biyolojik Örneklerde İlaç analizi ecz 344 9....
TRANSCRIPT
Biyolojik Örneklerde İlaç
AnaliziECZ 344
6. ders/25.04.2014
PROF.DR. DİLEK AK
ECZACILIK FAKÜLTESİ
ANALİTİK KİMYA ANABİLİM DALI
1
Diğer Biyolojik Örnekler
Sıvı ve gaz biyolojik matrisler • Kan: Tüm kan, plazma ve serum
• İdrar
• Salgı ve itrah: tükrük, gözyaşı, ter,
süt, beyin omurilik sıvısı, mide sıvısı,
safra, semen, amniyon sıvısı
• Nefes
Katı ve yarı katı biyolojik matrisler • Feçes
• Keratinli dokular: Saç, deri, tırnak
• Organlar ve diğer dokular: Beyin,
akciğer, karaciğer, kas, yağ, kemik
• Mide içeriği
Klinik ve adli uygulamalarda ilaç analizi için kullanılan biyolojik matrisler
2
Saç
Saç, ilaç analizi için cazip bir hedeftir, zira non-invaziv yolla toplanır, ilaç afinitesi değişkenliklerine bağlı olarak saç tipine göre değişkenlikler olsa bile maruziyetin tarihsel bir kaydını sağlar.
İlaç testleri için biyolojik örnek olarak idrar ve kandan sonra saç üçüncü sırada bulunan bir materyaldir.
Analiz için bir matris olarak saçın ilave üstünlüğü oldukça nonpolar olmasıdır ve bu yüzden metabolitlere göre daha az polar olan ana ilaç molekülünü adsorplama eğilimindedir. Bundan dolayı analitlerin non-polar ekstraksiyon fazları için ideal bir matrisdir, özellikle ana ilacın büyük ölçüde metabolizmaya uğradığı ve diğer dokularda tayin edilemediği durumlarda önemlidir.
Saç telinde üç farklı tabaka vardır: kütikül, korteks ve medulla. Kütikül dış tabakadaki koruyucubölümdür ve birbirinin üzerini örten kiremite benzer hücrelerin oluşturduğu birçok tabakadanoluşur. Saçın büyük bir bölümünü korteks oluşturur. Korteks orta, medulla ise iç tabakadır. Saçınbüyük kısmı bir protein olan keratin yapısından oluşur. Proteinlerin sarmal şekilde katı değişikbağlar yardımı ile bağlanması sonucu saç korteksi oluşur. Bu sarmal yapı sayesinde saç telikırılmadan bir miktar esneme özelliğine sahip olur.
Resim için adres: http://www.dogatek.com.tr
3
Saç
Saç numunesi almak için en uygun yer posterior vertex denilen başın arka kısmıdır. Bu alan saç büyüme hızında daha az değişkenliğe sahiptir. Erkeklerde saç uzaması 0.44 mm/gün, kadınlarda 0.45 mm/gün’dür.
En az 200-250 mg örnek alınmalıdır.
İlaç suiistimali (narkotiklerin incelenmesi, şartlı salıverilme, detoksifikasyontedavisi sırasında ilaçtan kaçınma vb) dışında adli bilimlerde ilaçlar için saçların incelenmesi genellikle ölmüş kişiler üzerinde yapılır.
Dış bulaşma ilaç suiistimali için önemli bir konudur, çünkü kişiler tozlu veya dumanlı ortama maruz kalabilir.
Diğer önemli konu saçın kozmetik işlem görmesi ile ilaç derişiminde meydana gelen değişikliktir.
4
Saç
Çeşitli çözücüler ile ekstraksiyon işlemleri uygulanabilir: metanolik
sonikasyon, 0.1 M NaOH, 0.1 M HCl, su, tamponlar, 1 M NaOH, % 0.1
sodyum dodesil sülfat, aseton, pronase, performik asit-pronaz, metanol, 5
M HCl, proteinaz K, ditiyotreitol, pH 7.4 fosfat tamponu, ß-glukuronidaz-
arilsulfataz ve süperkritik akışkan ekstraksiyonu (SFE). Metanolik sonikasyon
ve SFE dışında yapılan ekstraksiyonlarda analitik işlem öncesinde ilave
temizleme işlemleri gerekir.
Sıvı-sıvı ekstraksiyon en basiti, çok basamaklı eser zenginleştirme işlemleri ise
en zor ve karmaşık olanlarıdır.
5
Saç
Saç analizleri en çok adli toksikoloji ve ilaç suiistimali alanlarında ve daha
seyrek olarak klinik toksikoloji ve klinik kimya alanlarında uygulanır.
Kokain, amfetamin ve opiatlar ile ilgili saç analizlerini içeren pek çok
makale vardır.
Son zamanlardaki makaleler klenbutarol gibi doping ajanları,
benzodiazepin, metadon ve karbamazepin gibi terapötik ilaçlarla ilgilidir.
6
Ter
Ter ilaç atılma ile ilgili mekanizmaların aydınlatılmasında alternatif bir hedeftir ve terdeki ilaç bileşimi saçtaki gözlemlere kısmen katkı sağlayabilir.
Ter, eccrine ve apocrine glandlardan salgılanır ve deri sulu ve sebaceous salgıyı özellikle yüz ve alında salgılar. Sebaceous sekresyontemel olarak yağlardan oluşur ve bir çok ilacı taşır ve absorplayabilir. Sebum diğer vücut bölgelerine göre enseden ve alından daha fazla salgılanır.
Vücudun farklı bölgelerinden numune alınmasına bağlı olarak farklı derişimler beklenmelidir, çünkü yağda çözünür ilaçlar sebumdan atılır.
Terleme egzersiz ile uyarılabilir ve bir kaç ml ter numunesi alınabilir.
7
Ter
Ter numunesi alınırken 1-3 tabaka filtre kağıdı veya pamuk, tülbent,
havludan üretilmiş pet kullanılır.
Sweat patches bu amaçla özel olarak çeşitli şekillerde üretilmiş ve ticari
olarak mevcuttur.
Daha basit bir yol alkollü pamuk ile silerek teri almaktır.
Analiz edilen sıvının tam içeriği bilenemez, çünkü hem sulu sekresyon
(gerçek ter) hem de sebum toplanır.
8
Dokular
Doku örnekleri genellikle biyopside elde edilen, ameliyat sonrasında
numune olarak veya adli konularla ilgili numunelerdir.
Biyopsi numunelerinde histolojik fiksatiflere, diğerlerinde ise çürüme nedenli
bozulmalardan kaynaklanan girişimlere dikkat edilmelidir.
Homojenizasyon ve ardından enzim dijesyonu ve/veya protein çöktürme
işlemleir ve santrifüjden sonra ekstraksiyon için numune hazır hale gelir. Bu
şekilde böbrek, karaciğer, ve intestinal dokular çalışılabilir. Beyin dokusu
yüksek yağ içeriğine sahiptir ve ekstraksiyon işlemlerinden önce lipaz ile
muamele gerekir.
10
Dokular
Doku için numune hazırlama işlemi:
1 gram beyin dokusu alınır.
Üzerine 0.2 M Tris tamponu (pH 6.3) ve iç standart eklenir.
5 s homojenize edilir.
Selüler materyalden süzüntü santrifüj ile ayrılır.
Ekstraksiyon uygulanır.
Perkloirk asitle homojenizasyon işlemi koşullara bağlı olarak uygulanabilir.
11
Feçes
Feçes ile ilgili analizler pek tercih edilmez ancak bazen gerekli olabilir.
Zamanlı örneklerin toplanması güçtür.
Sıvı halde numune hazırlamak için iki şekilde çalışılır, ya kütle yakılır ve kalıntı
uygun bir çözücüde çözülür veya daha yağın olarak fekal homojenat elde
etmek için sıvının uygun bir hacminde homojenize edilir ve santrfüj ile
çözünmeyen kısımlar ayrılır. Ardından diğer işlemler uygulanır.
Başlangıçta çeker ocakta çalışmak tercih edilir.
12
Nefes
Nefeste bileşiklerin analizi klinik analizlerde oldukça yeni bir alandır. Etanol
ve aseton ve metabolik durum hakkında bir indikatör olan isopren
analizleri için makaleler bulunur.
Soluk alıp verme sırasında ağızda yerleştirilen adsorban tüpler nefes
numunesi almak mevcuttur.
Tedlar bag ise SPME fiber cihazına manuel yerleştirilmeye uygun bir araçtır.
13
Amniyon sıvısı
Bebek bekleyen anneler için bebeğe ilacın geçişini teşhis etmek amacıyla
uygulanabilir. Hamilelikte kokain kullanımı neonatal test gerektirebilir.
İdrarda kokain yarı ömrü azdır ve idrar ile atılımda bireysel değişkenlikler
sözkonusudur. Bu nedenle amniyon sıvısının analizi önerilmektedir.
Amniyon sıvısı anneden fetusa sirkule eden, viskoz beyaza yakın renkli bir
sıvıdır.
1 ml amniyon sıvısı 3 ml 0.025 M pH 4.0 fosfat tamponu ile seyreltilerek
ekstraksiyon uygulanır.
14
Tırnak
Adli tıpta uygulamalar fazladır.
İlaç kullanımının zaman bağlı durumunun bilinmesi gerektiğinde tırnak yararlı bir matrikstir.
İlacın miktar tayini çalışmalarında başlıca sınırlama tayin edilecek ilaç miktarın son derece az olmasıdır.
Kokain, benzilekgonin, norkokain, morfin, 6-monoasetil morfin, kodein, hidrokodon için analiz yöntemleri bulunmaktadır.
Numune hazırlanması sırasında 3-5 mm tırnak kesilir ve 100 mg kadarı numune olarak kullanılır. 3 ml metanol ile 2 defa yıkanarak kirliliklerden arındırılır. 60oC de 2 saat kurutulur. Daha küçük parçalara ayrılarak yeniden tartılır. 0.1 M 3 ml fosfat tamponuna (pH 5) alınır ve ultrasonik banyoda 1 saat tutulduktan sonra 72 saat fosfat tamponunda bekletilir.
15
İlaç analizi için numune hazırlama amaçları
Analit tayini ile girişim yapabilecek makromoleküler kontaminantların (proteinler) uzaklaştırılması
Kromatografik ve elektroforetik kolonun ayrım gücünün numunedeki tüm bileşenleri tamamen ayırmaya yeterli olmadığı durumlarda veya yeterince zaman olmadığında seçilmiş analitbileşenlerinin uzaklaştırılması
Kromatografik veya elektroforetik ayırmayı ve tekrar edilebilirliği etkileyebilecek materyalin uzaklaştırılması
Kromatografik sistemi bloke edebilecek materyalin uzaklaştırılması
Kompleks halde bulunan analitin belirlenmesi
Kromatografik sisteme verilecek analitlerin çözünür hale getirilmesi
Çözücü kuvvetini azaltmak veya çözücü uyumsuzluğunu önlemek için seyreltme
Analitik cihazın saptama sınırları içinde kalacak şekilde analitin derişik hale getirilmesi
Duyarlılık ve seçiciliği artırmak için analitin türevlendirilmesi
16
Kaynaklar
J. Pawliszyn, Comprehensive Analytical Chemistry. Sampling and Sample
preparation for Field and Laboratory. Chapter 23. Elsevier, 2002
M.J, Telepchak, T.F. August ve G. Chaney, Forensic and clinical
applications of solid phase extraction, Humana Press Inc. Totowa, NJ.
Chapter 7, 129
17