BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM

BÁO CÁO PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH TRONG THỰC PHẨM

MẪU NƯỚC MÍA

GVHD: ThS. Nguyễn Minh Hiền

SVTH: nhóm 2

Đặng Thị Hoài Bắc 10156003

Nguyễn Thị Bảo Châu 10156005

Phan Nguyễn Đình Khang 10156033

Phan Thị Thục Quyên 10156062

Trần Thị Thanh 10156065

Phạm Phước Toàn 10156079

Sinh viên viết bài: Trần Thị Thanh

Bài báo cáo đếm số vsv hiếu khí và định lượng coliform

Yêu cầu chung: tất cả các thiết bị, dụng cụ đều vô trùng, khu vực tiến hành thí nghiệm phải được lau cồn để vô trùng, thực hiện các tham tác bên ngọn lửa đèn cồn. tiến hành nhanh, chính xác

1. Định lượng tổng số vsv hiếu khí bằng pp đếm khuẩn lạc

Mục đích: nhằm xác định số lượng vsv hiếu khí trong mẫu nước mía

Xác định tổng số vsv hiếu khí

Các bước

Thiết bị Dụng cụ Môi trường

Cách tiến hành

Đồng nhất mẫu

Đây là môi trường lỏng nên có thể bỏ qua bước đồng nhất

Pha loãng mẫu

Máy rung

Pipet, ống nghiệm, bình tam giác 250ml, đèn cồn…

NaCl 0.85% vô trùng

Pha loãng với nồng độ 10-1

Bước 1: lắc đều mẫuBước 2: lấy 10ml dd từ mẫu ban đầu cho vào bình tam giác.Bước 3: cho 90ml NaCl 0.85% vt vào bình tam giác có chứa dịch mẫu vừa lấyBước 4: lắc đều mẫu.Pha loãng với nồng độ 10-2

Bước 1: lắc đều và lấy 1ml dd mẫu ở nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm.Bước 3: cho 9ml NaCl 0.85% vt vào ống nghiệm có chứa dịch mẫu vừa lấy.sau đó lắc đều mẫu.Làm tương tự cho các nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6

Chú ý: mỗi lần pha loãng ở các nồng độ khác nhau đều phải thay

đầu ống lấy dịch mẫuNuôi cấy 6 đĩa petri

chứa môi trường nuôi cấy, mẫu pha loãng, pipet, que cấy trang, đèn cồn…

PCA Lấy 0.1-1ml dd nước mía ở các nồng độ -4, -5, -6 cho vào 6 đĩa petri có sẵn môi trường nuôi cấy . Mỗi nồng độ 2 đĩa. Nuôi cấy bằng cách đổ đĩa hoặc cấy trang (chú ý: nếu nuôi cấy bằng cách đỗ đĩa thì cấy ở thể tích 1ml và nhiệt độ MT là 40-45oC. Còn cách cấy trang thì cấy ở thể tích 0.1ml và bề mặt MT phải khô, sau khi cấy để khô bề mặt 15-20’ rồi mới ủ.

Ủ Tủ ủ Incubator

Gói gọn số đĩa đã cấy vào giấy báo, lật ngược đĩa khi ủ. ủ trong 24h/37oC

Đếm khuẩn lạc

Máy đếm khuẩn lạc bán tự động

Bút long Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250. Dặt đĩa lên máy đếm, dùng bút đếm tất cả khuẩn lạc đơn lẻ mọc trên môi trường. sau đó đọc kết quả trên máy đếm.

Tính kết quả nồng độ -4 -5

Đếm 1 123 93

Đếm 2 106 94

Tổng số VSHK: =98*104 (cfu/ml)

Với: A: Tổng số vsv đếm được ở 2 nồng độ liên tiếp

n1: số lần đếm ở nồng độ 1

n2: số lần đếm ở nồng độ 2

d: nồng độ nuôi cấy lớn nhất

2. Định lượng vsv bằng pp MPN (Coliform)

Mục đích: định lượng tổng số coliform trong mẫu

Cách tiến hành:

Các bước đồng nhất mẫu, pha loãng mẫu tương tự như bài định lượng vsv hiếu khí

Các bước Dụng cụ Môi trường Cách tiến hànhB1:Nuôi cấy 9 ống

nghiệm, pipette, đèn cồn, bút viết

Lauryl tryptose (LT)

Lấy 9 ống nghiệm mt LT có sẵn các ống durham.Cho 1ml dd nước mía nồng độ -3, -4, -5 vào các ống nghiệm. mỗi nồng độ 3 ống nghiệm.Ghi rõ tên mẫu, môi trường, nồng độ lên các ống nghiệmsau 24h/370C quan sát và đọc kết quả.

Đọc kết quả:

Nồng độ Hiện tượng Kết luận Số ống đạt-3 ống chuông nổi, mt đục Dương tính 1-4 ống chuông chìm, mt

không có biến đổi nhiềuÂm tính 0

-5 ống chuông chưa nổi nhưng có bọt khí xuất hiện trong ống chuông(>=1/10), mt đục

Dương tính 3

Các bước Dụng cụ Môi trường Cách tiến hànhB2: Nuôi cấy 4 ống

nghiệm, piptte, đèn cồn, bút viết

BGBL Lấy 4 ống nghiệm mt BGBL có sẵn các ống durhamCho 1ml dd mẫu ở 4 ống dương tính vào 4 ống nghiệm môi trường (mỗi mẫu 1 ống nghiệm).Sau 24h/370C quan sát và đọc kết quả.

Kết quả:

Nồng độ Hiện tượng Kết luận Số ống đạt-3 ống chuông chưa nổi

nhưng có bọt khí xuất hiện trong ống chuông, mt đục

Dương tính 1

-4 ống chuông không nổi, không xuất hiện bọt khí, mt đục

Âm tính 0

-5 ống chuông nổi, mt đục Dương tính 1

Bước 3: lập tỉ lệ BGBL : coliform

Nước mía : 10-3 : 10-4 : 10-5 = 1: 0 : 1

Tra bảng Mac Crady ta có 1 : 0 :1 =7.2

Tổng số Coliform = MPN* 10n =7.2*103 MPN/g

( với n là nồng độ nuôi cấy đầu tiên lấy nguyên dương)

Báo cáo: Định tính vi khuẩn E.coli

Viết báo cáo: Phan Thị Thục Quyên

1. Mẫu thực phẩm : Nước mía

2. Mục đích :Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn E.coli trong mẫu thực phẩm.

3. Cách tiến hành : Sơ đồ các bước tiến hành:

10-1 …….. 10-3 10-4 10-5

Lauryl Tryptose

↓24h/27oC

↓ ↓ ↓

EC

↓24h/44oC

Nuôi cấy trên EMB agar,Endo agar

Nhận diện khuẩn lạc điển hình

Cấy khuẩn lạc điển hình vào môi trường NA

Nghiệm pháp IMvic

Kết luận

Bước 1: chuẩn bị các môi trường sau:

Nước muối sinh lý vô trùng 0,85%

Môi trường Lauryl Tryptose (LT)

Môi trường Enrichment coli (EC)

Môi trường Eosin  Methylene Blue Agar (EMB)

Bước 2:chuẩn bị dụng cụ

Các dụng cụ đã được vô trùng như: pipet, ống nghiệm, ống Durham, que cấy vòng,

bình nón có thể tích 250ml, đĩa petri.

Tủ ủ,nồi hấp tiệt trùng,máy rung ống nghiệm,đèn cồn, nút bông sạch dùng để đậy

ống nghiệm và phải đảm bảo mặt bàn làm thí nghiệm phải sạch sẽ.

Bước 3: pha loãng mẫu

Tất cả các thao tác lấy mẫu, dịch mẫu và cấy được thực hiện bên ngọn lửa đèn cồn

và tất cả dụng cụ đều được vô trùng.

Dùng pipet hút 10 ml nước mía vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lí

nồng độ 0,85%. Thu được dịch mẫu nồng độ 10-1. Chuẩn bị 5 ống nghiệm, mỗi ống

chứa 9 ml nước muối sinh lí nồng độ 0,85%. Dùng pipet hút 1 ml dịch mẫu nồng

độ 10-1 từ bình tam giác vào một ống nghiệm đã chuẩn bị như trên. Thu được dịch

mẫu nồng độ 10-2. Sử dụng máy rung ống nghiệm để làm đều dịch mẫu. Tiếp tục

thực hiện thao tác này để pha loãng dịch mẫu sang các nồng độ kết tiếp. Khi

chuyển sang nồng độ khác cần thay đầu pipet khác. Khi lấy mẫu ở cùng nồng độ ta

có thể dùng chung đầu pipet. Hoàn thành bước này ta có các dịch mẫu ở các nồng

độ : 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Ghi rõ nồng độ môi trường lên các ống nghiệm.

Bước 4 : giai đoạn tiền tăng sinh

Ta chọn ra 3 môi trường có nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 để nuôi cấy vào môi trường LT.

Mỗi nồng độ nuôi cấy vào 3 ống nghiệm. Dùng ống pipet hút 1 ml dịch mẫu cho

vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LT có kèm ống Durham. Không lắc để

tránh hiện tượng dương tính giả. Thực hiện tương tự với các ống nghiệm còn lại.

Mỗi khi cấy sang nồng độ khác cần thay đầu pipet mới.Ghi rõ môi trường và nồng

độ nuôi cấy cho mỗi ống nghiệm.

Dùng giấy bọc tất cả các ống nghiệm lại và cho vào tủ ủ ở 270C trong 24h. E. coli

thuộc nhóm vi khuẩn có khả năng sử dụng đường lactose trong môi trường LT và

sinh khí. Dựa vào đặc điểm này là xác định được số ống dương tính (nghi ngờ có

E. coli) ở từng nồng độ pha loãng. Ống được xác định là dương tính khi môi

trường trong ống đục và ống Durham nổi hoặc môi trường đục và có bọt khí trong

ống Durham với thể tích bọt khí lớn hơn hoặc bằng 1/10 thể tích ống chuông.

Bước 5 : giai đoạn tăng sinh

Sau khi xác định được các ống dương tính,ta bắt đầu cấy vào môi trường EC. Do

thành phần môi trường EC so với môi trường LT có thêm muối mật nên ức chế

được các vi khuẩn gram dương và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường

ruột.

Cấy truyền 1 ml dịch mẫu từ tất cả các ống dương tính lần lượt vào các ống

nghiệm có chứa 5 ml môi trường EC kèm theo một ống Durham. Gói tất cả ống

nghiệm vào giấy và cho vào tủ ủ trong 24h ở 44oC.

Xác định ống nghiệm dương tính tương tự như bước trên.

Bước 6 : cấy vào môi trường tăng sinh chọn lọc và nhận diện khuẩn lạc điển

hình

Dùng que cấy vòng vô trùng cấy phân lập dịch mẫu từ các ống dương tính nghi

ngờ có E. coli sang các đĩa petri có môi trường EMB agar và Endo agar. Lật úp các

đĩa và gói vào giấy cho vào tủ ủ 24h ở 37oC.

Nhận diện khuẩn lạc điển hình của E. coli trên các môi trường (nếu có) : Khuẩn lạc

điển hình của E. coli trên môi trường EMB agar: Mặt trên đĩa: khuẩn lạc tròn,

bóng, có ánh kim loại, mặt dưới đĩa: thấy tâm đen của khuẩn lạc. Khuẩn lạc điển

hình của E. coli trên môi trường Endo agar: khuẩn lạc tròn, màu đỏ, có hoặc không

có ánh kim loại.

Bước 7 : cấy khuẩn lạc điển hình vào môi trường NA

Sau khi xác định được khuẩn lạc điển hình ta cấy khuẩn lạc điển hình vào môi

trường thạch nghiêng NA. Dùng que cấy vòng lấy khuẩn lạc từ đĩa petri và lên

môi trường thạch nghiêng.Tất cả phải được làm trong điều kiện môi trường vô

trùng(làm gần ngọn lửa đèn cồn) và dụng cụ cũng phải được vô trùng.

Bước 8 : nghiệm pháp IMVic

Dùng để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác, gồm có các phản ứng:

-Phản ứng sinh indol (I): E. coli có indol (+).

-Phản ứng đỏ metyl (M): E. coli có phản ứng đỏ metyl (+).

-Phản ứng Voges Proskauer (V ): Phản ứng này dùng để kiểm tra khả năng sinh ra

acetyl - metyl cacbinol E.coli có pbản ứng Voges Proskauer âm tính

-Phản ứng kiểm tra lên men đường inozitol (I): Trong thực tế không làm

-Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon của citrat (c) E.coli phản ứng citrat âm

tính.

Ngoài ra E.coli không phân giải được ure, không sinh H2S sau 48 giờ.

4. Kết quả  :

Trong 9 ống LT có 4 ống dương tính

Nồng độ Số ống dương tính Biểu hiện

10-3 1 Nổi,môi trường đục

10-4 1 Nổi,môi trường đục

10-5 2 Có khí trong chuông(chưa nổi nhưng thể tích

bọt khí lớn hơn 1/10 thể tích ống

chuông),môi trường đục.

Trong 4 ống EC có 2 ống dương tính

Nồng độ Số ống dương tính

10-3 0

10-4 0

10-5 2

Nhóm em không nhận diện được khuẩn lạc điển hình : có tâm đen, có ánh kim.

Vì vậy nhóm em dừng tại bước 6.

5. Kết luận  :

Vì nuôi cấy trên môi trường EMB agar và endo agar mà không nhận diện được

khuẩn lạc điển hình nên trong mẫu nước mía không có vi khuẩn E.coli

Kiểm tra định tính vi khuẩn Samonella

Giới thiệu: Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy ý, có khả năng di động không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acide nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh Indole, và không

phân giải ure. Không có khả năng tách nhóm amine, hầu hết các chủng đều sinh H2S.

Nguyên tắc: là phương pháp định tính dùng để kiểm tra có hay không có sự hiện diện của Salmonella.

Quy trình đầy đủ: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập (nhận diện và chọn khuẩn lạc điển hình), nhuộm gram, cấy khuẩn lạc vào NA, phản ứng sinh hóa, kết luận.

1. Dụng cụ và môi trường: Mẫu nước mía ép siêu sạch. Canh Peptone đệm (BPW). Canh Rappaport-Vassiliadis soy peptone (RV). Xylose Lysine Deoxycholate agar (XLD Agar). Lam kính, kính hiển vi, bộ thuốc nhuộm gram (thuốc nhuộm: fucshin loảng,

crystal violet, cồn 900, dung dịch lugol). Nutrient agar (NA). Tủ ấm có thể duy trì ở 370C và 420C. Túi ni lông tiệt trùng. Máy đồng nhất mẫu Stomacher. Pipet, micropipet, đầu hút micropipet tất cả đã được tiệt trùng. Đèn cồn, ống nghiệm đã được tiệt trùng và có nút bông, giá để ống nghiệm,

que cấy vòng, bút lông, nồi hấp tiệt trùng.

2. Yêu cầu: Người làm thí nghiệm phải mang đầy đủ các trang phục yêu cầu trong phòng

thí nghiệm. Phải rửa tay sạch và sát trùng sơ qua bằng cồn 900. Nơi tiến hành quy trình phải sạch sẽ thoáng mát. Mặt bàn phải được chùi

sạch sẽ. Các thiết bị, dụng cụ phải được hấp tiệt trùng để đảm bảo cho kết quả kiểm

tra được chính xác. Tất cả các thao tác phải được thực hiện bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. Sau khi tiến hành kiểm tra xong, các mẫu và các dụng cụ phải được hấp tiệt

trùng, đem bỏ mẫu và rửa lại sạch sẽ.

3. Quy trình và cách thực hiện:

Bước 1: Tiền tăng sinh. Mở ngọn lữa đèn cồn, cho 225ml dung dịch peptone đệm vào túi ni lông. Lấy mẫu: lấy 25ml mẫu nước mía. Dùng pipet hút 25ml mẫu nước mía cho

vào túi ni lông đã đựng sẵn 225ml peptone đệm. Trộn 25ml mẫu với 225ml peptone đệm, đồng nhất mẫu bằng máy đồng nhất khoảng 30 giây. Ghi tên mẫu vào trên thành ống nghiệm. Sau đó đem ủ ở 370C trong vòng 24h.

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc: Dùng pipet khác hút 9,9ml dung dịch môi trường RV (mở nút bông của ống

nghiệm, hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn) cho vào ống nghiệm (hơ tiếp miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông lại). Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa RV.

Thay đầu hút của micropipet, chỉnh micropipet về vạch 0,1ml. Hút 0,1ml dung dịch mẫu sau khi được ủ 24h, cho vào 2 ống nghiệm chứa môi trường RV ( làm tương tự trên). Đem ủ trong tủ ấm khoảng 420C và trong 24h.

Bước 3: Phân lập: Sau khi tăng sinh trong môi trường RV ( có màu xanh nước biển vì chứa

Malachite green) ta thấy ống nghiệm chuyển sang màu xanh nhạt hơn với màu xanh của môi trường RV ban đầu chứng tỏ trong mẫu nước mía nghi ngờ có Salmonella.

Dùng que cấy vòng, đốt nóng đỏ trên ngọn lửa đèn cồn, lấy mẫu cấy vào trong đĩa chứa môi trường thạch XLD ( có màu đỏ vì chứa Phenol red). Ta mở nút bông của ống nghiệm sau đó (cà nhẹ que lấy mẫu trên thành ống để làm nguội que cấy) lấy mẫu bằng cách nhúng que cấy vào trong dung dịch, rút nhẹ ra ngoài, hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn. Đậy nút bông lại. Cấy mẫu và đĩa, ta mở hờ nắp đĩa bằng 1 tay, phía được mở hướng về phía ngọn lửa đèn cồn, tay còn lại cấy mẫu bằng cách kéo theo hình zíc zắc đều từ gần thành đĩa ra tới giữa đĩa, xoay đĩa đi qua góc khác và làm tương tự nhưng bây giờ ta cấy thành hang song song.

Làm tương tự với đĩa thứ 2. Ghi tên mẫu lên thành của đĩa. Lật ngược các đĩa lại và đem đi ủ trong tủ ấm 370C trong 24h.

Bước 4: Nhận diện khuẩn lạc điển hình:

Khuẩn lạc điển hình của Salmonella trên môi trường XLD: đỏ cùng màu với môi trường, trong, đôi khi có tâm đen do Salmonella sinh khí H2S kết hợp với Fe2+ tạo ra hợp chất FeS kết tủa có màu đen.

Quan sát đĩa XLD sau khi ủ 24h ta không thấy khuẩn lạc điển hình của Salmonella trên môi trường XLD.

Bước 5: khẳng định: Kết luận trong mẫu nước mía mang đi kiểm tra định tính Salmonella, ta nhận

thấy không có sự xuất hiện của Salmonella.

SV viết bài: Đặng Thị Hoài Bắc

PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH VI KHUẨN STAP. AUREUS

Sinh viên viết bài: Nguyễn Thị Bảo Châu

GIỚI THIỆU:

Staphylococcus aureus hay Tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩn Gram-dương kỵ khí tùy nghi, và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu. Nó là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy ở cả mũi và da. Khoảng 20% dân số loài người là vật mang lâu dài của S. aureus.

Phương pháp kiểm tra định tính nhằm xác định có hay không sự hiện diện của S.aureus

Quy trình thực hiện

Chú ý: tất cả các thao tác đều được thược hiện trong môi trường điều kiện vô trùng hoặc cách đèn cồn 5cm, thao tác nhanh chính xác,các ống nghiệm que cấy và các dụng cụ khác đều được tiệt trùng trước khi sử dụng, các ống hay đĩa môi trường trước khi mang đi ủ phải ghi rõ các thông tin cần thiết như tên mẫu, môi trường, nồng độ, ngày ủ, người thực hiện,…

1. Đồng nhất, pha loãng mẫua. Dụng cụ, thiết bị

Pipet, bình tam giác 250ml, đèn cồn, máy rung.b. Hóa chất, môi trường

Dịch mẫu nguyên chất. Dung dịch nước muối vô trùng (0,85%)c. Cách thực hiện

Đong 90ml dd nước muối vô trùng cho vào bình tam giác. Dùng pipet hút 10ml dịch mẫu cho vào bình tam giác giác chứa nước muối vô trùng. Để bình vào máy rung để đồng nhất mẫu. Ta thu được dung dịch mẫu với nồng độ 10-1.

2. Tăng sinh Stap.aureusa. Dụng cụ, thiết bị

Micropipette, đèn cồn, tủ ủ Incubator.b. Hóa chất, môi trường

2 ống nghiệm chứa môi trường MSB. Dung dịch mẫu nồng độ 10-1.c. Cách thực hiện

Dùng micropipet hút 1ml dịch mẫu nồng độ 10-1 lần lượt cho vào 2 ống nghiệm chứa môi trường MSB (mỗi ống 1ml). Gói cẩn thận 2 ống trên vào giấy báo sau đó cho vào tủ ủ để ở 37oC trong 24h.

d. Kết quả

Cả 2 ống đều chuyển từ màu đỏ sang vàng => tăng sinh dương tính.3. Cấy phân lập

a. Dụng cụ, thiết bịQue cấy trang, đèn cồn, tủ ủ Inclubator

b. Hóa chất, môi trường2 ống tăng sinh MSB+, 4 đĩa petri chứ môi trường Baird Parter Agar (BP Agar), tủ ủ.

c. Cách thực hiệnDùng que cấy trang cấy phân lập 2 ống MSB+ trên các đĩa petri chứa môi trường BP Agar, mỗi ống 2 đĩa. Gói gọn số đĩa đã cấy vào giấy báo, mang đi ủ ở 37oC trong 24h, lật ngược đĩa khi ủ.

d. Kết quảNhận dạng khuẩn lạc điển hình: khuẩn lạc điển hình của Stap.aureus trên BP Agar có đường kính từ 2-5 mm, tròn, bóng, lồi, màu đen, có viền sáng xung quanh khuẩn lạc. Một số dòng có thể xuất hiện các vòng mờ đục (khi kéo dài thời gian ủ) ở bên trong của viền sáng trong (do tác động của lipase).Sau khi ủ, có 3 đĩa có các khuẩn lạc điển hình, dùng bút lông khoanh tròn đánh dấu các khuẩn lạc.

4. Nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển via. Dụng cụ, thiết bị

Kính hiển vi, tiêu bản, đèn cồn, giấy lọc, que cấy trang.b. Hóa chất, môi trường

Thuốc nhuộm crystal violet, dung dịch lugol, cồn 96o, thuốc nhuộm fuchsin kiềm loãng, nước rửa.

c. Cách tiến hành- Dùng que cấy trang lấy khuẩn lạc điển hình cho lên mặt trên phiến

kính, cho thêm vào 1 giọt nước ( phạm vi được đánh dấu).- Dàn đều vi khuẩn trên khu vực đã đánh dấu.- Cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn.- Đặt mảnh giấy lọc lên vết bôi.- Nhỏ thuốc nhuộm crystal violet lên miếng giấy lọc sao cho đủ thấm

xuống vết bôi, để 1-2 phút. Rửa nước.- Nhỏ dung dịch lugol lên vết bôi vừa được nhuộm, để khoảng 1 phút.

Rửa nước- Tẩy màu bằng cồn 96o khoảng 15-30 giây. Rửa nước.- Đặt 1 mảnh giấy lọc khác lên vết bôi

- Nhỏ thuốc nhuộm fuchsin kiềm loãng lên miếng giấy lọc sao cho đủ thấm xuống vết bôi, để khoảng 1 phút. Rửa nước.

- Thấm khô tiêu bản để xem dưới kính hiển vi.d. Kết quả

Quan sát dưới kính hiển vi vi khuẩn Stap. aureus là các tụ cầu khuẩn bắt màu tím của thuốc nhuộm crystal violet

5. Cấy khuẩn lạc điển hình vào NAa. Dụng cụ, thiết bị

Que cấy trang, đèn cồn, tủ ủ.b. Hóa chất, môi trường

2 ống môi trường thạch nghiêng NAc. Cách thực hiện

Dùng que cấy trang cấy chuyển khuẩn lạc điển hình từ đĩa petri BP Agar sang môi trường thạch nghiêng NA. Gói cẩn thận các ống rồi mang đi ủ ở 37oC trong 24h.

d. Kết quảCác khuẩn lạc màu vàng mọc theo đường cấy trên thạch nghiêng NA.

6. Phản ứng sinh hóa tiến hành với huyết tương thỏ có cho thêm lòng đỏ trứng.Mục đích: thử nghiệm khả năng làm đông tụ huyết tương bởi enzyme coalulase.  Lòng đỏ trứng được cho vào môi trường để phát hiện khả năng sinh tổng hợp lycithinase của S.aureus.a. Dụng cụ, thiết bị

Micropipette, 2 ống nghiệm, đèn cồn, que cấy.b. Hóa chất, môi trường

Nước muối sinh lý vô trùng, tube huyết tương thỏ đông khô.c. Cách thực hiện

- Làm tan huyết tương thỏ đông khô: dùng micropipette hút 1ml nước muối sinh lý vô trùng cho vào tube huyết tương thỏ đông khô. Sau đó lăn nhẹ tube trong long bàn tay cho huyết tương tan hoàn toàn. Không được lắc mạnh

- Làm huyền dịch vi khuẩn: hút 1ml nước muối sinh lý vô trùng vào ống nghiệm, dùng que cấy trang cấy chuyển vi khuẩn từ ống chứa môi trường thạch nghiêng NA sang ống chứa nước muối sinh lý, đến khi huyền dịch đục là được.

- Chỉnh micropipette xuống vạc chia 0,5ml. Hút 0,5ml dung dịch huyết tương thỏ cho vào ống nghiệm, bỏ đầu hút pipet. Tiếp tục hút 0,5ml

huyền dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm trên, trộn đều bằng cách lăn nhẹ trong long bàn tay.

- Ủ trong tủ ấm khoảng 37oC.d. Kết quả

Đọc kết quả bằng cách quan sát sự đông tụ sau 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 12 giờ trong quá trình ủ.Nghiêng nhẹ tube lần lượt sau các khoảng thời gian như trên thì ta thấy không có hiện tượng huyết tương thỏ đông tụ vì vậy không có Stap.aureus trong mẫu nước mía đem kiểm tra.

Phản ứng sinh hóa IDS14 GNR

I. Mục đích

- Góp phần định danh VSV Gram (-)

II. Nguyên tắc

- Sử dụng VSV thuần, VSV còn non. Đọc kết quả đúng thời gian quy định

(sau 18-24h nuôi cấy).

- IDS 14 GNR là hệ thống gồm 14 phản ứng sinh hóa cơ bản. Các đĩa giấy

sinh hóa được gắn vào 10 đáy giếng

Giếng Phản ứng1 Lên men Glucose2 Khử Nitrate3 β-Galactosidase (với ONPG)4 Urease5 Phenylalanin Deaminase (PAD)6 Sử dụng CIT7 Thủy phân Esculin

8Sinh H2S

Sinh Indol (IND)9 Voges – Proskauer (VP)10 Sử dụng Malonate

- Thực hiện Oxidase Test trên đĩa giấy rời được bảo quản trong lọ nắp chặt có

chất hút ẩm.

- Thực hiệm LDC và MOB test trong chai môi trường thạch mềm Lysine

decarboxylase – motility.

III. Cơ chế của các phản ứng sinh hóa

1. Thử nghiệm khả năng lên men

- Khi sử dụng các nguồn cacbon để lên men, tùy phương thức lên men các

sảnphẩm tạo ra sẽ khác nhau bao gồm rượu, các acid hữu cơ, CO2,… Trong

tất cả các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH môi trường

dẫn đến sự thay đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.

2. Thử nghiệm Nitratase (khử Nitrate)

- Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat

thành nitrite hay nitơ tự do trong điều kiện kị khí. Nitrite được tạo ra sẽ phản

ứng vớisulphanilamide và N-napthylethylenediamine hydrochloride ở pH

acid cho hợp chất cómàu hồng.

3. Thử nghiệm ONPG

- Các vi khuẩn có khả năng len men đường lactose nhanh có khả năng sản

xuất cả2 loại men lactose permease và β-galactosidase. Một số vi khuẩn

được xem là nhóm vikhuẩn lên men lactose chậm chỉ sản xuất được β-

galactosidase. Hoạt tính của enzymenày có thể xác định dựa một cơ chất

tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside(ONPG). Sự thủy phân của

cơ chất đường này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích onitrophenolcó màu

vàng.

4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

- Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi

trường. Mặt khác mọi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn

cacbon duy nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm

duy nhất. Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi

trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này

được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.

5. Thử nghiệm Urease

- Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành

CO2 và NH3 làm môi trường bị kiềm hóa. Chất chỉ thỉ Phenol Red trong

môi trường thử nghiệm làm môi trường chuyển sang màu đỏ

6. Phenylalanine deaminase (PAD)

- Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia

có khả năng sản xuất men deaminase khử amin của amino acid

phenylalanine thành một keto acid, chất này kết hợp với ion sắt trong thuốc

thử Ferric chloride 10% để cho ra màu xanh lá cây.

7. Thử nghiệm bile esculine

- Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên

kết glucoside trong esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện

diện của muối mật. Esculetin tạo ra sẽ phản ứng với muối sắt trong môi

trường thử nghiệm tạo thành hợp chất màu đen hay nâu đen.

8. Thử nghiệm khả năng sinh indol

- Thử nghiệm này phát hiên vi sinh vật sản xuất men tryptophanase khi nuôi

cấy vi sinh vật trong môi trường canh trypton. Phản ứng thủy phân trytophan

tạo thành Indole, chất này kết hợp với Para-dimethylamino benzaldehyde

trong thuốc thử Kovác cho ra một hợp chất muối dimethyl ammonium màu

đỏ.

9. Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer)

- Thử nghiệm VP nhằm mục đích phát hiện acetoin, một sản phẩm trung tính

trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Chất này bị oxid

hóa trong môi trường kiềm biến đổi thành diacetyl, dưới sự xúc tác của

alpha-naphthol để cho một phức chất màu hồng đỏ.

10.Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate

- Thử nghiệm nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng malonate như

là nguồn carbon duy nhất trong môi trường. Các vi sinh vật biến dưỡng

malonate sẽ sử dụng chu trình glyoxylic acid để biến dưỡng năng lượng.

Nếu không sử dụng được malonate, chất này có tác dụng như một chất diệt

khuẩn. Các vi sinh vật có khả năng biến dưỡng malonate đồng thời có khả

năng sử dụng ammonium là nguồn đạm duy nhất. Do vậy khả năng biến

dưỡng malonate được ghi nhận nhờ sự phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi

trường và chuyển màu của chỉ thị pH.

11.Thử nghiệm KIA

- Thử nghiệm này nhằm phát hiện khả năng sử dụng các nguồn

carbonhydrate, khả năng sinh H2S và sinh khí trong môi trường KIA chứa

hai loại đường lactose 1% và glucose 0.1%. Sau khi nuôi cấy chủng này 18-

24 giờ, có ba trường hợp có thể xảy ra:

Nếu vi sinh vật chỉ lên men glucose, phần trên bề mặt của ống thạch nghiêng

trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống có pH acid. Điều này có thể giải

thích do vi sinh vật sau khi sử dụng hoàn toàn lượng glucose ít ỏi trên bề

mặt mội trường, chúng tiếp tục dị hóa pepton trong môi trường giải phóng

NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm. Ở phần sâu trong môi

trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được lên men kỵ khí sinh ra các acid

hữu cơ làm giảm pH của môi trường. Nếu trong môi trường có chất chỉ thị

phenol red thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có màu đỏ và phần sâu sẽ có màu

vàng.

Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, toàn bộ môi trường trở

nên có pH acid, vi sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton để tạo năng

lượng.

Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton

được sử dụng để biến dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng

trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do pepton chỉ được biến dưỡng trong điều

kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của bề mặt môi

trường và chỉ phần này mới trở nên có màu đỏ. Trong khi đó, phần môi

trường sâu trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu.

- Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí

được nhận biết nhờ các khí này đẩy ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch.

Thử nghiệm này cũng có thể phát hiện khả năng sinh H2S do thành phần

môi trường có chứa sodium thiosulphate. Vi sinh vật khử sulfate có thể khử

hợp chất này để giải phóng H2S. Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào

phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thị

ammonium citrate hiện diện trong môi trường.

12.Thử nghiệm tính di động

- Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi

trí khác nhau trên tế bào vi sinh vật. Trong môi trường thử nghiệm tính di

động thường bổ sung triphenyltetrazolium chloride để phát hiện dễ dàng vị

trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất này khi vào

bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ.

13.Thử nghiệm decarboxylase

- Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme

carboxylase thủy phân được các axít amin đặc hiệu để xúc tác phản ứng loại

bỏ nhóm carboxyl. Các enzyme carboxylase chỉ được cảm ứng tổng hợp khi

môi trường có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu. Phản ứng tạo CO2

trong điều kiện kỵ khí, CO2 sinh ra làm giảm pH của môi trường và được

ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH.

IV. Chuẩn bị và cách tiến hành

1. Đĩa giấy oxidase (OXI): thực hiện thử nghiệm oxidase

- Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame.

- Dùng kẹp giấy lấy một đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý

cho vừa đủ ướt và đặt lên lame.

- Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase.

- Đọc kết quả sau 10 giây: phản ứng dương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiện

màu tím đen; âm tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen.

2. Bảng nhựa có 10 giếng chứa 10 loại đĩa giấy sinh hóa

- Dùng tăm bông vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô

trùng để làm thành huyền dịch có độ đục McFarland 2,0.

- Cho vào mỗi giếng 200 μl huyền dịch, đậy nắp.

- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.

3. Môi trường Lysin decarboxylase (LDC) thực hiện thử nghiệm

Lysindecarboxylase

- Dùng pipet pasteur hay micropiper lấy 2-3 giọt huyền phù cho vào môi

trường LDC, xuyên pha lớp parafilm.

- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.

- Đọc kết quả: dương tính khi môi trường có vi khuẩn mọc và có màu tím; âm

tính khi môi trường có màu vàng hoặc có vàng tím.

4. Môi trường mobility (MOB) thực hiện thử nghiệm di động

- Dùng que cấy vô trùng lấy khúm khuẩn và cắm kim cấy cách 2/3 đáy

ampule chứa môi trường MOB, rút que cấy theo chiều thẳng đứng, cấy ria

trên bề mặt thạch.

- Ủ 35-37oC/12-24 giờ

- Đọc kết quả: vi khuẩn có khả năng di động khi màu đỏ lan rộng ra khỏi

đường cấy.

5. Hướng dẫn đọc kết quả các phản ứng sinh hóa trong bộ IDS14 GNR

GiếngKý hiệu

Thử nghiệm sinh hóa

Thuốc thử thêm vào

Kết quả thử nghiệm(+) (-)

1 GLULên men Glucose

Vàng Tím

2 NITKhử Nitrate thành Nitrite

Tìm NitriteĐỏ/hồng (xuất hiện trong vòng 3 phút)

Vàng nhạt

3 ONPGThủy giải

ONPGVàng nhạt

4 URE Sinh Urease Đỏ cánh senVàng/đỏ

nhạt

5 PADPhenyl Alanine

DeaminaseFeCl3

Xanh lá (xuất hiện ngay khi bỏ thuốc thử, để lâu sẽ mất

màu)

Vàng nhạt

6 CITSử dụng Citrate

Xanh biển (chỉ cần có ánh xanh biển)

Xanh lá/vàng

7 ESCThủy giải Esculine

Đen (có màu từ đen nhạt qua đen

đậmKhông đen

8

H2S Sinh H2SĐen (xuất hiện đáy giếng, mất màu khi

nhỏ Kovac vào)Không đen

IND Sinh indol KovacĐỏ bề mặt (đọc sau 1 phút, không đọc

sau 10 phút)

Vàng bề mặt

9 VPVoges -

ProskauerKOH +

Napthtol

Đỏ (xuất hiện sau 5 phút, không đọc kết quả sau 2h)

Vàng nhạt

10 MLOSử dụng malonate

Xanh biểnXanh

lá/vàng

- Sau khi có kết quả các phản ứng sinh hóa cùng số điểm tương ứng với từng

nhóm, ta có được mã định danh. Từ đó ta có thể tra cứu hệ thống mã định

danh của IDS14 GNR để xác định vi khuẩn cần định danh.

V. Kết quả và kết luận

- Đĩa giấy Oxidase: -

- Môi trường LDC:-

- Môi trường MOB: -

- Tra theo bảng định danh vi khuẩn Gram âm nhờ bộ hóa chất IDS 14 GNR

Tên: Phạm Phước Toàn

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP NHANH ĐỂ XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT

Sinh viên viết bài: Phan Nguyễn Đình Khang

Giếng Phản ứng Kết quả1 Lên men Glucose +2 Khử Nitrate +3 β-Galactosidase (với ONPG) +4 Urease -

5Phenylalanin Deaminase

(PAD)-

6 Sử dụng CIT +7 Thủy phân Esculin -

8Sinh H2S -

Sinh Indol (IND) -9 Voges – Proskauer (VP) -10 Sử dụng Malonate -

1. Giới thiệu

1.1. Đặt vấn đề

Kiểm tra vi sinh vật một cách nhanh chóng, chính xác là chìa khóa giúp nâng cao hiệu quả trong công tác ở phòng thí nghiệm. Nhằm rút ngắn thời gian kiểm tra, một số phương pháp nhanh đã ra đời, trong đó phải kể đến phương pháp xác định vi sinh vật bằng cách sử dụng đĩa Petrifilm.

Đĩa Petrifilm giúp tiết kiệm công lao động, do vậy sẽ có nhiều thời gian giám sát quá trình sản xuất thường xuyên hơn. Kết quả là việc quản lý tốt hơn, kiểm soát quy trình tốt hơn, chất lượng sản phẩm được nâng cao, tiết kiệm chi phí. Tất cả các yếu tố này là các yếu tố quan trọng giúp đạt lợi nhuận cao hơn.

Trong bài báo cáo này xin được giới thiệu về phương pháp xác định Staphylococcus aureus bằng đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates.

Đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates là một phần của bộ sản phẩm công nghiệp hàng đầu Petrifilm, các sản phẩm này độc lập với nhau, các đĩa được làm sẵn, tiết kiệm không gian và chi phí. Cách kiểm tra này chỉ cần ủ ở một nhiệt độ giống như phương pháp 3 đĩa agar Baird-Parker & ống coagulase (BAM).

đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates

1.2. Mục đích

Khi xác định S. aureus trong thực phẩm và trong môi trường, đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates giúp người sản xuất nhận biết và đánh giá rủi ro chất

lượng sản phẩm cũng như ảnh hưởng của điều kiện vệ sinh. Đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates cho kết quả nhanh giúp tiết kiệm thời gian và nguồn lực. Kết quả nhanh hơn có nghĩa là quyết định nhanh hơn ở thời điểm cần loại bỏ hay xuất hàng.

2. Nội dung

2.1. Cách thực hiện

Kiểm tra S.aureus nhanh chóng, chính xác, kết quả tin cậy chỉ với 3 bước đơn giản:

Bước 1: Cấy và trải đều 1 ml mẫu trên đĩa.Bước 2: Ủ ở nhiệt độ thích hợp.Bước 3: Đếm số khuẩn lạc.

2.2. Đọc kết quả

Khuẩn lạc có màu tím đỏ xuất hiện

Sau khi ủ trong khoảng từ ít nhất từ 22 giờ đến 29 giờ, chất chỉ thị trong đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates giúp xác định S. aureus bởi những khuẩn lạc màu tím đỏ, trên đĩa có kẻ ô thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc.

Vì đĩa Petrifilm được làm đồng nhất và dễ dàng sử dụng nên ít xảy ra sai sót so với các phương pháp khác. Đĩa có kẻ ô thuận tiện cho việc đếm khuẩn lạc. Cho kết quả nhanh, chính xác và nhất quán.

3. Kết luận

Phương pháp xác định S. aureus bằng đĩa Petrifilm Staph Express Count Plates là một trong những phương pháp xác định vi sinh vật nhanh chóng và đáng tin cậy. Nhờ vậy, chúng ta có thể rút ngắn được nhiều thời gian so với các phương pháp truyền thống. Việc nghiên cứu, phát triển các phương pháp kiểm tra nhanh và hiệu quả cao hơn luôn được xúc tiến và thực nghiệm.

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP KIỂM SOÁT VỆ SINH

Sinh viên viết bài: Phan Nguyễn Đình Khang

1. Giới thiệu

1.1. Đặt vấn đề

Kiếm soát vệ sinh là một trong những công việc rất cần thiết nhằm đảm bảo chất lượng môi trường sống, vệ sinh an toàn trong thực phẩm cùng nhiều lĩnh vực khác, có sự ảnh hưởng quan trọng đến cuộc sống cũng như sức khỏe của con người. Vậy làm thế nào ta có thể kiểm soát hết được cái mối nguy xung quanh, câu trả lời chính là việc phải xem xét mối nguy đó đến từ đâu và ngăn chặn sự xâm nhiễm.

Có nhiều phương pháp kiểm soát và đo lường vệ sinh, tuy nhiên ở bài báo cáo này, xin chỉ nêu phương pháp kiểm tra vệ sinh bề mặt bằng gói Contact Slide.

Contact Slide được thiết kế để sử dụng sàn lọc, xác định số vi khuẩn trên bề mặt và trong chất lỏng. Vật chứa đựng dạng ống tròn trong suốt với hướng mở phía trên khóa bằng khớp thuần, hai mặt Slides với các loại thạch khác nhau, phù hợp với việc đếm vi sinh vật toàn diện, thử nghiệm cho nấm men và khuôn mẫu.

Contact Slides

1.2. Mục đích

Trong kiểm soát vệ sinh thực phẩm, các Slides sàng lọc và nghiên cứu vi khuẩn thực hiện trên một loạt các sản phẩm thực phẩm và nước, chẳng hạn như các sản phẩm sữa, các sản phẩm thịt, thực phẩm đông lạnh, thực phẩm nấu chín, nước được sử dụng trong các quy trình công nghiệp, nước được xử lý trong các nhà máy lọc, nước uống và nước bể bơi. Sử dụng để xác định tổng số vi sinh vật toàn diện, nhận biết vi khuẩn coliform, staphylococcus aureus, phân Streptococcus, Pseudomonas và các thuộc địa khác của vi khuẩn.

2. Nội dung

2.1. Cách thực hiện

Sử dụng Contact Slide dễ dàng, thực hiện theo các bước:

Bước 1: Mở khớp với điểm tách đúc.

Bước 2: Contact Slide được lấy ra và nhấn thẳng lên bề mặt để được thử nghiệm, dù bề mặt là gồ ghề, ẩm ướt…

Bước 3: Sau đó Contact Slide được chèn ngược trở lại vào gói

Bước 4: Lưu trữ ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả (theo tài liệu đính kèm gói)

2.2. Ưu điểm

Vô trùng đôi gói của các Contact Slide qua chiếu xạ gamma.

An toàn dẫn truyền trong quá trình thử nghiệm và ngay cả sau khi sử dụng.

Dễ đóng chặt lại.

Chi phí làm giảm bằng cách khả năng tạo ra chỉ số lượng cần được sử dụng.

Chất lượng đảm bảo do điều kiện không đổi.

3. Kết luận

Nhìn chung, Contact Slide được sử dụng để đếm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc trên bề mặt. Các thùng chứa thạch đóng gói riêng lẻ và hoàn toàn kín, do đó loại trừ ô nhiễm thứ cấp. Các định dạng của các slide ngày càng phát triển hơn nữa. Đây chính là phương giúp kiểm soát vệ sinh bề mặt một cách nhanh chóng và hiệu quả.

Phương pháp giải trình tự gen 16S RNA

Nguyên tắc: gen 16S rRNA có chiều dài khoảng 1542 bp với nhiều trình tự bảotồn, trong đó có một đoạn trình tự chiều dài khoảng 550 bp đặc hiệu cho giống và loàicủa vi khuẩn. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh chính xác loài vi khuẩn.

Các bước tiến hành

1.Tách chiết DNA vi khuẩn

Phương pháp: DNA của vi khuẩn được tách chiết bằng phương pháp sốc nhiệt với qui trình như sau:

- Lấy một khúm khuẩn cho vào tube eppendorf có chứa sẵn 200 μl dung dịch TE, trộn đều để tạo huyền dịch vi khuẩn- Đun sôi mẫu ở 100oC trong 10 phút sau đó chuyển ngay sang khay đá trong 5 phút.

- Ly tâm 14000 RPM trong 10 phút.- Hút dịch nổi chứa DNA vi khuẩn sang eppendorf mới.

2.Phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rRNA

Phương pháp: sử dụng bộ hóa chất NK16S-PCR của công ty Nam Khoa với cácthành phần như trong bảng 1

Bảng 1 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA.

Chương trình luân nhiệt của phản ứng PCR 16S rRNA1 chu kỳ 40oC trong 10 phút

1 chu kỳ 95oC trong 10 phút40 chu kỳ 94oC trong 30 giây60oC trong 30 giây72oC trong 1 phút3 chu kỳ 72oC trong 10 phút

3. Tinh sạch sản phẩm PCRMục đích: loại bỏ mồi còn dư, dNTP cùng các thành phần khác, đảm bảo độ tinh sạch cao của DNA trước khi tiến hành giải trình tự.Phương pháp: sử dụng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification Kits(QUIAGEN, Mỹ). Bộ kit này được chế tạo dựa trên khả năng bám của DNA lên silicakhi có mặt của nồng độ muối cao và pH thích hợp (pH ≤ 7). Các chất không mong muốn như mồi dư, muối, enzyme, những nucleotit không bắt cặp,… không bám vào màng silica mà đi qua cột nhờ ly tâm. Muối được rửa khỏi cột bằng dung dịch đệm chứa ethanol. Dung dịch đệm rửa còn lại trong cột có thể ảnh hưởng đến các phản ứng enzyme sau này bị loại ra khỏi cột nhờ ly tâm. Dung dịch ly giải EB có nồng độ muốithấp và pH cao (pH 8,5) giúp DNA được ly giải ra khỏi cột. Cuối cùng là quá trình ly tâm để thu được dịch chứa DNA tinh sạch.Cách sử dụng bộ hóa chất QIAquick PCR Purification KitsVật liệu - Hóa chất- QUIAquick Spin columns.- Buffer PB (guanidine hydrochloride, isopropanol).- Buffer PE (bổ sung ethanol 100%).- Buffer EB (10 nM TrisCl, pH 8,5).- pH indicator.- Sodium acetate 3 M , pH 5.- Collection Tube.Qui trình:- Hòa dung dịch PB vào tube chứa sản phẩm khuếch đại DNA theo tỉ lệ 1:5- Chuyển dung dịch này qua hệ thống QUIAquick Spin columns đã đặt vào một collection tube, ủ 1,5 phút ở nhiệt độ phòng để DNA bám lên màng, sau đó ly tâm 16000 RPM trong 1 phút .- Loại bỏ dịch trong collection tube, rửa cột bằng 700 μl dung dịch PE (đã pha loãng với ethanol 95%), ly tâm 16000 RPM trong 1,5 phút.- Loại bỏ dịch trong collection tube, ly tâm khô 16000 RPM trog 1 phút. - Đặt QUIAquick Spin columns vào tube mới, cho vào 20-35 μl EB, để yên ở nhiệt độ phòng trong 1-2 phút, sau đó ly tâm 16000 RPM trong 1 phút. Dịch thu được chứa DNA tinh sạch.

4. Xác định nồng độ DNA sau tinh sạchMục đích: kiểm tra nồng độ DNA tinh sạch nhằm bổ sung thể tích thích hợp vào phản ứng PCR giải trình tự để thu được hiệu quả khuyếch đại tốt nhất.Phương pháp: Dùng máy phân tích tự động Aligent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies, Mỹ) xác định nhanh chóng nồng độ tương đối của DNA sau khi tinh sạch nhằm xác định được thể tích cẩn bổ sung vào phản ứng PCR giải trình tự.Qui trình:- Cho 9 μl Gel-dye vào giếng G, dùng piston ép gel trong 1 phút để gel theo ống mao quản đi vào các giếng khác.- Bổ sung 5 μl maker vào mỗi giếng- Cho 1 μl ladder vào giếng L và 1 μl mẫu vào cẩn kiềm tra vào giếng còn lại.- Vortex hỗn hợp trong vòng 1 phút, đặt vào máy Agilent 2100 Bioanalyser

5. PCR giải trình tựCác mẫu DNA tinh sạch cho kết quả điện di tốt được đưa vào chu trình nhiệt của phản ứng PCR giải trình tự nhằm tạo đoạn DNA có gắn các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang. Phản ứng PCR giải trình tự được thực hiện trong 2 phản ứng với lần lượt 2 cặp mồi NK16s-F và NK16s-R nhằm thu được đoạn trình tự có độ dài mong muốn.Thành phần phản ứng PCR giải trình tựBig dye Terminator 1 μlBig Dye buffer 3,5 μlMồi (5 pmol/μl) 0,7 μlDNA mẫu từ 13-18 ng

Nước khử ion thêm vào cho đủ 20 μl

Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR giải trình tự

1 chu kỳ 96oC trong 1 phút25 chu kỳ 96oC trong 10 giây50oC trong 5 giây60oC trong 4 phút1 chu kỳ 4OC trong 10 phút6 .Tủa và tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tựMục đích: loại bỏ các Bigdye terminators còn dư và các thành phần dư khác trong buffer trước khi tiến hành điện di mao quản nhằm thu được tín hiệu tốt hơn trên máy giải trình tự tự động.Phương pháp: sử dụng nồng độ muối cao trong ethanol tuyệt đối để tủa DNA.Qui trình- Cho 2 μl EDTA 0,125 M; 2 μl sodium acetate 3 M, 50 μl ethanol 100%

và 20 μl sản phẩm sau khi chạy PCR sequecing, ủ 10 phút ở nhiệt độphòng.- Ly tâm 17000 RPM trong 20 phút.- Úp ngược để loại dịch nổi, ly tâm 200 RPM trong 1 phút.- Thêm 50 μl ethanol 75%, ly tâm 17000 RPM trong 20 phút.- Úp ngược để loại dịch nổi, ly tâm 200 RPM trong 1 phút.- Đổ bỏ ethanol dư rồi sấy khô bằng bồn hút chân không trong 10 phút.- Cho 20 μl Hi-di, để 10 phút ở nhiệt độ phòng sau đó đặt vào hệ thốngmáy giải trình tự tự động ABI 3130 XL Genetic Analyser .7. Điện di mao quản DNANguyên tắc: đoạn DNA mạch đơn được đánh dấu bằng 4 màu huỳnh quang khác nhau tại đầu 5’ di chuyển trên gel polyacriamide trong quá trình điện di. Các vạch điện di được các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên. Tín hiệu được mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Tử biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự đoạn DNA [10].

Phương pháp: thực hiện điện đi trên máy giải trình tự ABI 3130 XL Genetic Analyser (Applied Biosystem, Mỹ) với gel POP-7.

8. Xử lý kết quả giải trình tựKết quả được phân tích bằng phần mầm Sequencing analysis, được lưu dưới định dạng fasta và được xử lý bằng phần mềm Bioedit nhằm đưa ra chuỗi trình tự tốt nhất.Chuỗi trình tự được so sánh với các trình tự tham khảo trên ngân hàng NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) thông qua công cụ BLAST nhằm xác định chính xác tên vi khuẩn.