a h o o k a n d t h r e a d i n ah o l l o w s u p p o r t ( F i g u r e1 ) . T h i s a r r a n g e m e n ta l l ow s t h e s u p e r f u s i o nf l u i dt o f l o w o f f t h e l o w e re n d o f t h e t i s s u ei n a c o n t i n u o u ss t r e am , a n d t h ed r o p s u l t ima t e l y f o r mb e n e a t h a s e co n d, i n de pe n-d e n t s u p p o r t , w h e r e t h e y f a l l t o wa s t e . T h es u p e r f u s i o no u t l e ti s p l a c e d c l o s et o t h e t o p o f t h et i s s u es o t h a td r o p s d o n o t f o r ma t t h i sp o i n t .I nt h i sw a y , f l u c t u a t i o n si n t h e we i gh t o ft h e f l u i do nt h e t i s s u ec a u s e d b y d r o p s f a l l i n go n a n d o f ft h es t r i pa r e a v o i d e d , a n d t h e sm a l l c h a n g e si n t e n s i o np r o d u c e d b y o x y t o c i n c a n b e r e c o r d e d m o r ec l e a r l y .

A p p a r a t u sS i n c e t h e s u p e r f u s i o n m u s t b e c o n t i n u o u s , am e t h o d o f d e l i v e r i n gsm a l l d o s e s o f o x y t o c i n t ot h e t i s s u ew i t h o u t i nt e r rup t i ng t he f l o w w a sd ev i s e d . The s t r i pi s s u p e r f u s e d a t a r a t eo f 0 . 5m l / m i na t r o om t e m p e r a t u r e b y a r o l l e rp u m p .F l u i d i s d r a w n b y t h e p ump t h r o u g h a l e n g th o fv i n y lt u b i n g f r o m a r e s e r v o i r ,a n d m o d i f i e dr e l a y sa r e u s e d t o c o n t r o l t h e f l o w.A r e l a ym o v e sa b r a s sr o d b e t w e e n t w o s t o p s mad e o f p e r s p e x . T u b i n gp a s s e s on e i t h e rs i d eo f t h e r o d a n d i s p i n c h e db e t w e e n i t a n d o n e o f t h e s t o p s .Wh a t e v e rt h ep o s i t i o no f t h e r e l a y ,o n e t u b e i s o c c l u d e da n d t h eo t h e r i s o p e n ( F i g u r e2 ) . One o f t h e t u b e s l e a d s

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410 I . C . A . F . ROB INSON& J . M . WALKER

I

h

F i g . 1 D i a g r a m s h o wi n gs t r i po f mo u s e m amm a r yg l a n d s e t u p f o r s u p e r f u s i o n . Th e h o l l o w l o w e rs u p p o r t a l l o w s a c o n t i n u o u sf l o w o f s u p e r f u s i n gf l u i d .( a ) C o t t o n t h r e a d , ( b ) h o o k , ( c ) m amm a r y s t r i p ,( d )h o l l o w s u p p o r t , ( e ) f l u i do u t l e t ,( f ) c o t t o n t h r e a d , ( g )d r o p f o r m s , ( h )t o w a s t e .

f r o m t h e r e s e r v o i r ,a n d t h e o t h e r d i p s i n t o as a m p l e po t . The t u b e s j o i nt o g e t h e r b e t w e e n t h er e l a y a n d t h e pump; w i t h t h e p ump r u n n i n gc o n t i n u o u s l y , f l u i d i s d r a w n t h r o ug h w h i c h ev e r

t u b e i s o p e n . When t h e r e l a y i s o p e r a t e d , t h e r o do c c l u d e s t h e t u b e f r o m t h e r e s e r v o i ra n d o p e n s t h et u b e f r o m t h e s am p l e . A t a r a t eo f f l o w o f 0 . 5

m I / m i n , o p e r a t i o n o f t h e r e l a yf o r I m i n a l l ow st h e p um p t o d e l i v e ra d o s e o f 0 . 5m l o f t h e s a m p l et o t h e t i s s u ew i t h o u t i n t e r r up t i o n o f f lo w. I n t h ea p p a r a t u s s h own i n F i g .3 , f o u r s u c h r e l a y s a r eus e d ; t h e t u b e f r o m t h e r e s e r v o i rp a s s e s t h r o u g ho n e s i d eo f e a c h i n t u r n , a n d f ou r t u b e s l e a d i n g

f r o m d i f f e r e n ts a m p l e p o t s a r e o c c l u d e d b y t h er e l a y s .T h e t u b e s f r o m t h e s a m p l e s j o i n t h er e s e r v o i rt u b i n g p a s t t h e r e l a ya s s e m b l y a t al o w - v o l u m es i x -w ay j un ct i o n.When a n y r e l a yi so p e r a t e d , t h e t u b e f r o m t h e r e s e r v o i ri s o c c l u d e da n d 0 . 5m l o f o n e o f t h e s a m p l e s i s d e l i v e r e d t ot h e mamma r y s t r i p .

Au toma t i c a s s a y s

T h e r e l a y sc a n b e o p e r a t e d b y h a n d , b u t i t i s mor ec o n v e n i e n t t o o p e r a t e t h e m a u t om a t i c a l l y . The

c o n t r o l u n i t( B e l l ,1 9 7 3 ) c o n s i s t s e s s e n t i a l l yo f ac l o c k , t w o b a t c h i n g c o u n t e r s , a m a t r i x u n i t ,a n dr e l a yd r i v i n g c i r c u i t s .I t i sp o s s i b l et o s e t w i t h i nw i d e l i m i t sb o t h t h e i n t e r v a lb e t w e e n d o s e s a n dt h e amoun t o f e a c h d o s e , a n d t h e r e l a y sc a n b eo p e r a t e d i n d e p e n d e n t l y. T h e m a t r i x p a n e l e n a b l e spu l s e s t o b e d i r e c t e d t o a n y r e l a yi n a n y o r d e r .I ti s t h e r e f o r e p o s s i b l et o p r o g r a ma f u l lf o u r - p o i n ta s s a y o f u p t o 4 0 r a n d o m i z e dd o s e s i n o n e c y c l e ,a f t e rw h i c ht he p a tt er n i s r e p e a t e d i f r e q u i r e d .

T h e e q u i p m e n ti s r e l i a b l e ,d e l i v e r sa c c u r a t e a n dr e p e a t a b l e do s e s , a n d w i l lr u n u n a t t e n d e d f o rl o n gp e r i o d s .T h e p r e p a r a t i o n t a k e s 1 0 m i n t o s e t up ,a n d i t i s o n l y n e c e s s a r y t o p l a c e t h e s a m p l e s i np o s i t i o n ,p r o g r a mt h e d e s i g n o f t h e a s s a y on t h em a t r i x p a n e l a n d s w i t c h o n t h e c on t r o l u n i t f o rt h e a s s a y t o b e c o m p l e t e da u t oma t i c a l l y.

D r u g sand s o l u t i o n s

T h e s u p e r f u s i o n f l u i du s e d w a s m o d i f i e d Ty r o d es o l u t i o n d e s c r i b e d b y R o c a , G a r 6 f a l o , G i o i a d eC o c h , A r o c e n a& Coch ( 1 9 7 2 )a s ' Ty r o d e 9 0 ' . I tc o n t a i n e d ( g ) :N a C l8 . 0 ;KC I0 . 2 0 ; M g C l 2. 6H200 . 1 0 ; C aC l2 a n h y d r o u s0 . 1 7 ; Na2HPO4 12H200 . 0 0 5 5 ; NaHCO3 1 . 0 ;g l u c o s e 1 . 0 ;mad e u p t o11 0 0m l w i t h d i s t i l l e dw a t e r a n d g a s s e d t o pH 7 . 4w i t h 5% CO2 a n d 95% 0 2 . F o r c o n v e n i e n c et h i si sr e f e r r e dt o a sTy r o d es o l u t i o n .

The f o ll ow i ng d ru gsw e r e u s e d : S y n t h e t i c o x y -t o c i n ( S y n t o c i n o n , S a n d o z ) b a t c h No 1 0 2 7 2r e - a s s a y e da g a i n s tt h e T h i r d I n t e r n a t i o n a l S t a n d a r df o r O x y t o c i c , Va s o p r e s s o ra n d An t i d i u r e t i c S u b -s t a n c e s ( B a n g h a m& Mus s e t t , 1 9 5 8 ) on t h e r a tu t e r u s . S y n t h e t i c l y s i n e 8- v a s o p r e s s i n ( S y n t o -p r e s s i n ,S a n d o z ) ; h i g h l y p u r i f i e da r g i n i n e 8 - v a s op r e s s i np r e p a r e d b y D r L . O . U t t e n t h a l i n t h i s

d e p a r t m e n t a n d a s s a y e d a g a i n s tt h e I n t e r n a t i o n a lS t a n d a r d on t h e b l o o d p r e s s u r e o f t h e r a t ; s y n -t h e t i ca n g i o t e n s i n( Va l 5- a n g i o t e n s i na m i d e ,H y p e r -

I

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A I

I

A

/ t

' D

C

F i g .2 D i a g r a ms h o w i n gt h e m e c h a n i s mo f a r e l a y .( 1 )A t r e s t ,t u b e AB i s o c c l u d e d a n d s u p e r f u s i o nf l u i di spumped t h r o u g h t u b e D C . ( 2 )When t h e r e l a yi s o p e r a t e d , t u b e DC i s o c c l u d e d a n d t h e s amp l e i s p u m p e dt h r o u g h t u b e A B . A t t h e e n d o f t h e d o s e ,t h e r e l a yi s s w i t c h e d b a c k t o p o s i t i o n1 a n d s u p e r f u s i o nf l u i di spumped o n c e m o r e .

1 2

F i g .3 D i a g r a mo f t h e a u t o m a t i c a s sa y a p pa r a tu s . ( 1 ) S t r a i n - g a u g e t r a n s d u c e r ; ( 2 ) h i g h - f r e q u e n c yf i l t e r ;( 3 )

a m p l i f i e r ;( 4 )p o t e n t i om e t r i c r e c o r d e r ;( 5 )c o n t r o l u n i t ;( 6 )ma r k e r ; ( 7 )r e l a yd r i v e r s ;( 8 )mamm a r y s t r i p ;( 9 )t owa s t e ; ( 1 0 )r o l l e rpump ; ( 1 1 )l o w - v o l u m ej u n c t i o n ; ( 12 )e l e c t r om a g n e t i cr e l a y s ;( 1 3 )a s s a y s o l u t i o n s ;( 1 4 )s u p e r f u s i o nf l u i d .

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412 I . C . A . F. ROB INSON& J . M . WALKER

F i l t e ro n

5 0mg

O x y t o c i n5 p u 5 5 5 5 5 50 0 0 0 0 0

F i g .4 S u p e r f u s e d mouse mammary g l a n d . C o n t r a c t i o n s p r o d u c e d by r e p e a t e d d o s e s o f 5 , u o x y t o c i n . Th ef i g u r e s h o w st h e e f f e c to f t he h i gh - f r eq ue nc yf i l t e ron t h e r e c o r d o b t a i n e d .

t e n s i n , CIBA); atropine s u l p h a t e , b r a d y k i n i nt r i a c e t a t e ,a c e t y l c h o l i n e c h l o r i d e , 5 - h y d r ox y t r y p -t a m i n e c r e a t i n i n e s u l p h a t e , h i s t a m i n e , n o r a d r e n a -l i n e b i t a r t r a t e ( S i g m a ) ; a d r e n a l i n e ( K o c h - L i g h t ) .P r o s t a g l a n d i n F 2 a Cw a s s u p p l i e d by P r o f e s s o r J . R .Va n e .

A l l d r u g s w e r e d i l u t e d i n Ty r o d e s o l u t i o ni m m e d i a t e l yb e f o r e u s e . The c o n c e n t r a t i o n so f t h es a l t sa r e e x p r e s s e di n t e r m s o f t h e f r e e b a s e .

a

2 5 1 0 2 0 4 0 60 1 0 0

Ox y t o c i n( p u )

Results

R e s p o n s e st o o x y t o c i n

R e s p o n s e sc o u l d b e o b t a i n e d o v e r a w i d e r a n g e o fi n i t i a lt e n s i o n s , a n d t h e u s u a l t e n s i o n u s e d was 400t o 500 m g. A l t e r a t i o n o f t h e t e n s i o n d u r i n g t h ea s s a y u s u a l l y r e d u c e d t h e r e s p on s e s a n d s o t h i swasa v o i d e d . A t t h e h i g h e s t r e c o r d i n g s e n s i t i v i t yu s e d ,

b7 5 '

C 50E

0

C O )C :

2 5 0 Ua a I I.

r- n r 4 %f _U 5 1 t 0 u

O x y t o c i n( p J u )5U 1 0 0

F i g .5 S u p e r f u s e dmouse mammary s t r i p .( a )R e p r e s e n t a t i v ec o n t r a c t i o n s t o a w i d e r ange o f d o s e s o f o x y t o c i n

g i v e n d u r i n g a n e x p e r i m e n t . T r a c e no t c o n t i n u o u s ; t h e r e s pon s e s a r e a r r a n g e d i n o r d e r o f i n c r e a s i n gd o s e . ( b )Ad o s e - r e s p o n s ec u r v e c o n s t r u c t e d f rom s i m i l a r r e s u l t sf rom a n o t h e r e x p e r i m e n t . Each p o i n t i s t h e mean o f t h r e er e s p o n s e s .

, 2 0 m i

I

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ASSAY OF OXYTOC INON SUPERFUSEDMAMMARY GLAND 413

t h e b a s e l i n ew o u l d s o m e t i m e ss h o w a s l o w d r i f t ,b u t t h e r e s p o n s e s o b t a i n e d w e r eu n a f f e c t e d b yd r i f t so f u p t o 10% o f f u l ls c a l ed e f l e c t i o npe rh o u r .

M i n o rm e c h a n i c a ld i s t u r b a n c e s c a u s e d b y t h ef l o w o f s up er f us i on c o ul db e s e e n o n t h e t r a c e ,

p a r t i c u l a r l yi f t h e s u p e r f u s i o n o u t l e th a d b e e ni n c o r r e c t l yp l a c e d ,c a u s i n g sm a l l d r o p s t o f o r m .F i g u r e4 s h o w s t h e e f f e c t so f p a ss in g t h e s i g n a lt h r o u g h a h i g h f r e q u e n c y f i l t e r .T h e f a s tf l u c t u a -t i o n so n t h e b a s e l i n eh a v eb e e ne l i m i n a t e d ,a n d t h ep e a k s a r es e e n m o r ec l e a r l y .A l le xp er i m e nt s w e r er e c o r d e du s i n g t h i sf i l t e r .

T h e s e n s i t i v i t yo f t h e p r e p a r a t i o n t o o x y t o c i nv a r i e df r o m a s s a y t o a s s a y .T h e l o w e s t d o s e t h a tg a v e c o n s i s t e n tr e s p o n s e s w a s 0 . 4 4m u , b u t t h el o w e s t d o s e s a t i s f a c t o r yf o r a s s a y p u r p o s e s w a sa b o u t 2 M u ,w h i c hr e q u i r e sa c o n c e n t r a t i o ni n t h es a m p l eo f 4 mu /m l .T h i s i s t h e s a m e

s e n s i t i v i t yt h a t

w a s o b t a i n e d i n p r e l i m i n a r ye x p e r i m e n t si n w h i c ht h e mamma r y s t r i pw a s s u s p e n d e d i n a b a t h o f4 m l c a p a c i t y ,b u t s i n c e1 6 M u a r e r e q u i r e d t oa c h i e v e t h i sc o n c e n t r a t i o nb y t h i sm e t h o d ,s u p e r -f u s i o n e f f e c t i v e l yi n c r e a s e s t h e s e n s i t i v i t ye i g h tt i m e s .I t i s p o s s i b l et o i n c r e a s et h e e f f e c t i v es e n s i t i v i t ys t i l l f u r t h e rb y r e d u c i n g t h e r a t e o fs u p e r f u s i o n .T h e r e s u l t sp r e s en t e d h e r e w e r eo b t a i n e da t a r a t eo f 0 . 5m l /m i n u t e .

T h e mamma r y s t r i pc on t ra c t s t o o x y t o c i no v e ra w i d e r a n g e o f c o n c e n t r a t i o n s .T h e r e s p o n s e s t oi n c r e a s i n gd o s e s a r e s e e n i n F i g .S a ,a n d a d o s e -r e s p o n s e c u r v e o b t a i n e d i n a n o t h e r e x p e r i m e n ti sp l o t t e d i n F i g u r eS b .T h e r e s p o n s e s w e r e a l w a y ss i n g l ep e a k s ; no s p o n t a n e o u s a c t i v i t yw a s e v e ro b s e r v e d .

T h e c o n t r a c t i o n s t o r e p e a t e d d o s e s o f o x y t o c i nw e r e r e l a t i v e l yc o n s t a n t o v e r a l o n g p e r i o d ,t h o u g ht h e r ew a s o f t e n a g r a d u a li n c r e a s ei n s e n s i t i v i t yu n t i l a b o u t 8 h a f t e r t h e s t a r t o f t h e a s s a y .

2 0 r

o c

a )

0 4 6T i m e( h )

8 1 0 1 2

F i g . 6 C o n t r a c t i o n s o f t h e s u p e r f u s e d mamma r ys t r i pt o o x y t o c i n . D o s e so f 2 M u w e r e g i v e n a t 1 0 m i ni n t e r v a l so v e r a p e r i o d o f 1 2 hou r s . E a c h p o i n t i s t h eme a n s . e .o f s i xr e s p o n s e s .

F i g u r e 6 s h o w sa n e x p e r i m e n ti n w h i c ha l o w d o s eo f o x y t o c i n ( 2Mu)w a s g i v e n a t 1 0 m i n i n t e r v a l so v e r a p e r i o d o f 1 2 h o u r s .

I t w a s u s u a l l yn e c e s s a r y t o wa i t 1 0 m i nb e t w e e n d o s e s , s i n c ei f t h e y w e r e g i v e n mor ef r e q u e n t l yt a c h y p h y l a x i so f t e n o c c u r r e d . T h e d i s - 'a d v a n t a g e o f t h e l o n g i n t e r v a lr e q u i r e d b e t w e e nd o s e s i n a n a s s a y i s p a r t i a l l yo f f s e tb y t h i sa b i l i t yo f t h e p r e p a r a t i o n t o r e s p o n do v e r a l o n g p e r i o d ,a n d m o s t a s s a y s w e r e r u n f o ra t l e a s t1 8 h o u r s .

T h e r e s u l t so f e i g h tf o u r - p o i n ta s s a y s ,i nw h i c hs o l u t i o n sc o n t a i n i n g known a m o u n t so f o x y t o c i nw e r e a s s a y e d a g a i n s te a c h o t h e r ,a r e s h o w n i nTa b l e 1 . T h e mea n e r r o r , i . e . t h e d i f f e r e n c eb e t w e e n t h e e s t i m a t e d a n d known c o n c e n t r a t i o ne x p r e s s e d a s a p e r c e n t a g e , w a s 2 . 6 0 . 37% ( s . e . ) ,t h e mean i n d e x o f p r e c i s i o n( X )w a s 0 . 0 4 4 7 0 . 0 0 5 7 ( s . e . ) ,t h e mean f i d u c i a ll i m i t sa t P = 0 . 0 5w e r e 1 1 . 3 % ,a n d t h e r e w a s no s i g n i f i c a n td e v i a -t i o n f r o m p a r a l l e l i s mi n a n y o f t h e a s s a y s .T h e s e

Ta b l e 1 S t a t i s t i c a la n a l y s i so f a s e r i e so f f o u r - p o i n t a s s a y s o f o x y t o c i n

D o s e ( M u ) P o t e n c yr a t i oA s s a y l o w h i g h t r u e f o u n d

1234567

8

5 . 55

1 01 0 0

3 . 33 . 7

1 0

1 7 . 5

1 11 02 0

2 0 055 . 5

1 5

2 5

1

1

0 . 9 8 50 . 9 6 91 . 0 3 01 . 0 1 31 . 0 1 60 . 9 3 20 . 9 5 9

0 . 9 7 3Mean s . e .

t %

F i d u c i a l% I n d e x o f l i m i t s Numbe r o f

E r r o r p r e c i s i o n ( A J ( P= 0 . 0 5 ) g r o u p s

1 . 53 . 13 . 01 . 31 . 63 . 64 . 1

2 . 72 . 60 . 3 7

0 . 0 6 2 00 . 0 1 3 40 . 0 4 4 00 . 0 4 1 50 . 0 4 1 20 . 0 3 6 10 . 0 6 2 1

0 . 0 5 7 10 . 0 4 4 70 . 0 0 5 7

1 3 . 23 . 4 1

1 3 . 7 47 . 3 5

1 1 . 09 . 2 3

1 6 . 7

1 5 . 4 21 1 . 31 . 5 7

6437454

4

I a 9 I - a L- i 11n

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6/9

414 I . C . A . F. ROBINSON& J . M . WALKER

f i g u r e si n d i c a t e t h a ta u t o m a t i ca s s a y sc a r r i e do u tu n d e r t h e s ec o n d i t i o n s a r e r e l i a b l e ,a c c u r a t e a n dp r e c i s e .

R e s p o n s e st o o t h e r s u b s t a n c e s

T h e s p e c i f i c i t yo f t h e a s s a y w a s t e s t e db y g i v i n gd o s e s o f o x y t o c i n a n d v a r i o u so t h e r s u b s t a n c e sa l t e r n a t e l y .E a c h s u b s t a n c ew a s t e s t e don a t l e a s tt h r e e d i f f e r e n to c c a s i o n s ,a n d t h e r e s u l t sa r es h o w ni n Ta b l e 2 .

I t w i l lb e s e e n t h a t t h e p r e p a r a t i o ni s r e l a t i v e l ys p e c i f i cf o ro x y t o c i n ; t h e o n l y s u b s t a n c e sl i k e l yt ob e p r e s e n t i n b o d yf l u i d si n s u f f i c i e n tq u a n t i t i e st oi n t e r f e r ew i t h a s s a y s a r ea c e t y l c h o l i n ea n d v a s o -p r e s s i n .T h e r e s p o n s e s t o a s much a s 5 0 0n ga c e t y l c h o l i n ea r e c omp l e t e l y a b o l i s h e d b y t h ea d d i t i o n o f a t r o p i n e 2 0, g / m l t o t h e s u p e r f u s i n g

f l u i d ,a n d t h i s d o e s n o t a f f e c tt h e r e s p o n s e s t osm a l l a m o u n t so f o x y t o c i n . Va s o p r e s s i np r o d u c e dc o n t r a c t i o n s s i m i l a rt o t h o s e o f o x y t o c i n . I t sp o t e n c y , h o w e v e r , c o u l d n o t b e e x p r e s s e da s as i n g l ev a l u e i n t e r m s o f a c t i v i t yo f o x y t o c i non t h i s

Ta b l e 2 T h r e s h o l d d o s e s o f s u b s t a n c e sc o n t r a c t i n gt h e s u p e r f u s e dmamma r y s t r i p

S u b s t a n c e

O x y t o c i nA r g - Va s o p r e s s i nLy s 8 - Va s o p r e s s i nA c e t y l c h o l i n eB r a d y k i n i nV a l5 - A n g i o t e n s i n am i d eA d r e n a l i n eN o r a d r e n a l i n eH i s t a m i n e5 - H y d r o x y t r y p t a m i n eP r o s t a g l a n d i nF 2 .

T h r e s h o l d( n g )

1 0 - 31 1 X 1 0 - 38 . 5x 1 0 - 30 . 2

3 . 5x 1 0 31 2 5>5 x 1 0 2*>5 x 1 0 2*2 . 5 x 1 0 '>5 x 1 0 4 *1 0 3

The d o s e sw e r eg i v e n i n v o l u m e so f 0 . 5 m l .* No c o n t r a c t i o nwas o b s e r v e da t t h i sd o s e .

t i s s u e ,s i n c et h e d o s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r b o t hl y s i n e 8 - v a s o p r e s s i na n d a r g i n i n e 8 - v a s o p r e s s i nw e r en o t p a r a l l e lt o t h o s e o f o x y t o c i n , a n d t h u s t h ea p p a r e n t p o t e n c y d e p e n d su p o n t h e d o s e a tw h i c h

Ta b l e 3 Some a s s a y s f o ro x y t o c i nu s i n gm amm a r y t i s s u e

O x y t o c i n

Me thod

L o w e s td o s eT h r e s h o l d (w o* d u uf o r

* f R e f . d o s e 6 A u u )c o n c . ( , u u / m l J r o u t i n e a s s a y

M i n . c o n c .( u / m i )

r e q u i r e d i na s s a y s a m p l e

( 1 ) I n v i v oG u i n e a - p i gR a tR a t

( 2 ) I n v i t r oR a b b i ts t r i pR a t s t r i pR a t s t r i p

R a t s t r i pR a t m i l ke x p u l s i o nR a t m i l ke x p u l s i o nR a tt r a n s p a r e n c yMou s e s t r i pMous e s t r i pS u p e r fu s e dmouse s t r i p

( 1 ) ( 2 )( 3 )( 4 )

( 5 )( 6 )( 7 )

( 4 ) ( 8 )

1

1

0.5

1 0 02 x 1 0 3

2

1

(9 ) 1 0 - ' 1

1 655

1 0 0200

0 . 5

1

1 - 8 1

5004 x 1 0 '

50

251 0 - 6

( 1 0 ) 4 . 4 x 1 0 - 5 4 . 4 X 1 0 - 3 2 . 2 x 1 0 - 2

( 1 1 )

( 1 2 )( 1 3 )

( 1 4 )

0 . 2 51 00 . 2

0 . 4 4

0 . 2 550 . 1

0 . 8 8

0 . 5202

2

3 22525

1 0 4

5 t

25

0 . 0 8 00 . 0 7 40 . 0 7 9

0 . 9 9 3

0 . 1 1 5

0 . 0 8 7

3 . 77 . 1

3 . 9

1 0 - 4 1 . 0 2 6 -

2 . 2 - -

51 01

0 . 1 0 8 2 . 50 . 0 4 6 -

4 0 . 0 4 5 2 . 6

* ( 1 )T i n d a l & Yokoy ama , 1 9 6 2 ( 2 ) F o l l e y & K n a g g s ,1965 ( 3 )B i s s e t e t a l . , 1967 ( 4 )F a b i a n , F o r s l i n g , J o n e s &L e e , 1 9 6 9 ( 5 ) Moore & Z a r r o w , 1965 ( 6 ) Smi th , 1961 ( 7 ) Ryden & S j o h o l m ,1962 ( 8 ) Brove t to , O l h a b e r r y ,

G i o i a d e C o c h , C o d a ,F i e l i t z ,C a b o t , F r a g a& C o c h , 1967 ( 9 )Va n Dongen & H a y s , 1966 ( 1 0 )Van Dongen &Ma r s h a l l , 1 9 6 7 ( 1 1 ) B i l e k e t a l . , 1 9 7 1 ( 1 2 ) F i e l i t z ,R o c a , M a t t e i , M e l a n d e r ,G a r o f a l o ,G i o i a d e Coch & C o c h ,1970 ( 1 3 ) Roca e t a., 1 9 7 2 ( 1 4 ) presen t p a p e r .

X E r r o r

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A SSAY OFOXYTOC INON SUPERFUSEDMAMMARY GLAND 415

t h e c o m p a r i s o n i s m a d e . I n s ome a s s a y si t sa p p a r e n t p o t e n c y w a s a s much a so n e - f i f t ht h a to fo x y t o c i n .

D i s c u s s i o n

M o s t m e t h o d s o f a s s a y i n go x y t o c i n b i o l o g i c a l l yd e p e n d o n i t s a c t i o n i n l owe r i n g t h e b l o o d -p r e s s u r e o f t h e f o w l ,c o nt ra c ti ng t he u t e r u s ,o rc on t r ac ti ng t h e myo e p i t h e l i a l e l e m e n t s i n t h emamma r y g l a n d .T h e b l o o d - p r e s s u r e m e t h o d( Co o n , 1 9 3 9 )i s i n s e n s i t i v ea n d u s e f u lo n l y f o rt h ea s s a y o f t h e l a r g ea m o u n t so f o x y t o c i nt h a to c c u ri n e x t r a c t s o f t h e n e u r o h y p o p h y s i so r f o r d e t e r -m i n i n g t h e o x y t o c i c p o t e n c y o f s y n t h e t i cp e p t i d e s .M e t h o d su s i n g t h e u t e r u s ( H o l t o n ,1 9 4 8 )a r e s o m e w h a tmore s e n s i t i v e ,p a r t i c u l a r l yi f t h ea n i m a l i s p r e t r e a t e d w i t h s t i l b o e s t r o l( F o l l e t t&Ben t l e y, 1 9 6 4 ) a n d t h e u t e r u s i s s u p e r f u s e d( F i t z p a t r i c k ,1 9 6 1 ) , b ut t h e o r g a n r e s p o n d s i na d d i t i o n t o many o t h e r s u b s t a n c e sw h i c ha r el i k e l yt o b e p r e s e n t i n c o n c e n t r a t e d e x t r a c t s o f b o d yf l u i d s( B i s s e t& Lew i s , 1 9 6 2 ) .O nl y m e t h o d su s i n g

t h e mamma r y g l a n d a r e s e n s i t i v ea n d s p e c i f i ce n o u g h f o r t he d et ec t i o n a n d a s s a y o f t h e sm a l lq u a n t i t i e so f t h e h o r m o n ep r e s e n t i n p l a s m aa n du r i n e ( F i t z p a t r i c k& B e n t l e y ,1 9 6 8 ) .

Many m e t h o d s u s i n g t h e mamma r y g l a n di nv ol v e t h e m e a s u r e m e n to f i n t r a m a m m a r yp r e s -s u r e i n v i v o .T h e t e a to f t h e a n a es t h et i z edl a c t a t i n ga n i m a li s c a n n u l a t e d , o x y t o c i n i s i n j e c t e di n t o t h eb l o o d s t r e a m a n d c h a n g e s i n t h e p r e s s u r e a r er e c o r d e d . S u i t a b l e a n i m a l s a r e t h e r a b b i t( F i t z -p a t r i c k ,1 9 6 1 ) , g ui ne a- pi g ( Ti n da l& Yo k o y a m a ,1 9 6 2 )a n d r a t ( B i s s e t ,C l a r k ,Ha l d a r ,H a r r i s ,L e w i s& R o c h a e S i l v a ,1 9 6 7 ) . I t i s p o s s i b l e t o o b t a i ng r e a t e rs e n s i t i v i t yb y g i v i n gi n j e c t i o n sd i r e c t l yi n t ot h e a r t e r i a ls up pl y , s o t h a t t h e o x y t o c i nr e a c h e s i t ss i t e o f a c t i o n i n h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s ( F i t z -p a t r i c k ,1 9 6 1 ;B i s s e te t a l . , 1 9 6 7 ) .O t h e r w o r k e r sh a v e u s e d t h e mamma r y g l a n d i n v i t r o ;a s t r i po f

t i s s u ei s s u s p e n d e d i n a n o r g a n b a t h , a n d t h ei n c r e a s e si n t e n s i o n c a u s e d b y o x y t o c i n a r er e c o r d e d (M e n d e z - B a u e r ,C a b o t & C a l d e y r o -B a r c i a ,1 9 6 0 ;Ryden & S j 6 h o l m ,1 9 6 2 ;R o c ae t a l . ,1 9 7 2 ) .A l t e r n a t i v e l y ,f r a gm e n t so f g l a n d may b eo b s e r v e d u n d e r a m i c r o s c o p e ;t h e l a t e n tp e r i o d

O t h e r s u b s t a n c e s

A p p r o x .A p p r o x . p o t e n c y o f95% A VP r e l a t i v e

f i d u c i a l t o o x y t o c i nl i m i t s ( % J Ach B r Ang A NA H i s t

( 1 ) Min imum e f f e c t i v ed o s e ( n g )1 6 1 0 3 1 0 34 1 0 0 1 . 5x 1 0 4

( 2 ) Minimum e f f e c t i v ec o n c e n t r a t i o n ( n g / m l )2 . 5 x 1 0 4 - - 1 0 0

1 0 - 3 - - 1 0 - 2- > 1 0 3 > 1 0 3 -

5 x 1 0 3 _ 1 . 8x 1 0 4 1 . 1x 1 0 4- - >2 x 1 0 4 1 0 0

- 1 . 2 5 x 1 0 '

1 0 - 2 1 0 - 2

>5 x 1 0 4

1 0

- 1 0 0

34 %15%

38**20

1 . 3 x 1 0 - ' 450

0 . 620

21 0 3

- >80 >7 4 >50

2 5 0 - - 1 0 3- > 1 0 ' > 1 0 ' > 1 0 4

11% 20 * * 0 . 4 7 x 1 0 ' 250 >10'

AVP, a r g i n i n e 8 - v a s o p r e s s i n ; A c h , a c e t y l c h o l i n e ; B r , b r a d y k i n i n ; A n g , a n g i o t e n s i n ; A , a d r e n a l i n e ; NA,n o r a d r e n a l i n e ;H i s t ,h i s t a m i n e ;5 - H T , 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e .* * Wher e a r ange o f f i g u r e s was g i v e n by t h e a u t h o r s , t h e h i g h e s t v a l u e s i s s h o w n h e r e .t A s s u m i n ga 10 m l o rgan b a t h .

2 7

18%26%

1 5%11%

1 42 5 * *

1 53

1 0 * *

5 -HT

>7 7

0 . 1 2> 1 0 6

> 1 0 3 > 1 0 3 5 x 1 0 '

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416 I . C . A . F. ROB INSON& J . M . WALKER

b e t w e e n t h e a p p l i c a t i o n o f o x y t o c i n a n d t h ee x p u l s i o n o f d r op l e t s o f m i l k i s r e l a t e dt o t h ec o n c e n t r a t i o n o f hormone a p p l i e d ( Va nD o n g e n&H a y s , 1 9 6 6 ) .I t i s a l s op o s s i b l et o m e a s u r e t h ec h a n g e si n t r a n s p a r e n c y i n d u c e db y o x y t o c i n i n af l a t s e g m e n t o f mamma r y g l a n d ( B i l e k ,Mi k u l a s ,

S l a b a &S k a l a ,1 9 7 1 ) .M e t h o d si n v i v oa r el e s ss a t i s f a c t o r yt h a n t h o s ei n v i t r o i na number o f w a y s . T h e y a r e m o r ed i f f i c u l tt o s e t u p a n d r e q u i r e c a r eo v e r t h ep r e p a r a t i o n a n d m a i n t e n a n c eo f t h e a n i m a l . F u r -t h e r ,t h e d e p t h o f a n a e s t h e s i aa n d r a t eo f i n j e c t i o no f o x y t o c i na r ec r i t i c a lf a c t o r s .W i t h m o s to f t h e s em e t h o d s ,t he r es po n se sa r er a p i da n d r e l i a b l e ,b u tt h e 95% f i d u c i a ll i m i t sa r er a t h e r w i d e . O f t h e i nv i t r om e t h o d s , t h e d r o p l e t e x p u l s i o n m e t h o do fVan D o n g e n& H a y s( 1 9 6 6 ) ,t h o u g hv e r y s e n s i t i v e ,c a n b e c r i t i c i z e do n a number o f g r o u n d s( C o w i e&

T i n d a l ,1 9 7 1 ) , n o t l e a s tb e c a u s e t h e i n d e x o fp r e c i s i o n( X )i s m o r e t h a n 1 , wh i c h m a k e si tu n s u i t a b l e f o r r o u t i n e a s s a y s .T h e t r a n s p a r e n c ym e t h o dd e s c r i b e d b y B i l e ke t a L ( 1 9 7 1 ) i s m o r ep r om i s i n g ; i t i s s e n s i t i v ea n d h a s a s a t i s f a c t o r yi n d e x o f p r e c i s i o n .On t h e o t h e r h a n d t h ep r e p a r a -t i o n r e a c t st o sm a l l q u a n t i t i e so f o t h e r s u b s t a n c e sa s we l l a s t o o x y t o c i n . S i m i l a r l y ,t h e i s o l a t e dmamma r y s t r i po f t h e r a t i s s e n s i t i v eb u t r e l a t i v e l yn o n - s p e c i f i c( R y d e n& S j 6 h o l m , 1 9 6 2 ) . T h a t o ft h e mous e i s f a rm o r e s p e c i f i c ,a n d ma i n t a i n si t sr e a c t i v i t ya n d s t a b i l i t ya t r o om t e m p e r a t u r e f o rl o n g p e r i o d s ( R o c ae t a l . ,1 9 7 2 ) .We h a v e t h e r e f o r es e l e c t e dt h e mous e mamma r y s t r i p f o r s u p e r -f u s i o n .

M o s t w o r k e r sh a v e a v o i d e ds u p e r f u s i o no f t h i so r g a n , a p p a r e n t l y b e c a u s e o f t h e d i f f i c u l t yo fp r e v e n t i n g t h e f l u c t u a t i o n si n w e i g h t o f t h e t i s s u ef r o md i s t o r t i n gt h e r e c o r d a t t h eh i g h s e n s i t i v i t yo fr e c o r d i n gn e c e s s a r y( F i t z p a t r i c k& Ben t l e y, 1 9 6 8 ) .We h a v e s h o w n t h a tt h i sd i f f i c u l t yc a n b e o v e r -come b y a s im p l em e t h o do f f i x i n gt h e t i s s u ea n dt h e i n t r o d u c t i o n o f a h i g h - f r e q u e n c yd a m p i n gd e v i c e .S u p e r f u s i o nh a s t h e a d v a n t a g e t h a td o s e sa r e d i s s o l v e d i n a sm a l l v o l u m ei n s t e a d o f b e i n g

d i l u t e di n t h e f l u i d i na n o r g a n - b a t h ;t h u s t h ee f f e c t i v es e n s i t i v i t yi s i n c r e a s e d .T h e m e t h o dd e s c r i b e d h e r e i s s e n s i t i v e ;i t c a n

b e u s e d t o a s s a y f l u i d sc o n t a i n i n ga s l i t t l ea s 4 M up e r m l . R o c ae t a l . ( 1 9 7 2 )h a v e r e p o r t e d t h a t t h em o u s em amma r y s t r i ps u s p e n d e di n a b a t h i s e v e nmore s e n s i t i v et h a n t h i s ,b u t we h a v e f a i l e dt oo b t a i n r e s p o n s e sb e l o wa t h r e s h o l d d o s e o f a b o ut0 . 4 , u , p o s s i b l yb e c a u s ew e u s e d a d i f f e r e n ts t r a i n

o f m o u s e .T h e s e n s i t i v i t yr e m a i n sh i g h f o r a t l e a s t1 8 h o ur s . When c o n t r o l l e d b y t h e a u t o m a t i ca p p a r a t u s , a s s a y s o f a l a r g enumber o f s a m p l e sc a nb e c o n v e n i e n t l yp e r f o r m e d .A d i s a d v a n t a g ei s t h a td o s e s c a n n o t b e g i v e n a t s h o r t i n t e r v a l sw i t h o u tt h e o c c u r r e n c eo f t a c h y p h y l a x i s .T h e p r e p a r a t i o n

i s r e l a t i v e l yi n s e n s i t i v et o o t h e r s u b s t a n c e s ; v a s o -p r e s s i ni s t h e m a i n e x c e p t i o n . T h e d o s e - r e s p o n s ec u r v e s f o r o x y t o c i n a n d v a s o p r e s s i na r e n o t p a r a -l l e l , a n d i t i s t h e r e f o r e d i f f i c u l tt o e x p r e s s t h ea c t i v i t yo f v a s o p r e s s i n i n t e r m s o f o x y t o c i n . I tf o l l o w s t h a t t h e a s s a y o f o x y t o c i n i n a s a m p l ec o n t a i n i n g v a s o p r e s s i ni s c om p l i c a t e d , a n d i tw o u l db e d e s i r a b l ef i r s tt o r e m o v et h e , v a s o p r e s s i ne . g .b y i n c u b a t i o nw i t h t r y p s i n( B i s s e t ,E r r i n g t o n& R i c h a r d s ,1 9 7 3 )o r b y s e l e c t i v ee x t r a c t i o n .

Ta b l e 3 g i v e sd e t a i l so f o th e r m e t h o d su s i n g t h emamma r y g l a n d .I t w i l lb e s e e n t h a t t h e m e t h o dd e s c r i b e d h e r e c o m p a r e sf a v o u r a b l yw i t h m o s t o ft h e o th er s i n a c c u r a c y, s e n s i t i v i t ya n d s p e c i f i c i t y .T h e c h i e fme r i t o f t h i sm e t h o do f s u p e r f u s i o n i st h a t i t i s p o s s i b l et o o b t a i n a n a s s a y r e s p o n s er o u t i n e l y w i t h o n l y 0 . 5m l o f a s a m p l ec o n t a i n i n ga s l i t t l ea s 4 , u u / m l .I f t h e t i s s u ew e r e s u s p e n d e di na n o r g a n b a t h o f 1 0 m l , a d o s e o f 5 0 , u w o u l db er e q u i r e d t o a c h i e v e t h e s a m ec o n c e n t r a t i o n ;a l t e r -n a t i v e l y ,t h e b a t h w o u l dh a v e t o b e e n t i r e l yf i l l e dw i t h t h e s a m p l e t o b e a s s a y e d , w h i c h w o u l dn e c e s s i t a t et h e u s e o f v e r y l a r g es amp l e s . Byc o n c e n t r a t i n g s a m p l e s b e f o r e a s s a y ,i t s h o u l d b ep o s s i b l et o m e a s u r ew i t h r e a s o n a b l ea c c u r a c yt h eo x y t o c i n c o n t e n t o f p l a s m a i n t he ph ys io lo gi c alr a n g e .E x p e r i m e n t so n t h e s e l i n e sa r ei n p r o g r e s s .

R a d i o - i m m u n o a s s a y so f o x y t o c i nh a v e r e c e n t l yb e e n d e v e l o p e d ( f o r r e v i e w s e e C h a r d , 1 9 7 3 ) .A l t h o u g hs u c h m e t h o d sa r e n o t a f f e c t e db y l a r g ea m o u n t so f v a s o p r e s s i n ,t h e y a r ea t p r e s e n t n o t a ss e n s i t i v ea s t h e b e s tb i o l o g i c a lm e t h o d s .F u r t h e r -m o r e , i t h a s b e e n s h o w n t h a t a n t i b o d i e s t oo x y t o c i n may r e a c tw i t h f r a gm e n t so r d e r i v a t i v e so f o x y t o c i n , w h i c h h a v e n o b i o l o g i c a la c t i v i t y .Th u s , i m m u n o l o g i c a lm e t h o d smay g i v ef a l s e l yh i g h l e v e l sw h e r eb r e a k d o w no f o x y t o c i n i s r a p i d ,e . g . i n h um a n p r e g n a n c yp l a s m a ( C h a r d ,F o r s l i n g ,J a m e s , K i t a u& L a n d o n ,1 9 7 0 ) .S e n s i t i v eb i o a s s a y sr e m a i nt h e r e f o r e a n e s s e n t i a l a l t e r n a t i v e .

We a r eg r a t e f u lt o P r o f e s s o rJ . R .Va n e f o rp r o s t a g l a n d i nF 2 a c ;t o S a n d o zP r o d u c t sL td f o rS y n t o c i n o na n d Sy n t o -p r e s s i n ;a n d t o CIBA L a b o r a t o r i e sf o r H y p e r t e n s i n .I . C . A . F . R .i s a Med i c a lR e s e a r c hC o u n c i lS c h o l a r .

Re f e r e n c e s

BANGHAM,D . R . & MUSSETT, M . V. ( 1 9 5 8 ) .T h i r dI n t e r n a t i o n a lS t a n d a r d f o r p o s t e r i o rp i t u i t a r y .B u l l .W l dH l t h O r g . ,1 9 ,3 2 5 - 3 4 0 .

B E L L ,P.M . G . ( 1 9 7 3 ) .A p r o g r a m m i n gd e v i c e f o r b i o -a s s a y .J . P h y s i o l . ,Lond . , 2 3 4 , 7 - 8 P.

B I L E K ,J . , MIKULAS, I . , SLABA, J . & SKALA, I .

8/6/2019 brjpharm00537-0093

9/9

ASSAYOF OXYTOC INON SUPERFUSEDMAMMARY GLAND 417

( 19 71 ) . B i o a ss a yo f o x y t o c i n b y c h a n g e s i n l i g h tp e n e t r a t i o n t h r o u g h r a t mamma r y g l a nd t i s s u ei nv i t r o .J . Endo c r . , 5 1 ,7 7 1 - 7 8 0 .

B I S S E T , G . W. , CLARK, B . J . ,HALDAR, J . , HARRIS ,M . C . , LEWIS, G . P. & ROCHA E SILVA J N R . , M .( 1 9 6 7 ) .T h e a s s a y o f m i l k - e j e c t i n ga c t i v i t yi n t h el a c t a t i n gr a t . B r . J . P h a r m a c . C h em o t h e r . , 3 1 ,

5 3 7 - 5 4 9 .B I S S E T ,G . W. , ERR INGTON , M . L .& RICHARDS , C . D .( 1 9 7 3 ) .T h e d i s t r i b u t i o no f v a s o p r e s s i na n d o x y t o c i ni n t h e h y p o t h a l a m o n e u r o h y p o p h y s i a ls y s t em o f th eg u i n e a - p i g .B r .J . P h a rm a c . ,4 8 , 2 6 3 - 2 7 2 .

B I S S E T ,G . W . & L E W I S ,G . P. ( 1 9 6 2 ) . A s pe c t r um o fp h a rm a c o l o g i c a la c t i v i t yi n s o m e b i o l o g i c a l l ya c t i v ep e p t i d e s .B r .J . P h a r ma c . C h em o th e r . ,1 9 ,1 6 8 - 1 8 2 .

BROVETTO , J . ,OLHABERRY, J . , GIOIA DE COCH ,M . N . , CODA , H . , FIELITZ, C . , CABOT, H . M . ,FRAGA, A . & COCH, J . A . ( 1 9 6 7 ) .S e p a r a t i o n o fo x y t o c i n f r o m t h e s u b s t a n c e s t h a ti n t e r f e r ew i t h i t sb i o l o g i c a la s s a y o n t h e i s o l a t e dr a tmamma r yg l a n d .J .E n d o c r . ,3 8 ,3 55 - 3 56 .

CHARD, T . ( 1 9 7 3 ) .T h e r a d i o i mm u n o a s s a yo f o x y t o c i na n d v a s o p r e s s i n .J . E n d o c r . ,5 8 ,1 4 3 - 1 6 0 .

CHARD , T . , FORSLING, M . L . ,JAMES, M . A . R . ,KITAU,M . J . & LANDON, J . ( 1 9 7 0 ) .T h e d e v e l o pm e n to f ar a d i o i mm u n o a s s a yf o r o x y t o c i n : s e n s i t i v i t yo f t h ea s s a yi n a q u e o u sb u f f e r s o l u t i o n ,s p e c i f i c i t ya n d t h ed i s s o c i a t i o no f i m m u n o l o g i c a la n d b i o l o g i c a la c t i v i t y .J . E n d o c r . ,4 6 ,53 3 - 5 4 2 .

COON, J . M .( 1 9 3 9 ) .A n e w m e t h o d f o r t h e a s s a yo fp o s t e r i o rp i t u i t a r ye x t r a c t s .A r c h . i n t .P h a r m a c o d y n .T h& r . ,6 2 ,7 9 - 9 9 .

C O W I E ,A .T. & TINDAL, J . S .( 1 9 7 1 ) .Th ep h y s i o l o g yo fl a c t a t i o n .L o n d o n :E d w a r dA r n o l d .

FABIAN ,M . ,

FORSLING, M . L . , JONES , J . J .& LEE, J .( 1 9 6 9 ) .C o m p a r i s o no f t w o m e t h o d sf o rt h e b i o a s s a yo f o x y t o c i n .E n d o c r i n o l o g y,8 5 ,6 0 0 - 6 0 3 .

F I E L I T Z ,C . ,ROCA , R . ,MATTEI , A . , MELANDER ,S . ,GAROFALO , E . , GIOIA DE COCH, M.N. & COCH,J . A . ( 1 9 7 0 ) .A s e n s i t i v ea n d s p e c i f i cb i o a s s a yf o ro x y t o c i n . P r o c .S o c .e x p .B i o l .Med . , 1 3 3 , 1 1 5 5 - 1 1 5 7 .

FITZPATRICK, R . J .( 1 9 6 1 ) .T h e e s t im a t i o n o f s m a l la m o u n t s o f o x y t o c i n i n b l o o d . I n Ox y t o c i n , e d .C a l d e y r o - B a r c i a ,R . & H e l l e r ,H. p p .3 5 8 - 3 7 9 .Ox f o r d :P e r g a m o nP r e s s .

F I T Z PAT R I C K ,R . J .& BENTLEY, P. J .( 1 9 6 8 ) .T h ea s s a yo f n e u r o h y p o p h y s i a lh o r m o n e si n b l o o d a n d o t h e r

b o d y f l u i d s .I n : H a n d b u c hde r expe r imen t e l l e nP h a r -ma k o l o g i e ,Vo l .2 3 , p p .1 9 0 - 2 8 5 .B e r l i n :S p r i n g e r .

FOLLETT, B .K .& BENTLEY, P. J .( 1 9 6 4 ) .T h eb i o a s s a yo f o x y t o c i n : i n c r e a s e ds e n s i t i v i t yo f t h e r a t u t e ru s t os e r i a l i n j e c t i o n so f s t i l b o e s t r o l .J . E n d o c r . , 2 9 ,2 7 7 - 2 8 2 .

FOLLEY, S . J . & KNAGGS, G . S .( 1 9 6 5 ) .L e v e l so f

o x y t o c i n i n t h e j u g u l a rv e i nb lo o d o f g o a t s d u r i n gp a r t u r i t i o n .J . Endo c r . , 3 3 ,3 0 1 - 3 1 5 .HOLTON, P . ( 1 9 4 8 ) .A m o d i f i c a t i o no f t h em e t h o do f

D a l e a n d L a i d l a w f o r s t a n d a r d i z a t i o n o f p o s t e r i o rp i t u i t a r ye x t r a c t .B r . J . P h a r n a c . C h em o t h e r . , 3 ,3 2 8 - 3 3 4 .

MENDEZ -BAUER ,C . , CABOT, H.M. & CALDEYRO-BARCIA, R ( 1 9 6 0 ) . New t e s tf o rt h e b i o l o g i c a la s s a yo f o x y t o c i n .S c i e n c e ,N . Y . ,1 3 2 , 2 9 9 - 3 0 0 .

MOORE ,R .D . & ZARROW,M . X .( 1 9 6 5 ) .C o nt r a c ti o n o ft h e r a b b i tmamma r y s t r i p i nv i t r oi n r e s p o n s e t oo x y t o c i n .A c t a e n d o c r . ,Co p n h . ,4 8 ,1 8 6 - 1 9 8 .

ROBINSON, I . C . A . F .& WALKER,J . M . ( 1 9 7 3 ) .A s s a yo fo x y t o c i n o n t h e s up e r f u s ed m o u s e m amma r y g l a n d

u s i n ga n a u t o m a t i ca p p a r a t u s .J . P h y s i o . ,L o n d . , 2 3 4 ,6 - 7 P .

ROCA , R . A . , GAROFALO , E . G . , GIOIA DE COCH ,M .N . ,AROCENA,M . & COCH, J . A .( 1 9 7 2 ) .I m p r o v e -m e n t i n t h e b i o a s s a yo f o x y t o c i n b y t h e m o u s emamma r y g l a n d i n v i t r o .P r o c .S o c .e x p .B i o l .Med . ,1 3 9 ,1 0 1 0 - 1 0 1 2 .

RYDEN, G . & SJOHOLM, I . ( 1 9 6 2 ) .A s s a yo f o x y t o c i nb y r a t mamma r y g l a n d i n v i t r o .B r . J . P h a r m a c .Ch emo t h e r . ,1 9 ,1 3 6 - 1 4 1 .

S M I T H ,M . W .( 1 9 6 1 ) .Some p r o p e r t i e so f r a tmamma r yt i s s u e .Na t u r e , Lon d . , 1 9 0 , 5 4 1 - 5 4 2 .

TINDAL, J . S . & YOKOYAMA ,A . ( 1 9 6 2 ) . A s s a y o f

o x y t o c i n b y t h e m i lk e j e c t i o nr e s p o n s e i n t h e a n a e s -t h e t i z e dl a c t a t i n gg u i n e a - p i g .E n d o c r i n o l o g y, 7 1 ,1 9 6 - 2 0 2 .

VAN DONGEN,C . G .& HAYS, R . L . ( 1 9 6 6 ) .A s e n s i t i v ei n v i t r oa s s a yf o ro x y t o c i n .E n d o c r i n o l o g y,7 8 ,1 - 6 .

VANDONGEN,C . G .& MARSHALL,J . M . ( 1 9 6 7 ) .E f f e c to f v a r i o u sh o r m o n e son t h e m i l k - e j e c t i o nr e s p o n s e o ft i s s u ei s o l a t e df r o m t h e r a t mamma r yg l a n d . N a t u r e ,L o n d . , 2 1 3 ,6 3 2 - 6 3 3 .

( Re c e i v e dA u g u s t 11 , 1 97 3 )