Birth of parthenogenetic Birth of parthenogenetic mice that can develop to mice that can develop to

adulthoodadulthoodTomohiro Kono, Yayoi Obata, Quiong Wu, Katsutoshi Niwa, Yukiko Ono, Yuji Yamamoto, Eun Sung Park,

Jeong-Sun Seo & Hidehiko Ogawa

Nature - vol 428 – 22 april 2004Nature - vol 428 – 22 april 2004

Porque não ocorre partenogênese em mamíferos?

IMPRINTING

Função de cada umFunção de cada um Embrião Embrião

Somente com cromossomos maternos:Somente com cromossomos maternos:

Tecidos extraembrionários se desenvolvem poucoTecidos extraembrionários se desenvolvem pouco

Somente com cromossomos paternos:Somente com cromossomos paternos:

Desenvolvimento do embrião é retardadoDesenvolvimento do embrião é retardado

Expressão Gênica DiferencialExpressão Gênica Diferencial

Genes Genes Igf2 Igf2 ee H19 H19

Cópia materna - expressaCópia materna - expressa H19 H19

Cópia paterna - expressaCópia paterna - expressa Igf2 Igf2

DMD: differentially methylated domainDMD: differentially methylated domain Está entre os dois genes, acima do gene Está entre os dois genes, acima do gene H19H19 Coopera com acentuadores abaixo do gene Coopera com acentuadores abaixo do gene H19H19 Cópia materna: CTCF se liga a DMDCópia materna: CTCF se liga a DMD Cópia paterna: DMD metilado – ligação impedidaCópia paterna: DMD metilado – ligação impedida

Kono Kono e colaboradorese colaboradores

Cromossomos de óvulo imaturo (ngCromossomos de óvulo imaturo (ngWTWT))

sem imprintingssem imprintings

Cromossomos de óvulo maduro (fgCromossomos de óvulo maduro (fgWTWT))

Embriões partenogenéticosEmbriões partenogenéticos

(13,5 dias de feto)(13,5 dias de feto)

Partenogênese X Genes Partenogênese X Genes H19 e Igf2H19 e Igf2

Cromossomos de óvulo imaturo (ngCromossomos de óvulo imaturo (ngH19Δ3))

sem uma região de 3Kb (gene sem uma região de 3Kb (gene H19)H19)

Cromossomos de óvulo maduro (fgCromossomos de óvulo maduro (fgWTWT))

Embriões partenogenéticosEmbriões partenogenéticos

(17,5 dias de gestação)(17,5 dias de gestação)

Partenogênese X Genes Partenogênese X Genes H19 e Igf2 + H19 e Igf2 + DMDDMD

Cromossomos de óvulo imaturo(ngCromossomos de óvulo imaturo(ngH19Δ13))

sem região do gene sem região do gene H19 H19 e do DMDe do DMD

Cromossomos de óvulo maduro (fgCromossomos de óvulo maduro (fgWTWT))

Table 1

Development of reconstructed parthenogenetic embryos

Developmental progress

Number

Number of reconstructed eggs 457457

Number of embryos developed to

Blastocysts417 (91.2% of reconstructed eggs)

Number of embryos transferred 371 (89.0% of blastocysts)

Number pregnants/recipients 24/26

Number of implantation to recipients

246 (71.7% of embryos transferred to pregnants)

Number of pups28 (8.2% of embryos transferred to pregnants)

Dead Dead 18 (5.2% of embryos transferred to pregnants)

LiveLive8 (2.3% of embryos transferred to pregnants)

Survived2 (0.6% of embryos transferred to pregnants)

Análise de expressão gênica globalAnálise de expressão gênica global

Microarray de embriões com 12,5 dias de Microarray de embriões com 12,5 dias de gestaçãogestação Controle, ngControle, ngWTWT/fg/fgWT WT e nge ngH19Δ13/fg/fgWTWT

Fenótipos similares com o controle mas pesos da Fenótipos similares com o controle mas pesos da placenta e do feto inferior aos do controlesplacenta e do feto inferior aos do controles

Não houve diferença significativa na proporção Não houve diferença significativa na proporção de embriões gde embriões gWTWT/fg/fgWT WT (25%)(25%) e nge ngH19Δ13/fg/fgWT WT (35%).(35%).

Análise de expressão gênica globalAnálise de expressão gênica global

O padrão de expressão gênica dos embriões O padrão de expressão gênica dos embriões ngngH19Δ13/fg/fgWTWT diferiu em uma grande variedade diferiu em uma grande variedade de genes quando comparados com embriões de genes quando comparados com embriões ngngWTWT/fg/fgWTWT. Foram . Foram 10381038 genes distribuídos: genes distribuídos:

15,1% comunicação celular15,1% comunicação celular 19,1% manutenção/crescimento celular19,1% manutenção/crescimento celular 21,9% metabolismo21,9% metabolismo

Dentre os 34 genes com Dentre os 34 genes com imprintingimprinting:: ngngH19Δ13/fg/fgWTWT

Grb10 (mantém comportamento de FGrb10 (mantém comportamento de FmmFFmm, 2 cópias ligadas), 2 cópias ligadas) Upregulated mais do que o dobro dos níveis de controle.Upregulated mais do que o dobro dos níveis de controle.

Nnat (FNnat (FmmFFmm, tem 2 cópias desligadas), tem 2 cópias desligadas) Downregulated menos que a metade dos níveis de controle.Downregulated menos que a metade dos níveis de controle.

ngngWTWT/fg/fgWTWT

11 genes são downregulated (11 genes são downregulated (FFmmFFmm, 2 cópias desligadas, 2 cópias desligadas))

Grb10 Grb10 é upregulated no ngé upregulated no ngWTWT/fg/fgWT WT ((FFmmFFmm, , ligados)ligados)

Expressão diferencial significativaExpressão diferencial significativa

Entre 11 e 42 (média 30) genes nos ngEntre 11 e 42 (média 30) genes nos ngH19Δ13/fg/fgWTWT

Somente o gene Somente o gene Dlk1 Dlk1 mudou sua expressão nos 4 mudou sua expressão nos 4 embriões ngembriões ngH19Δ13/fg/fgWTWT

Entre 431 e 1324 (média 842) genes ngEntre 431 e 1324 (média 842) genes ngWTWT/fg/fgWTWT

329 genes com expressão diferenciadas nesses embriões 329 genes com expressão diferenciadas nesses embriões (todos eles)(todos eles)

Quais genes seriam responsáveis pela Quais genes seriam responsáveis pela sobrevivência dos embriões partenogenéticos?sobrevivência dos embriões partenogenéticos?

Igf2Igf2 H19H19 Passam a ter imprintingPassam a ter imprinting Dlk1 Dlk1 durante a durante a

espermatogêneseespermatogênese Gtl2Gtl2

Análise de expressão gênica quantitativa : Real Análise de expressão gênica quantitativa : Real time PCRtime PCR

Igf2Igf2 Expressos no Expressos no H19H19 mesmo nível em ngmesmo nível em ngH19Δ13/fg/fgWTWT

Dlk1 Dlk1 (pulmões, coração e músculo)(pulmões, coração e músculo) ngngH19Δ13/fg/fgWTWT somente no músculo e pulmões (coração somente no músculo e pulmões (coração

OK...)OK...) Nos embriões com crescimento retardado a expressão no Nos embriões com crescimento retardado a expressão no

pulmão foi reprimida também = causa da morte?pulmão foi reprimida também = causa da morte?

Gtl2Gtl2 Em embriões com crescimento retardado tiveram níveis de Em embriões com crescimento retardado tiveram níveis de

expressão 2 a 4 vezes expressão 2 a 4 vezes maioresmaiores que o controle que o controle Normalmente tem expressão bilateral (dados recentes)Normalmente tem expressão bilateral (dados recentes)

Resultados

Os dois genes devem ter tido expressão normal nos partenotos que sobreviveram

ConclusãoConclusão

Imprinting é uma barreira para Imprinting é uma barreira para desenvolvimento partenogenético em desenvolvimento partenogenético em camundongoscamundongos

Hipótese do conflito parentalHipótese do conflito parental

Expressão apropriada de Expressão apropriada de Igf2 Igf2 e e H19 H19 causa causa modificação em uma grande variedade de modificação em uma grande variedade de genes e no desenvolvimento normal em genes e no desenvolvimento normal em camundongos partenogenéticos ngcamundongos partenogenéticos ngH19Δ13/fg/fgWTWT..