bỘ nÔng nghiỆp cỘng hoÀ xÃ hỘi chỦ nghĨa …º¢n cÔng bỐ tiÊu chuẨn cƠ sỞ...

QUYẾT ĐỊNH

Ban hành Tiêu chuẩn cơ sở

Căn cứ Luật Tiêu chuẩn và Quy chuẩn kỹ thuật ngày 29/6/2006;

Căn cứ Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 của Chính phủ quy

định chi tiết thi hành một số điều của Luật tiêu chuẩn và quy chuẩn kỹ thuật;

Căn cứ Thông tư số 21/2007/TT-BKHCN ngày 28/9/2007 của Bộ trưởng

Bộ Khoa học và Công nghệ về việc hướng dẫn xây dựng và áp dụng tiêu chuẩn;

Căn cứ Quyết định số 666/QĐ-BNN-TCCB ngày 04/4/2014 của Bộ trưởng

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền

hạn và cơ cấu tổ chức của Cục Thú y;

Xét đề nghị của Trưởng phòng Thú y Thủy sản,

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1. Ban hành 04 (Bốn) Tiêu chuẩn cơ sở xét nghiệm bệnh ở tôm nước

lợ, bao gồm:

1. Tiêu chuẩn cơ sở xét nghiệm phát hiện vi rút gây bệnh đầu vàng (YHV)

ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR, Ký hiệu: TCCS 01:2017/TY-TS;

2. Tiêu chuẩn cơ sở xét nghiệm phát hiện vi rút gây hội chứng Taura (TSV)

ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR, Ký hiệu: TCCS 02:2017/TY-TS;

3. Tiêu chuẩn cơ sở xét nghiệm phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy

(NHP-B) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime PCR, Ký hiệu: TCCS 03:2017/TY-TS;

4. Tiêu chuẩn cơ sở xét nghiệm phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử cơ

(IMNV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR, Ký hiệu: TCCS 04:2017/TY-TS;

Điều 2. Đối tượng và phạm vi áp dụng:

1. Áp dụng tại tất cả các phòng thử nghiệm của các đơn vị trực thuộc Cục

Thú y.

2. Chi cục Thú y/Chi cục Chăn nuôi và Thú y, các đơn vị liên quan căn cứ

điều kiện phòng thử nghiệm của đơn vị tham khảo, áp dụng Tiêu chuẩn cơ sở này

cho phù hợp, hiệu quả.

Điều 3. Quyết định này có hiệu lực thi hành kể từ ngày ký.

BỘ NÔNG NGHIỆP

VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

CỤC THÚ Y

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Số: 126 /QĐ-TY-TS Hà Nội, ngày 07 tháng 4 năm 2017

Điều 4. Trưởng phòng Thú y Thủy sản và Thủ trưởng các đơn vị liên quan

chịu trách nhiệm thi hành quyết định này./.

Nơi nhận:

- Như Điều 4;

- Bộ trưởng Nguyễn Xuân Cường (để b/c);

- Thứ trưởng Vũ Văn Tám (để b/c);

- Cục trưởng (để b/c);

- Tổng cục Thủy sản;

- CCTY, CN&TY các tỉnh, thành phố;

- Lưu VT, TS.

BẢN CÔNG BỐ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

TCCS 01:2017/TY-TS

Tên cơ quan: Cục Thú y

Địa chỉ: Số 15/78, Giải Phóng, Phương Mai, Đống Đa, Hà Nội

Điện thoại: 0436.290.284

Fax: 0436.290.286

CÔNG BỐ:

Tên tiêu chuẩn: TCCS 01:2017/TY-TS

Áp dụng cho các xét nghiệm phát hiện vi rút gây bệnh đầu vàng (YHV) ở

tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR.

Cục Thú y cam kết thực hiện xét nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh đầu

vàng ở tôm theo đúng tiêu chuẩn công bố nêu trên./.

Hà nội, ngày 07 tháng 4 năm 2017

BỘ NÔNG NGHIỆP


CỤC THÚ Y




TCCS 02:2017/TY-TS



Điện thoại: 0436.290.284

Fax: 0436.290.286

CÔNG BỐ:


Áp dụng cho các xét nghiệm phát hiện vi rút gây hội chứng Taura (TSV) ở

tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR.

Cục Thú y cam kết thực hiện xét nghiệm phát hiện tác nhân gây hội chứng

Taura ở tôm theo đúng tiêu chuẩn công bố nêu trên./.


BỘ NÔNG NGHIỆP


CỤC THÚ Y




TCCS 03:2017/TY-TS



Điện thoại: 0436.290.284

Fax: 0436.290.286

CÔNG BỐ:


Áp dụng cho các xét nghiệm phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy

(NHP-B) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime PCR.

Cục Thú y cam kết thực hiện xét nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh hoại

tử gan tụy cấp tính ở tôm theo đúng tiêu chuẩn công bố nêu trên./.


BỘ NÔNG NGHIỆP


CỤC THÚ Y




TCCS 04:2017/TY-TS



Điện thoại: 0436.290.284

Fax: 0436.290.286

CÔNG BỐ:


Áp dụng cho các xét nghiệm phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử cơ (IMNV) ở

tôm bằng kỹ thuật Realtime PCR.

Cục Thú y cam kết thực hiện xét nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh hoại

tử cơ ở tôm theo đúng tiêu chuẩn công bố nêu trên./.


BỘ NÔNG NGHIỆP


CỤC THÚ Y



TCCS TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

TCCS 01:2017/TY-TS

QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN VI RÚT GÂY BỆNH ĐẦU

VÀNG (YHV) Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR

Hà Nội, ngày 07/4/2017

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU ...................................................................................................... 3

PHẦN KHÁI QUÁT ............................................................................................. 4

1. Tên gọi ........................................................................................................... 4

2. Phạm vi áp dụng ............................................................................................. 4

3. Giới thiệu ........................................................................................................ 4

PHẦN KỸ THUẬT ............................................................................................... 5

1. Tiêu chuẩn kỹ thuật ........................................................................................ 5

2. Mục đích ......................................................................................................... 5

3. Nội dung ......................................................................................................... 5

3.1. Nguyên tắc ................................................................................................ 5

3.2. Nguyên liệu hóa học và sinh học.............................................................. 5

3.3. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 6

3.4. Cách tiến hành ............................................................................................. 7

3.4.1. Sơ đồ thực hiện ...................................................................................... 7

3.4.2. Chuẩn bị mẫu ......................................................................................... 8

3.4.3. Chiết tách RNA ..................................................................................... 8

3.4.4. Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR ................................................ 8

3.4.5. Đọc kết quả ............................................................................................ 9

Tài liệu tham khảo ............................................................................................... 11

PHỤ LỤC A: CHIẾT TÁCH RNA ..................................................................... 12

PHỤ LỤC B: TIÊU TỐN VẬT TƯ CHO MỘT MẪU XÉT NGHIỆM ............ 14

3

LỜI NÓI ĐẦU

TCCS 01:2017/TY-TS xét nghiệm phát hiện vi rút gây bệnh đầu vàng

(YHV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR do Cục Thú y biên soạn và ban

hành. Tiêu chuẩn này được áp dụng tại tất cả các phòng thử nghiệm của các đơn

vị trực thuộc Cục Thú y. Các phòng thử nghiệm bệnh thủy sản khác căn cứ điều

kiện phòng thử nghiệm của đơn vị mình tham khảo, áp dụng cho phù hợp, hiệu

quả.

Cơ quan biên soạn: Cục Thú y.

Quyết định ban hành số 126/QĐ-TY-TS ngày 07 tháng 4 năm 2017 của

Cục trưởng Cục Thú y.

4

PHẦN KHÁI QUÁT

1. Tên gọi

TCCS 01:2017/TY-TS quy trình phát hiện vi rút gây bệnh đầu vàng

(YHV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR.

2. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này áp dụng để xét nghiệm phát hiện vi rút gây bệnh đầu vàng

(YHV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR tại tất cả các phòng thử nghiệm

của các đơn vị trực thuộc Cục Thú y.

3. Giới thiệu

Bệnh đầu vàng xuất hiện trên tôm sú, tôm thẻ chân trắng, tôm rảo, tôm rằn

và nhiều loại tôm khác tại Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ... Ở Việt Nam, tôm

nhiễm bệnh đầu vàng nhiều lúc thời tiết thay đổi lúc giao mùa, ở những vùng

nuôi ven biển độ mặn cao.

Tác nhân gây bệnh đầu vàng ở tôm sú là vi rút hình que kích thước 44±6 x

173±13nm. Nhân của vi rút có đường kính gần bằng 15nm, chiều dài có thể tới

800nm. Cấu trúc acid nhân là ARN; vi rút thuộc giống Okavirus, họ

Roniviridae.

Bệnh đầu vàng lây truyền theo đường nằm ngang, vi rút từ tôm nhiễm

bệnh bài tiết ra môi trường hoặc một số tôm tự nhiên cũng nhiễm bệnh đầu vàng

sẽ lây truyền cho các tôm trong ao nuôi. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm

bị bệnh đầu vàng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẩu thừa rơi

vào ao nuôi.

5

PHẦN KỸ THUẬT

1. Tiêu chuẩn kỹ thuật

TCCS xét nghiệm, phát hiện vi rút gây bệnh đầu vàng (Yellow head

disease – YHV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR.

2. Mục đích

Phát hiện YHV ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR nhằm phục vụ

công tác chẩn đoán xét nghiệm và phòng chống dịch bệnh trên tôm.

3. Nội dung

3.1. Nguyên tắc

Bệnh đầu vàng (Yellow head disease – YHV) ở tôm hay còn gọi là nhiễm

vi rút đầu vàng genotype 1 (YHV1). YHV1 là 1 trong 8 genotype của phức hợp

đầu vàng và cũng là tác nhân gây bệnh; vi rút thuộc giống Okavirus, họ

Roniviridae, acid nhân là RNA sợi đơn dương (+; ssRNA); vi rút được phát hiện

bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR với mồi xuôi YHV 141F, mồi ngược YHV

206R và đoạn dò Taqman YHV.

3.2. Nguyên liệu hóa học và sinh học

3.2.1. Nguyên liệu hóa học

- Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS):

Thành phần Số lượng (gram)

NaC1 8,0

KC1 0,2

Na2HPO4 1,15

KH2PO4 0,2

Lượng hóa chất trên được cho vào bình thủy tinh, cho nước cất 2 lần vào

vừa đúng 1 lít, khuấy tan hoàn toàn, điều chỉnh pH 7,2 ± 0,2 và đem hấp vô

trùng (Autoclave) 121C, 15 phút.

- Cồn (Ethanol) 90% và 70%.

6

- Kít chiết tách InviMAG® Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96, Catalogue

Number: 7441050100 hoặc kít tương đương.

- Kít MasterMix theo SuperScript® III Platinum

® One-Step Quantitative

RT-PCR. Catalogue Number: 11732-020 hoặc kít tương đương.

3.2.2. Nguyên liệu sinh học

- Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe) cho phản ứng Realtime RT-PCR

Tên mồi và

đoạn dò Trình tự

Kích thước sản

phẩm khuếch đại

YHV 141F 5’-CGT CCC GGC AAT TGT GAT C-3’

66 bp YHV 206R

5’-CCA GTG ACG TTC GAT GCA

ATA-3’

YHV p 5’-Texas Red CCA TCA AAG CTC TCA

ACG CCG TCA BHQ2-3’

- Hệ thống đối chứng:

+ Đối chứng âm là mẫu nước không có RNA/DNA dùng để pha loãng các

chất phản ứng.

+ Mẫu đối chứng dương là mẫu có chứa RNA của vi rút gây bệnh đầu

vàng (YHV1) ở tôm được chiết tách từ mẫu dương chuẩn, chứa trong các ống có

dán nhãn rõ ràng, lập danh sách quản lý và lưu giữ -75oC. Mỗi ống không rã

đông quá 03 lần.

3.3. Thiết bị và dụng cụ

- Máy trộn mẫu (Vortex).

- Máy ly tâm nhỏ (Centrifuge Spin).

- Máy lắc và ủ nhiệt HLC-MHR23 hoặc tương đương.

- Máy chiết tách RNA/DNA tự động Thermo Scientific™ KingFisher™

Flex; Thermo Scientific™ KingFisher™ mL hoặc tương đương.

- Máy ly tâm lạnh cho ống eppendorf 1,5 ml MIKRO 200R hoặc tương

đương.

- Máy hấp khử trùng Autoclave.

7

- Máy Real-time PCR Stratagene Mx3005P hoặc tương đương.

- Tủ an toàn sinh học cấp II.

- Tủ mát và âm sâu: + 4oC; –20°C và -80

oC.

- Micropipettes và đầu típ có màng lọc tương ứng lấy được các thể tích:

0,5 - 10 µl; 10 -100 µl và 100 - 1000µl.

- Các đĩa nhựa 96 giếng hoặc ống nhựa chứa dung dịch tách chiết, phù

hợp với máy chiết tách RNA/DNA tự động.

- Ống PCR 200 µl hoặc đĩa PCR 200 µl 96 giếng.

- Ống eppendorf thể tích 0,5 ml và 1,5 ml

- Ống ly tâm nhựa thể tích 5 ml, 10 ml và 50 ml

- Chai thủy tinh 500 - 1000 ml

- Bút viết, đồng hồ chuyên dụng trong phòng thí nghiệm và các dụng cụ

cần thiết khác.

3.4. Cách tiến hành

3.4.1. Sơ đồ thực hiện

8

3.4.2. Chuẩn bị mẫu

Loại mẫu được sử dụng để xét nghiệm với quy trình này có thể là mẫu

tươi hoặc mẫu được cố định trong cồn 90%, bao gồm: mang, máu, mang, gan

tụy, ấu trùng, hậu ấu trùng của các loài tôm như: tôm sú (P. monodon), tôm thẻ

chân trắng (P. vanamei),…

Dùng pen, kéo vô trùng để thực hiện các thao tác: tách, cắt lấy mẫu. Mẫu

được chia thành 2 phần: 1 phần cho thực hiện xét nghiệm và 1 phần lưu trữ.

Mẫu được nghiền nhuyễn trong dung dịch muối đệm PBS, để tạo thành

huyễn dịch 10% (sử dụng cân phân tích cân trọng lượng mẫu được nghiền để

điều chỉnh lượng dung dịch PBS nhằm đảm bảo tạo được huyễn dịch 10%). Thu

hồi huyễn dịch 10% vào ống nắp vặn vô trùng, rồi chuyển vào tủ âm sâu (-80oC)

trong thời gian tối thiểu 1 giờ trước khi tiến hành chiết tách RNA.

3.4.3. Chiết tách RNA

- Quy trình chiết tách RNA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản

xuất kít chiết tách InviMAG® Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96 (Phụ lục A).

- Hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách khác tương đương, phù hợp

cho chiết tách RNA.

3.4.4. Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR

- Chuẩn bị Master Mix và chu kỳ luân nhiệt được thực hiện theo Bảng 1

và Bảng 2.

Bảng 1: Chuẩn bị Master Mix theo kít SuperScript® III Platinum

® One-

Step Quantitative RT-PCR Kit. Catalogue Number: 11732-020.

STT Thành phần Nồng độ gốc Thể tích cho 1 phản ứng (µl)

1 Nước không có RNA/DNA 5,5

2 Dung dịch đệm (2X

Reaction Mix) 2X 12,5

3 Mồi YHV 141F 20 µM 0,5

4 Mồi YHV 206R 20 µM 0,5

9

5 Đoạn dò YHV-P 6 µM 0,5

6 Enzyme Taq Mix 0,5

Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng 20

7 Mẫu RNA 5

Tổng thể tích dung dịch thực hiện phản ứng 25

* Tùy theo kít sử dụng mà thành phần Master Mix có thể khác nhau, việc

thực hiện chuẩn bị Master Mix nên tuân thủ theo hướng dẫn của kít được sử

dụng.

- Đặt ống PCR hoặc đĩa PCR 96 giếng chứa thành phần phản ứng

Realtime RT-PCR (Master Mix) và mẫu RNA vào máy Real-time PCR. Vận

hành máy theo hướng dẫn và chọn chương trình luân nhiệt đã được cài đặt.

Bảng 2: Chu kỳ luân nhiệt đối với máy Real-time PCR Stratagene

Mx3005P

Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

50oC (*) 15 phút (*) 01

95oC (*) 02 phút (*) 01

94oC 20 giây

40 60

oC

60 giây

(Ghi nhận tín hiệu quang ở bước này)

(*) Nhiệt độ và thời gian này chỉ phù hợp với kít SuperScript® III

Platinum® One-Step Quantitative RT-PCR Kit. Catalogue Number: 11732-020.

Việc thực hiện cài đặt nhiệt độ và thời gian nên tuân thủ theo hướng dẫn của

từng bộ kít được sử dụng.

3.4.5. Đọc kết quả

Kết quả của phản ứng Realtime RT-PCR được xác định dựa vào chu kỳ

ngưỡng (Cycle threshold: Ct).

10

Kiểm tra hệ thống mẫu đối chứng dương và đối chứng âm. Nếu hệ thống

mẫu đối chứng dương và đối chứng âm là đúng thì điều chỉnh baseline theo 5%

tín hiệu huỳnh quang và đọc kết quả xét nghiệm theo baseline này.

+ Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính.

+ Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct trùng

khớp với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó.

Nếu hệ thống mẫu đối chứng dương và đối chứng âm là không đúng thì

phải thực hiện lại xét nghiệm.

Giải thích kết quả

+ Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính

+ Mẫu không có giá trị Ct là âm tính

+ Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ

Những mẫu nghi ngờ này, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử

dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

11

Tài liệu tham khảo

1. OIE Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals 2016. CHAPTER

2.2.2. - Infection with yellow head virus genotype 1.

http://www.oie.int/international-standard-setting/aquatic-manual/access-

online/

2. Tang K. F. J. and Lightner D. V., 2001. Development of realtime PCR

assays for detection of White spot syndrome virus, Yellow head virus, Taura

syndrome virus and Infectious hypodermaland hematopoietic necrosis virus in

Penaeid shrimp.

3. InvitrogenTM

SuperScript® III Platinum

® One-Step Quantitative RT-

PCR System.

http://www.oie.int/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online/


12

PHỤ LỤC A: CHIẾT TÁCH RNA

1. Chuẩn bị hóa chất

Các hóa chất cần được chuẩn bị và bảo quản theo đúng hướng dẫn của bộ

kít InviMAG® Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96, Cat. No: 7441050100, với thể

tích vừa đủ cho số lượng mẫu chiết tách, bao gồm:

(1) Dung dịch đệm Lysis Buffer RV

(2) Dung dịch rửa 1 (Wash 1)


(4) Hỗn hợp hạt từ tính (Bead Mix)

(5) Dung dịch thu hồi DNA/RNA Elution Buffer (EB)

Nếu chiết tách RNA bằng máy chiết tách tự động Thermo Scientific™

KingFisher™ Flex, cần phải chuẩn bị trước các đĩa chứa dung dịch chiết tách

theo hệ thống của máy như sau:

+ Đĩa Washing 1: 800µl dung dịch Wash 1/giếng;

+ Đĩa Washing Wash 2 và Washing Wash 3: 800µl dung dịch Wash

2/giếng;

+ Đĩa Elution Buffer: 100µl dung dịch EB/giếng.

2. Tiến hành

- Huyễn dịch 10% của mẫu bệnh phẩm được rã đông, trộn đều bằng máy

vortex. Ly tâm mẫu trong máy ly tâm lạnh với lực ly tâm 2500 g/15 phút.

- Hút 200µl dịch trong bên trên sau khi ly tâm vào ống eppendorf 1,5ml

vô trùng có chứa sẵn 200µl dung dịch đệm Lysis. Trộn đều mẫu bằng máy

vortex và spin để kéo các phần bám trên nắp ống xuống.

- Chuyển toàn bộ dung dịch trong ống eppendorf vào đĩa chứa mẫu 96

giếng (mỗi giếng tương ứng với một mẫu chiết tách). Dùng giấy dán đĩa chuyên

dụng dán kín mặt đĩa.

13

- Đặt đĩa lên máy lắc, ủ nhiệt (HLC-MHR23). Lắc đĩa với gia tốc

750rpm/15 phút, nhiệt độ 65oC.

- Lấy đĩa ra khỏi máy lắc, để nguội trong 5 phút, tháo bỏ giấy dán đĩa. Bổ

sung 420µl dung dịch Bead Mix (gồm có 400µl Binding solution và 20µl MAP)

vào mỗi giếng.

- Chuyển tất cả các đĩa bao gồm: đĩa Tip Combs, đĩa Elution Buffer, đĩa

Washing Wash 3, đĩa Washing Wash 2, đĩa Washing Wash 1 và đĩa chứa mẫu

vào từng khay của máy chiết tách tự động theo hướng dẫn của máy.

- Chọn chương trình chiết tách RNA đã được cài đặt trước đó theo hướng

dẫn của hãng sản xuất kít InviMAG® Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96.

- Sau 34 phút, quá trình chiết tách hoàn tất. Thu hồi RNA của từng giếng

vào ống eppendorf 0.5 ml tương ứng đã ghi rõ ký hiệu mẫu.

- Bảo quản mẫu RNA ở 4oC trong vài giờ và (-)80

oC trong thời gian lâu

hơn.

14

PHỤ LỤC B: TIÊU TỐN VẬT TƯ CHO MỘT MẪU XÉT NGHIỆM

Đối với xét nghiệm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR

TT Tên Vật Tư Đơn vị

tính

Số lượng

bình

quân

cho 01

mẫu

Diễn giải

1

Cryotube 1,8ml free

RNA/DNA (nắp vặn ngoài, tự

đứng)

Cái 7

1 cái: chứa mẫu

2 cái: chuẩn bị mẫu đối chứng.

1 cái: chứa Proteinase K working

solution

1 cái: chứa Carrier RNA working

solution

1 cái: chứa primer & probes

1 cái: chuẩn bị master mix

2 Cryotube 5ml free RNA/DNA

(nắp vặn ngoài, tự đứng) Cái 2

1 cái: chứa Elution Buffer

1 cái: chứa Binding Solution và

MAP solution

3 PCR tube 0,5 ml Cái 3 Lưu giữ mẫu RNA/DNA

4 Trip PCR có nắp 0,2ml Cái 1 Nhân gene qRT-PCR

5 InviMag® Virus DNA/RNA

Mini Kit/ KF96(480 test/ kit) Kit 0,0069 Chiết tách RNA hoặc DNA

6 Ethanol Absolute ml 7,15 Bổ sung vào dung dịch rửa 1, rửa 2

7 KF ml tube Cái 3 Chiết tách RNA hoặc DNA

8 KF ml Tip Combs Cái 1 Chiết tách RNA hoặc DNA

9 Tube ly tâm nhựa 50 ml Cái 3

1 cái: chứa dung dịch Lysis

1 cái: chứa dung dịch rửa 1


10 Finntip Multistepper 1500µl

sterile Cái 5

1 cái: cho dung dịch rửa 1


1 cái: cho Lysis Solution vào

eppendorf

1 cái: cho Elution Buffer vào đĩa

chiết xuất

15


tính

Số lượng

bình

quân

cho 01

mẫu

Diễn giải

11 Micropipet filter tip 1000µl Cái 8

2 cái: Mix Proteinase K và Carrier

RNA

3 cái: chuyển mẫu + Lysis Solution

vào đĩa chiết xuất

1 cái: cho Binding Solution vào

ống cryotube 5ml

1 cái: cho MAP solution vào ống

cryotube 5 ml

1 cái: cho Binding Solution và

MAP solution vào đĩa chiết xuất


3 cái: cho mẫu và đối chứng vào

eppendorf chứa Lysis Solution

3 cái: cho thu hoạch RNA/DNA


1 cái: phân phối Master mix vào đĩa

PCR

13 Micropipet filter tip 20µl Cái 3 Chuẩn bị master mix



1 cái: đưa mẫu RNA/DNA vào đĩa

PCR chứa master mix

4 cái: đưa mẫu RNA/DNA đối

chứng vào đĩa PCR chứa master

mix

15 Quần áo bảo hộ dùng 1 lần Bộ 2 Xử lý mẫu

16 Găng tay Đôi 8

4 đôi: xử lý mẫu

2 đôi: chiết xuất RNA/DNA

2 đôi: chuẩn bị master mix

17 Khẩu trang Cái 2 Xử lý mẫu

18 Primers và Probe YHV (2000

test/bộ) Bộ 0,0028 Nhân gene qRT-PCR

19 Invitrogen Onestep RT-PCR

(100 react with 50µl/reaction) Kit 0,0275

Nhân gene qRT-PCR: 25 µl/

reaction



TCCS 02:2017/TY-TS

QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG

TAURA (TSV) Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR


MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU ...................................................................................................... 3

PHẦN KHÁI QUÁT ............................................................................................. 4

1. Tên gọi ........................................................................................................... 4

2. Phạm vi áp dụng ............................................................................................. 4

3. Giới thiệu ........................................................................................................ 4

PHẦN KỸ THUẬT

1. Tiêu chuẩn kỹ thuật ........................................................................................... 5

2. Mục đích ............................................................................................................ 5

3. Nội dung ............................................................................................................ 5

3.1. Nguyên tắc .................................................................................................. 5

3.2. Nguyên liệu hóa học và sinh học ................................................................ 5

3.3. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 6

3.4. Cách tiến hành ............................................................................................. 7

3.4.1. Sơ đồ thực hiện........................................................................................ 7

3.4.2. Chuẩn bị mẫu .......................................................................................... 7

3.4.3. Chiết tách RNA ....................................................................................... 8

3.4.4. Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR .................................................. 8

3.4.5. Đọc kết quả.............................................................................................. 9




3

LỜI NÓI ĐẦU

TCCS 02:2017/TY-TS xét nghiệm phát hiện vi rút gây hội chứng Taura

(TSV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR do Cục Thú y biên soạn và ban




quả.




4

PHẦN KHÁI QUÁT

1. Tên gọi

TCCS 02:2017/TY-TS quy trình phát hiện vi rút gây Hội chứng Taura

(Taura syndrome virus - TSV) ở tôm.


Tiêu chuẩn này áp dụng để xét nghiệm phát hiện vi rút gây Hội chứng

Taura (TSV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR tại tất cả các phòng thử

nghiệm của các đơn vị trực thuộc Cục Thú y. Đối tượng áp dụng là các loài tôm

như: tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng (P. vanamei), …; Mẫu

được dùng để xét nghiệm là: biểu mô dưới vỏ kittin, máu, chân bơi, mang, ấu

trùng, hậu ấu trùng của các loài nêu trên.

3. Giới thiệu

Vi rút gây hội chứng Taura được phát hiện vào năm 1992 ở Ecuador và

nhanh chóng truyền sang các nước Châu Mỹ, châu Á gây nhiều thiệt hại cho

người nuôi tôm. Dịch bệnh TSV rất nguy hiểm, thời gian ủ bệnh cao, lan truyền

rất nhanh, có thể gây chết từ 40- 95% ở tôm nuôi từ post, tôm giống, tôm giống

lớn.

Vi rút Taura thuộc Aparavirus, họ Dicistroviridae, có dạng hình cầu 20

mặt, kích thước khoảng 31- 32 nm. Hệ thống gen là một mạch RNA. Vi rút ký

sinh tế bào biểu mô và dưới biểu mô đuôi. Hội chứng Taura thường gặp ở tôm

thẻ chân trắng (L. vannamei = Penaeus vannamei) ở giai đoạn nuôi từ 14-45

ngày tuổi, cỡ 0,05-7,0g. Bệnh cũng có thể nhiễm trên tôm thương phẩm.

Bệnh TSV có thể lây nhiễm theo 2 trục ngang và dọc. Đặc biệt sự lây

nhiễm theo trục dọc rất phổ biến, do những con tôm bị bệnh ở thời kỳ mãn tính,

sau vài lần lột xác, những dấu hiệu của bệnh TSV biến mất, nhưng trong cơ thể

vẫn mang mầm bệnh. Nguồn nước chứa các chất thải từ tôm bệnh và những con

chim ăn tôm chết đã trở thành nguồn lây bệnh từ nơi này tới nơi khác.

5

PHẦN KỸ THUẬT


TCCS xét nghiệm, phát hiện vi rút gây Hội chứng Taura (Taura syndrome

virus - TSV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR.

2. Mục đích

Phát hiện TSV ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR nhằm phục vụ


3. Nội dung

3.1. Nguyên tắc

Hội chứng Taura là một bệnh do tác nhân vi rút Taura syndrome virus

(TSV) gây ra trên tôm he. TSV thuộc Aparavirus, họ Dicistroviridae, acid nhân

là RNA sợi đơn, dương (+; ssRNA), vi rút được phát hiện bằng kỹ thuật

Realtime RT-PCR với mồi xuôi TSV1004F, mồi ngược TSV1075R và đoạn dò

Taqman Probe TSV-P1.





NaC1 8,0

KC1 0,2

Na2HPO4 1,15

KH2PO4 0,2





6








Tên mồi và




TSV 1004F 5’-TTG GGC ACC AAA CGA CAT T-3’

72 bp TSV 1075R

5’-GGG AGC TTA AAC TGG ACA CAC

TGT-3’

TSV-P1 5’-6FAM CAG CAC TGA CGC ACA

ATA TTC GAG CAT C BHQ1-3’




+ Mẫu đối chứng dương là mẫu có chứa RNA của vi rút gây hội chứng

Taura ở tôm được chiết tách từ mẫu dương chuẩn, chứa trong các ống có dán

nhãn rõ ràng, lập danh sách quản lý và lưu giữ -75oC. Mỗi ống không rã đông

quá 03 lần.








đương.


7




oC.


0,5 - 10 µl; 10 -100 µl và 100 - 1000µl.











8



tươi hoặc mẫu được cố định trong cồn 90%, bao gồm: biểu mô dưới vỏ kittin,

máu, chân bơi, mang, ấu trùng, hậu ấu trùng của các loài tôm như: tôm sú (P.

monodon), tôm thẻ chân trắng (P. vannamei),…

Dùng pank, kéo vô trùng để thực hiện các thao tác: tách, cắt lấy mẫu. Mẫu














và Bảng 2.


® One-






3 Mồi TSV1004F 20 µM 0,5

4 Mồi TSV1075R 20 µM 0,5

9

5 Đoạn dò TSV-P1 6 µM 0,5



7 Mẫu RNA 5




dụng.





Mx3005P


50oC (*) 15 phút (*) 01

95oC (*) 02 phút (*) 01

94oC 20 giây

40 60

oC

60 giây









10















11



2.2.5. Taura Syndrome.


online/

2. Tang K. F. J., Wang J. and Lightner D. V., 2004. Quantitation of Taura

syndrome virus by realtime RT-PCR with a TaqMan assay. J. Virol. Methods

115: 109-114.

3. InvitrogenTM



PCR System.



12
















2/giếng;


2. Tiến hành




vô trùng có chứa sẵn 200 µl dung dịch đệm Lysis. Trộn đều mẫu bằng máy


13







sung 420 µl dung dịch Bead Mix (gồm có 400 µl Binding solution và 20 µl

MAP) vào mỗi giếng.










hơn.

14




tính

Số lượng

bình

quân

cho 01

mẫu

Diễn giải

1

Cryotube 1,8ml free


đứng)

Cái 7




solution


solution

1 cái : chứa primer & probes

1 cái : chuẩn bị master mix





MAP solution













sterile Cái 5




eppendorf


chiết xuất

15


tính

Số lượng

bình

quân

cho 01

mẫu

Diễn giải



RNA




ống cryotube 5ml


cryotube 5 ml









PCR








mix







18 Primers và Probe TSV (2000

test/bộ) Bộ 0,0028 Nhân gene qRT-PCR




reaction



TCCS 03:2017/TY-TS

QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN VI KHUẨN GÂY HOẠI TỬ

GAN TỤY (NHP-B) Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR

Hà Nội, ngày 07 /4/2017

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU ...................................................................................................... 3

PHẦN KHÁI QUÁT ............................................................................................. 4

1. Tên gọi ........................................................................................................... 4

2. Phạm vi áp dụng ............................................................................................. 4

3. Giới thiệu ........................................................................................................ 4

PHẦN KỸ THUẬT ............................................................................................... 5


2. Mục đích ............................................................................................................ 5

3. Nội dung ............................................................................................................ 5

3.1. Nguyên tắc .................................................................................................. 5



3.4. Cách tiến hành ............................................................................................. 7

3.4.1. Sơ đồ thực hiện ...................................................................................... 7

3.4.2. Chuẩn bị mẫu ......................................................................................... 7

3.4.3. Chiết tách DNA ..................................................................................... 8

3.4.4. Thực hiện phản ứng Realtime PCR ...................................................... 8

3.4.5. Đọc kết quả ............................................................................................ 9


PHỤ LỤC A: CHIẾT TÁCH DNA .................................................................... 12


3

LỜI NÓI ĐẦU

TCCS 03:2017/TY-TS xét nghiệm phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử

gan tụy (NHP-B) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime PCR do Cục Thú y biên soạn và

ban hành. Tiêu chuẩn này được áp dụng tại tất cả các phòng thử nghiệm của các

đơn vị trực thuộc Cục Thú y. Các phòng thử nghiệm bệnh thủy sản khác căn cứ

điều kiện phòng thử nghiệm của đơn vị mình tham khảo, áp dụng cho phù hợp,

hiệu quả.




4

PHẦN KHÁI QUÁT

1. Tên gọi

TCCS 03:2017/TY-TS quy trình phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan

tụy (NHP-B) ở tôm.


Tiêu chuẩn này áp dụng để xét nghiệm phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại

tử gan tụy (NHP-B) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime PCR tại tất cả các phòng thử



được dùng để xét nghiệm là gan tụy, ấu trùng, hậu ấu trùng của các loài nêu trên.

3. Giới thiệu

Vi khuẩn hoại tử gan tụy Necrotizing Hepatopancreatitis – NHP được báo

cáo lần đầu tiên ở Texas vào năm 1985 làm tôm chết và gây thiệt hại lớn về kinh

tế ở khắp các trang trại nuôi tôm ở Trung và Nam Mỹ.

Bệnh vi khuẩn hoại tử gan tụy NHP gây ra bởi loài vi khuẩn gây ra bởi

Proteobacteria thuộc nhóm α (α-subclass – proteobacterium), kích thước tương

đối nhỏ, đa hình thể, gam âm nội bào bắt buộc. Vi khuẩn NHP có hai hình thái

học khác nhau dễ nhận diện: một là vi khuẩn hình que (0,3 x 0,9µm) đa hình thể

nhỏ và thiếu tiên mao (lông roi); hai là vi khuẩn hình que xoắn ốc dài hơn (0,2 x

2,6 – 2,9µm) có 8 tiên mao (lông roi) ở đỉnh gốc của vi khuẩn và 1 – 2 tiên mao

phụ (có thể là) trên chỏm xoắn. Vi khuẩn NHP được tìm thấy tự do trong tế bào

chất của các tế bào gan tụy bị nhiễm bệnh.

Phương thức lan truyền bệnh theo phương ngang qua nguồn nước ao bị ô

nhiễm (trong phân) hoặc cảm nhiễm qua đường miệng (ăn thịt đồng loại). Các

yếu tố như nhiệt độ cao (29 – 35 độ C) và độ mặn (20 – 40 ppt) có liên quan đến

các triệu chứng lâm sàng rõ rệt, vật chủ trung gian và ao lắng. Tỉ lệ chết có thể

từ 90 – 95% trong vòng 30 ngày của một đợt dịch. Giai đoạn tôm bị lây nhiễm:

hậu post, ấu trùng và trưởng thành.

5

PHẦN KỸ THUẬT


TCCS xét nghiệm, phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy (NHP-B)

ở tôm bằng kỹ thuật Realtime PCR.

2. Mục đích

Phát hiện NHP-B ở tôm bằng kỹ thuật Realtime PCR nhằm phục vụ công

tác chẩn đoán xét nghiệm và phòng chống dịch bệnh trên tôm.

3. Nội dung

3.1. Nguyên tắc

Bệnh Hoại tử gan tụy (NHP) là một bệnh được gây ra bởi Proteobacteria

thuộc nhóm α (α-subclass – proteobacterium), vi khuẩn gram âm, đa hình thể,

acid nhân là DNA, vi khuẩn được phát hiện bằng kỹ thuật Realtime PCR với

mồi xuôi NHP1300F, mồi ngược NHP1366R và đoạn dò Taqman NHP.





NaC1 8,0

KC1 0,2

Na2HPO4 1,15

KH2PO4 0,2







6

- Kít MasterMix theo Platinum® Quantitative PCR superMix-UDG, Cat.

No: 11730-017 hoặc kít tương đương.


- Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe) cho phản ứng Realtime PCR

Tên mồi

và đoạn

dò

Trình tự


phẩm khuếch

đại

NHP1300F 5’-CGT TCA CGG GCC TTG TAC AC-3’

69 bp NHP1366R 5’-GCT CAT CGC CTT AAA GAA AAG

ATA A-3’

NHP-p 5’-FAM CCG CCC GTC AAG CCA TGG

AA TAMRA-3’




+ Mẫu đối chứng dương là mẫu có chứa DNA của vi khuẩn gây bệnh hoại

tử gan tụy (NHP-B) ở tôm được chiết tách từ mẫu dương chuẩn, chứa trong các

ống có dán nhãn rõ ràng, lập danh sách quản lý và lưu giữ -75oC. Mỗi ống

không rã đông quá 03 lần.








đương.



7



oC.


0,5 - 10 µl; 10 -100 µl và 100 - 1000µl.











8



tươi hoặc mẫu được cố định trong cồn 90% của mẫu gan tụy hoặc ấu trùng, hậu

ấu trùng của các loài tôm như: tôm sú (P. monodon), tôm thẻ chân trắng (P.

vanamei),…







trong thời gian tối thiểu 1 giờ trước khi tiến hành chiết tách DNA.

3.4.3. Chiết tách DNA

- Quy trình chiết tách DNA được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản



cho chiết tách DNA.

3.4.4. Thực hiện phản ứng Realtime PCR


và Bảng 2.

Bảng 1: Chuẩn bị Master Mix theo kít Platinum®

Quantitative PCR

superMix-UDG kit. Catalogue Number: 11730-017.



2 Mồi NHP 1300F 20 µM 0,5

3 Mồi NHP 1366R 20 µM 0,5

4 Đoạn dò NHP-p 6 µM 0,5

5 Dung dịch SuperMix 2X 12,5


9

6 Mẫu DNA 5




dụng.


Realtime PCR (Master Mix) và mẫu DNA vào máy Real-time PCR. Vận hành

máy theo hướng dẫn và chọn chương trình luân nhiệt đã được cài đặt.


Mx3005P


50oC (*) 02 phút (*) 01

95oC (*) 02 phút (*) 01

94oC 20 giây

40 60

oC

60 giây


(*) Nhiệt độ và thời gian này chỉ phù hợp với kít Platinum®

Quantitative

PCR superMix-UDG kit. Catalogue Number: 11730-017. Việc thực hiện cài đặt

nhiệt độ và thời gian nên tuân thủ theo hướng dẫn của từng bộ kít được sử dụng.


Kết quả của phản ứng Realtime PCR được xác định dựa vào chu kỳ








10









11



2.2.4. Necrotising hepatopancreatitis.


online/

2. Aranguren L. F., Tang K. F. J. and Lightner D. V., 2010.

Quantification of the bacterial agent of necrotizing hepatopancreatitis (NHP-B)

by real-time PCR and comparison of survival and NHP load of two shrimp

populations.

3. InvitrogenTM

Platinum®

Quantitative PCR superMix-UDG kit.



12

PHỤ LỤC A: CHIẾT TÁCH DNA










Nếu chiết tách DNA bằng máy chiết tách tự động Thermo Scientific™





2/giếng;


b. Tiến hành






13












- Chọn chương trình chiết tách DNA đã được cài đặt trước đó theo hướng


- Sau 34 phút, quá trình chiết tách hoàn tất. Thu hồi DNA của từng giếng


- Bảo quản mẫu DNA ở 4oC trong vài giờ và (-)80


hơn.

14


Đối với xét nghiệm bằng kỹ thuật Realtime PCR

TT Tên Vật Tư

Đơn

vị

tính

Số lượng

bình

quân cho

01 mẫu

Diễn giải

1

Cryotube 1,8ml free


đứng)

Cái 7




solution


solution







MAP solution


4 Trip PCR có nắp 0,2ml Cái 1 Nhân gene qPCR











sterile Cái 5




eppendorf


chiết xuất

15

TT Tên Vật Tư

Đơn

vị

tính

Số lượng

bình

quân cho

01 mẫu

Diễn giải



RNA




ống cryotube 5ml


cryotube 5 ml








1 cái: phân phối Master mix vào

đĩa PCR








mix







18 Primers và Probe NHP-B

(2000 test/bộ) Bộ 0,0028 Nhân gene qPCR

19

InvitrogenTM

Platinum®

Qua

ntitative PCR SuperMixUDG

(100 react with 50µl/reaction)

Kit 0,0275 Nhân gene qPCR: 25 µl/ reaction



TCCS 04:2017/TY-TS

QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ

CƠ (IMNV) Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR


MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU ...................................................................................................... 3

PHẦN KHÁI QUÁT ............................................................................................. 4

1. Tên gọi ........................................................................................................... 4

TCCS 04:2017/TY-TS quy trình phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử cơ (IMNV)

ở tôm. ................................................................................................................. 4

2. Phạm vi áp dụng ............................................................................................. 4

PHẦN KỸ THUẬT ............................................................................................... 5


2. Mục đích ............................................................................................................ 5

3. Nội dung ............................................................................................................ 5

3.1. Nguyên tắc .................................................................................................. 5



3.4. Cách tiến hành ............................................................................................. 7

3.4.1. Sơ đồ thực hiện ...................................................................................... 7

3.4.2. Chuẩn bị mẫu ......................................................................................... 8

3.4.3. Chiết tách RNA ..................................................................................... 8

3.4.4. Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR ................................................ 8

3.4.5. Đọc kết quả ............................................................................................ 9




3

LỜI NÓI ĐẦU

TCCS 04:2017/TY-TS xét nghiệm phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử cơ

(IMNV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR do Cục Thú y biên soạn và ban




quả.


Quyết định ban hành số 126 /QĐ-TY-TS ngày 07 tháng 4 năm 2017 của


4

PHẦN KHÁI QUÁT

1. Tên gọi

TCCS 04:2017/TY-TS quy trình phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử cơ

(IMNV) ở tôm.


Tiêu chuẩn này áp dụng để xét nghiệm phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử

cơ (IMNV) ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR tại tất cả các phòng thử



được dùng để xét nghiệm là: cơ, máu, mang, chân bơi, trứng, ấu trùng, hậu ấu

trùng của các loài nêu trên.

3. Giới thiệu

Bệnh hoại tử cơ là một bệnh truyền nhiễm do tác nhân vi rút gây ra

(infectious myonecrosis virus – IMNV). Đây là một trong những bệnh vi rút trên

tôm được phát hiện trong thời gian gần đây nhất. Năm 2002, bệnh xảy ra lần đầu

tiên ở các ao nuôi tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei miền Đông Bắc Braxin.

Sau đó, bệnh lây lan sang các nước khác thuộc khu vực Châu Á như Indonesia,

Thái Lan và tỉnh Hải Nam, Trung Quốc.

IMNV là một Totivirus, thuộc họ Totiviridae, có vật chất di truyền là

ARN mạch đôi, với kích thước 7.560bp, cấu trúc không có lớp màng bao. Phân

tích phát sinh loài dựa vào gen RNA-dependent RNA polymerase (RdRp).

Tôm thẻ chân trắng được ghi nhận là vật chủ chính của IMNV do khả

năng gây tỉ lệ chết cao ở loài tôm này. IMNV thường gây tỉ lệ chết cho tôm thẻ

chân trắng trong khoảng từ 40 cho đến 70%.

5

PHẦN KỸ THUẬT


TCCS xét nghiệm, phát hiện vi rút gây bệnh hoại tử cơ (IMNV) ở tôm

bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR.

2. Mục đích

Phát hiện IMNV ở tôm bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR nhằm phục vụ


3. Nội dung

3.1. Nguyên tắc

Bệnh Hoại tử cơ hay bệnh Đục cơ ở tôm he (Penaeid spp.) được gây ra

bởi vi rút gây Hoại tử cơ (Infectious myonecrosis virus - IMNV). IMNV là một

Totivirus, thuộc họ Totiviridae, acid nhân là RNA kép (dsRNA), vi rút được

phát hiện bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR với mồi xuôi IMNV412F, mồi ngược

IMNV545R và đoạn dò Taqman IMNVp1.





NaC1 8,0

KC1 0,2

Na2HPO4 1,15

KH2PO4 0,2







6






Tên mồi và




IMNV412F 5’-GGA CCT ATC ATA CAT AGC GTT

GCA-3’

134 bp IMNV545R

5’-AAC CCA TAT CTA TTG TCG CTG

GAT-3’

IMNVp1

5’-6FAM CCA CCT TTA CTT TCA

ATA CTA CAT CAT CCC CGG –

TAMRA-3’




+ Mẫu đối chứng dương là mẫu có chứa RNA của vi rút gây bệnh Hoại tử

cơ (IMNV) ở tôm được chiết tách từ mẫu dương chuẩn, chứa trong các ống có

dán nhãn rõ ràng, lập danh sách quản lý và lưu giữ -75oC. Mỗi ống không rã

đông quá 03 lần.








đương.



7



oC.


0,5 - 10 µl; 10 -100 µl và 100 - 1000µl.











8



tươi hoặc mẫu được cố định trong cồn 90%, bao gồm: cơ, máu, mang, chân bơi,

trứng, ấu trùng, hậu ấu trùng của các loài tôm như: tôm sú (P. monodon), tôm

thẻ chân trắng (P. vannamei),…















và Bảng 2.


® One-






3 Mồi IMNV412F 20 µM 0,5

4 Mồi IMNV545R 20 µM 0,5

5 Đoạn dò IMNV-p1 6 µM 0,5

9



7 Mẫu RNA 5




dụng.





Mx3005P


50oC (*) 15 phút (*) 01

95oC (*) 02 phút (*) 01

94oC 20 giây

40 60

oC

60 giây












10












11



2.2.4. Infectious myonecrosis.


online/

2. Andrade T. P. D., Srisuvan T., Tang K. F. J. and Lightner D. V., 2007.

Realtime reverse transcription polymerase chain reaction assay using TaqMan

probe for detection and quantification of infectious myonecrosis virus (IMNV).

Aquaculture, 264, 9–15.

3. InvitrogenTM



PCR System.



12
















2/giếng;


b. Tiến hành











13













hơn.

14




tính

Số lượng

bình

quân

cho 01

mẫu

Diễn giải

1

Cryotube 1,8ml free


đứng)

Cái 7




solution


solution







MAP solution













sterile Cái 5




eppendorf


chiết xuất

15


tính

Số lượng

bình

quân

cho 01

mẫu

Diễn giải



RNA




ống cryotube 5ml


cryotube 5 ml









PCR








mix







18 Primers và Probe IMNV

(2000 test/bộ) Bộ 0,0028 Nhân gene qRT-PCR




reaction

bỘ nÔng nghiỆp cỘng hoÀ xÃ hỘi chỦ nghĨa …º¢n cÔng bỐ tiÊu chuẨn cƠ sỞ...

Documents